Summary
Aquí describimos una metodología de detección CRISPR/Cas9 rápida y directa in vivo utilizando inyecciones lentivirales embrionarias de tero guiadas por ultrasonido para evaluar simultáneamente las funciones de varios genes en la piel y la cavidad oral de ratones inmunocompetentntes.
Abstract
Los modelos de ratón modificados genéticamente (GEMM) han sido fundamentales para evaluar la función génica, modelar enfermedades humanas y servir como modelo preclínico para evaluar las vías terapéuticas. Sin embargo, su naturaleza de tiempo, mano de obra y costo intensivo limita su utilidad para el análisis sistemático de la función génica. Los recientes avances en las tecnologías de edición del genoma superan esas limitaciones y permiten la rápida generación de perturbaciones genéticas específicas directamente dentro de órganos específicos del ratón de una manera multiplexada y rápida. Aquí, describimos un método basado en CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) para generar miles de clones genéticos knock-out dentro del epitelio de la piel y la cavidad oral de ratones, y proporcionar un protocolo que detalle los pasos necesarios para realizar una pantalla CRISPR directa in vivo para los genes supresores tumorales. Este enfoque se puede aplicar a otros órganos u otras tecnologías CRISPR/Cas9 como la activación CRISPR o la inactivación CRISPR para estudiar la función biológica de los genes durante la homeostasis tisular o en diversos entornos de la enfermedad.
Introduction
Uno de los desafíos para la investigación del cáncer en la era post-genómica es extraer la gran cantidad de datos del genoma para mutaciones genéticas causales e identificar nodos en la red genética que pueden ser dirigidos terapéuticamente. Si bien los análisis bioinformáticas han ayudado enormemente hacia estos objetivos, establecer modelos eficientes in vitro e in vivo es un requisito previo para descifrar la complejidad de los sistemas biológicos y los estados de enfermedades y para permitir el desarrollo de fármacos. Si bien los modelos convencionales de ratón transgénico se han utilizado ampliamente para estudios genéticos in vivo sobre el cáncer, su naturaleza intensiva en costos, tiempo y mano de obra ha prohibido en gran medida el análisis sistemático de los cientos de genes cancerosos putativos desentrañados por la genómica moderna. Para superar este cuello de botella, combinamos una tecnología de edición genética1,2 con una tecnología de edición de genes CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)3 para inducir y estudiar simultáneamente mutaciones de pérdida de función de cientos de genes en la piel y cavidad oral de un solo ratón.
La metodología descrita aquí utiliza inyecciones guiadas por ultrasonido de lentivirus de ingeniería en la cavidad amniótica de embriones de ratón vivos en el día embrionario E9.5. La carga lentiviral que contiene componentes CRISPR/Cas9 transduce el ectodermo superficial de una sola capa, que más tarde da lugar al epitelio de la piel y la cavidad oral. La piel se compone de una epidermis externa, seguida de membrana y dermis del sótano. Epidermis es un epitelio estratificado compuesto por una capa interior basal, que mantiene contacto con la membrana del sótano y tiene capacidad proliferativa y de células madre. La capa basal da lugar a las capas diferenciadas anteriores, como las capas de córneo espinosas, granulares y estrato2,4. Estudios de rastreo de linaje muestran que este método crispr/cas9 in vivo directo manipula genéticamente las células madre residentes en tejidos dentro de la capa basal que persisten a lo largo de la edad adulta. Como el lentivirus se puede valorar para transducir el ectodermo superficial E9.5 a densidad clonal, este método se puede utilizar para generar ratones mosaico que albergan miles de clones noqueantes genéticos discretos. A continuación, la secuenciación de próxima generación se puede utilizar para analizar el efecto de la ablación genética mediada por CRISPR/Cas9 dentro de esos clones de forma multiplexada5.
Recientemente utilizamos este método para evaluar la función de 484 genes que muestran mutaciones recurrentes en carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello humano (HNSCC)5. El HNSCC es un cáncer devastador con una alta tasa de mortalidad del 40-50% y es el6º cáncer más común en todo el mundo6. El HNSCC surge en revestimientos mucosos de las vías respiratorias superiores o cavidad oral y se asocian con el consumo de tabaco y alcohol o la infección por el virus del papiloma humano (VPH). Carcinoma de células escamosas cutáneas (SCC) son tumores de piel y representan el segundo cáncer más común en los seres humanos7. Cutánea SCC y HNSCC son histológica y molecularmente muy similares, con un alto porcentaje de casos que exhiben alteración en TP53, PIK3CA, NOTCH1 y HRAS8. Si bien sólo hay un puñado de genes mutados a alta frecuencia, hay cientos de genes que se encuentran mutados a baja frecuencia (< 5%), un fenómeno comúnmente conocido como la distribución de cola larga. Como la mayoría de los genes de cola larga carecen de validación biológica o clínica, utilizamos esta tecnología de detección CRISPR in vivo para modelar la pérdida de la función de estos genes en ratones propensos a tumores con mutaciones sensibilizantes en p53, Pik3ca o Hras e identificamos varios genes supresores tumorales novedosos que cooperan con p53, Pik3ca o Hras para desencadenar el desarrollo tumoral5.
Aquí, describimos un protocolo detallado para generar bibliotecas de sgRNA lentiviral CRISPR lentiviral multiplexed y realizar pantallas noqueadas del gen CRISPR/Cas9 en el ectodermo de la superficie del ratón. Cabe destacar que esta metodología se puede adaptar para incorporar otras tecnologías de manipulación genética como la activación CRISPR (CRISPRa) y la inactivación CRISPR (CRISPRi) o modificarse para dirigirse a otros sistemas de órganos del ratón para estudiar las funciones genéticas.
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Protocol
Este protocolo fue aprobado y realizado de acuerdo con la UACUC de la Universidad de Toronto.
1. Diseño y clonación de bibliotecas CRISPR agrupadas
- Seleccione 4-5 sgRNAs dirigidos a genes de ratón de interés de recursos como el diseñador de esgRNA de Broad Institute (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) o el servidor CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no). Seleccione un número igual de sgRNAs no dirigidos de, por ejemplo, Sanjana y otros9 para generar una biblioteca de gRNA de controles no dirigidos de igual tamaño.
- Mientras construye las bibliotecas de sgRNA, asegúrese de que haya suficiente cobertura para cada sgRNA en el sistema de órganos dirigido. Para la piel del ratón, la epidermis en E9.5 es una sola capa que contiene ~ 150,000 células, la mayoría de las cuales tienen capacidad de células madre4. Si la transducción lenti-viral resulta en infectividad del 15-20%, sólo 18.000-24.000 células se transducirán a E9,5. Escale el experimento en consecuencia.
- Para la clonación y amplificación de estas bibliotecas de sgRNA, añada sitios de restricción de enzimas BsmBI, así como secuencias de ADN de unión de imprimación a 5' y 3' final del sgRNA y ordene los oligos de longitud completa resultantes como chip de oligonucleótido agrupado (Figura 1A).
- Para multiplexar bibliotecas diferentes en un chip, agregue secuencias de imprimación específicas de la biblioteca.
- Utilizando los pares de imprimación adecuados, amplifica cada biblioteca por separado del chip de oligo agrupado. En un tubo PCR, mezcle 25 μL de mezcla maestra de polimerasa 2x, 20 μL de agua libre DNase/RNase, 5 ng de ADN de chip de oligo, 2,5 μL de imprimación delantera adecuada y 2,5 μL de imprimación inversa adecuada. Utilice 12-15 ciclos y amplíe con desnaturalización de 98 °C, recocido de 63-67 °C, parámetros de extensión de 72 °C para cada ciclo en la máquina PCR.
- Ejecute el producto PCR en un gel de agarose del 2,5% y purifique el producto PCR ~100 bp usando un kit de limpieza de ADN en gel.
- Prepare el plásmido de la columna vertebral.
- Digest 5 μg de la Cre-recombinasa que contiene plásmido pLKO-Cre stuffer v3 con 2 μL de BsmBI en mezcla de reacción de 50 μL durante 1 h a 55 °C, seguido de 1 μL de incubación alcalina de fosfatasa durante 45 minutos a 37 °C de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
NOTA: Cre-recombinasa que contiene plásmido pLKO-Cre stuffer v3 es un plásmido basado en lenti-viral que contiene enzima Cre-recombinasa para eliminar el casete Lox-Stop-Lox en células de ratón y también tiene un promotor U6 para impulsar la expresión de sgRNA y tracrRNA. Una versión con Cas9 y sin Cas9 se puede utilizar y disponible en Addgene #158030 y #158031. - Ejecute el ADN digerido en un gel de agarose del 1% y purifique la banda vectorial linealizada de 7 kb usando un kit de limpieza de ADN en gel. Cabe destacar que una banda de relleno de 2 kb también debe ser visible indicando un resumen exitoso.
- Digest 5 μg de la Cre-recombinasa que contiene plásmido pLKO-Cre stuffer v3 con 2 μL de BsmBI en mezcla de reacción de 50 μL durante 1 h a 55 °C, seguido de 1 μL de incubación alcalina de fosfatasa durante 45 minutos a 37 °C de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Configure la reacción de ligadura para generar una biblioteca de plásmidos de SgRNA.
- Mezclar 1 μg de vector purificado y 30 ng de inserción PCR purificada con 2 μL de BsmBI, 5 μL de ligasa de ADN T4, 10 μM ATP y 1x buffer específico de BsmBI. Incubar la mezcla de ligadura durante la noche a 37 °C. Utilice un tubo adicional que contenga todos los materiales anteriores, excepto el inserto PCR como control negativo.
- Al día siguiente por la mañana, purificar la mezcla de ligadura utilizando el kit de limpieza de oligo y elute en 7 μL de agua libre RNase /DNase.
- Electroporate la biblioteca en células competentes.
- Añadir 2 μL de biblioteca de sgRNA eluted o mezcla de ligadura de control negativo a 25 μL de células electrocompetentntes descongeladas en cubetas preenfriadas (1,0 mm) sobre hielo. Electropolar siguiendo el protocolo del fabricante (10 μF, 600 Ohmios, 1800 Voltios). A la cubeta añadir 975 μL de medio de recuperación (o medio SOC) dentro de 10 s del pulso.
- Transfiera las células electroporadas a un tubo de cultivo e incuba durante una hora a 37 °C en una incubadora de agitación bacteriana a 300 rpm.
- Calcule la eficiencia de la transformación y la cobertura de la biblioteca por sgRNA.
- Prepare una dilución de 100 veces transfiriendo 10 μL de la reacción de transformación que contiene células electroporadas con biblioteca de SgRNA o ligadura de control negativo a 990 μL de medio de recuperación y mezcle bien.
- Placa 10 μL de la mezcla de transformación diluida en una placa de agar pre-calentada de 10 cm LB + ampicilina (100 μg/L). Esto resulta en una dilución de 10.000 veces de los transformadores y utilizar esta placa para calcular la eficiencia de transformación. Realizar la incubación de las placas a 30 °C durante 14-16 h.
- Coloque el resto de la reacción de transformación extendiendo 100 μL de células recuperadas en cada placa de un total de 10 placas de agar LB + ampicilina pre-calentadas. Incubar las placas de 14-16 h a 30 °C. Cabe destacar que el crecimiento a 30 °C minimiza la recombinación entre las dos repeticiones de terminales largos dentro del plásmido viral.
- Para evaluar el éxito de clonación, calcule la eficiencia de transformación. Contar el número de colonias en la placa de dilución que contienen transformadores de la biblioteca de sgRNA o ligadura de control negativo (placas de 10 cm, paso 1.8.2). La mezcla de control negativo no debe tener ninguna o muy pocas colonias. Para obtener el número total de colonias, multiplique el número de colonias en 10.000.
NOTA: El número total de colonias contabilizadas representa una cobertura de biblioteca que debe ser mínima de 200x colonias por sgRNA.- Asegúrese de que una biblioteca con 2000 sgRNAs tendrá al menos 400.000 colonias. En caso de que no haya suficientes colonias, repita y configure más electroporación.
- Control de calidad: De la placa de dilución, elija 20 colonias y agregue cada colonia a un tubo de cultivo individual que contenga 3 ml de medios LB + ampicilina. Incuba los 20 tubos durante la noche a 30 °C sacudiendo a 250 rpm. Purifique el ADN plásmido usando un kit de mini-preparación de acuerdo con las instrucciones del fabricante y la secuencia de Sanger todas las 20 muestras de ADN plásmido para verificar que cada muestra tiene una secuencia de SgRNA diferente utilizando la imprimación U6 (5'-GAG GGC CTA TTT CCC ATG ATT CC-3').
- Cosecha las colonias de cada placa de 15 cm.
- Agregue 7 ml de media LB, luego raspe las colonias de la placa lb agar con un esparcidor celular. Utilice una pipeta de 10 ml para transferir las células a un matraz cónico estéril de 2 L. Repita para todas las placas y bacterias de la piscina en el matraz de 2 L. Incubar el matraz durante 2-3 h temblando a 30 °C. Centrífuga la cultura y recoge el pellet.
- Purifique el ADN plásmido utilizando un kit de purificación maxi-plásmido.
- Control de calidad adicional: Utilice 1 ng de ADN plásmido de biblioteca de sgRNA maxi-prep y ejecute una reacción PCR utilizando imprimaciones de secuenciación de próxima generación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La representación de todos los sgRNAs de la biblioteca se puede verificar mediante una plataforma de secuenciación profunda.
2. Producción de lentivirus de alto valor adecuado para la transducción in vivo
NOTA: Realice todos los pasos de esta sección del protocolo en una instalación BSL2+ en un gabinete de bioseguridad clase II, tipo A2. 293FT y especialmente las células de envasado 293NT permiten una mayor producción de virus. Utilice células heK293T, 293FT o 293NT de paso bajo ( 3. Cirugía e inyección guiadas por ultra-sonido NOTA: Esta tecnología fue adaptada de4,11. La microinjeción orientada a la transducción del epitelio superficial debe realizarse en el día embrionario E9.5, cuando el ectodermo superficial consiste en una sola capa y antes de la formación del periderm a partir del E10, lo que evitaría la transducción de esta capa basal. Preferiblemente instalar ratones el viernes, por lo que el primer día posible con embriones E9.5 es el lunes siguiente. Utilice ratones Rosa26-Lox-STOP-LOX-Cas9-GFP (#024857 de Laboratorio Jackson) para una eficiencia crispr/cas9 óptima12. 4. Procedimiento de secuenciación profunda
NOTA: Utilice siempre una botella de DMEM sin abrir o muy recientemente abierta para la transfección, ya que el pH en este paso es crítico, y DMEM se vuelve más básico con el tiempo una vez abierto.
NOTA: La suspensión viral resultante debe producir una concentración aproximada de 2.000 veces y la solución de virus resultante y debe tener un valor viral de 107-109,lo que es lo suficientemente bueno para más de 100 cirugías E9.5 descritas a continuación.
NOTA: La comparación entre la suspensión viral concentrada con su sobrenadante viral no concentrado permitirá estimar el éxito de (1) la producción viral, así como (2) la concentración viral. Alternativamente, el valor del valor viral se puede estimar utilizando el método qRT-PCR10. La producción y concentración a gran escala de lentivirus también se puede realizar utilizando una concentración de dos pasos con una concentración de cartucho seguida de ultracentrifugación como se describió anteriormente2.
NOTA: No exceda de 30 minutos de anestesia, ya que las presas embarazadas son mucho más propensas a abortar sus embriones más allá de ese tiempo. Un cirujano experimentado puede inyectar hasta 12 embriones dentro de una cirugía de 30 minutos.
NOTA: Mientras se realiza una guía ultranóstiva en cirugías de útero, se debe tener el máximo cuidado de mantener un ambiente limpio, mantener la esterilidad tanto como sea posible y evitar posibles contaminantes. Si se debe hacer más de una cirugía el mismo día, es importante esterilizar los instrumentos de disección usando un esterilizador de cuentas y limpiar otros aparatos que encuentran tejido del ratón limpio con etanol. Esto aumenta en gran medida la mayor supervivencia de los embriones después de la cirugía. La tasa de supervivencia para el método de cirugía descrito aquí es consistentemente entre 80-100%.
NOTA: Los ratones son mejor identificados usando microscopio fluorescente hasta el día 3 postnatal antes de que el cabello comience a crecer.
NOTA: Es importante generar una muestra de referencia que permita calcular los cambios de pliegue de sgRNA a lo largo del tiempo. Embriones transducidos 3 días después de la infección o células transducidas (ver paso 2. 6) pueden servir como muestra de referencia para determinar la representación del ESN en la biblioteca original.
NOTA: Configure la reacción de PCR de código de barras en un área dedicada separada del laboratorio o en una campana de cultivo de tejidos que se limpia a fondo mediante el borrado del ADN para evitar cualquier contaminación. Ejecute el control negativo para cada placa PCR con agua como plantilla para asegurarse de que no haya contaminación.
NOTA: El paso de preamplificación solo es necesario para la amplificación de un tejido transducido complejo. Si amplificar un solo tumor que presumiblemente se desarrolló forma una célula clonal y por lo tanto contiene un solo esgRNA, uno puede saltarse el PCR1 de preamplificación y proceder inmediatamente con PCR2.
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Representative Results
La Figura 1A muestra el diseño de los oligonucleótidos para multiplexar varias bibliotecas CRISPR personalizadas de una manera rentable en un solo chip de oligo de 12k o 92k. Una vez seleccionados los sgRNAs (color azul codificado), los oligonucleótidos están diseñados con sitios de restricción (BsmBI de color naranja) y pares de imprimación PCR específicos de la biblioteca (codificados en color verde). Varias bibliotecas se pueden diseñar mediante el uso de una combinación única de pares de imprimación para multiplexar en un solo chip de oligo. Cuando pcr amplificar las bibliotecas utilizando un par de imprimación PCR específico, siempre incluya un control negativo solo con agua y ejecute todas las reacciones en un gel de agarose. El carril de control negativo no debe tener ninguna banda a 100 bp, mientras que el carril amplificado de la biblioteca debe tener una sola banda de 100 bp. Si no hay banda, asegúrese de que el par de imprimación PCR esté seleccionado correctamente. La Figura 1B muestra el paso de control de calidad de la biblioteca clonada y el procedimiento de producción y concentración viral. Se debe tener cuidado de preservar la representación igualitaria de los sgRNAs de la clonación hasta la transducción. Las lecturas de secuenciación de próxima generación del ADN amplificado de PCR a partir de células transducidas por la biblioteca plasmoide e vílticas de la biblioteca lenti-viral deben mostrar una alta correlación. Cualquier desviación debe analizarse cuidadosamente para examinar si la representación se pierde antes o después de la preparación del virus lenti. Si el sgRNA se lee a partir de ADN plásmido no muestra la misma representación de los sgRNAs, entonces el procedimiento de preparación y concentración viral debe repetirse con cuidado. Si la pérdida de representación de SgRNA igual se produjo en el ADN plásmido, entonces todo el procedimiento de clonación debe repetirse incluyendo la amplificación de PCR de bibliotecas desde el chip de oligo con ciclos de amplificación reducidos. El éxito de la proyección de la biblioteca CRISPR depende críticamente de la representación igualitaria de los sgRNAs presentes en la biblioteca.
La Figura 2 muestra la microinyección guiada por ultrasonido creada para manipular los embriones E9.5 en ratones embarazadas. Toda la configuración se coloca bajo un gabinete de nivel ii de bioseguridad para mantener el estado estéril de todo el procedimiento y evitar cualquier infección del ratón embarazada debido a los procedimientos quirúrgicos. Se debe tener cuidado para evitar presionar los cuernos uterinos durante la inyección. La aguja debe ser muy afilada, de modo que la herida en la pared uterina y la membrana amniótica sea mínima.
La Figura 3 muestra los resultados de la inyección guiada por ultra-sonido de los cachorros de ratón confeti de virus lenti portadores de Cre-recombinase en E9.5 Lox-stop-Lox (LSL) Cachorros de ratón confeti en el día postnatal (P)0. El valor de los títulos virales se puede ajustar para obtener una cobertura de transducción adecuada de la epidermis. Mientras que el alto valor del virus daría lugar a una mayor cobertura de la piel del ratón, también resultaría en la transducción de múltiples sgRNAs en la misma célula potencialmente confundiendo los resultados. Para reducir múltiples transducciones de una sola célula, la tasa de infección debe mantenerse <20%.
La Figura 4 muestra lecturas de secuenciación de próxima generación de ADN amplificado de PCR a partir de células transducidas de la biblioteca plasmoide e víntica y también lee de 4 tumores representativos. Las guías de esgRNA dirigidas a Adam10 y Ripk4 se enriquecen en las muestras tumorales (triángulos y diamantes) en comparación con la presentación de sgRNA en la piscina de plásmidos o células infectadas. Adam10 y Ripk4 funcionan como supresores tumorales5. Varios cientos de tumores pueden ser multiplexados mediante la asignación de códigos de barras únicos a cada muestra y secuenciados profundos como se describe en el protocolo.
Figura 1: Clonación de la biblioteca CRISPR dirigida. (A) Esquema que representa el diseño de oligonucleótidos para el chip de oligodo personalizado de 12 k o 92 k. Se agregaron sitios de restricción BsmBI (u otros sitios de restricción compatibles) (color naranja codificado y subrayado) a cada lado del sgRNA. Los cabezales de flecha indican el sitio de corte BsmBI. Para cada biblioteca, se agregaron un par único de imprimaciones PCR (color verde, marrón y púrpura codificados), de modo que se puede amplificar específicamente usando PCR desde el chip agrupado. Varias bibliotecas personalizadas se pueden multiplexar hasta oligos de 12k o 92k. (B) Gráfico que muestra la representación del SgRNA de una biblioteca CRISPR en ADN plásmido frente al ADN de las células transducidas con la misma biblioteca lentiviral. Cada punto representa una guía. La representación completa se mantuvo después de la transducción con cierta correlación en abundancia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imagen de la configuración de microinyección guiada por ultrasonido. (A) El ratón que transportaba embriones E9.5 fue anestesiado y colocado en una plataforma calentada con el útero expuesto en una cámara de placa Petri modificada llena de PBS (estabilizada por cuatro arcillas de modelado). El caucho semi-redondo azul sostenía el útero que contenía embriones y la aguja de inyección del microinyector se coloca en el lado derecho. La cabeza de la ecografía se montó en la parte superior transmitiendo la imagen en vivo al monitor detrás con la cabeza de la aguja visible. B) Imagen de primer plano ultranoro de un embrión E9.5. La biblioteca lentiviral fue inyectada con la aguja (vista en el lado derecho) en la cavidad amniótica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Transducción exitosa del epitelio superficial en ratone. Imágenes fluorescentes de todo el cuerpo, cavidad oral, lengua y paladar de ratones recién nacidos con cre-reportera LSL-Confetti transducidos con Cre lentivirus (Entrada: imágenes de luz blanca correspondientes). Barras de escala = 500 μm Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Secuenciación profunda de muestras tumorales. Gráfico que muestra la representación del SgRNA de una biblioteca CRISPR en ADN plásmido frente al ADN de células transducidas con la misma biblioteca lentiviral y además de lecturas de 4 tumores representativos. Los círculos rojo y verde denotan el número de lecturas de Rdarna Adam10 y Ripk4 en la biblioteca y las células transducidas, mientras que el triángulo rojo representa las lecturas de los sgRNAs Adam10 y el diamante verde representa lecturas de los sgRNAs Ripk4 identificados en tumores de ratones HNSCC separados que muestran un enriquecimiento de pliegue de 1000x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Imprimación delantera PCR1 | GAGGGCCTATTTCCCATGATTC |
| Imprimación inversa PCR1 | CAAACCCAGGGCTGCCTTGGAA |
Tabla 1: Imprimaciones para la reacción PCR1. Las imprimaciones hacia adelante y hacia atrás utilizadas para la amplificación de la región que rodea el casete de ESGRNA a partir del ADN genómico de las células transducidas con el virus lenti.
| paso | temperatura | Hora | |
| 1 | 98 °C | 30 seg | |
| 2 | 98 °C | 10 seg | |
| 3 | 66 °C | 30 seg | |
| 4 | 72 °C | 15 seg | 15 ciclos (paso 2-4) |
| 5 | 72 °C | 2 min | |
| 6 | 4 °C | sostener |
Tabla 2: Parámetros del ciclo PCR1. Condiciones de PCR utilizadas para la amplificación de la región que rodea el casete de ESGRNA a partir del ADN genómico de las células transducidas con el virus lenti.
| 501 FW | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATAGCCTACACTCTTTCCCTACACG ACGCTCTTCCGATCTtgtggaaaggacgaaaCACCG |
||
| 701 RV | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAGTAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGTGCT CTTCCGATCTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC |
||
| * Las bases subrayadas indican la ubicación de código de barras Illumina (D501-510 para adelante y D701-712 para reversa) que se utilizaron para multiplexar. | |||
| * Las bases de color rojo indican la secuencia que se unen al sitio objetivo en el plásmido CRISPR lentiviral. Esta región se puede modificar según el vector lentiviral utilizado. | |||
Tabla 3: Imprimaciones de barcoding para reacción PCR2. Las imprimaciones utilizadas para amplificar cada muestra tumoral (ya sea directamente del ADN genómico o utilizando los productos de PCR1 como plantilla). La región subrayada indica la región de código de barras única que se puede asignar para cada muestra para la multiplexación en una reacción de secuenciación profunda. Los pares base de color rojo indican la región objetivo en la construcción lentiviral que estas imprimaciones se unen. Esta región de destino se puede modificar según el tipo de construcción lentiviral utilizada.
| paso | temperatura | Hora | |
| 1 | 98 °C | 30 seg | |
| 2 | 98 °C | 10 seg | |
| 3 | 68 °C | 30 seg | |
| 4 | 72 °C | 15 seg | 10 ciclos (paso 2-4) |
| 5 | 72 °C | 2 min | |
| 6 | 4 °C | sostener |
Tabla 4: Parámetros del ciclo PCR2. Las condiciones de PCR utilizadas para amplificar cada muestra tumoral (ya sea directamente del ADN genómico o utilizando los productos de PCR1 como plantilla).
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Discussion
La edición del genoma CRISPR/Cas9 ha sido ampliamente utilizada en estudios in vitro e in vivo para investigar las funciones genéticas y los procesos celulares. La mayoría de los estudios in vivo utilizan células editadas por genes CRISPR/Cas9 injertadas en un modelo animal (aloinjerto o xenoinjerto). Si bien esta es una poderosa herramienta para estudiar la genética del cáncer y las funciones celulares, todavía carece del microambiente de tejido nativo y podría provocar heridas y/o respuestas inmunes.
Para superar estos desafíos, varios grupos han sido pioneros en enfoques CRISPR directos in vivo generando varios modelos de ratón autóctonos multiplexados en los últimos años15,16,17,18. Estos proyectos generalmente se basan en el virus asociado al adeno (AAV) para entregar sgRNAs a los órganos objetivo. El AAV permite la generación de títulos muy superiores facilitando así la producción de virus de alto valor necesarios para manipulaciones in vivo. Sin embargo, el uso de AAVs limita severamente el número de genes que se pueden analizar a unos 40-50 genes, ya que los AAVs, a diferencia del lentivirus, no se integran de forma estable en el ADN genómico, lo que hace que la lectura de las bibliotecas de sgRNA sea poco práctica. El cribado basado en AAV requiere la lectura directa de mutaciones en sitios objetivo utilizando, por ejemplo, secuenciación de capturas dirigidas. Sin embargo, la secuenciación de capturas basada en PCR multiplexada restringe el número de objetivos capturables en una biblioteca "se puede proyectar" normalmente al orden de docenas15,16,17,18.
En comparación con las pantallas CRISPR in vivo de AAV, la metodología descrita aquí utiliza sgRNAs lentivirales. Dado que las construcciones lentivirales se integran en el ADN de la célula objetivo, la representación del ESGN se puede analizar en ADN genómico similar a cualquier pantalla CRISPR convencional19,20. Por lo tanto, esta metodología permite el análisis simultáneo de cientos de genes y se puede escalar sin problemas incluso a pantallas in vivo de todo el genoma. Por ejemplo, una pantalla de todo el genoma con 78.000 sgRNAs y una cobertura de 30x requeriría ~90 embriones como se describió anteriormente para una pantalla de shRNAsimilar 4. Como el tamaño de camada de las cepas de ratón endogámico más comunes es alrededor de 8-12 cachorros / basura y un cirujano experimentado puede inyectar fácilmente todos los ratones dentro de un poco, sólo alrededor de ~ 10-12 presas y cirugías serían necesarias para una pantalla de todo el genoma.
El éxito de una pantalla in vivo depende de la producción de virus de alto nivel. Mientras que las construcciones lentivirales que expresan un sgRNA de interés, Cas9 y Cre (por ejemplo, pSECC) son una solución todo en uno conveniente y factible, tienen el límite de embalaje para la capsid lentiviral (~ 10 kb en tamaño total), lo que conduce a un titer viral más bajo en general. Para superar este desafío, utilizamos ratones R26-LSL-Cas9-GFP y una construcción lenti-viral que contiene sólo Cre-recombinasa junto con un sgRNA. La construcción lentiviral resultante tiene sólo 7 kb de longitud y produce un valor viral de más de 108 PFU/mL.
Las bibliotecas específicas y específicas se pueden generar rápidamente en tan solo unos días y la compleja red de interacciones genéticas se puede estudiar in vivo en unas pocas semanas. La mutagénesis mediada por Cas9 se puede realizar ya sea en ratones de tipo salvaje para estudiar el desarrollo de órganos, homeostasis o fenotipos de enfermedades (cáncer, enfermedades inflamatorias de la piel, etc.) o se puede combinar fácilmente con ratones que albergan cualquier mutación oncogénica o combinación de mutaciones para modelar el estado genético que se encuentra en pacientes humanos. Además, la metodología de clonación se puede perfeccionar para clonar bibliotecas CRISPRa o CRISPRi añadiendo sitios de restricción y secuencias de sgRNA compatibles en plásmidos todo en uno. Cabe destacar que todas las bibliotecas que manipulan las funciones genéticas se pueden utilizar no sólo en modelos de ratón, sino también en otros modelos animales y en cultivos organoides. En conjunto, esta metodología destaca la utilidad y proporciona una placa de caldera para utilizar CRISPR directo in vivo para integrar la edición de genes somáticos y el modelado de ratones para evaluar rápidamente la función génica in vivo.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una subvención de proyectos del Instituto Canadiense de Investigación de la Salud (CIHR 365252), la Fundación Krembil y la Ronda 8 de Excelencia en Investigación del Fondo de Investigación de Ontario (RE08-065). Sampath Kumar Loganathan es el receptor de una beca de la Sociedad Canadiense del Cáncer (BC-F-16#31919).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 micron filter | Sigma | S2HVU02RE | |
| 12k or 92k oligo chip | Customarray Inc. (Genscript) | ||
| 15 cm cell culture plates | Corning | ||
| 293FT | Invitrogen | R70007 | |
| 293NT | Systems Biosciences | LV900A-1 | |
| Alkaline phosphatase | NEB | M0290L | |
| Amplicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| ATP | NEB | 9804S | |
| BsmBI | NEB | R0580L | |
| Chromic gut suture | Covidien | ||
| Deep sequencing (Next-Seq or Hi-Seq) | Illumina | ||
| DNA-cleanup kit | Zymo Research | D4008 | |
| DNAesy Blood and Tissue DNA extraction kit | Qiagen | 69506 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 60242-1 | |
| Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High-Speed Centrifuge | Beckman Coulter | MLS-50 | |
| LB Agar | Wisent Technologies | 800-011-LG | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Mini-prep plasmid Kit | Frogga Bio | PDH300 | |
| Mouse oxygen anaesthesia system | Visual Sonics | ||
| Nanoject II micromanipulator | Drummond | ||
| NEBuffer 3.1 (Buffer for BsmBI) | NEB | R0580L | |
| Needle sharpener | Sutter Instrument | BV-10 | |
| Oligo cleanup kit | Zymo research | D4060 | |
| PAGE purified illumina sequencing primer | IDT DNA | ||
| PEI (polyethyleneimine) | Sigma | 408727-100ML | |
| Permoplast modeling clay | |||
| Petridish with central opening | Visual Sonics | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| Q5 Polymerase 2x Master mix | NEB | M0494L | |
| Qubit Fluorometric Quantification | Invitrogen | Q33327 | |
| Semicircular Silicone plug | Corning | ||
| Silicone membrane | Visual Sonics | ||
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| Ultra-centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Vevo2000 ultrasound system | Visual Sonics |
References
- Beronja, S., Fuchs, E. RNAi-mediated gene function analysis in skin. Methods in Molecular Biology. 961, 351-361 (2013).
- Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos. Nature Medicine. 16, 821-827 (2010).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343, 84-87 (2014).
- Beronja, S., et al. RNAi screens in mice identify physiological regulators of oncogenic growth. Nature. 501, 185-190 (2013).
- Loganathan, S. K., et al. Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling. Science. 367, 1264-1269 (2020).
- Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18, 269-282 (2018).
- Green, A. C., Olsen, C. M. Cutaneous squamous cell carcinoma: an epidemiological review. British Journal of Dermatology. 177, 373-381 (2017).
- Campbell, J. D., et al. pathway network, and immunologic features distinguishing squamous carcinomas. Cell Reports. 23, 194-212 (2018).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11, 783-784 (2014).
- Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnology. 6, 34 (2006).
- Schramek, D., et al. Direct in vivo RNAi screen unveils myosin IIa as a tumor suppressor of squamous cell carcinomas. Science. 343, 309-313 (2014).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159, 440-455 (2014).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25 (2009).
- Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens. Genome Biology. 15, 554 (2014).
- Winters, I. P., Murray, C. W., Winslow, M. M. Towards quantitative and multiplexed in vivo functional cancer genomics. Nature Reviews Genetics. 19, 741-755 (2018).
- Rogers, Z. N., et al. Mapping the in vivo fitness landscape of lung adenocarcinoma tumor suppression in mice. Nature Genetics. 50, 483-486 (2018).
- Chow, R. D., et al. AAV-mediated direct in vivo CRISPR screen identifies functional suppressors in glioblastoma. Nature Neuroscience. 20, 1329-1341 (2017).
- Wang, G., et al. Mapping a functional cancer genome atlas of tumor suppressors in mouse liver using AAV-CRISPR–mediated direct in vivo screening. Science Advances. 4, 5508 (2018).
- Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. Pooled CRISPR-based genetic screens in mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (151), e59780 (2019).
- Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163, 1515-1526 (2015).
