Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In Vitro Wedge Slice Förberedelse för Härma In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

Published: August 18, 2020 doi: 10.3791/61664
Automatic Translation
1, 1
1Section on Neuronal Circuitry, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, NIH

Summary

Integration av olika synaptiska ingångar till nervceller mäts bäst i en beredning som bevarar alla pre-synaptiska kärnor för naturlig timing och krets plasticitet, men hjärnan skivor vanligtvis bryta många anslutningar. Vi utvecklade en modifierad hjärna skiva för att efterlikna in vivo krets verksamhet samtidigt som in vitro experimentförmåga.

Abstract

In vitro-skiva elektrofysiologi tekniker mäta encellig aktivitet med exakt elektriska och tidsmässiga upplösning. Hjärnan skivor måste vara relativt tunn för att korrekt visualisera och tillgång nervceller för patch-fastspänning eller bildbehandling, och in vitro-undersökning av hjärnan kretsar är begränsad till endast vad som är fysiskt närvarande i den akuta skiva. För att bibehålla fördelarna med in vitro-skiva experiment samtidigt som en större del av presynaptiska kärnor, utvecklade vi en ny skiva beredning. Denna "kil skiva" var avsedd för patch-clamp elektrofysiologi inspelningar för att karakterisera olika monaural, ljud-driven ingångar till mediala olivocochlear (MOC) nervceller i hjärnstammen. Dessa nervceller får sin primära afferent excitatoriska och hämmande ingångar från nervceller aktiveras av stimuli i kontralateral örat och motsvarande cochlear kärnan (CN). En asymmetrisk hjärnan skiva utformades som är tjockaste i rostro-caudal domänen vid den laterala kanten av en halvklotet och sedan tunnar mot den laterala kanten av den motsatta halvklotet. Denna skiva innehåller, på den tjocka sidan, den auditiva nervrot förmedla information om auditiva stimuli till hjärnan, den inneboende CN kretsar, och både disynaptic excitatoriska och trisynaptiska hämmande afferenta vägar som konvergerar på kontralaterala MOC nervceller. Inspelning utförs från MOC nervceller på den tunna sidan av skivan, där de visualiseras med hjälp av DIC optik för typiska patch-clamp experiment. Direkt stimulering av hörselnerven utförs när den kommer in i hörselhjärnstammen, vilket möjliggör inneboende CN-kretsaktivitet och synaptisk plasticitet att ske vid synapser uppströms MOC nervceller. Med denna teknik kan man härma in vivo kretsaktivering så nära som möjligt inom segmentet. Denna kil skiva beredning är tillämplig på andra hjärnkretsar där kretsanalyser skulle dra nytta av bevarande av uppströms anslutning och långväga ingångar, i kombination med de tekniska fördelarna med in vitro-skiva fysiologi.

Introduction

Observation av aktivitet av neurala kretsar är idealiskt utförs med inhemska sensoriska ingångar och feedback, och intakt anslutning mellan hjärnan regioner, in vivo. Men utför experiment som ger encellig upplösning av neurala kretsfunktion är fortfarande begränsad av tekniska utmaningar i intakt hjärnan. Medan in vivo extracellulär elektrofysiologi eller multifoton avbildningsmetoder kan användas för att undersöka aktivitet i intakta nervsystem, tolka hur olika ingångar integrera eller mäta subthreshold synaptiska ingångar förblir svårt. In vivo helcellsinspelningar övervinna dessa begränsningar men är utmanande att utföra, även i hjärnan regioner som är lätt att komma åt. Tekniska utmaningar av encelliga upplösningsexperiment förstärks ytterligare i vissa neuronpopulationer som ligger djupt i hjärnan, eller i rumsligt diffusa populationer som kräver antingen genetiska verktyg för att lokalisera celler in vivo (t.ex. genetiska uttryck för channelrhodopsin paras ihop med optrodeinspelning) eller post-hoc histokemisk identifiering efter inspelning av sitens märkning (t.ex. med neurotransmission-specifika markörer). Att ligga diffust nära den ventrala ytan av hjärnstammen, mediala olivocochlear (MOC) nervceller lider av ovanstående begränsningar1, vilket gör dem extremt svårt att komma åt för in vivo experiment.

Hjärnan skivor (~ 100-500 μm tjocklek) har länge använts för att studera hjärnan kretsar, inklusive auditiva hjärnstammen kretsar, på grund av den fysiska segregeringen av anslutna nervceller som finns inom samma skiva2,3,4,5,6,7,8,9. Experiment med mycket tjockare skivor (>1 mm) har varit anställda i andra labb för att förstå hur bilaterala ingångar integreras i områden av den överlägsna olivary komplex (SOC) inklusive den mediala överlägsen oliv10,11. Dessa skivor var beredda så att axoner av hörselnerven (AN) förblev intakt inom skiva och var elektriskt stimuleras att inleda synaptic signalsubstansen release i CN, härma verksamhet första ordningens hörsel nervceller som de skulle svara på ljud. En stor nackdel med dessa tjocka skivor är synlighet av nervceller för patch-clamp elektrofysiologiska inspelningar ("patching"). Patching blir allt svårare eftersom de många axoner i detta område blir myelinated medålder 12,13,14,15, vilket gör vävnaden optiskt tät och döljande nervceller även i en typisk, tunn hjärna skiva. Vårt mål är att skapa in vitro-preparat som mer liknar kretsens anslutning av in vivo-inspelningar, men med hög genomströmning och högupplösta inspelningsförmågor hos visuellt guidad patch-clamp elektrofysiologi i hjärnskivor.

Vårt labb undersöker fysiologi neuroner av hörsel efferent systemet, inklusive MOC nervceller. Dessa kolinerga nervceller ger efferent feedback till cochlea genom modulera aktiviteten hos yttre hårceller (OHCs)16,17,18,19,20. Tidigare studier har visat att denna modulering spelar en roll i att få kontroll i snäckan21,22,23,24,25,26 och skydd mot akustiskt trauma27,28,29,30,31,32,33. Hos möss, MOC nervceller är diffust ligger i den ventrala kärnan i trapetsoid kroppen (VNTB) i hörselhjärnstammen1. Vår grupp har utnyttjat ChAT-IRES-Cre muslinjen korsade med tdTomato reporter mus linje för att rikta MOC nervceller i hjärnstammen skivor under epifluorescerande belysning. Vi visade att MOC nervceller får afferent hämmande ingång från ipsilateral mediala kärnan i trapetsoid kroppen (MNTB), som är upphetsad, i sin tur, av axoner från klotformiga buskiga celler (GBC) i den kontralaterala cochlear kärnan (CN)34,35,36,37,38. Dessutom, MOC nervceller sannolikt får sina excitatoriska input från T-stellate celler i kontralateral CN39,40,41. Sammantaget visar dessa studier MOC nervceller får både excitatoriska och hämmande ingångar som härrör från samma (kontralateral) öra. Emellertid, den presynaptiska nervceller, och deras axoner konvergerande på MOC nervceller, är inte riktigt tillräckligt nära varandra för att vara helt intakt i en typisk koronal skiva beredning. För att undersöka hur integration av synaptiska ingångar till MOC nervceller påverkar deras åtgärder potentiella bränning mönster, med fokus på nyligen beskrivna hämning, utvecklade vi en beredning där vi kunde stimulera de olika afferents till MOC nervceller från ena örat på det mest fysiologiskt realistiska sätt som möjligt, men med de tekniska fördelarna med in vitro hjärnan skiva experiment.

Kilskivan är en modifierad tjock skiva beredning avsedd för undersökning av krets integration i MOC nervceller (schematized i figur 1A). På den tjocka sidan av skivan innehåller kilen hörselnervens avhuggna axoner (kallas "auditiv nervrot" härefter) när de kommer in i hjärnstammen från periferin och synapsen i CN. Den auditiva nervrot kan elektriskt stimuleras att framkalla signalsubstansen release och synaptisk aktivering av celler i den helt intakta CN42,43,44,45,46. Detta stimuleringsformat har flera fördelar för kretsanalys. Först, istället för att direkt stimulera T-stellate och GBC axoner som ger afferent input till MOC nervceller, stimulerar vi AN att tillåta aktivering av inneboende kretsar rikligt i CN. Dessa kretsar modulera produktionen av CN nervceller till sina mål i hela hjärnan, inklusive MOC nervceller46,47,48,49,50,51. För det andra, den polysynaptiska aktiveringen av afferenta kretsar från AN genom CN uppströms MOC nervceller möjliggör mer naturlig aktivering timing och för plasticitet att inträffa vid dessa synapser som de skulle in vivo under auditiv stimulering. För det tredje kan vi variera våra stimuleringsmönster för att efterlikna EN aktivitet. Slutligen, både excitatoriska och hämmande monaural prognoser till MOC nervceller är intakt i kilen skiva, och deras integration kan mätas vid en MOC neuron med precision patch-clamp elektrofysiologi. Som helhet ger detta aktiveringssystem en mer intakt krets till MOC nervceller jämfört med en typisk hjärnan skiva beredning. Denna hjärnstammen kil slice kan också användas för att undersöka andra hörselområden som får hämmande ingång från ipsilateral MNTB inklusive den laterala överlägsen oliv, överlägsen olivary kärnan och mediala överlägsen oliv10,11,52,53,54,55,56. Utöver vår specifika förberedelse, kan denna skivning metod användas eller ändras för att utvärdera andra system med fördelarna med att upprätthålla anslutning av långväga ingångar och förbättra visualisering av nervceller för en mängd encellig upplösning elektrofysiologi eller bildframställning tekniker.

Detta protokoll kräver användning av en vibratome skede eller plattform som kan lutas cirka 15°. Här använder vi en kommersiellt tillgänglig 2-bit magnetiska scenen där "scenen" är en metallskiva med en böjd botten placeras i en konkav magnetisk "scenbas." Scenen kan sedan skiftas för att justera segmentvinkeln. Koncentriska cirklar på scenbasen används för att uppskatta vinkeln reproducerbara. Scen- och scenbasen placeras i skivningskammaren, där även den magnetiska scenbasen kan roteras.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experimentella förfaranden godkändes av National Institute of Neurological Disorders and Stroke/National Institute on Deafness and Other Communication Disorders Animal Care and Use Committee.

1. Experimentella preparat

OBS: Detaljer angående skivberedning inklusive skivningslösning, skivningstemperatur, skiva inkubationstemperatur och apparatur (etc.) är specifika för hjärnstamsberedning utförd i detta experiment. Skiva inkubation detaljer kan ändras per laboratoriet erfarenhet.

  1. Förbered interna lösningar för patch-fastspänning.
    1. Preparera spänningsklämlösning som innehåller (i mM) 76 Cs-metansulfonat, 56 CsCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES, 10 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 5 Na2-phosphocreatine, 5 QX-314, och 0.01 Alexa Fluor-488 hydrazide. Justera pH-värdet till 7,2 med CsOH.
    2. Bered strömklämlösning innehållande (i mM) 125 K-gluconate, 5 KCl, 1 MgCl2, 0.1 CaCl2, 10 HEPES, 1 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 1 Na2-fosforeatin, och 0.01 Alexa Fluor-488 azhydride. Justera pH-värdet till 7,2 med KOH.
  2. Förbered 100 mL av 4% agar genom att tillsätta 4 g agar till 100 mL varmt (nära kokning) vatten. Placera på uppvärmd rörplatta för att bibehålla temperaturen och rör om tills den är helt upplöst. Häll i 100 mm plast Petri-rätter till cirka 1 cm djup och låt svalna. Kylskåp tills det behövs.
  3. Förbered 1 L konstgjord cerebrospinalvätska (ACSF) som innehåller i mM: 124 NaCl, 1.2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 5 KCl, 26 NaHCO3, 1.25 KH2PO4, och 10 dextros. Bubbla med karbiogen (5% CO2 / 95% O2) i minst 10 min, justera sedan slutliga pH till 7,4 med 1 M NaOH om det behövs. Underhåll syresättning och pH-värde av lösning genom att bubbla kontinuerligt med karbiogen under hela experimentet.
  4. Förbered 200 mL skivningslösning genom att tillsätta 1 mM kynurenic syra till ACSF. Sonikera lösning i ett sonikerande vattenbad i 10 min tills kynurenic syra är upplöst. Bubbla kontinuerligt med karbiogen och placera på is.
    FÖRSIKTIGHET: Använd lämplig personlig skyddsutrustning vid hantering av kynurenic syra.
  5. Montera ett lämpligt blad i vibratomen enligt tillverkarens anvisningar. Chill vibratome skivning kammare genom att omge den med is.

2. Hjärnborttagning med intakt hörselnervrot för stimulering

OBS: Möss för dessa experiment erhölls genom att korsa ChAT-IRES-Cre transgena möss på en C57BL/6J bakgrund med tdTomato reporter möss (Ai14). Möss som användes för histologi och elektrofysiologi var efter förhandlingen debut (P14-P23), som är runt P12 i möss. Nervceller som uttrycker tdTomato i den ventrala kärnan i trapetsoidkroppen (VNTB) har tidigare karakteriserats som MOC nervceller i denna mus linje57.

  1. Avliva (t.ex., CO2 kvävning) och halshugga djuret med hjälp av godkända institutionella förfaranden.
  2. Med hjälp av ett rakblad, skär huden vid mittlinjen av skallen från näsan till baksidan av halsen. Skala tillbaka huden för att exponera skallen.
  3. Med hjälp av små saxar, gör ett snitt i skallen genom mittlinjen börjar vid basen (caudal slutet nära ryggmärgen) av skallen och fortsätter mot näsan.
  4. Vid lambda suturen, gör nedskärningar i skallen från mittlinjen, lateral mot örat på båda sidor. Skala tillbaka skallen för att exponera hjärnan.
  5. Börjar vid rostral slutet, lyft försiktigt hjärnan bort från skallen med en liten lab spatel eller trubbiga tång. Skär synnerven och fortsätta att försiktigt arbeta hjärnan bakåt, utsätta den ventrala ytan.
  6. Skär trigeminala nerverna genom att nypa dem med fina tång nära hjärnstammens ventrala yta.
    OBS: Gör detta försiktigt eftersom den vestibulocochlear nerven ligger strax under detta och måste vara intakt för eventuell stimulering.
  7. Placera preparatet i en petriskål av glas fylld med kall skivningslösning. Placera skålen under ett dissekerande mikroskop. Försiktigt bubbla med carbogen.
  8. Trimma ansiktsnerven nära hjärnstammen och exponera vestibulocochlear nerv.
  9. Med hjälp av fina tänjningar, tryck in spetsarna i foramina där vestibulocochlear nerven lämnar skallen så långt som möjligt och nyp nerven för att bryta den, lämnar nervroten fäst vid hjärnstammen. Upprepa detta på andra sidan.
  10. När båda nervrötterna är fria, ta bort hjärnhinnorna och vasculature från den ventrala ytan av hjärnstammen nära trapetsoidkroppen.
  11. Befria hjärnan helt från skallen genom att nypa de återstående kranialnerverna och bindväven var noga med att bevara den återstående ryggmärgen om möjligt.

3. Block och montera hjärnan på scenen (magnetisk skiva)

  1. Förbered hjärnans yta för att fixera till scenen genom att blockera hjärnan på nivån för den optiska chiasmen.
    1. Med den ventrala ytan upp, stabilisera hjärnan med hjälp av ett trubbigt verktyg för att försiktigt immobilisera ryggmärgen så att hjärnan inte lutar under följande steg.
    2. På nivån för den optiska chiasm, använd öppna tåtor för att skapa planet för att blockera hjärnan genom att sätta in genom hjärnan ner till botten av skålen. För in tlycklarna i en vinkel på ungefär 20° från vertikalt så att spetsarna går ut ur hjärnans ryggyta caudal till optik chiasm.
    3. Skär längs krafttrådarna med hjälp av rakbladet.
  2. Limma hjärnan till scenens yta.
    1. Förbered ett litet block (~1 cm3) av 4% agar för att stödja hjärnan.
    2. Placera en liten droppe lim på scenen och sprida den i en rektangel så att både hjärnan och agarblocket kan limmas ner.
    3. Med hjälp av tuktar, försiktigt lyfta hjärnan och försiktigt badda överflödig vätska med hjälp av kanten av en pappershandduk. Placera den blockerade ytan på limmet, kommer ventral yta att vara mot bladet under skivning.
    4. Tryck agarblocket försiktigt mot hjärnans ryggyta för att stödja det under skivning och för att säkerställa korrekt hjärnans positionering (dvs. vinkel).

4. Skiva hjärnan för att skapa kil slice

OBS: Förbered en hjärnskiva med vibratom som har cochlear nervroten på den tjocka sidan och mediala olivocochlear (MOC) nervceller och den mediala kärnan i trapetsoidkroppen (MNTB) på den tunna sidan.

  1. Placera den magnetiska skivan med fäst hjärna på scenen bas och placera den i skivningskammaren med den ventrala ytan av hjärnan orienterad mot bladet.
  2. Fyll kammaren med iskall skivningslösning och bubbla med karbiogen.
  3. Sänk bladet i lösningen och skär skivor caudal till regionen av intresse för att se till att skivorna är symmetriska. Om skivorna verkar asymmetriska, luta scenen något för att erhålla symmetri.
    OBS: Bladhastigheter mellan 0,05-0,10 mm/s var effektiva för att skära friska skivor och kan variera beroende på djurålder och hjärnregion.
  4. När skivorna är symmetriska, skifta scenen ~ 15 ° (motsvarande cirka 3 koncentriska ringar på scenen bas) till en sida.
    OBS: Förskjut scenen bort från den auditiva nervrot som du vill bevara i segmentet.
  5. Fortsätt skära försiktigt tills hörselnerven roten är nära ytan på ena sidan, och ansiktsnerven kan ses vid ytan av den andra sidan.
  6. För stadiet bakåt 15° till ursprungsläget.
  7. För bort bladet från vävnaden och snurra på scenbasen 90° så att den tunna sidans sidokant är riktad mot bladet. Sänk bladet flera hundra mikrometer och sedan långsamt föra bladet nära kanten av vävnaden. Upprepa detta tills bladet vidrör den laterala kanten. Sänk bladet till önskad tjocklek av den tunna kanten av skivan, här ytterligare två hundra mikrometer.
    OBS: Den resulterande skiva är idealiskt ~ 300 mm tjock i nivå med den ventrala kärnan i trapetsoidkroppen (VNTB) på den sida där patch fastspänning kommer att ske.
  8. Flytta bladet tillbaka från vävnaden och snurra på scenbasen bakåt så att den ventrala ytan är vänd mot den.
  9. Gör snittet som betecknar kilskivans rostrala yta. Överför skiva till en bit gränssnittspapper (1 cm2) caudal yta ner. Flytta skiva till inkubationskammaren eller annan lämplig inkubationsapparat för återhämtning (30 min vid 35 °C).
    OBS: Ansiktsnerven ska synas på båda halvkloten av skivan på rostral yta (se figur 1B).

5. Uppställda och registrerande av elektrofysiologi

  1. Placera kilskivan i inspelningskammaren och säkra skiva med en harpa eller stabiliserande system. Genomsyra vävnaden kontinuerligt med en hastighet av 7-10 mL/min med varm (35 °C) ACSF bubblade med karbiogen.
  2. Identifiera genetiskt märkta MOC nervceller i VNTB med hjälp av epifluorescens med 561 nm utsläppsfilter för patch-clamp inspelningar. Vänd segment om det inte finns några potentiellt patchable celler.
  3. Med hjälp av DIC optik, fokusera på hörselnerv roten på den tjocka sidan av skivan och använda en micromanipulator för att flytta den bipolär volfram stimulerande elektrod ner till hörselnerven rot och försiktigt in i ytan av vävnaden.
    OBS: Sugelektroder har använts i auditiva nervstimuleringsexperiment i andra labb. Thetaglaselektroder, eller optiska stimuleringsmetoder kan användas om tillämpligt på andra specifika preparat.
  4. Flytta synfältet tillbaka till VNTB att välja en MOC neuron att rikta för patch clamp elektrofysiologi.
  5. Fyll en inspelningpipett med lämplig intern lösning för det föreslagna experimentet.
  6. Lapp och spela in från MOC neuron i hela cellen konfiguration. Kompensera membran kapacitans och serie motstånd om det krävs.
  7. Justera elektrisk stimulering amplitud av hörselnerven roten för att få konsekventa postynaptic händelser i MOC neuron.
    OBS: Det kan vara nödvändigt att flytta stimuleringselektroden.
  8. Kör lämpliga stimuleringsprotokoll för att observera framkallade synaptiska strömmar i MOC (spänningsklämma) eller åtgärdspotentialmönster (strömklämma).
    OBS: Wedge slice-beredningen kan användas med alla typiska patch-clamp-verktyg som lösa patch-inspelningar, farmakologi, optogenetik, kalciumavbildning, signalsubstansen uncaging, etc.

6. Histologisk bekräftelse av hjärnstammens kärnor

OBS: Detta görs med cresylviolettfärgning, i fast, omdebiterad kilskiva. Denna metod möjliggör visualisering av kärnor som finns i segmentet.

  1. Efter att ha förberett en kilskiva, dränka skiva i fixativ (4% PFA i PBS) över natten. Skölj skivan 3x i 10 min i PBS (rumstemperatur på en shaker), lägg sedan i 30% sackaros i PBS över natten vid 4 °C för att cryoprotect.
  2. Dela upp skivan på nytt på en frysning mikrotom (40-70 mm) och samla seriesektioner i en 24 brunnsplatta i PBS.
  3. Montera sektioner på gelatinbelagda objektglas och låt torka helt. Placera diabilder i glidvagn.
  4. Förbered cresylvioletta lösningar
    1. Förbered 1% kresylviolettacetat genom att blanda 5 g kresylviolettacetat i 500 mL dH2O
    2. Bered acetatbuffert genom att först förbereda 90 mL lösning A (540 mL glacial ättiksyra + 89,46 mL dH2O) och 10 mL lösning B (136 mg natriumacetat i 10 mL dH2O). Kombinera lösning A och lösning B som ger acetatbufferten.
    3. Kombinera 1% cresylviolettacetat med acetatbufferten 1:1 för 0,5% kresylviolett i acetatbuffert. Filtrera före användning.
    4. Förbered 95 % och 70 % etanol genom att späda 100 % etanol med lämpliga volymer av dH2O
  5. Utför cresyl violett färgning protokoll. Flytta glidvagnen genom lösningsbrickor, blotting överflödig lösning på en pappershandduk mellan brickor: xylen – 5 min; 95% etanol – 3 min; 70% etanol – 3 min; dH2O – 3 min; 0,5% cresyl violett lösning – 8-14 min övervakning ofta tills nukleär färgning blir mörklila; dH2O – 3 min; 70% etanol – 3 min; 95% etanol – 1-2 min; 100% etanol – dopp glider två gånger; xylen – 5 min; xylen: 25 min tills montering utförs.
    FÖRSIKTIGHET: Använd xylener endast under en draghuva.
  6. Ta bort diabilder från xylen en i taget och placera omedelbart täckglidningar på glidbanor med hjälp av monteringsmedium. Låt monteringsmedium torka (över natten).
  7. Bildsektioner.

7. Biocytinmärkning för anterograde spårning av axoner i levande, ofixerad vävnad

  1. Förbered en kilskiva enligt ovan (Steg 2-4).
  2. Överför segmentet till gränssnittspapper (~1 cm2). Under ett dissekerande mikroskop, lokalisera CN på den tjocka sidan av skivan.
  3. Ta försiktigt bort överflödig ACSF från området kring skivan genom att vrida upp ett hörn av ett silkespapper för att dra ACSF bort från vävnaden. Detta hindrar biocytin från att sprida sig till omgivande områden av skivan som kan leda till upptag i celler utanför CN.
  4. Med fina tärningar väljer du en liten kristall av biocytin och placerar den på YTAN AV CN. Tryck försiktigt kristallen i vävnaden för att främja kontakt med nervceller och efterföljande upptag i somata. Upprepa detta steg för att täcka önskad region av intresse, i detta fall CN regioner som innehåller T-stellate och GBC nervceller.
  5. Placera skivan i en inkubationskammare. Låt skiva inkubera i 2-4 h vid 35 °C för att möjliggöra upptagning och transport av biocytin. Efter inkubationen sköljer du skivan i ACSF för att avlägsna eventuella biocytinpartiklar.
  6. Placera skiva i fixativ (4% PFA i PBS) över natten. Skölj 3x i 10 min i PBS.
  7. Cryoprotect skiva i 30% sackaros i PBS över natten vid 4 °C eller tills skiva sjunker.
  8. Resect vävnaden för att producera tvärgående sektioner på en frysning mikrotom vid 70-100 mm.
  9. Process vävnad med hjälp av standard immunohistochemical metoder med en fluorescently konjugerat streptavidin.
    OBS: Ytterligare immunohistokemi kan utföras på avsnitten om det är till hjälp för märkning av presynaptiska cellkroppar, axoner, receptorer, eller andra synaptiska molekyler viktiga för kretsvisualisering (dvs. primära antikroppssteg bör inte påverka biocytin sekundär visualisering negativt).
  10. Avbilda vävnaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Histologisk undersökning av kilskiva
För vår undersökning av auditiva hjärnstammen neuron funktion, kil slice beredningen var utformad för att innehålla hörselnerven rot och CN kontralateral till MOC nervceller riktade för inspelningar (exempel skiva visas i figur 1B). Inledande histologisk undersökning av preparatet är viktigt att bekräfta att skiva innehåller de kärnor som är nödvändiga för kretsaktivering och att axonalprojektioner är intakta. Två celltyper inom CN ger ljudinformation till MOC nervceller. T-stellate celler är hypotetiska för att ge den excitatoriska ingången till MOC nervceller39,40,41,58. Klotformiga buskiga celler (GBC) excitera MNTB nervceller i kontralateral halvklotet (via den specialiserade calyx av Held synapse)34,36,37,38,59,60 som i sin tur ger hämmande indata till MOC nervceller57 (schematisk figur 1A). För att bekräfta förekomsten av både T-stellate celler och GBCs, vi re-sectioned (till 50 μm) en kil skiva som fastställdes genom nedsänkning i 4% PFA och utförs cresyl violett färgning till etikett somata. I den tjocka sidan av kilskivan (Figur 2, vänster halvklot) var CN närvarande i nästan sin fulla rostro-caudal utsträckning. Dessutom var de dorsala och ventrala underavdelningarna i CN intakta (Figur 2; pil och pilspets i S19). T-stellate nervceller och GBCs kluster i den ventrala cochlear kärnan nära där hörselnerven (Figur 2; pil i S17) kommer in i CN61,62,63,64,65. Kilskivan innehåller också nervceller av MNTB-ipsilateral till MOC nervceller från vilka inspelningar utförs (tunn halvsfär av den ursprungliga kil slice, höger sida i figur 2). Detta bekräftar att åtminstone en del av den hämmande ingången till MOC nervceller är intakt (Figur 2, skivor 1-15, markeras av streckade ovaler i S11).

I separata experiment bekräftade vi att axons och presynaptic terminaler av CN nervceller var intakt i kilen skiva med anterograde märkning med biocytin. Först var den levande kil skiva beredd och placeras på gränssnitt papper. Omedelbart efter att ha förberett kilskivan placerades biocytinkristaller i KN som tillät upptag och anterograde transport längs axoner under en inkubationstid. Sedan fastställande och re-sectioning av vävnaden (70 mm sektioner) utfördes. Färgning av sektioner med fluorescently märkt streptavidin utfördes för att visualisera axons märkt med biocytin. Confocal bilder av dessa avsnitt visar ljus märkning i CN där kristallerna placerades och tas upp i cellkroppar (Figur 3A, vänster hjärnhalva, streckade området). Axons som lämnar CN längs den ventrala akustiska stria (Figur 3A, vita pilspetsar) var tydligt märkta och kunde följas till sina termineringspunkter. Biocytin-positiva puncta omgivande kontralateral MOC nervceller föreslå våra preparat bevarar synaptiska kontakter med ursprung i CN (Figur 3B). Likaså märkt calyces av Held i kontralateral MNTB ange axoner utsytande från GBCs till MNTB nervceller bevaras i kilen skiva (Figur 3C). Dessa histologiska undersökningar bekräftar vår kil skiva innehåller både cellen organ och axonal prognoser afferent ingångskretsar till MOC nervceller, som därför gör det möjligt för oss att mäta postynaptic svar framkallas genom stimulering av hörselnerven och efterföljande förökning av verksamhet genom stigande kretsar.

Synaptisk fysiologi i kilskiva
Integration av excitatoriska och hämmande synaptiska ingångar kritiskt former neuronal aktivitet. Vi beskrev nyligen hämmande ingångar till MOC nervceller från nervceller av MNTB57, men effekten av integration av dessa ingångar med excitatoriska ingångar på MOC neuron aktivitet är okänd. I en kil skiva från en ChAT-IRES-Cre x tdTomato mus, spänning-clamp inspelningar utfördes från en MOC neuron. Ström tillämpades via en bipolär volfram stimulerande elektrod drivs av en stimulans isolering enhet för att framkalla signalsubstansen release från presynaptiska axons. Först den ventrala akustiska stria (VAS) vid mittlinjen var elektriskt stimuleras att aktivera T-stellate axoner direkt och MNTB nervceller via GBC axon stimulering (Figur 4A), för att mäta latensen till post-synaptiska svar i en inspelning konfiguration som härmar typiska tunn-slice experiment (Figur 4B), spår, grå, innehav potential -60 mV). I separata experiment, den auditiva nerv roten stimulerades att aktivera monaural stigande kretsar och post-synaptic svar mättes vid MOC nervceller som beskrivs ovan. Elektrisk stimulering i antingen plats framkallat en snabb-elektrisk artefakt följt av multipeaked ström svar (exempel svar från AN stimulering i figur 4C, svarta spår, innehav potential -60 mV). Vi jämförde inset latens åtgärder av den första postsynaptic nuvarande (PSC) framkallat med direkt stimulering av VAS med de framkallat med auditiva nerv stimulering och fann en betydligt längre latens till AN stimulering händelser. Detta tillskrevs den synaptiska fördröjningen vid SYNAPSEN AN/CN (AN-stimulering: 5,27 ± 0,43 ms, median ± median absolutavvikelse (MAD), intervall 4,26-5,93 ms, n = 8; VAS-stimulering: 1,98 ± 0,28 ms, median ± MAD, intervall 0,75-3,46 ms, n = 17; Wilcoxon Signerad Rankas Test, p = 0,014, Figur 4D). Dessa resultat bekräftar att stimulering av hörselnerven roten resulterar i synaptic aktivering av CN nervceller och efterföljande krets aktivitet, närmare representerar in vivo – som timing än direkt stimulering av T-stellate eller GBC/MNTB axoner.

Med vår cesium baserad, hög [Cl-] inre lösning som används i spänning klämma, excitatoriska (glutamatergic) och hämmande (GABA och glycinergic) PSC är båda inåt vid vilande membran potential (-60 mV) och därför omöjlig att skilja. Medan frammanande krets verksamhet i AN-stimulerande konfigurationen, vi elektriskt isolerade förmodat hämmande ingång genom att flytta innehav potential till 0 mV, den ungefärliga återföring potential för AMPA medierad glutamatergic strömmar. I vårt exempel neuron, observerades utåt nuvarande svar vid 0 mV (Figur 4Ci, röda spår) som tyder på klorid conductances. Dessa är sannolikt GABA- eller glycinergic synaptiska svar. Dessa data visar nyttan av kilen skiva för att aktivera både excitatoriska och hämmande ingångar till MOC nervceller genom att stimulera hörselnerven rot, med aktivering av efterföljande afferent kretsar. Vidare var olika mönster av post-synaptic svar framkallats av AN stimulans, vilket tyder på att även under villkor av identiska stimulering av AN axoner, verksamhet av hela kretsen är dynamisk och komplex. Denna experimentella paradigm möjliggör en detaljerad analys av hur komplexa auditiva stimuli propagera genom hjärnstammen och integrera på MOC nervceller, bestämma MOC efferent systemets produktion och eventuell inverkan på hörselsnäckan.

Figure 1
Bild 1: Wedge slice schematisk och exempelbild. (A) Schematisk av den mediala olivocochlear feedback krets. Blå pilar visar afferent stigande väg till MOC nervceller och svarta pilar indikerar fallande feedback väg från MOC nervceller till basen av yttre hårceller (OHC). (B) Brightfield bild av en kil skiva med etiketter av den auditiva nervrot (ANR) och cochlear kärna (streckad kontur) på den tjocka sidan. Asterisk indikerar den ungefärliga platsen för den ventrala kärnan i trapetsoidkroppen där MOC nervceller är riktade för patch-fastspänning på den tunna sidan av kilskivan. Streckade svarta linjer indikerar ansiktsnerverna som kan ses i båda halvkloten av skivan på rostral yta. IHC - inre hårcell, GBC - klotformig buskig cell, SPN - överlägsen paraolivary kärna, MNTB - mediala kärnan i trapetsoid kroppen, VNTB - ventrala kärnan i trapetsoid kroppen, LSO - laterala överlägsen oliv. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Cresylviolettfärgade färgas sektioner från en kilskiva som åter var sektionerad vid 50 μm. Varannan sektion avbildades. Sektioner är numrerade rostrala --> caudal. Kilskivor tenderade att innehålla hela cochlearkärnan (CN) inklusive både rygg-KN (pil i S19) och ventrala CN (pilspets i S19), auditiv nervrot (öppen pilspets i S17) och mycket av MNTB (mörkt område nära ventral yta i S3-S15, markerad med streckade ovaler i S11). D och V på skala bar representerar dorsala och ventrala i segment orientering. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Axoner av stigande ingång till MOC-nervceller från den kontralaterala cochlearkärnan förblir intakta i kilskivan. (A) Den rostral-mest avsnitt från en kil skiva tas från en P23 ChAT-IRES-Cre x tdTomato (röd fluorescens) mus som var re-sectioned (70 μm) och bearbetas för biocytin visualisering. Confocal bild är en kaklad, maximal intensitet projektion z-stack. Axons i ventrala akustiska stria markeras av vita pilspetsar. Streckad kontur indikerar den lilla delen av cochlear kärnan kvar i denna rostral-mest skiva. Skala bar 500 μm. (B) Confocal bild av en ChAT-IRES-Cre x tdTomato positiv neuron i VNTB med biocytin positiva puncta i den omgivande neuropil. Skala bar 50 μm. (C) Biocytin märkta axoner visas korsar mittlinjen och avslutande i den kontralaterala MNTB som calyces av Held. Vertikal streckad linje representerar mitten av segmentet. Skala bar 100 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Elektrisk stimulering av afferenta ingångar i spänningsklämma ger multipeak postynaptic strömmar i MOC nervceller. (A) Schematisk av kilskiva med inspelningsuppstängt för både ventral akustisk stria (VAS) stimulering (gråstimulerande elektrod) och hörselnerven (AN) stimulering (svartstimulerande elektrod) av afferenta ingångar till MOC. (B) Exempel på postsynaptiska strömmar (PSC) från en enskild P17 neuron framkallas med en enda elektrisk stimulans nära mittlinjen vid -60 mV. (C) PSCs framkallas under AN stimulering vid -60 mV i en P15 neuron. (Ci) Exempel PSC i samma cell som C framkallat vid 0 mV innehav potential (den ungefärliga återföring potential för AMPA medierad strömmar i vår inspelning setup, röd). (D) Befolkningsdata för kvantifiering av latens till första PSC för VAS och AN-stimulering. Lådor: kvartilar, linje inset: median, kvadratisk inset: medelvärde, morrhår: median absolut avvikelse. * p < 0,05. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Skivning förfarandet beskrivs här kallas en kil skiva är kraftfull för att upprätthålla intakt presynaptic neuronal kretsar, men med tillgängligheten av hjärnan skiva experiment för analys av neuronal funktion. Stor försiktighet måste tas i flera inledande steg för att maximera nyttan av preparatet för kretsanalys. Kilens dimensioner bör bekräftas med hjälp av histologisk undersökning, som är integrerad för bekräftelse av att både presynaptiska kärnor och deras axonalprojektioner finns inom den beredda kilskivan. Slice geometri kan kräva modifiering om prognoser är avhuggna eller få axoner når målet atomkärnor. Mer allmänt är det avslutande snittet på vibratomen för kilskivan som är oerhört viktigt. Optimal kil skiva förberedelse kommer att kräva en kombination av konsekvent användning av vibratome konfigurationer inklusive användning av koncentriska cirkel markeringar på scenen bas, tillsammans med justering av inställningar baserat på kända hjärnan landmärken. Efter optimering av skiva geometri, vi registreras konsekvent PSCs i MOC nervceller framkallat genom att elektriskt stimulera hörsel nerv rot i 8 av 18 kil skivor. I vårt tidigare arbete kunde vi framkalla hämmande PSCs via direkt stimulering av MNTB axoner i cirka 60% av MOC nervceller57, vilket tyder på att vår framgång här är bara en blygsam minskning med tanke på den långa räckvidden av ingångar och nödvändighet för polysynaptisk krets aktivering. När du förbereder skiva, är det lämpligt att fela på den tjockare sidan som en minskning av synligheten på grund av en tjockare skiva är gynnsam över en oanvändbar sektion som är ofullständig eller saknar kretsanslutning. Alla segment konfiguration eller dimensioner kan användas, så länge som segmentet passar under inspelningen mikroskop objektiv, är tillgänglig genom patch och stimulerande elektroder (eller andra sonder eller utrustning), och är tillräckligt tunn för optiskt-baserade patch-fastspänning vid postynaptic cell av intresse. Snabb, skonsam dissektion och korrekt inkubation och återhämtning villkor är också viktigt att upprätthålla livskraften i kretsen för patch-clamp experiment. Specifika för vår auditiva hjärnstammen förberedelse, hjärnan måste tas bort mycket försiktigt från skallen för att bevara intakt och funktionella auditiva nervrötter. Stretching eller riva nerven kommer att påverka förmågan att stimulera fibrerna och framkalla aktivitet i hörselnerv. På grund av den större volymen av vävnad i skivan, modifiering av traditionella skivningslösningar, temperaturer, inkubation detaljer och perfusion system kan förbättra hälsan hos skivan. Här använder vi små ändringar i vår normala skiva beredning. Dessa inkluderar kortare återhämtning inkubationstider (30 minuter vs 60 minuter) och snabbare flödeshastigheter i skiva kammare perfusion systemet.

När segmentdimensionerna och inkubationsdetaljerna har bestämts, ska funktionen och anslutningen hos olika komponenter i kretsar inom segmentet visas. I vår beredning säkerställer vi att både excitatoriska och hämmande ingångar, hypoteser att ha sitt ursprung i cochlear kärnan med T-stellate och GBC (via MNTB), är närvarande som förväntat. Alternativa stimuleringsmetoder såsom sugelektroder för hörselnerven, eller optisk stimuleringsmetoder såsom optogenetik eller fokal neurotransmittor uncaging kan också öka kretsaktivering eller möjliggöra cell-typ specifik aktivering när den paras ihop med genetisk inriktning av cellens subtyper.

Medan denna skivningsmetod förhoppningsvis kommer att vara användbar för många system och kretsar, några av begränsningarna i standard tunn-skiva avsnitt är också relevanta för denna beredning. Generellt kan det vara svårt att bevara kretsar med mindre planar projektionsmönster, som axoner skulle sannolikt vara avskurna. Aktivera kretsen vid kranialnerverna, som gjort här för att efterlikna hörselgångar, kanske inte är möjligt i många kretsar. Liksom för andra skiva preparat, måste nätverkseffekterna av någon farmakologi beaktas. Till exempel, bad tillämpning av glutamat receptorblockerare att isolera hämmande (GABA- eller glycinergic) eller andra lägen för överföring kan inte användas med polysynaptic krets aktivering när glutamat är nödvändigt för aktivering av nervceller uppströms den lappade mål neuron. Detta är sant i vårt fall som både AN/CN och GBC/MNTB synapser är glutamatergic, därför skulle alla överföring elimineras vid MOC nervceller med bad tillämpning av glutamat receptor blockerare. Dessutom, tillämpning av GABA eller glycin receptorblockerare att eliminera MNTB-MOC synaptiska svar skulle ha den oavsiktliga konsekvensen av att eliminera inneboende hämmande anslutning inom CN som kan forma mönstren av afferenta ingångar till MOC nervceller. Fokal tillämpning av receptorblockerare, med tryckutskjutning eller jontofores, skulle kunna användas för att begränsa farmakologisk funktion.

Slutligen, den viktigaste begränsningen av detta, och någon, in vitro-teknik är att även om denna beredning maximerar aktivering av monaural stigande hörselkretsar, resten av nervsystemet, inklusive perifera receptorer som kodar stimuli, är frånvarande. Detta inkluderar själva snäckan, excitatoriska ingångar från det andraörat 66, commissural CN anslutningar67,68,69,70, och fallande kortikala71,72,73,74 och kollikulär75,76 prognoser och modulatoriska ingångar77,78,79,80 kända för att påverka verksamhet av CN och SOC kärnor. Även om det är möjligt att en del av fallande IC prognoser bibehålls det skulle vara omöjligt att inkludera både när prognoser och commissural CN prognoser på grund av skiva geometri. Därför fokuserar vi på de stigande hörselkretsarna från snäckan med de aktuella experimenten. Den minimala tjockleken på skivan på den tunna sidan minskar också möjligheten att utföra binaural polysynaptiska kretsanalyser, vilket är en fördel med symmetriska tjockaskivorberedningar 10,11. Dessutom kan vi inte stimulera hörselnerven med ljud för att framkalla naturliga mönster av kretsaktivitet. Auditiv nerv svar är tonotopically varierade, skakis, och plast81,82,83,84, vilket gör det svårt att perfekt simulera med vår elektrisk stimulering metod. Detta är en stor nackdel med in vitro-experiment i hörselsystemet. Tonotopic begränsning av vår stimulering är inte möjligt eftersom stimulera hela AN rot kommer att framkalla spikning i AN fibrer över tonotopic gradient. Exakt härma mångfalden av AN fiber svar (dvs. låg vs. hög spontan hastighet fibrer) till en elektrisk stimulans mönster är inte heller möjligt. Det är också svårt att exakt matcha den dynamiska intensiteten kodning av flera AN fibrer vid CN. Vi har dock möjlighet att använda vår elektrofysiologi programvara för att producera en mängd olika stimulering mönster syftar till att efterlikna lämpliga auditiva nerv utgång under olika akustiska stimuli (t.ex. korta, höga ljud, tyst, långvarig ljud eller ljud i bakgrundsljud) genom att variera stimulans frekvensen både mellan elektriska stimulans protokoll och även inom ett individuellt protokoll till ungefärliga kombinerade AN ingångar (modelleras i ref.85). Övervakning MOC utgång under dessa experiment kommer att testa våra hypoteser om vad stimulans mönster kan gynna hämning eller excitation vid MOC nervceller.

Trots de begränsningar som beskrivs ovan, en wedge slice beredningsmetod har fördelar jämfört med in vivo och typiska in vitro-skiva fysiologi metoder och kan användas för att närma in vivo krets aktivering så nära som möjligt i segmentet för celler som är svåra att komma åt. In vivo helcellsinspelningar i hörselhjärnstammen har varit sällsynta på grund av svårigheter att komma åt detta område kirurgiskt86. Istället skivan var beredd att inkludera stigande ingångar till MOC nervceller börjar med hörselnerven, som stimuleras direkt för att aktivera hela monaural stigande krets. Vi visar aktivering av både excitatoriska och hämmande synaptic ingångar, och svar på dessa ingångar ger värdefull information om tidpunkten för synaptic ingångar som de når MOC nervceller. Detta ger en plattform för hög genomströmning experiment där vi kan anställa en stor repertoar av in vitro elektrofysiologi verktyg såsom kalcium eller spänning imaging, signalsubstansen uncaging, och både intracellulära (via plåstret pipetten) och extracellulära (via bad ansökan eller jontofores) farmakologi. Preparatet bör också erbjuda en ökning av genomströmningen över tjocka skiva preparat på grund av bättre synlighet mål nervceller med hjälp av DIC optik, som oskärpa med ökad vävnadstjocklek, särskilt i den ventrala hjärnstammen. Sammantaget ger denna teknik förbättringar i inriktning och genomströmning över in vivo metoder, och bättre möjligheter för kretsanalys än traditionella segment fysiologi metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Denna forskning stöddes av Intramural Research Program av NIH, NIDCD, Z01 DC000091 (CJCW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Experimental Preparations
Agar, powder Fisher Scientific BP1423500 4% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning
AlexaFluor Hydrazide 488 Invitrogen A10436 Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch
Analytical Balance Geneses Scientific (Intramalls) AV114 Weighing chemicals
Double edged razor blade Ted Pella 121-6 Vibratome cutting blade
Kynurenic acid (5g) Sigma Aldrich K3375-5G Slicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping
pH Meter Fisher Scientific (Intramalls) 13-620-451 Solution pH tester
Plastic petri dishes 100mm dia X 20mm Fisher Scientific (Intramalls) 12-556-002 4% Agar Prep
Stirring Hotplate Fisher Scientific (Intramalls) 11-500-150 Heating for 4% Agar preparation
Dissection and Slicing
Biocytin Sigma Aldrich B4261-250MG Chemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)
Dissecting Microscope Amscope SM-1BN For precision dissection during brain removal
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Fine forceps dissection tool
Economy tweezers #3 WPI 501976 Forceps dissection tool
Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm H Fisher Scientific (Intramalls) 08-747E Dissection dish
Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um) Thomas Scientific 1220823 Slice incubation/biocytin application
Leica VT1200S Vibratome Leica 1491200S001 Vibratome for wedge slice sectioning
Mayo scissors Roboz RS-6872 Dissection tool
Single-edged carbon steel blades Fisher Scientific (Intramalls) 12-640 Razor blade for dissection
Specimen disc, orienting Leica 14048142068 Specialized vibratome stage for reproducible tilting
Spoonula FisherSci 14-375-10 Dissection tool
Super Glue Newegg 15187 Used for glueing tissue to vibratome stage
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 91500-09 Dissection tool
Electrophysiology
A1R Upright Confocal Microscope Nikon Instruments Electrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology
Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm long Sutter Instrument BF150-110-10 Patch clamping pipette glass
Electrode Filler MicroFil WPI CMF20G Patch electrode pipette filler
In-line solution heater Warner Instruments (GSAdvantage) SH-27B Slice perfusion system heater
Multi-Micromanipulator Systems Sutter Intruments MPC-200 with MP285 Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement
P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettes Sutter instruments FG-P1000 Patch clamp pipetter puller
Patch-clamp amplifier and Software HEKA EPC-10 / Patchmaster Next Can be any amplifier/software
Recording Chamber Warner Instruments RC26G Slice "bath" during recording
Recording Chamber Harp Warner Instruments 640253 Stablizes slice during electrophysiology recording
Slice Incubation Chamber Custom Build Heated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing
Stimulus isolation unit A.M.P.I. Iso-Flex Stimulus isolation unit for electrophysiology
Syringe 60CC Fischer Scientific (Intramalls) 14-820-11 Electrophysiology perfusion fluid handling
Temperature controller Warner Instruments (GSAdvantage) TC-324C Slice perfusion system temperature controller
Tubing 1/8 OD 1/16 ID Fischer Scientific (Intramalls) 14-171-129 Electrophysiology perfusion fluid handling
Tugsten concentric bipolar microelectrode WPI TM33CCINS Stimulating electrode for electrophysiology
Histology
24 well Plate Fisher Scientific (Intramalls) 12-556006 Histology slice collection and immunostaining
Alexa Fluor 488 Streptavidin Jackson Immuno labs 016-540-084 Secondary antibody for biocytin visualization
Corning Orbital Shaker Sigma CLS6780FP Shaker for immunohistochemistry agitation
Cresyl Violet Acetate Sigma Aldrich (Intramalls) C5042-10G Cellular stain for histology
Disposable Microtome Blades Fisher Scientific 22-210-052 Sliding microtome blade
Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2um Fisher Scientific (Intramalls) 09-740-34A Syringe filter for filling recording pipettes with internal solution
Fluoromount-G Slide Mounting Medium Fisher Scientific OB100-01 Immunohistochemistry fluorescence mounting medium
glass slide staining dish with rack Fisher Scientific (Intramalls) 08-812 Cresyl Violet staining chamber
Microm HM450 Sliding Microtome ThermoFisher 910020 Freezing microtome for histology
Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mm Fisher Scientific (Intramalls) 12-543D Histochemistry slide cover glass
Permount mounting medium Fisher Scientific SP15-100 Cresyl violet section mounting medium
Superfrost Slides Fisher Scientific 22-034980 Histology slides

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Campbell, J. P., Henson, M. M. Olivocochlear neurons in the brainstem of the mouse. Hearing Research. 35 (2-3), 271-274 (1988).
  2. Grothe, B., Sanes, D. H. Synaptic inhibition influences the temporal coding properties of medial superior olivary neurons: An in vitro study. Journal of Neuroscience. 14, 1701-1709 (1994).
  3. Kotak, V. C., Sanes, D. H. Long-lasting inhibitory synaptic depression is age- and calcium-dependent. Journal of Neuroscience. 20 (15), 5820-5826 (2000).
  4. Smith, A. J., Owens, S., Forsythe, I. D. Characterisation of inhibitory and excitatory postsynaptic currents of the rat medial superior olive. The Journal of Physiology. 529 (3), 681-698 (2000).
  5. Scott, L. L., Mathews, P. J., Golding, N. L. Posthearing developmental refinement of temporal processing in principal neurons of the medial superior olive. Journal of Neuroscience. 25 (35), 7887-7895 (2005).
  6. Fischl, M. J., Combs, T. D., Klug, A., Grothe, B., Burger, R. M. Modulation of synaptic input by GABAB receptors improves coincidence detection for computation of sound location. Journal of Physiology. 590 (13), 3047-3066 (2012).
  7. Clause, A., et al. The Precise Temporal Pattern of Prehearing Spontaneous Activity Is Necessary for Tonotopic Map Refinement. Neuron. 82 (4), 822-835 (2014).
  8. Oertel, D. Use of brain slices in the study of the auditory system: Spatial and temporal summation of synaptic inputs in cells in the anteroventral cochlear nucleus of the mouse. Journal of the Acoustical Society of America. 78 (1), 328-333 (1985).
  9. Hermann, J., Pecka, M., Von Gersdorff, H., Grothe, B., Klug, A. Synaptic transmission at the calyx of held under in vivo-like activity levels. Journal of Neurophysiology. 98 (2), 807-820 (2007).
  10. Jercog, P. E., Svirskis, G., Kotak, V. C., Sanes, D. H., Rinzel, J. Asymmetric excitatory synaptic dynamics underlie interaural time difference processing in the auditory system. PLoS Biology. 8 (6), 1000406 (2010).
  11. Roberts, M. T., Seeman, S. C., Golding, N. L. A mechanistic understanding of the role of feedforward inhibition in the mammalian sound localization circuitry. Neuron. 78 (5), 923-935 (2013).
  12. Sinclair, J. L., et al. Sound-evoked activity influences myelination of brainstem axons in the trapezoid body. Journal of Neuroscience. 37 (34), 8239-8255 (2017).
  13. Wang, J., et al. Myelination of the postnatal mouse cochlear nerve at the peripheral-central nervous system transitional zone. Frontiers in Pediatrics. 1, 5-8 (2013).
  14. Long, P., Wan, G., Roberts, M. T., Corfas, G. Myelin development, plasticity, and pathology in the auditory system. Developmental Neurobiology. 78 (2), 80-92 (2018).
  15. Leão, R. M., et al. Presynaptic Na+ channels: Locus, development, and recovery from inactivation at a high-fidelity synapse. Journal of Neuroscience. 25 (14), 3724-3738 (2005).
  16. Fex, J. Efferent Inhibition in the Cochlea Related to Hair-Cell dc Activity: Study of Postsynaptic Activity of the Crossed Olivocochlear Fibres in the Cat. The Journal of the Acoustical Society of America. 41 (3), 666-675 (1967).
  17. Mountain, D. C. Changes in endolymphatic potential and crossed olivocochlear bundle stimulation alter cochlear mechanics. Science. 210 (4465), 71-72 (1980).
  18. Siegel, J. H., Kim, D. O. Efferent neural control of cochlear mechanics? Olivocochlear bundle stimulation affects cochlear biomechanical nonlinearity. Hearing Research. 6 (2), 171-182 (1982).
  19. Guinan, J. J. Cochlear efferent innervation and function. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 18 (5), 447-453 (2010).
  20. Elgoyhen, A. B., Katz, E. The efferent medial olivocochlear-hair cell synapse. Journal of Physiology-Paris. 106 (1-2), 47-56 (2012).
  21. Galambos, R. Suppression of auditory nerve activity by stimulation of efferent fibers to cochlea. Journal of Neurophysiology. 19 (5), 424-437 (1956).
  22. Desmedt, J. E. Auditory-Evoked Potentials from Cochlea to Cortex as Influenced by Activation of the Efferent OlivoCochlear Bundle. Journal of the Acoustical Society of America. 34 (9), 1478-1496 (1962).
  23. Wiederhold, M. L., Kiang, N. Y. S. Effects of Electric Stimulation of the Crossed Olivocochlear Bundle on Single Auditory-Nerve Fibers in the Cat. The Journal of the Acoustical Society of America. 48 (4), 950-965 (1970).
  24. Wiederhold, M. L., Peake, W. T. Efferent Inhibition of Auditory-Nerve Responses: Dependence on Acoustic-Stimulus Parameters. Journal of the Acoustical Society of America. 40 (6), 1427-1430 (1966).
  25. Geisler, D. C. Hypothesis on the function of the crossed olivocochlear bundle. Journal of the Acoustical Society of America. 56 (6), 1908-1909 (1974).
  26. Guinan, J. J., Gifford, M. L. Effects of electrical stimulation of efferent olivocochlear neurons on cat auditory-nerve fibers. III. Tuning curves and thresholds at CF. Hearing Research. 37 (1), 29-45 (1988).
  27. Rajan, R. Involvement of cochlear efferent pathways in protective effects elicited with binaural loud sound exposure in cats. Journal of Neurophysiology. 74 (2), 582-597 (1995).
  28. Rajan, R. Effect of electrical stimulation of the crossed olivocochlear bundle on temporary threshold shifts in auditory sensitivity. II. Dependence on the level of temporary threshold shifts. Journal of Neurophysiology. 60 (2), 569-579 (1988).
  29. Reiter, E. R., Liberman, M. C. Efferent-mediated protection from acoustic overexposure: Relation to slow effects of olivocochlear stimulation. Journal of Neurophysiology. 73 (2), 506-514 (1995).
  30. Taranda, J., et al. A point mutation in the hair cell nicotinic cholinergic receptor prolongs cochlear inhibition and enhances noise protection. PLoS Biology. 7 (1), 1000018 (2009).
  31. Maison, S. F., Usubuchi, H., Liberman, C. M. Efferent feedback minimizes cochlear neuropathy from moderate noise exposure. Journal of Neuroscience. 33 (13), 5542-5552 (2013).
  32. Tong, H., et al. Protection from noise-induced hearing loss by Kv2. 2 potassium currents in the central medial olivocochlear system. Journal of Neuroscience. 33 (21), 9113-9121 (2013).
  33. Boero, L. E., et al. Enhancement of the medial olivocochlear system prevents hidden hearing loss. Journal of Neuroscience. 38 (34), 7440-7451 (2018).
  34. Spirou, G. A., Brownell, W. E., Zidanic, M. Recordings from cat trapezoid body and HRP labeling of globular bushy cell axons. Journal of Neurophysiology. 63 (5), 1169-1190 (1990).
  35. von Gersdorff, H., Borst, J. G. G. Short-term plasticity at the calyx of held. Nature Reviews Neuroscience. 3 (1), 53-64 (2002).
  36. Smith, P. H., Joris, P. X., Carney, L. H., Yin, T. C. T. Projections of physiologically characterized globular bushy cell axons from the cochlear nucleus of the cat. Journal of Comparative Neurology. 304 (3), 387-407 (1991).
  37. Kuwabara, N., DiCaprio, R. A., Zook, J. M. Afferents to the medial nucleus of the trapezoid body and their collateral projections. Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 684-706 (1991).
  38. Friauf, E., Ostwald, J. Divergent projections of physiologically characterized rat ventral cochlear nucleus neurons as shown by intra-axonal injection of horseradish peroxidase. Experimental Brain Research. 73 (2), 263-284 (1988).
  39. De Venecia, R. K., Liberman, M. C., Guinan, J. J., Brown, M. C. Medial olivocochlear reflex interneurons are located in the posteroventral cochlear nucleus: A kainic acid lesion study in guinea pigs. Journal of Comparative Neurology. 487 (4), 345-360 (2005).
  40. Darrow, K. N., Benson, T. E., Brown, M. C. Planar multipolar cells in the cochlear nucleus project to medial olivocochlear neurons in mouse. Journal of Comparative Neurology. 520 (7), 1365-1375 (2012).
  41. Brown, M. C., De Venecia, R. K., Guinan, J. J. Responses of medial olivocochlear neurons: Specifying the central pathways of the medial olivocochlear reflex. Experimental Brain Research. 153 (4), 491-498 (2003).
  42. Wang, Y., Manis, P. B. Synaptic transmission at the cochlear nucleus endbulb synapse during age-related hearing loss in mice. Journal of Neurophysiology. 94 (3), 1814-1824 (2005).
  43. Golding, N. L., Robertson, D., Oertel, D. Recordings from slices indicate that octopus cells of the cochlear nucleus detect coincident firing of auditory nerve fibers with temporal precision. Journal of Neuroscience. 15 (4), 3138-3153 (1995).
  44. Ferragamo, M. J., Golding, N. L., Oertel, D. Synaptic inputs to stellate cells in the ventral cochlear nucleus. Journal of Neurophysiology. 79 (1), 51-63 (1998).
  45. Oertel, D. Synaptic responses and electrical properties of cells in brain slices of the mouse anteroventral cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 3 (10), 2043-2053 (1983).
  46. Xie, R., Manis, P. B. Radiate and planar multipolar neurons of the mouse anteroventral cochlear nucleus: Intrinsic excitability and characterization of their auditory nerve input. Frontiers in Neural Circuits. 11, 1-17 (2017).
  47. Wu, S., Oertel, D. Inhibitory circuitry in the ventral cochlear nucleus is probably mediated by glycine. The Journal of Neuroscience. 6 (9), 2691-2706 (1986).
  48. Xie, R., Manis, P. B. Target-specific IPSC kinetics promote temporal processing in auditory parallel pathways. Journal of Neuroscience. 33 (4), 1598-1614 (2013).
  49. Wickesberg, R. E., Oertel, D. Delayed, frequency-specific inhibition in the cochlear nuclei of mice: A mechanism for monaural echo suppression. Journal of Neuroscience. 10 (6), 1762-1768 (1990).
  50. Campagnola, L., Manis, P. B. A map of functional synaptic connectivity in the mouse anteroventral cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2214-2230 (2014).
  51. Doucet, J. R., Ryugo, D. K. Projections from the ventral cochlear nucleus to the dorsal cochlear nucleus in rats. Journal of Comparative Neurology. 385 (2), 245-264 (1997).
  52. Kopp-Scheinpflug, C., et al. The sound of silence: Ionic mechanisms encoding sound termination. Neuron. 71 (5), 911-925 (2011).
  53. Alamilla, J., Gillespie, D. C. Maturation of Calcium-Dependent GABA, Glycine, and Glutamate Release in the Glycinergic MNTB-LSO Pathway. PLoS One. 8 (9), 0075688 (2013).
  54. Spangler, K. M., Warr, W. B., Henkel, C. K. The projections of principal cells of the medial nucleus of the trapezoid body in the cat. Journal of Comparative Neurology. 238 (3), 249-262 (1985).
  55. Kramer, F., et al. Inhibitory glycinergic neurotransmission in the mammalian auditory brainstem upon prolonged stimulation: Short-term plasticity and synaptic reliability. Frontiers in Neural Circuits. 8, 1-22 (2014).
  56. Roberts, M. T., Seeman, S. C., Golding, N. L. The relative contributions of MNTB and LNTB neurons to inhibition in the medial superior olive assessed through single and paired recordings. Frontiers in Neural Circuits. 8, 1-14 (2014).
  57. Torres Cadenas, L., Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. Synaptic Inhibition of Medial Olivocochlear Efferent Neurons by Neurons of the Medial Nucleus of the Trapezoid Body. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 40 (3), 509-525 (2020).
  58. Brown, M. C., Mukerji, S., Drottar, M., Windsor, A. M., Lee, D. J. Identification of inputs to olivocochlear neurons using transneuronal labeling with pseudorabies virus (PRV). JARO - Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (5), 703-717 (2013).
  59. Morest, D. K. The collateral system of the medial nucleus of the trapezoid body of the cat, its neuronal architecture and relation to the olivo-cochlear bundle. Brain Research. 9 (2), 288-311 (1968).
  60. Warr, B. W. Fiber degeneration following lesions in the multipolar and globular cell areas in the ventral cochlear nucleus of the cat. Brain Research. 40 (2), 247-270 (1972).
  61. Osen, K. K. Cytoarchitecture of the cochlear nuclei in the cat. Journal of Comparative Neurology. 136 (4), 453-483 (1969).
  62. Cant, N. B., Morest, D. K. The bushy cells in the anteroventral cochlear nucleus of the cat. A study with the electron microscope. Neuroscience. 4 (12), 1925-1945 (1979).
  63. Cant, N. B., Morest, D. K. Organization of the neurons in the anterior division of the anteroventral cochlear nucleus of the cat. Light-microscopic observations. Neuroscience. 4 (12), 1909-1923 (1979).
  64. Lauer, A. M., Connelly, C. J., Graham, H., Ryugo, D. K. Morphological Characterization of Bushy Cells and Their Inputs in the Laboratory Mouse (Mus musculus) Anteroventral Cochlear Nucleus. PLoS One. 8 (8), 1-16 (2013).
  65. Harrison, J. M., Warr, W. B. A study of the cochlear nuclei and ascending auditory pathways of the medulla. Journal of Comparative Neurology. 119 (3), 341-379 (1962).
  66. Robertson, D., Gummer, M. Physiological and morphological characterization of efferent neurones in the guinea pig cochlea. Hearing Research. 20 (1), 63-77 (1985).
  67. Bledsoe, S. C., et al. Ventral cochlear nucleus responses to contralateral sound are mediated by commissural and olivocochlear pathways. Journal of Neurophysiology. 102 (2), 886-900 (2009).
  68. Zhou, J., Zeng, C., Cui, Y., Shore, S. Vesicular glutamate transporter 2 is associated with the cochlear nucleus commissural pathway. JARO - Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 11 (4), 675-687 (2010).
  69. Kuenzel, T. Modulatory influences on time-coding neurons in the ventral cochlear nucleus. Hearing Research. 384, 107824 (2019).
  70. Cant, N. B., Gaston, K. C. Pathways connecting the right and left cochlear nuclei. Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 313-326 (1982).
  71. Feliciano, M., Saldana, E., Mugnaini, E. Direct projections from the rat primary auditory neocortex to nucleus sagulum, paralemniscal regions, superior olivary complex and cochlear nuclei. Auditory Neuroscience. 1 (3), 287-308 (1995).
  72. Mulders, W. H. A. M., Robertson, D. Evidence for direct cortical innervation of medial olivocochlear neurones in rats. Hearing Research. 144 (1-2), 65-72 (2000).
  73. Schofield, B. R., Coomes, D. L. Pathways from auditory cortex to the cochlear nucleus in guinea pigs. Hearing Research. 216-217 (1-2), 81-89 (2006).
  74. Meltzer, N. E., Ryugo, D. K. Projections from auditory cortex to cochlear nucleus: A comparative analysis of rat and mouse. Anatomical Record - Part A Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 288 (4), 397-408 (2006).
  75. Schofield, B. R., Cant, N. B. Descending auditory pathways: Projections from the inferior colliculus contact superior olivary cells that project bilaterally to the cochlear nuclei. Journal of Comparative Neurology. 409 (2), 210-223 (1999).
  76. Thompson, A. M., Schofield, B. R. Afferent projections of the superior olivary complex. Microscopy Research and Technique. 51 (4), 330-354 (2000).
  77. Woods, C. I., Azeredo, W. J. Noradrenergic and serotonergic projections to the superior olive: Potential for modulation of olivocochlear neurons. Brain Research. 836 (1-2), 9-18 (1999).
  78. Mulders, W. H. A. M., Robertson, D. Morphological relationships of peptidergic and noradrenergic nerve terminals to olivocochlear neurones in the rat. Hearing Research. 144 (1-2), 53-64 (2000).
  79. Thompson, A. M., Thompson, G. C. Light microscopic evidence of serotoninergic projections to olivocochlear neurons in the bush baby (Otolemur garnettii). Brain Research. 695 (2), 263-266 (1995).
  80. Wang, X., Robertson, D. Substance P-induced inward current in identified auditory efferent neurons in rat brain stem slices. Journal of Neurophysiology. 80 (1), 218-229 (1998).
  81. Taberner, A. M., Liberman, M. C. Response properties of single auditory nerve fibers in the mouse. Journal of Neurophysiology. 93 (1), 557-569 (2005).
  82. Galambos, R., Davis, H. The response of single auditory-nerve stimulation. Journal of Neurophysiology. 6 (1), 39-57 (1943).
  83. Sachs, M. B., Abbas, P. J. Rate versus level functions for auditory-nerve fibers in cats: Tone-burst stimuli. Journal of the Acoustical Society of America. 56 (6), 1835-1847 (1974).
  84. Zhang, X., Heinz, M. G., Bruce, I. C., Carney, L. H. A phenomenological model for the responses of auditory-nerve fibers: I. Nonlinear tuning with compression and suppression. The Journal of the Acoustical Society of America. 109 (2), 648-670 (2001).
  85. Zilany, M. S. A., Bruce, I. C., Carney, L. H. Updated parameters and expanded simulation options for a model of the auditory periphery. The Journal of the Acoustical Society of America. 135 (1), 283-286 (2014).
  86. Franken, T. P., Smith, P. H., Joris, P. X. In vivo whole-cell recordings combined with electron microscopy reveal unexpected morphological and physiological properties in the lateral nucleus of the trapezoid body in the auditory brainstem. Frontiers in Neural Circuits. 10, 1-20 (2016).

Tags

Neurovetenskap mediala olivocochlear nervceller in vitro-skiva elektrofysiologi synaptisk integration hörselnerven hörselhjärnstam cochlear kärnan hämmande neurotransmission
In Vitro Wedge Slice Förberedelse för Härma In Vivo Neuronal Circuit Connectivity
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. In… More

Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity. J. Vis. Exp. (162), e61664, doi:10.3791/61664 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter