Summary
Defensive atferdsresponser er betinget av trusselintensitet, nærhet og kontekst av eksponering. Basert på disse faktorene utviklet vi et klassisk kondisjoneringsparadigme som fremkaller klare overganger mellom betinget frysing og flyatferd hos individuelle. Denne modellen er avgjørende for å forstå patologiene som er involvert i angst, panikk og posttraumatiske stresslidelser.
Abstract
Frykt- og angstrelatert atferd bidrar betydelig til kroppens overlevelse. Imidlertid er overdrevne defensive svar på oppfattet trussel karakteristisk for ulike angstlidelser, som er den mest utbredte formen for psykisk sykdom i USA. Å oppdage de nevrobiologiske mekanismene som er ansvarlige for defensiv atferd, vil hjelpe til med utviklingen av nye terapeutiske inngrep. Pavlovian frykt condition er et mye brukt laboratorieparadigme for å studere fryktrelatert læring og minne. En stor begrensning av tradisjonelle Pavlovian frykt condition paradigmer er at frysing er den eneste defensive atferd overvåket. Vi har nylig utviklet en modifisert Pavlovian frykt condition paradigme som tillater oss å studere både betinget frysing og fly (også kjent som flukt) atferd i individuelle. Denne modellen benytter høyere intensitet fotskjelv og et større antall sammenkoblinger mellom den betingede stimulansen og ubetinget stimulans. I tillegg benytter dette bedede flyparadigmet seriell presentasjon av ren tone og hvit støy auditive stimuli som den bedede stimulansen. Etter kondisjonering i dette paradigmet viser mus frysing som svar på tonestimulansen, og flyresponser under den hvite støyen. Denne kondisjoneringsmodellen kan brukes på studiet av raske og fleksible overganger mellom atferdsresponser som er nødvendige for å overleve.
Introduction
Frykt er en evolusjonært bevart adaptiv respons på en umiddelbar trussel1,2. Mens organismer har medfødte defensive svar på en trussel, er lærde assosiasjoner avgjørende for å fremkalle passende defensive svar på stimuli prediktiv for fare3. Dysregulering i hjernekretser som kontrollerer defensive responser vil sannsynligvis bidra til misforstående reaksjoner forbundet med flere svekkende angstlidelser, som posttraumatisk stresslidelse (PTSD), panikklidelse4og spesifikke fobier5,6. Prevalensen i USA for angstlidelser er 19,1% for voksne og 31,9% hos ungdom7,8. Byrden av disse sykdommene er ekstremt høy på den daglige rutinen til enkeltpersoner og påvirker deres livskvalitet negativt.
I løpet av de siste tiårene har Pavlovian frykt condition fungert som et kraftig modellsystem for å få enorm innsikt i nevrale mekanismer underliggende frykt-relatert læring og minne9,10,11. Pavlovian frykt condition innebærer parring en betinget stimulans (CS, for eksempel en auditiv stimulans) med en aversiv ubetinget stimulans (USA; for eksempel en elektrisk fotsjokk)12. Fordi frysing er den dominerende oppførselen fremkalt og målt i standard Pavlovian condition paradigmer, de nevrale kontrollmekanismer av aktive former for defensiv atferd som flukt / flyresponser forblir i stor grad uutforsket. Tidligere studier viser at ulike former for defensiv atferd, for eksempel fly, fremkales avhengig av trusselintensiteten, nærheten ogkonteksten 13,14. Studere hvordan hjernen kontrollerer ulike typer defensiv atferd kan betydelig bidra til forståelsen av nevronale prosesser som er dysregulert i frykt og angstlidelser.
For å løse dette kritiske behovet utviklet vi et modifisert Pavlovian condition paradigme som fremkaller fly- og flukthopp, i tillegg til frysing15. I dette paradigmet er mus betinget med en seriell sammensatt stimulans (SCS) bestående av en ren tone etterfulgt av hvit støy. Etter to dager med parring av SCS med et sterkt elektrisk fotsjokk, viser mus frysing som svar på tonekomponenten og flygingen under den hvite støyen. Atferdsbrytere mellom betinget frysing og flyatferd er raske og konsekvente. Interessant, mus viser flyatferd bare når den hvite støyen CS presenteres i samme sammenheng som et tidligere levert fotsjokk (kondisjoneringskonteksten), men ikke i nøytral sammenheng. I stedet dominerer fryseresponser i denne nøytrale konteksten, med betydelig større nivåer av frysing som svar på den hvite støyen i forhold til tonen. Dette er i samsvar med kontekstens rolle i å modulere defensiv responsintensitet og med den regulatoriske rollen kontekstuell informasjon i fryktrelatert læring og minne som finnes i tradisjonelle trusselkondisjoneringsparadigmer16,17. Denne modellen muliggjør direkte, innenfor-emne sammenligninger av flere defensive atferd på en kontekst-spesifikk måte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende trinn/prosedyrer ble utført i samsvar med institusjonelle retningslinjer etter godkjenning fra Institutional Animal Care & Use Committee ved Tulane University.
1. Fremstilling av mus
- Bruk mannlige og/eller voksne mus i alderen 3-5 måneder. I den nåværende studien brukte vi mannlige C57BL/ 6J-mus hentet fra Jackson Laboratory, men enhver musebelastning fra en anerkjent leverandør kan brukes.
- Minst en uke før eksperimentet, hus alle musene individuelt på en 12:12 h lys / mørk syklus gjennom hele studien. Gi musene ad libitum tilgang til mat og vann.
- Utfør alle atferdseksperimenter under lyssyklusen. Utfør alle økter på samme tid på dagen i en individuell kohort. Hvis du for eksempel starter eksperimentet klokken 09.00 på dag 1, fortsetter du å starte på det tidspunktet til eksperimentet er fullført.
2. Utarbeidelse av studiemateriell
- Studere sammenhenger
- Velg to forskjellige kontekster du vil utføre eksperimentene i.
- Bruk et sylindrisk kammer bestående av klare pleksiglass (diameter 30 cm) som kontekst A, med et glatt pleksiglassgulv. Høyden på kammeret bør være tilstrekkelig for å hindre rømming (minst 30 cm høy).
- For kontekst B bruker du et rektangulært kabinett (25 cm x 30 cm) med et elektrisk nettgulv som brukes til å levere vekselstrømfotskjelv. Høyden på dette kammeret er svært viktig og bør være minst 35 cm høy. Alternativt kan du bruke et gjennomsiktig tak (sørg for at video kan tas opp gjennom dette materialet).
MERK: Bruk et kammer med glatte veggflater som enkelt kan rengjøres. - Bruk en annen rengjøringsløsning til å rengjøre kontekstene. For eksempel, ren kontekst A med 1% eddiksyre og kontekst B med 70% etanol. Rengjør kontekstene før du begynner den første økten, mellom testing av individuelle mus, og etter fullføring av dagens økter. Dette er viktig for å fjerne olfaktoriske signaler fra tidligere mus. Grundig rengjøring vil også bidra til å forhindre urinskalering på sjokknettet, noe som vil kompromittere kondisjoneringsøkter.
MERK: Rengjøringsløsningene fungerer også som et olfaktorisk signal, og bruker derfor samme rengjøringsvæske for en bestemt kontekst. - Plasser kontekst A eller kontekst B i en lydsnepingsboks under respektive studieøkter.
- Lydgenerator
- Monter en overhead høyttaler over sammenhenger for å levere auditive stimuli ved 75 dB.
- Bruk en programmerbar lydgenerator til å generere auditive stimuli på en forhåndsdefinert tidsplan. Den 7,5 kHz rene tonen er en lyd med en sinusformet bølgeform, mens den hvite støyen er et tilfeldig signal som har lik intensitet ved forskjellige frekvenser, alt fra 1-20 000 Hz.
- Bruk TTL-pulser til å levere auditive stimuli og sjokksignaler med temporal presisjon.
MERK: Før du starter forsøkene, må du måle lydintensitetsutgangen fra den monterte høyttaleren i hvert kammer ved hjelp av en dB-måler.
- Shocker: Koble støteren til det elektriske nettgulvet som brukes til å levere 0,9 mA AC-støt. Definer frekvensen, utbruddet og varigheten av støt i et dataprogram. Lever hver sjokkstimulans på slutten av hver SCS i en varighet på 1 s, totalt fem SCS-sjokk sammenkoblinger per kondisjoneringsøkt.
3. Utarbeidelse av dataprogram og videosporing
- Generer atferdsprotokoller ved hjelp av koding i et program.
- I programmet definerer du den serielle sammensatte stimulansen SCS. Denne stimulansen er en seriell presentasjon av en 10 s ren tone (hver pip presenteres for 500 ms, med en frekvens på 7,5 kHz og hastighet på 1 Hz) og 10 s hvit støy (500 ms pips ved 1 Hz).
- Definer intervallene for inter-trial (ITI) som presenteres etter hver studie, pseudorandomly.
- Under studien registrerer du all museatferd til video for senere analyse.
MERK: Kommersielt tilgjengelige fryktkondisjoneringsbokser kan ikke konfigureres til å registrere atferden gjennom det toppmonterte kameraet. Dette er svært viktig siden den innspilte videoen brukes til å beregne horisontal bevegelse, hastighet og total avstand reist av dyret. - For å angi programvaresporing, plasser en testmus i hver relevante kontekst, juster kontursporingsfølsomheten og definer tyngdepunktet. Dette vil sikre innhenting av pålitelige data om relativ posisjon. I tillegg definerer du hele kontekstområdet som er tilgjengelig for emnet.
MERK: Justeringen av konturstørrelsen for begge kontekstene er viktig, da endringen i lysstyrke i forskjellige sammenhenger vil endre konturstørrelsen. - Bestem en kalibreringskoeffisient ved hjelp av kamrenes kjente størrelser og kameraets pikseldimensjoner som kan brukes til å beregne hastighet (cm/s).
- Synkroniser tidsstempelhendelsene for datainnhentingsdatamaskinen til hendelsesforekomstene i sanntid.
4. Atferdseksperiment
- Slå på alt utstyr: datamaskiner, frykt condition box controller, shocker, og video og tidsstempel opptak programvare. Kontroller at instrumentene er slått på i riktig rekkefølge.
- Kontroller alle funksjonene, inkludert tone, hvit støy og sjokklevering, og sett opp systemet for datainnsamlingen.
- Transport dyrene fra oppbevaringsrommet til pleierommet. La dem akklimatisere seg der i minst 10 min.
- Ta dyret ut fra hjemmeburet, plasser det forsiktig i den respektive konteksten, og aktiver deretter umiddelbart dataprogrammene.
MERK: Initialiseringen av både fryktkondisjoneringssystem og datainnsamling (tidsstempler, musesporing og videoopptak) kan synkroniseres ved hjelp av TTL pulsmedierte aktiveringer. - Pre-condition / Pre-eksponering
- På dag 1 plasserer du emnet i kontekst A (nøytral kontekst). La det akklimatisere seg til kammeret i 3 min (grunnlinjeperioden), og utsett det deretter for 4 studier av en SCS på 20 s totale varighet (figur 1A-1B).
- Opprettholde en 90 s gjennomsnittlig pseudorandom ITI (område 80-100 s). Den totale varigheten for hver pre-eksponering økt er 590 s.
- Frykt condition
- På dag 2 og dag 3 plasserer du emnet i kontekst B. Etter en 3 min baseline periode, utsettes det for fem sammenkoblinger av SCS samtidig avslutte med en 1 s, 0,9 mA AC footshock.
- Opprettholde en 120 s gjennomsnittlig pseudorandom ITI (område 90-150 s). Få hver kondisjoneringsøkt til å vare i totalt 820 s (figur 1A).
- Avhengig av målet med eksperimentet, bør fagmus på dag 4 enten en tilbakekallingstest (se trinn 4.7) eller frykte utryddelse (se trinn 4.8).
- Frykt tilbakekalling (for å teste kontekstavhengighet)
- På dag 4 plasserer du emnet i kontekst A. Etter 3 min baseline periode, presentere den med 4 studier av SCS uten fotsjokk, over 590 s.
- Opprettholde en 90 s gjennomsnittlig pseudorandom ITI (område 80-100 s).
- Frykt utryddelse
- På dag 4 plasserer du emnet i kontekst B. Etter 3 min baseline periode, presentere 16 studier av SCS uten fotsjokk, over 1910 s.
- Opprettholde en 90 s gjennomsnittlig pseudorandom ITI (område 60-120 s).
- Returner dyret til sitt hjem bur og gjenta prosedyren for alle dyrene.
5. Kvantifisering av atferd
- Få en observatør blind for eksperimentet score de innspilte videoene for frysing atferd ved hjelp av automatisk frysing detektor tersklering etterfulgt av en ramme-for-ramme analyse av pikselendringer.
MERK: Andre programvarepakker kan også brukes til å beregne frysing automatisk ved hjelp av 2 kamerasystem. Det er også mulig for en observatør å manuelt score fryseatferd. - Definer frysing som en fullstendig opphør av kroppslige bevegelser, med unntak av de som kreves for åndedrett, for minst 1 s.
- Score hopper når alle 4 av potene forlater gulvet, noe som resulterer i en vertikal og / eller horisontal bevegelse.
- Eksporter den merkede filen med frysing, hopp og hendelsesmarkører.
- Trekk ut relevante hendelser (frysing og hopp) fra definerte tidsperioder (f.eks. 10 s varighet av pre-SCS, tone og hvit støy, for hver studie).
- Ved hjelp av de utpakkede startstoppvarighetene for hendelser i en regnearkfil beregner du varigheten av frysing (i) ved å trekke starttidspunkt fra slutttid, fra de respektive prøveperiodene.
- Representerer disse dataprøvemessig eller dagmessig, ved å oppsummere frysing varighet fra alle forsøk.
MERK: Avhengig av formålet med studien, kan fly- eller fryseatferden scores og beregnes ut fra enhver prøveperiode/varighet fra studieøkten. - Sum det totale antallet hopp fra en bestemt prøvevarighet.
- Trekk ut filen som genereres av musesporingskoordinater fra ramme for ramme X-Y-aksebevegelse av musens tyngdepunkt og beregn musens hastighet (cm/ s).
MERK: Hastighetsdataene kan være til stede enten i cm/s- eller piksel-/s-format. Konverter pikselen/s-enheten til cm/s ved hjelp av tomme- eller cm/pikselverdien som er definert i videoen for den testkonteksten (se pkt. 3.6). - Etter å ha hentet ut hastighetsdata for ramme ved bildebevegelse av dyret, basert på bildefrekvensen til videoen (helst 30 bilder / s), beregner gjennomsnittshastigheten til dyret i en bestemt rammenummerbrakett (multipliser start- og slutttiden i s med 30 for å få start- og sluttrammenummeret).
- Beregn flypoengene ved å dele gjennomsnittshastigheten under hver SCS med gjennomsnittshastigheten i løpet av 10-tallets pre-SCS (baseline, BL) og deretter legge til 1 poeng for hvert escape jump (speedCS / speedBL + # av hopp). En flypoengsum på 1 indikerer derfor ingen endring i flyatferd fra pre-SCS-perioden.
- Du kan eventuelt se videoer manuelt for andre atferder, for eksempel opp- og pleie.
6. Statistisk analyse
- Analyser data for statistisk signifikans ved hjelp av statistisk analyseprogramvare. For alle tester er definisjonen av statistisk signifikans P<0,05.
- Kontroller dataene for normal distribusjon ved hjelp av Shapiro-Wilk normalitetstesten (α= 0,05).
- For å teste effekten av signaler, utfør sammenligningene på samme måte ved hjelp av den aktuelle parametriske (parede t-testen) eller ikke-parametrisk (Wilcoxon-testtest) .
- For å vurdere 2-veis interaksjon av faktorer (cue X-studie), utfør en 2-veis ANOVA etterfulgt av post-hoc-tester (f.eks. Bonferronis flere sammenligningstest / Tukeys test).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som beskrevet i diagrammet (figur 1A) starter økten med forhåndseksponering (dag 1), etterfulgt av fryktkondisjonering (dag 2 og 3), og deretter enten utryddelse eller gjenfinning (dag 4).
Presentasjoner av SCS i pre-eksponering (dag 1) økten ikke fremkalle fly eller frysing respons hos musene (Figur 2A-2B). Atferdsanalyse under kondisjonering (dag 2 og 3) viste at tonekomponenten i SCS betydelig forbedret frysing sammenlignet med frysing under pre-SCS (figur 2B,2E). Flypoeng endret seg betydelig på tvers av økter (dag 1 til dag 3, n = 20; Figur 2A). Mus viste høyere hastighet og flere hopp, og dermed større flyscore, til det hvite støysignalet sammenlignet med tone (figur 2C-2D). Mus viste en klar overgang av defensiv atferd - viser lavere flyscore i løpet av tonen etterfulgt av høyere flyscore under hvit støy (Figur 2F) og omvendt for frysing svar (Figur 2G).
For å teste effekten av trussel nærhet og kontekst på betinget fly, mus ble delt inn i to grupper: en gruppe gjennomgikk utryddelse trening i condition sammenheng (Figur 3A-3B), og en annen gruppe ble testet for frykt minne tilbakekalling ved å utsette dem for SCS i en nøytral sammenheng (Figur 3C-3D). Mus utsatt for de 16 studiene med utryddelsestrening viste rask utryddelse av betinget flyging (n = 12). Flyresultater under den første blokken av fire forsøk var høyere under hvit støy sammenlignet med tonen (figur 3A). Flyatferd ble ikke lenger fremkalt av noen av signalene på slutten av utryddelsesøkten. Det var en generell nedgang i toneindusert frysing og en økning i hvit støymediert frysing under utryddelsesøkten. Frysing for den første blokken av fire studier var betydelig høyere enn tonen sammenlignet med den hvite støyen (figur 3B). Dette tyder på at umiddelbarhet av trusselen er avgjørende for flyresponsen.
Flyresponsen ble redusert på en kontekstavhengig måte. Eksponering for den hvite støyen i nøytral sammenheng fremkallet ikke fly (n = 8). I stedet fremkalte hvite støypresentasjoner i nøytral sammenheng fryseresponser som var høyere enn de som ble fremkalt av tonen (figur 3C-3D). Dette viser viktigheten av kontekst i å modulere defensiv respondering.
Figur 1: Studer design for å vurdere frysing og flyparadigme.
A) Diagram over atferdsøktene. B) Diagram detaljering sammensetningen av den serielle sammensatte stimulans (SCS), samt tidspunktet for USA. C) Kontekst A - fungerte som en nøytral kontekst, og brukes under pre-eksponering og tilbakekalling økter. D) Kontekst B – brukes av frykt condition. Dette tallet er endret fra Fadok et al. 2017. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Betinget flyrespons.
A) Sammenligning av gjennomsnittlig prøvemessig flyscore (n = 20) etter presentasjon av tonen og hvit støy over dag 1-3. En betydelig endring i flyscore på tvers av økter har blitt notert (dag 1 til dag 3; toveis gjentatte tiltak ANOVA, cue × prøveinteraksjon, F (13, 266) = 5,795; P<0.0001). Post-hoc Bonferronis flere sammenligningstest avslører en betydelig forskjell mellom tone og hvit støyindusert flyscore på fryktkondisjonering Dag 1 (studie 4, P < 0,05) og dag 2 (forsøk 2-5, P < 0,001). B) Sammenligning av gjennomsnittlig prøvemessig % frysing i tone- og hvitstøyperioder i dag 1-3. Legg merke til en statistisk signifikant endring i % frysing over øktene (dag 1 til dag 3, n = 20; toveis gjentatte tiltak ANOVA, cue × prøveinteraksjon, F (13, 266) = 20,81; P < 0,001; Figur 2B). Post-hoc Bonferronis flere sammenligningstest avslører en betydelig forskjell mellom tone og hvit støy indusert frysing på fryktkondisjonering Dag 1 (studie 4 og 5, P < 0,001) og dag 2 (alle studier, P < 0,001). C) Sammenligning av antall hoppfluktresponser under pre-SCS, tone, hvit støy og sjokkperioder på dag 3. Enveis ANOVA etterfulgt av Bonferronis flere sammenligningstest viste at rømningshopp var betydelig høyere under hvit støy og sjokk sammenlignet med toneperioden (P < 0,01 og P < 0,001). D) Sammenligning av flyresultater under presentasjon av tone og hvit støy på dag 3. Legg merke til en betydelig høyere poengsum på dag 3 i hvit støyperiode (P < 0,001, Wilcoxon-samsvarende par signert rangeringstest). E) Sammenligning av % frysing under pre-SCS, tone og hvit støy på dag 3. Frysing atferd på dag 3 avslører betydelig effekt av tone og hvit støy (enveis gjentatte tiltak ANOVA, F = 56,82, P<0,01). Bonferronis test for flere sammenligninger viste at presentasjonen av tone øker % frysing betydelig i forhold til pre-SCS-varighet (P < 0,01), mens % frysing ble betydelig redusert sammenlignet med pre-SCS og tonevarighet (både P < 0,001). De representative prøvemessige dataene viser overganger av flyging (F) og frysing (G) oppførsel etter presentasjon av tone og hvit støy i musen på dag 3. De representerte verdiene betyr ± SEM. *P<0,05, **P<0,01, ***P <0,001. Pre-exp, Pre-eksponering. Panel A-E er modifisert fra Fadok et al., 2017. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Utryddelse og tilbakekalling etter flykondisjonering (dag 4).
A)Sammenligning av flyscore under utryddelsestrening viste rask utryddelse av betinget flyvning (n = 12; 16 studier, toveis gjentatte tiltak ANOVA, cue × prøveinteraksjon, F (15 165) = 3,05, P < 0,01). Flyscore fra første blokk med fire forsøk (studie 1-4) av utryddelse observert betydelig høyere for hvit støy sammenlignet med tonen (P < 0,05, Wilcoxon matchet par signert rang test). B) Sammenligning av frysing viste en statistisk signifikant effekt på frysing (%) følgende hvit støy (n = 12; 16 studier, toveis gjentatte tiltak ANOVA, cue × prøve interaksjon, F (15165) = 3,55, P < 0,01). Frysingen for den første blokken av fire studier (studie 1-4) under utryddelse funnet å være betydelig lavere i hvit støyperiode sammenlignet med tonen (Paret t-test, P < 0,01). C) Endringer i konteksten påvirker flyresultatene betydelig (n = 8; 4 studier, toveis gjentatte tiltak ANOVA, cue × prøveinteraksjon, F(1,7) = 27,44, P < 0,01). Flyscore betydelig redusert under hvit støy sammenlignet med toneperioden i nøytral sammenheng (to-tailed paret t-test, P < 0,01) D). Frysing av respons på tvers av forsøk under henting var også signifikant (n = 8, 4 studier, toveis gjentatte tiltak ANOVA, effekten av cue F(1,7) = 27,67, P < 0,01). Eksponering av WN i nøytral sammenheng økte fryseresponsen betydelig sammenlignet med tonen (tosidig paret t-test, P < 0,001). De representerte verdiene betyr ± SEM. *P<0,05, **P<0,01, ***P <0,001. Panel A-D er modifisert fra Fadok et al. 2017. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De beskrevne lyd- og sjokkparametrene er viktige elementer i denne protokollen. Det er derfor avgjørende å teste sjokkalituden og lydtrykknivået før du starter eksperimentene. Frykt condition studier bruker vanligvis 70-80 dB lydtrykknivåer og 0,1-1 mA sjokkintensitet18; dermed er de beskrevne parametrene innenfor grensene for tradisjonelle frykt condition paradigmer. I et tidligere CS-bare (ingen fotsjokk) kontrolleksperiment observerte vi ikke fly- eller fryseresponser hos musene, noe som indikerer at de auditive stimuli ikke er aversive når de presenteres sombeskrevet 15. Hvis du øker dB-nivået av den hvite støyen over 80 dB, kan det føre til medfødt aversjon. Støystimuli presentert ved 75 dB fremkaller imidlertid ikke stress i form av undertrykt atferdsaktivitet hos mus19.
De auditive stimuli som utgjør SCS må velges nøye. I vår forrige studie bestemte vi oss for at single-CS condition med hvit støy induserer høyere flyscore enn kondisjonering med en ren tone15. Dette illustrerer viktigheten av stimulans salience i denne protokollen20. En fersk studie viste imidlertid at kondisjonering med en reversering av SCS-sekvensen (hvit støytone) resulterer i fly til tonen og frysing til den hvite støyen21. Disse dataene støtter at det lærde timelige forholdet mellom signalene også er en viktig faktor.
Fordi burendringer er en potensiell kilde til stress, anbefales det å starte kondisjonering minst 2 dager etter den siste burendringen. For ytterligere å minimere virkningen av stress hos musene som gjennomgår studien, bør det tas riktig forsiktighet for å redusere olfaktoriske signaler som gjenstår fra tidligere fag, inkludert lukten av avføring og urin. Derfor er rengjøring av kammeret før og etter hver mus avgjørende. For å unngå andre potensielle kilder til forstyrrelser, er det best å gjennomføre denne protokollen i et rom atskilt fra andre pågående eksperimenter. Mus bør vise svært lav baseline frysing15. For å teste de eksperimentelle forholdene, bør hvert laboratorium gjennomføre et piloteksperiment for å teste baseline frysing i hver sammenheng.
Annet enn C57BL/6J og andre transgene linjer som brukes av Fadok et al. (2017)15, bør denne metoden være egnet for tilpasning til andre stammer av mus og rotter20,21. Nyere data (Borkar et al. 2020)22 tyder på at både mannlige og kvinnelige mus viser sammenlignbare flyresponser, derfor er paradigmet egnet for begge kjønn. Som nevnt i trinn 2.1.2, som svar på høyintensitetssjokk, hopper mus veldig høyt, og velger dermed forsiktig høyden på kammeret for å forhindre at musene unnslipper konteksten. Det er også viktig å sikre konsekvent og nøyaktig timing av signaler og sjokk stimuli. Både AC og DC sjokk er effektive; Men når du bruker LIKESTRØMsstøt, kan det være nødvendig å øke fotsjokkintensiteten for å nå lignende flyscore som for AC-sjokk. Fordi DC-støt har en mindre skadelig effekt på elektrofysiologiske opptak, anbefales bruk av DC-støt for studier som krever elektrofysiologidata. Det er viktig å merke seg at å redusere intensiteten av fotsjokket kan redusere intensiteten av flyresponsen.
Som det er merket av i protokollen, beregnes flyresultater ved å normalisere hastighetsdata under tone og hvit støy ved å dele dem med individuelle forhånds SCS-hastighetsverdier for prøveversjon. Men hvis en mus viser ekstremt høye nivåer av frysing under pre-SCS, kan de resulterende flyresultatene være svært høye, og dermed øke datavariabiliteten. Dette kan omgås ved hjelp av en annen baselinemåling, for eksempel gjennomsnittshastighetsdata fra 3 min baseline-perioden i begynnelsen av økten eller ved hjelp av gjennomsnittshastigheten for total pre-SCS (gjennomsnitt 5 studier), i stedet for individuelle pre-SCS-verdier for prøveversjon.
Fleksibel og rask atferdstilpasning til trussel er avgjørende for å overleve. De fleste klassiske frykt condition protokoller bruker forhold som induserer frysing som en eneste determinant av frykt læring. Fordelen med denne protokollen er at den gjør det mulig å studere komplekse defensive tilstandsoverganger innen. Tidligere ble denne modellen brukt til å oppdage at atferdsoverganger behandles av lokale tilbakevendende hemmende kretser i den sentrale amygdala15,23. Dette paradigmet gjorde det også mulig for forskere å belyse kortiko-thalamus kretser for valg av defensivatferd 21. Disse studiene viser at denne metoden vil lette studier som undersøker nevrale kretskontroll av raske overganger mellom defensiv atferd i et emne. Dette har potensielle anvendelser for å utvikle en bedre forståelse av nevrobiologisk underbygger angst, panikklidelse, eller PTSD24,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Louisiana Board of Regents gjennom Board of Regents støttefond (LEQSF (2018-21)-RD-A-17) og National Institute of Mental Health av National Institutes of Health under prisnummer R01MH122561. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neutral context | Plexiglass cylinder 30 X 30 cm | ||
| Fear conditioning box | Med Associates, Inc. | VFC-008 | 25 X 30 X 35 cm dimentions |
| Audio generator | Med Associates, Inc. | ANL-926 | |
| Shocker | Med Associates Inc. | ENV-414S | Stainless steel grid |
| Speaker | Med Associates, Inc. | ENV-224AM | Suitable for pure tone and white noise |
| C57/BL6J mice | Jackson laboratory, USA | 664 | Aged 3-5 month |
| Cineplex software (Editor/ studio) | Plexon | CinePlex Studio v3.8.0 | For video tracking and behavioral scoring analysis |
| MedPC software V | Med Associates, Inc. | SOF-736 | |
| Neuroexplorer | Plexon | Used to extract the freezing data scored in PlexonEditor | |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software, Inc. | Version 8 | Statistical analysis software |
References
- Gross, C. T., Canteras, N. S. The many paths to fear. Nature Reviews Neuroscience. 13 (9), 651-658 (2012).
- LeDoux, J. Rethinking the Emotional Brain. Neuron. , (2012).
- Maren, S. Neurobiology of Pavlovian fear conditioning. Annual Review of Neuroscience. 24, 897-931 (2001).
- Johnson, P. L., Truitt, W. A., Fitz, S. D., Lowry, C. A., Shekhar, A. Neural pathways underlying lactate-induced panic. Neuropsychopharmacology. 33 (9), 2093-2107 (2008).
- Mobbs, D., et al. From threat to fear: The neural organization of defensive fear systems in humans. Journal of Neuroscience. 29 (39), 12236-12243 (2009).
- Münsterkötter, A. L., et al. Spider or no spider? neural correlates of sustained and phasic fear in spider phobia. Depression and Anxiety. 32 (9), 656-663 (2015).
- Kessler, R. C., Wai, T. C., Demler, O., Walters, E. E. Prevalence, severity, and comorbidity of 12-month DSM-IV disorders in the National Comorbidity Survey Replication. Archives of General Psychiatry. 62 (6), 617-627 (2005).
- National Institute of Mental Health. Generalized anxiety disorder. National Institute of Mental Health. , 3-8 (2017).
- Herry, C., Johansen, J. P. Encoding of fear learning and memory in distributed neuronal circuits. Nature Neuroscience. 17 (12), 1644-1654 (2014).
- Janak, P. H., Tye, K. M. From circuits to behaviour in the amygdala. Nature. 517 (7534), 284-292 (2015).
- Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. Neuronal circuits for fear and anxiety. Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).
- Seidenbecher, T., Laxmi, T. R., Stork, O., Pape, H. C. Amygdalar and hippocampal theta rhythm synchronization during fear memory retrieval. Science. 301 (5634), 846-850 (2003).
- Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. Defensive behaviors, fear, and anxiety. Handbook of Anxiety and Fear. Handbook of behavioral neuroscience. Blanchard, D. C. , Elsevier Academic Press. 63-79 (2008).
- Perusini, J. N., Fanselow, M. S. Neurobehavioral perspectives on the distinction between fear and anxiety. Learning and Memory. 22 (9), 417-425 (2015).
- Fadok, J. P., et al. A competitive inhibitory circuit for selection of active and passive fear responses. Nature. 542 (7639), 96-99 (2017).
- Maren, S. Neurotoxic or electrolytic lesions of the ventral subiculum produce deficits in the acquisition and expression of Pavlovian fear conditioning in rats. Behavioral Neuroscience. 113 (2), 283-290 (1999).
- Xu, C., et al. Distinct hippocampal pathways mediate dissociable roles of context in memory retrieval. Cell. 167 (4), 961-972 (2016).
- Curzon, P., Rustay, N. R. Chapter 2: Cued and contextual fear conditioning for rodents. Methods of Behavior Analysis in Neuroscience. 2nd edition. , CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton (FL). (2009).
- Mollenauer, S., Bryson, R., Robison, M., Phillips, C. Noise avoidance in the C57BL/6J mouse. Animal Learning & Behavior. 20 (1), 25-32 (1992).
- Hersman, S., Allen, D., Hashimoto, M., Brito, S. I., Anthony, T. E. Stimulus salience determines defensive behaviors elicited by aversively conditioned serial compound auditory stimuli. eLife. 9, (2020).
- Dong, P., et al. A novel cortico-intrathalamic circuit for flight behavior. Nature Neuroscience. 22 (6), 941-949 (2019).
- Borkar, C. D., et al. Sex differences in behavioral responses during a conditioned flight paradigm. Behavioural Brain Research. 389, 112623 (2020).
- Fadok, J. P., Markovic, M., Tovote, P., Lüthi, A. New perspectives on central amygdala function. Current Opinion in Neurobiology. 49, 141-147 (2018).
- Pitman, R. K., et al. Biological studies of post-traumatic stress disorder. Nature Reviews Neuroscience. 13 (11), 769-787 (2012).
- Canteras, N. S., Graeff, F. G. Executive and modulatory neural circuits of defensive reactions: Implications for panic disorder. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. , (2014).
