Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

En kronisk søvnfragmenteringsmodell ved hjelp av vibrerende orbital rotor for å indusere kognitivt underskudd og angstlignende oppførsel hos unge villtypemus

Published: September 22, 2020 doi: 10.3791/61531
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1,3
1Department of Neurology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430000, China, 2Key Laboratory of Neurological Diseases of Chinese Ministry of Education, The School of Basic Medicine, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430000,China, 3Department of Pharmacology, School of Basic Medical Science; State Key Laboratory of Medical Neurobiology, Institutes of Brain Science and Collaborative Innovation Center for Brain Science, Fudan University, Shanghai 200032, China

Summary

Presentert her er en protokoll for kronisk søvnfragmentering (CSF) modell oppnådd av en elektrisk kontrollert orbital rotor, som kan indusere bekreftet kognitivt underskudd og angst-lignende atferd i unge vill-type mus. Denne modellen kan brukes til å utforske patogenesen av kronisk søvnforstyrrelser og relaterte lidelser.

Abstract

Søvnforstyrrelser er generelt vanlig i populasjoner som en kronisk sykdom eller en klaget hendelse. Kronisk søvnforstyrrelse foreslås å være nært knyttet til patogenesen av sykdommer, spesielt nevrodegenerative sykdommer. Vi fant nylig at 2 måneder med søvnfragmentering initierte Alzheimers sykdom (AD)-lignende atferdsmessige og patologiske forandringer i unge villtypemus. Her presenterer vi en standardisert protokoll for å oppnå kronisk søvnfragmentering (CSF). Kort sagt ble CSF indusert av en orbital rotor vibrerende ved 110 rpm og opererer med en repeterende syklus på 10 s-on, 110 s-off, under lys-ON fase (08:00-8:00) kontinuerlig i opptil 2 måneder. Svekkelser av romlig læring og minne, angstlignende, men ikke depresjonslignende oppførsel hos mus som konsekvenser av CSF-modellering, ble evaluert med Morris vannlabyrint (MWM), Novel object recognition (NOR), Open field test (OFT) og Forced swimming test (FST). Sammenlignet med andre søvnmanipulasjoner minimerer denne protokollen håndteringsarbeidene og maksimerer modelleringseffektiviteten. Den produserer stabile fenotyper i unge villtypemus og kan potensielt genereres for en rekke forskningsformål.

Introduction

Søvnforstyrrelser er stadig mer vanlig både hos pasienter med søvnfors forstyrrende tilstander og friske mennesker med søvnfors forstyrrende hendelser. Det har blitt observert at pasienter med nevrodegenerative sykdommer, kroniske smerter, følelsesmessig stress, luftveissykdommer, urinsystemsykdommer, etc., vanligvis klager over ubehagelige søvnopplevelser1,2,3,4,5. Obstruktiv søvnapné (OSA), periodiske lembevegelser i søvn (PLMS), søvnvedlikehold søvnløshet blant andre søvnforstyrrelser er de vanligste årsakene, som induserer søvnfragmentering6,7. I utviklede land har OSA over 5% til 9% prevalens i voksen befolkning og 2% ibarnebefolkningen 8,9,10. I mellomtiden er det en økende andel av den friske befolkningen som opplever søvnforstyrrelser på grunn av overforbruk av smarttelefoner, uregelmessige søvnvaner, irriterende lyder og arbeidsoppgaver, for eksempel nattskift for omsorgspersoner. Søvn er anerkjent for å være viktig for hjernen avfall klaring11,12, minnekonsolidering 13,14, metabolsk balanse15,16, blant mange andre fysiologiske prosesser. Likevel er det fortsatt i stor grad ukjent om langvarig søvnforstyrrelse gir opphav til irreversible patogeneseendringer hos friske mennesker, og om det er etiologien eller en medvirkende faktor for å utvikle sykdommer i sentralnervesystemet, som nevrodegenerative sykdommer om et par år nedover veien. Vårt mål er å rapportere en eksperimentell modell som genererer stabilt og tydelig kognitivt underskudd og angstlignende atferd hos unge villtypemus etter en 2-måneders søvnfragmenteringsbehandling. Denne modellen vil bli brukt for å svare på de vitenskapelige spørsmålene som er nevnt ovenfor.

Søvnforstyrrelser er oppført som en potensiell risikofaktor for å utvikle Alzheimers sykdom (AD) eller demens. Kang et al. først funnet og beskrev forverring av AD patologi ved 6 h akutt søvnmangel17. Deretter rapporterte mange andre studier at søvnmangel eller fragmentering kunne forverre patogenesen i transgene AD-musmodeller18,19,20. Imidlertid har svært få forskere studert konsekvensen av søvnforstyrrelser hos unge villtypemus; det vil si om søvnforstyrrelser gir opphav til AD-lignende oppførsel eller patologiske forandringer hos unge villtypemus. I vår nylige publikasjon rapporterte vi at 2 måneder med søvnfragmentering induserte tydelig romlig hukommelsessvikt og angstlignende oppførsel, samt økt intracellulær Amyloid-β (Aβ) akkumulering både i cortex og hippocampus i 2-3 måneder gamle villtypemus21. Vi observerte også endrede uttrykksnivåer av endosom-autophagosom-lysosom stimarkører og microglia aktivering, som var lik de patologiske endringene rapportert i APP / PS1 mus21,22.

Denne presenterte svalefragmenteringsprotokollen (SF) ble validert av Sinton et al.23 og endret av Li et al.24. Kort sagt, en orbital rotor vibrerer ved 110 rpm avbryter søvn i 10 s hver 2 min i lys-ON fase (08:00-20:00). Søvnstrukturendring i denne modellen var tidligere preget av elektrofysiologiske søvnopptak og rapportert av Li et al.24, noe som indikerer en betydelig økning i vekketid og reduksjon i rask øyebevegelse (REM) søvn under lys-ON-fasen, med den totale søvn- og vekketiden (i 24 timer) upåvirket etter mer enn 4 ukers modellering24. For tiden er total søvn eller delvis søvnmangel de mest brukte søvnmanipulasjonsmodellene. Total søvnmangel utføres vanligvis ved vedvarende skånsom håndtering eller utsette dyret for nye gjenstander, alternativt ved å kontinuerlig rotere en bar eller en løpende tredemølle25,26,27,28,29. Av etiske årsaker er total søvnmangel vanligvis kortere enn 24 timer. Den mest brukte delvise søvnmangelmodellen er vannplattformmetoden, som primært ablating REM sove30,31,32. Andre tilnærminger ved hjelp av enten en tredemølle eller en bar som feier langs bunnen av buret, kan indusere søvnfragmentering når den er satt på med fasteintervaller 33,34,35,36,37,38. Det er bemerkelsesverdig at SF avbryter søvn og midlertidig forårsaker opphisselser på tvers av alle søvnstadier24. En av de fremtredende fordelene med denne CSF-modellen som bruker orbital rotor er at den kan utføres kontinuerlig i måneder automatisk kontrollert av maskiner, noe som unngår hyppig behandlingsarbeid daglig med unntak av regelmessig overvåking. Videre ville apparatet tillate samtidig å modellere flere bur av mus under uniformerte inngrep. Under hele modelleringsøkter er mus plassert i sine hjemmebur med vanlig sengetøy og hekkende materialer, mens noen andre metoder krever eksponering for diversifiserte miljøer og uunngåelig stress.

Søvnfragmentering var tidligere preget av søvnmanipuleringsmetoden, som etterligner hyppige opphisselseer under søvnfasen og betydelig søvnretur i våknefasen. I noen litteraturer ble CSF ansett som dyremodellen for OSA39,40. I denne studien er begrunnelsen for den valgte frekvensen av opphisselse til å være 30 ganger per time basert på observasjon av opphisselsesindekser hos pasienter med moderat til alvorlig søvnapné. Det ble observert at 4 ukers søvnfragmentering betydelig økt hyperkapnisk opphisselse ventetid og taktil opphisselse terskelen, som kan minst vare 2 uker etter utvinning24. Denne fenotypen ble forklart ved å avsløre c-fos aktiveringsreduksjon i noradrenergic, orexinergic, histaminergic, og kolinerge våkne aktive nevroner som svar på hyperkapnia, samt redusert katekolaminergisk og orexinergic projeksjoner i cingulate cortex24. Det er imidlertid nødvendig å merke seg at den viktigste funksjonen i OSA er hypoksi forårsaket av luftveisobstruksjon, noe som resulterer isøvnforstyrrelser 41,42. Søvnforstyrrelser og repeterende hypoksi interciprocally samhandle med hverandre i OSA patogenese. Derfor kan søvnfragmentering alene ikke være i stand til å demonstrere alle viktige trekk ved OSA hos mus.

Her presenterer vi en standardisert protokoll for å modellere kronisk søvnfragmentering hos unge villtypemus. Kognitivt underskudd og angstlignende samt depresjonslignende atferd etter CSF-behandling ble evaluert av Morris vannlabyrint, ny objektgjenkjenning, åpen felttest og tvungen svømmetest. Det er viktig å merke seg at denne modellen bør tas som helhet som genererer fenotyper av dysregulert søvnmønster, kognitivt underskudd og angstlignende oppførsel. Den nåværende modellen kan potensielt brukes, men ikke være begrenset, til følgende formål: 1) Videre undersøke funksjonelle eller molekylære patogenesemekanismer forårsaket av kronisk søvnforstyrrelser hos unge mus uten genetisk predisposisjon, 2) Identifisere den direkte veien som fører til nevrodegenerasjon initiert av søvnforstyrrelser, 3) Utforske terapeutiske midler for å forbedre fenotyper indusert av kronisk søvnforstyrrelser, 4) Studere iboende beskyttende / kompenserende mekanismer i vill-type mus ved kronisk søvnforstyrrelser, 5) Brukes til å studere søvn-våkne regulering og tilstand-overgang mekanismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee of Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology.

1. Musscreening og forberedelse til eksperimentet

  1. Velg villtype voksen (8–10 uker gamle) hannmus med vekt på 20–28 g for hele eksperimentet.
    MERK: Wild-type C57BL/6 mus er hentet fra Hubei Research Center for Laboratory Animals, Hubei, Kina.
  2. Tilordne tilfeldig alle mus til CSF og kontrollgruppen. Hus 3-5 mus i hvert bur for å unngå sosial isolasjon stress. Antall mus som ligger i kontrollburene er matchet med det som ligger i de parede CSF-burene.
    MERK: Mus i samme gruppebur er samlet for å utføre oppfølgingsatferdseksperimenter.
  3. Finn kontrollburene i samme rom med CSF-burene, for å holde omgivelsene og arbeidseffektene identiske.
  4. Nummerer og merk musene i hver gruppe på ørene ved hjelp av en øremerke for overvåkingsformål.
  5. Opprettholde omgivelsestemperatur og fuktighet mellom 21–23 °C og 35 %–60 %.
  6. Oppretthold omgivelsesmiljøet i 12-timers lys-mørk syklus (08:00-20:00 light-ON, 20:00-20:00 lys-OFF), for å unngå partisk effekt på normal søvnrytme hos mus.
  7. Minimer støy og forstyrrelser mens forskeren er tilstede i modelleringsrommet.
  8. Gi mus tilstrekkelig mat og vann. Bruk lange dyser med kuleventilspisser på vannflasker, for å forhindre vannlekkasje på plattformbevegelsene. Fest vannflasken på toppen av buret med en fjær for å unngå forvridning av flasken under rotoren i gang.

2. Forberedelse og innstilling av orbital rotor

  1. Forbered en elektrisk styrt orbital rotor med forstørret plattform (67 cm x 110 cm), hvorav 10 bur kan plasseres på det meste.
  2. Sett orbital rotoren på under lys-ON fase (08:00-20:00) kontrollert av et program timer, som er den tiden da mus viser mesteparten av sin daglige søvn.
  3. Sett orbital rotoren med en hastighet på 110 rpm og en repeterende syklus på 10 s-on, 110 s-off kontrollert med en SSD-timer.
    MERK: Plattformens lastekapasitet er 50 kg. Den faste amplituden til rotorhorisonten vibrerende er 2,5 cm.
  4. Fest CSF-burene på toppen av rotorplattformen med tykke fjærer for å forhindre forvridning av bur ved plattformrotasjoner.

3. Kronisk søvnfragmentering modellering og overvåking

  1. Plasser burene til CSF og kontrollmusene inn i modelleringsrommet i en uke før eksperimenter, for å la mus tilpasse seg omgivelsesmiljøet.
  2. I begynnelsen av modelleringen må du sørge for at alle mus har fri tilgang til mat og vann under orbitale rotasjoner.
  3. I begynnelsen av modelleringen må du observere minst 1 time for å sikre at orbital rotoren fungerer i gir.
  4. I løpet av modelleringsperioden må du kontrollere at orbitalrotoren fungerer som den skal, og at mus tilstander hver 2. Endre sengetøy av bur ukentlig.
  5. I løpet av modelleringsperioden, veie musene ukentlig kl 08:00 når du endrer sengetøyet. Fjern musene med betydelig vekttap fra modelleringen, og også fra eksperimentelle grupper.
    MERK: Betydelig vekttap er definert som veier mindre enn 20 g som varer i 2 uker.
  6. Under hele modelleringsøktene fjerner du aggressoren, om noen, fra buret og også fra eksperimentelle grupper.
  7. Etter avslutning av modellering, fortsett å vedlikeholde og mate musene i det opprinnelige rommet.

4. Morris vann labyrint (MWM) test

  1. Forberedelse til testen
    1. Forbered apparatet til en sirkulær tank fylt med varmt vann (20–23 °C).
    2. Suspender fire tegn med forskjellige former og farger på gardinen rundt tanken i fire kvadrantretninger som den fjerne visjonsreferansen. Gjør vannet til å virke ugjennomsiktig ved tilsetning av pulverisert melk.
    3. Finn en plattform midt i den sørvestlige kvadranten.
  2. Treningstesten
    1. Subjek mus for fire påfølgende studier mellom 08:00 og 12:00 hver dag over en 5-dagers treningsperiode.
    2. Slipp hver mus i vannet mot sideveggen på en av fire kvadranter i fire forsøk. I hver prøve, la musen svømme i 60 s for å finne plattformen. Hvis musen ikke er i stand til å komme til plattformen innen 60 s, guide den til plattformen og å forbli der i 15 s.
    3. Bruk et videosporingssystem til automatisk å registrere fluktventetiden til mus for å finne den skjulte plattformen.
  3. Sonden test
    1. Utuk sonden testen på den sjette dagen etter 5 treningsdager.
    2. Fjern plattformen. Slipp hver mus fra nordøst kvadranten og la den svømme i 60 s
    3. Bruk et videosporingssystem til å registrere spordataene til mus automatisk.

5. Ny objektgjenkjenning (NOR) test

  1. Den kjente fasen
    1. Plasser mus i en tank (lengde 30 cm, bredde 28 cm, høyde 35 cm) i rekkefølge, som inneholder to kopier av objekter (A1 og A2). La musene utforske fritt (10 min per studie).
    2. Bruk et videosporingssystem til å registrere spordataene til mus automatisk.
  2. Testfasen
    1. Utukne teststudien etter en 1 t forsinkelse av den kjente fasen. Erstatt et av de opprinnelige objektene med et nytt objekt ("roman") i tanken som holder den andre uendret. Returner musene til tanken og la den utforske i 5 min per studie.
    2. Bruk et videosporingssystem til å registrere tiden som brukes i utforskningen av hvert objekt automatisk av hver mus.
      MERK: Utforskningen av objektet bestemmes ved å slikke, snuse, tygge eller flytte vibrissae mens du orienterer nesen mot og mindre enn 1 cm fra objektet. Diskrimineringsindeksen (DI) beregnes med ligningen (TN − TF)/(TN + TF), der TN = tid brukt på å utforske "romanen" objektet og TF = tid brukt på å utforske det "kjente" objektet.

6. Åpne felttest (OFT)

  1. Forbered apparatet til en tank (30 cm x 28 cm x 35 cm).
  2. Under testen plasserer du hver mus i midten av tanken og lar den utforske fritt i 5 min. Rengjør tanken med 75% etanol etter hver studie for å unngå restene av den forrige musen.
  3. Bruk et videosporingssystem til å registrere spordataene til mus automatisk.

7. Tvunget svømmetest (FST)

  1. Forbered apparatet til et åpent sylindrisk fartøy, som inneholder vann (20–23 °C) som er 15 cm dyp.
  2. Under testen plasserer du hver mus i sylinderen og lar den forbli der i 6 min.
  3. Bruk et videosporsystem til automatisk å registrere immobilitetstiden i løpet av de siste 4 min av testen av hver mus.
    MERK: Musen er fast bestemt på å være immobil når den slutter å slite og flyter i vannet, noe som gjør bare bevegelser som er nødvendige for å holde hodet over vann.

8. Dataanalyse

  1. Analyser data ved hjelp av programvare for statistisk analyse (f.eks. GraphPad Prism 6.0).
  2. Uttrykk alle data som gjennomsnittet ± SEM.
  3. Sammenlign fluktsenatensen i MWM-testen mellom to grupper ved hjelp av toveis ANOVA med gjentatte tiltak etterfulgt av Bonferroni-posttester. Andre sammenligninger mellom CSF og kontrollgruppene bestemmes av unpaired t tester.
  4. Vurder forskjeller som er signifikante hvis P < 0,05 i alle tester.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Alle representative resultater og tall ble gjengitt fra vår siste publikasjon21. Gjenbruk av tallene ble tillatt av det opprinnelige tidsskriftet.

Hele eksperimentell design er illustrert i tidsrekkefølgen, noe som indikerer tidspunktet for CSF-modellering, atferdstester av MWM, NOR, OFT og FST (figur 1A). Vi fikk vekter av mus hver uke fra CSF og kontrollgruppene, for å overvåke deres generelle forhold under modelleringsøktene. Det ble ikke funnet noen tydelig forskjell i vektøkningen hos mus mellom to grupper under modelleringen (figur 1B).

For å evaluere effekten av CSF på romlig læring og minneytelse, gjennomførte vi MWM atferdsstudie43,44. CSF-gruppen viste dårligere rømningskapasitet for å finne plattformen gjennom 5 treningsdager sammenlignet med kontrollgruppen (figur 2A). I sonden testen brukte CSF-musene betydelig mindre tidsandel i den målrettede kvadranten og krysset den forrige plattformplasseringen med færre ganger (figur 2B, C), uten svømmehastighetsforskjell ( figur2D). Disse resultatene ovenfor indikerte at de romlige lærings- og minnehentingsevnene til mus ble svekket etter CSF.

Vi gjennomførte også NOR-test for å vurdere objektgjenkjenning og kortsiktig arbeidsminne etter CSF45. I den kjente fasen var det ingen signifikant forskjell i den totale letetiden mellom CSF og kontrollgruppen (figur 3A). Tilsvarende ble det ikke funnet forskjeller i letetiden mellom objektene A1 og A2, henholdsvis i to grupper (figur 3B). Resultatene ovenfor garanterte at det ikke var noen forskjeller i musenes evner for utforskning og preferanser for plassering. I testfasen ble Discrimination Index (DI) av CSF-musene betydelig redusert versus kontroller (figur 3C), som tydeligvis indikerte underskudd i objektgjenkjenning og kortsiktig arbeidsminne etter CSF.

Vi utførte videre OFT og FST, henholdsvis for å undersøke angstlignende og depresjonslignende oppførsel av mus46,47. Interessant, i OFT, ble det funnet at CSF-gruppen tilbrakte mindre tid i den sentrale sonen enn kontrollgruppen (Figur 4A), som illustrerte at søvnfragmentering kunne indusere angstlignende oppførsel til en viss grad. I tillegg viste CSF-mus lengre total avstand flyttet i tanken (figur 4B), noe som tyder på økt spontan aktivitet etter modellering. Likevel kunne denne CSF-modelleringen ikke indusere depresjonslignende oppførsel, verifisert av ikke-signifikant forskjell i immobilitetstiden mellom to grupper utsatt for FST (figur 4C).

Figure 1
Figur 1: Flytskjemaet for eksperimentell designprosedyre. (A)Den eksperimentelle designprosedyren som indikerer tidspunktet for CSF-modellering og atferdstester (det vil at MWM, NOR, OFT og FST). (B) Kroppsvektkurver av CSF og kontrollmusene i løpet av den første måneden etter at CSF-modellen ble etablert. Denne figuren er endret fra Xie et al.21 Vennligstklikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: CSF svekket romlig læring og minneevner evaluert av MWM-testen. (A)CSF-musene utførte lengre fluktventetid sammenlignet med kontrollmusene under 5-dagers treningstest. **p < 0,01. (B) I sonden testen viste CSF-musene mindre prosentandelstid brukt i plattformen kvadrant i motsetning til kontrollmusene. Øvre panel viser representative sporinger av to grupper. p < 0,0001. (C) I probetesten utførte CSF-gruppen færre tider med å krysse plattformplasseringen sammenlignet med kontrollgruppen. *p < 0,05. (D)Svømmehastigheten til to grupper i probetesten. n.s. indikerer at endringer mellom ulike grupper ikke var signifikante. Alle data ble presentert som ± SEM. n = 10 per gruppe. Denne figuren er endret fra Xie et al.21 Vennligstklikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: CSF svekket objektgjenkjenning og korttids arbeidsminne evaluert av NOR-testen. (A)Den totale letetiden mellom CSF og kontrollmusene i den kjente fasen, i.s. indikerer ingen signifikante endringer mellom ulike grupper. (B)Letetiden for objektene A1 og A2 mellom to grupper i den kjente fasen. n.s. indikerer ingen vesentlige endringer mellom ulike grupper. (C) I testfasen ble Discrimination Index (DI) i CSF-gruppen betydelig redusert sammenlignet med kontrollgruppen. *p < 0,05. Alle data ble presentert som ± SEM. n = 10 per gruppe. Denne figuren er endret fra Xie et al.21 Vennligstklikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: CSF forverret angstlignende, men ikke depresjonslignende oppførsel evaluert av OFT og FST. (A)CSF-musene tilbrakte mindre tid i den sentrale sonen under den observerte 5 min sammenlignet med kontrollmusene i OFT. *p < 0,05. (B)CSF-gruppen viste lengre total avstand flyttet i tanken kontra kontrollgruppen i OFT. *p < 0,05. (C) Immobilitetstiden mellom CSF og kontrollgruppene i FST. n.s. indikerer ingen vesentlige endringer mellom ulike grupper. Alle data ble presentert som ± SEM. n = 10 per gruppe. Denne figuren er endret fra Xie et al.21 Vennligstklikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiske trinn i den nåværende protokollen inkluderer å sette opp søvnfragmenteringsmaskiner med de optimaliserte parametrene i henhold til studieformålet og opprettholde musene i komfortabelt og rolig bomiljø gjennom hele modelleringsøktene. Det er også avgjørende å bestemme riktig timing for å avbryte eller stoppe søvnfragmentering og ordne atferdstester for disse musene. Som andre søvnmanipuleringsmodeller er det viktig å utføre protokollen i et dedikert rom med kontrollerte lyssykluser og blottet for alle mulige unødvendige forstyrrelser. Det bør arbeides for å unngå å indusere lyder og minimere driftstiden utført av forskerne for å sjekke, fylle på mat og vannforsyning, endre sengetøy, etc. I sjeldne tilfeller er det aggressorer som angriper kullkameratene, spesielt ved initiering av ubehagelige søvnforstyrrelser økter. Aggressoren når den er tilstede, bør fjernes ut av hjemmeburene så vel som eksperimentelle grupper. De fleste av de eksperimentelle dyrene bortsett fra noen få til vår erfaring, ville tilpasse seg behandlingen og klare å få tilgang til vann og mat etter behov. Mus med indre problemer, som deformerte tenner, undervektige og hudsår kan forårsake vekttap eller svakhet. De må også unngås å bli brukt til modellering. Siden denne protokollen potensielt kan indusere kronisk stress og metabolsk dysregulering, er det viktig å bruke mus screenet med uniformerte kriterier, for eksempel kroppsvekt, for modellering og eksperimenter.

I den beskrevne protokollen vil orbitalrotoren automatisk slås på i løpet av 08:00-20:00 (light-ON) daglig, som er tiden da mus viser det meste av sitt daglige liv. Rotoren ble satt i gang på en repeterende syklus på 10 s-on, 110 s-off under lys-ON fase for å indusere hyppige opphisselseer. Ulike modelleringsvarigheter ville gi opphav til forskjellige fenotyper. Akutt søvnfragmentering kan føre til absolutt reduksjon i søvnvarighet, økt sympatiske aktiviteter i nervesystemet, som forhøyede kortisonnivåer og nedsattinsulinfølsomhet 23,24. Imidlertid viste kronisk søvnfragmentering upåvirket kortisonnivåer, og balansert total søvntid24. Eventuelle endringer basert på gjeldende protokoll, for eksempel lyssykluser, samsvarende vibrerende innstillinger (hastighet, amplitude, repeterende syklus, etc.) og modelleringsvarighet, kan potensielt endre fenotypene. Det er nødvendig å gjennomføre søvnregistrering og søvnstrukturanalyse under forskjellige modelleringsinnstillinger for å identifisere søvnfenotyper. Det kan også føre til særegne atferdsmessige og patologiske forandringer. Da vi utforsket det kognitive underskuddet etter langsiktig i stedet for en natts søvnfragmentering og hadde en tendens til å unngå de partisk effektene av intermitterende søvnfragmentering på musatferd i MWM og NOR, utførte vi disse to atferdstestene etter å ha avsluttet CSF-protokollen på dag 60. Men uunngåelig kan effekten av restitusjonssøvn hos mus ha forvirret resultatene for MWM og NOR vist.

Selv om denne modellen har rett med søvnfragmenteringsmodell, består den faktisk av fragmenterte søvnmønstre under lys-PÅ-fasen, dysregulering av døgnrytme og kompenserende søvnretur i lys-OFF-fasen. Denne protokollen kan indusere ikke bare søvnmønster endringer, men også betydelig neuroinflammation, metabolsk ubalanse, immunsystem forstyrrelse, etc21,23,24. Alle disse patologiske prosessene kan samhandle med hverandre og megle fenotyper som et orkester. Denne modellen bør tas som helhet for å generere musene med fenotyper av dysregulert søvnmønster, kognitivt underskudd og angstlignende oppførsel hos unge villtypemus. Som nevnt i forrige avsnitt, er denne modellen ikke akkurat speiling OSA på grunn av mangel på repeterende hypoksi. En annen begrensning er at det er vanskelig å generere nøyaktige patologiske forandringer og søvnfenotyper hos de samme musene. Den mye brukte EEG / EMG elektrodeimplantasjon for søvnregistrering uunngåelig indusert alvorlig gliose i cortex48. I de senere årene ble videoovervåking og bildeanalyseteknikker basert på kunstig intelligens brukt i søvnstudier, som ville samle inn nøyaktig søvninformasjon uten invasiv elektrodeimplantasjon49,50,51.

Betydningen av denne CSF-metoden i forhold til eksisterende metoder inkluderer: 1) Forskjellig fra søvnmangelprotokoller som vanligvis utføres i timer eller dager, etterligner den nåværende protokollen bedre langsiktig søvnforstyrrelse hos friske mennesker. Den kompenserende søvn rebound i søvn fragmenterte mus perfekt speiler dagtid somnolence oghemmende arbeidsytelse hos personer med dårlig søvnkvalitet i løpet av natten52,53. 2) Det er så langt den eneste kroniske søvn fragmentering modell i unge vill-type mus med bekreftet kognitive underskudd og angst-lignende, men ikke depresjon-lignende atferd fenotyper, samt tydelige molekylære patologiske endringer i hjernevev. 3) Denne behandlingen forårsaker mildere irritasjoner på mus slik at modelleringen kan vare i flere måneder, selv med mulighet for å bli utført i lengre perioder. 4) Med riktige innstillinger, kan denne modellen generere stabile fenotyper av søvnforstyrrelser, kognitive underskudd, og angst-lignende atferd, som kan brukes enten som sykdomsmodeller eller intervensjoner for ulike studiedesign. 5) Noen søvnmangel modeller krever full økt interferens av forskere for å bruke skånsom håndtering eller nye objekter. Med unntak av regelmessig overvåking minimerer denne metoden håndtering av arbeid, noe som også eliminerer kunstig bias.

Denne CSF-protokollen gir mulighet til å svare på en rekke viktige vitenskapelige spørsmål, for eksempel, er kronisk søvnforstyrrelser årsaken eller konsekvensen av nevrodegenerative sykdommer? Er kronisk søvnforstyrrelse indusert patogenese i ung alder reversibel? Varierer kompenserende mekanismer ved kronisk søvnforstyrrelser mellom unge og eldre mennesker, friske mennesker og pasienter? Denne protokollen kan også brukes til å utforske terapeutiske midler ved å vurdere alvorlighetsgraden og forbedringen av atferds- og molekylærfenotyper. Det ville også bli brukt til å modellere musene med kronisk kraniektomi, optisk fiberimplantasjonspreparater for funksjonelle opptak. Videre kan det muligens brukes som intervensjonsstrategi for å indusere eller forverre fenotyper på toppen av eksisterende forhold. Til slutt kan den brukes til å studere søvn-våkne tilstand overgangsmekanismer. Interessant, den nåværende CSF-modellen kan indusere angstlignende snarere enn depresjonslignende oppførsel hos mus, som er i tråd med den kliniske observasjonen at søvnforstyrrelsen hos pasienter sannsynligvis vil være forbundet mye mer med angst enn med depresjon54,55. Det gir en praktisk modell for å studere følelsesmessige lidelser hos gnagere.

Oppsummert presenterer vi protokollen for modellering av kronisk søvnfragmentering ved bruk av en vibrerende orbital rotor, som kan produsere stabile fenotyper hos unge villtypemus og minimere modelleringsarbeidene med høy effektivitet. Det kan potensielt genereres for en rekke forskningsformål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (61327902-6 til W. Wang og 81801318 til F.F. Ding). Vi anerkjenner Dr. Sigrid Veasy for å etablere SF eksperimentelle systemet og vennligst gi tekniske detaljer. Vi anerkjenner Dr. Maiken Nedergaard for lærerike kommentarer til relaterte eksperimenter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Any-maze behavior tracking system Stoelting,Inc,USA - A video-tracking system which was used to record the behavior track of mice.
C57BL/6J mice Hubei Research Center for Laboratory Animals, Hubei, China. - healthy male C57BL/6J mice aged 10-12 weeks were purchased from Hubei Research Center for Laboratory Animals
Graphpad Prism 6.0 Software Graphpad Software,Inc.USA - Graphpad Prism 6.0 software was used to draw statistical graphs.
Morris water maze system Shanghai XinRuan Information Technology Co.,Ltd,China XR-XM101 The system was used to perform Morris water maze test
Orbial rotor Shanghai ShiPing Laboratory Equipment Co.,Ltd,China SPH-331 The orbital rotor was used to establish the chronic sleep fragmentation model
Solid state timer OMRON Corporation, Kyoto, Japan H3CR-F8-300 The solid state time was used to control the frequency and time of the rotor running
Wooden Lusterless Tank - - length 30 cm, width 28 cm, height 35 cm The tank was used to perform open field test and novel object recognition test

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peter-Derex, L., Yammine, P., Bastuji, H., Croisile, B. Sleep and Alzheimer's disease. Sleep Medicine Reviews. 19, 29-38 (2015).
  2. Mathias, J. L., Cant, M. L., Burke, A. L. J. Sleep disturbances and sleep disorders in adults living with chronic pain: a meta-analysis. Sleep Medicine. 52, 198-210 (2018).
  3. Murphy, M. J., Peterson, M. J. Sleep Disturbances in Depression. Sleep Medicine Clinics. 10 (1), 17-23 (2015).
  4. Walter, L. M., et al. Sleep disturbance in pre-school children with obstructive sleep apnoea syndrome. Sleep Medicine. 12 (9), 880-886 (2011).
  5. Helfand, B. T., et al. The relationship between lower urinary tract symptom severity and sleep disturbance in the CAMUS trial. Journal of Urology. 185 (6), 2223-2228 (2011).
  6. Kimoff, R. J. Sleep fragmentation in obstructive sleep apnea. Sleep. 19 (9), Suppl 61-66 (1996).
  7. Dhondt, K., et al. Sleep fragmentation and periodic limb movements in children with monosymptomatic nocturnal enuresis and polyuria. Pediatric Nephrology. 30 (7), Berlin, Germany. 1157-1162 (2015).
  8. Young, T., Peppard, P. E., Gottlieb, D. J. Epidemiology of obstructive sleep apnea: a population health perspective. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 165 (9), 1217-1239 (2002).
  9. Peppard, P. E., et al. Increased prevalence of sleep-disordered breathing in adults. American Journal of Epidemiology. 177 (9), 1006-1014 (2013).
  10. Marcus, C. L., et al. Diagnosis and management of childhood obstructive sleep apnea syndrome. Pediatrics. 130 (3), 714-755 (2012).
  11. Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342 (6156), New York, N.Y. 373-377 (2013).
  12. Benveniste, H., et al. The Glymphatic System and Waste Clearance with Brain Aging: A Review. Gerontology. 65 (2), 106-119 (2019).
  13. Stickgold, R., Walker, M. P. Memory consolidation and reconsolidation: what is the role of sleep. Trends in Neurosciences. 28 (8), 408-415 (2005).
  14. Stickgold, R. Sleep-dependent memory consolidation. Nature. 437 (7063), 1272-1278 (2005).
  15. Aalling, N. N., Nedergaard, M., DiNuzzo, M. Cerebral Metabolic Changes During Sleep. Current Neurology and Neuroscience Reports. 18 (9), 57 (2018).
  16. Rempe, M. J., Wisor, J. P. Cerebral lactate dynamics across sleep/wake cycles. Frontiers in Computational Neuroscience. 8, 174 (2014).
  17. Kang, J. E., et al. Amyloid-beta dynamics are regulated by orexin and the sleep-wake cycle. Science. 326 (5955), New York, N.Y. 1005-1007 (2009).
  18. Minakawa, E. N., et al. Chronic sleep fragmentation exacerbates amyloid beta deposition in Alzheimer's disease model mice. Neuroscience Letters. 653, 362-369 (2017).
  19. Qiu, H., et al. Chronic Sleep Deprivation Exacerbates Learning-Memory Disability and Alzheimer's Disease-Like Pathologies in AβPP(swe)/PS1(ΔE9) Mice. Journal of Alzheimer's Disease : JAD. 50 (3), 669-685 (2016).
  20. Holth, J. K., et al. The sleep-wake cycle regulates brain interstitial fluid tau in mice and CSF tau in humans. Science. 363 (6429), New York, N.Y. 880-884 (2019).
  21. Xie, Y., et al. Chronic sleep fragmentation shares similar pathogenesis with neurodegenerative diseases: Endosome-autophagosome-lysosome pathway dysfunction and microglia-mediated neuroinflammation. CNS Neuroscience & Therapeutics. 26 (2), 215-227 (2020).
  22. Ba, L., et al. Distinct Rab7-related Endosomal-Autophagic-Lysosomal Dysregulation Observed in Cortex and Hippocampus in APPswe/PSEN1dE9 Mouse Model of Alzheimer's Disease. Chinese Medical Journal (England). 130 (24), 2941-2950 (2017).
  23. Sinton, C. M., Kovakkattu, D., Friese, R. S. Validation of a novel method to interrupt sleep in the mouse. Journal of Neuroscience Methods. 184 (1), 71-78 (2009).
  24. Li, Y., et al. Effects of chronic sleep fragmentation on wake-active neurons and the hypercapnic arousal response. Sleep. 37 (1), 51-64 (2014).
  25. Misrani, A., et al. Differential effects of citalopram on sleep-deprivation-induced depressive-like behavior and memory impairments in mice. Progress Neuro-psychopharmacology & Biological Psychiatry. 88, 102-111 (2019).
  26. Xu, A., et al. Roles of hypothalamic subgroup histamine and orexin neurons on behavioral responses to sleep deprivation induced by the treadmill method in adolescent rats. Journal of Pharmacological Sciences. 114 (4), 444-453 (2010).
  27. Saito, L. P., et al. Acute total sleep deprivation potentiates amphetamine-induced locomotor-stimulant effects and behavioral sensitization in mice. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 117, 7-16 (2014).
  28. Spano, G. M., et al. Sleep Deprivation by Exposure to Novel Objects Increases Synapse Density and Axon-Spine Interface in the Hippocampal CA1 Region of Adolescent Mice. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 39 (34), 6613-6625 (2019).
  29. Morrow, J. D., Opp, M. R. Sleep-wake behavior and responses of interleukin-6-deficient mice to sleep deprivation. Brain, Behavior, and Immunity. 19 (1), 28-39 (2005).
  30. Arthaud, S., et al. Paradoxical (REM) sleep deprivation in mice using the small-platforms-over-water method: polysomnographic analyses and melanin-concentrating hormone and hypocretin/orexin neuronal activation before, during and after deprivation. Journal of Sleep Research. 24 (3), 309-319 (2015).
  31. Aleisa, A. M., Alzoubi, K. H., Alkadhi, K. A. Post-learning REM sleep deprivation impairs long-term memory: reversal by acute nicotine treatment. Neuroscience Letters. 499 (1), 28-31 (2011).
  32. Zagaar, M., Dao, A., Alhaider, I., Alkadhi, K. Regular treadmill exercise prevents sleep deprivation-induced disruption of synaptic plasticity and associated signaling cascade in the dentate gyrus. Molecular and Cellular Neurosciences. 56, 375-383 (2013).
  33. McKenna, J. T., et al. Sleep fragmentation elevates behavioral, electrographic and neurochemical measures of sleepiness. Neuroscience. 146 (4), 1462-1473 (2007).
  34. Tartar, J. L., et al. Hippocampal synaptic plasticity and spatial learning are impaired in a rat model of sleep fragmentation. The European Journal of Neuroscience. 23 (10), 2739-2748 (2006).
  35. Guzman-Marin, R., Bashir, T., Suntsova, N., Szymusiak, R., McGinty, D. Hippocampal neurogenesis is reduced by sleep fragmentation in the adult rat. Neuroscience. 148 (1), 325-333 (2007).
  36. Nair, D., et al. Sleep fragmentation induces cognitive deficits via nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase-dependent pathways in mouse. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 184 (11), 1305-1312 (2011).
  37. McCoy, J. G., et al. Experimental sleep fragmentation impairs attentional set-shifting in rats. Sleep. 30 (1), 52-60 (2007).
  38. Dumaine, J. E., Ashley, N. T. Acute sleep fragmentation induces tissue-specific changes in cytokine gene expression and increases serum corticosterone concentration. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (12), 1062-1069 (2015).
  39. Carreras, A., et al. Chronic sleep fragmentation induces endothelial dysfunction and structural vascular changes in mice. Sleep. 37 (11), 1817-1824 (2014).
  40. Khalyfa, A., et al. Circulating exosomes potentiate tumor malignant properties in a mouse model of chronic sleep fragmentation. Oncotarget. 7 (34), 54676-54690 (2016).
  41. Ferreira, C. B., Cravo, S. L., Stocker, S. D. Airway obstruction produces widespread sympathoexcitation: role of hypoxia, carotid chemoreceptors, and NTS neurotransmission. Physiological Reports. 6 (3), (2018).
  42. Tripathi, A., et al. Intermittent Hypoxia and Hypercapnia, a Hallmark of Obstructive Sleep Apnea, Alters the Gut Microbiome and Metabolome. mSystems. 3 (3), (2018).
  43. D'Hooge, R., De Deyn, P. P. Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory. Brain Research. Brain Research Reviews. 36 (1), 60-90 (2001).
  44. Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nature Protocols. 1 (2), 848-858 (2006).
  45. Vogel-Ciernia, A., Wood, M. A. Examining object location and object recognition memory in mice. Current Protocols in Neuroscience. 69, 1-17 (2014).
  46. Kraeuter, A. K., Guest, P. C., Sarnyai, Z. The Open Field Test for Measuring Locomotor Activity and Anxiety-Like Behavior. Methods in Molecular Biology. 1916, Clifton, N.J. 99-103 (2019).
  47. Porsolt, R. D., Bertin, A., Blavet, N., Deniel, M., Jalfre, M. Immobility induced by forced swimming in rats: effects of agents which modify central catecholamine and serotonin activity. European Journal of Pharmacology. 57 (2-3), 201-210 (1979).
  48. Hauglund, N. L., Kusk, P., Kornum, B. R., Nedergaard, M. Meningeal Lymphangiogenesis and Enhanced Glymphatic Activity in Mice with Chronically Implanted EEG Electrodes. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 40 (11), 2371-2380 (2020).
  49. Nguyen-Michel, V. H., et al. Rapid eye movement sleep behavior disorder or epileptic seizure during sleep? A video analysis of motor events. Seizure. 58, 1-5 (2018).
  50. Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. A video method to study Drosophila sleep. Sleep. 31 (11), 1587-1598 (2008).
  51. Abad, J., et al. Automatic Video Analysis for Obstructive Sleep Apnea Diagnosis. Sleep. 39 (8), 1507-1515 (2016).
  52. Sandlund, C., Hetta, J., Nilsson, G. H., Ekstedt, M., Westman, J. Impact of group treatment for insomnia on daytime symptomatology: Analyses from a randomized controlled trial in primary care. International Journal of Nursing Studies. 85, 126-135 (2018).
  53. Shekleton, J. A., Rogers, N. L., Rajaratnam, S. M. Searching for the daytime impairments of primary insomnia. Sleep Medicine Reviews. 14 (1), 47-60 (2010).
  54. Dixon, L. J., Lee, A. A., Gratz, K. L., Tull, M. T. Anxiety sensitivity and sleep disturbance: Investigating associations among patients with co-occurring anxiety and substance use disorders. Journal of Anxiety Disorders. 53, 9-15 (2018).
  55. Press, Y., Punchik, B., Freud, T. The association between subjectively impaired sleep and symptoms of depression and anxiety in a frail elderly population. Aging Clinical and Experimental Research. 30 (7), 755-765 (2018).

Tags

Atferd Problem 163 kronisk søvnfragmentering orbital rotor kognitivt underskudd angstlignende atferd obstruktiv søvnapné nevrodegenerative sykdommer
En kronisk søvnfragmenteringsmodell ved hjelp av vibrerende orbital rotor for å indusere kognitivt underskudd og angstlignende oppførsel hos unge villtypemus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xie, Y., Deng, S. Y., Chen, S. M.,… More

Xie, Y., Deng, S. Y., Chen, S. M., Chen, X. J., Lai, W. W., Huang, L. F., Ba, L., Wang, W., Ding, F. F. A Chronic Sleep Fragmentation Model using Vibrating Orbital Rotor to Induce Cognitive Deficit and Anxiety-Like Behavior in Young Wild-Type Mice. J. Vis. Exp. (163), e61531, doi:10.3791/61531 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter