Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

In Vivo CRISPR/Cas9 Screening for samtidig å evaluere genfunksjon i musehud og munnhule

Published: November 2, 2020 doi: 10.3791/61693
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 3, 1,2
1Centre for Molecular and Systems Biology, Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 3Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University

Summary

Her beskriver vi en rask og direkte in vivo CRISPR/Cas9 screeningmetodikk ved hjelp av ultralydstyrte i utero embryonale lentivirale injeksjoner for samtidig å vurdere funksjoner av flere gener i huden og munnhulen til immunokokkmus.

Abstract

Genmodifiserte musemodeller (GEMM) har vært medvirkende til å vurdere genfunksjon, modellere menneskelige sykdommer og fungere som preklinisk modell for å vurdere terapeutiske veier. Men deres tids-, arbeids- og kostnadsintensive natur begrenser deres nytte for systematisk analyse av genfunksjon. Nylige fremskritt innen genomredigeringsteknologier overvinner disse begrensningene og tillater rask generering av spesifikke genperturbasjoner direkte innenfor spesifikke museorganer på en multiplekset og rask måte. Her beskriver vi en CRISPR/Cas9-basert metode (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats) for å generere tusenvis av gen-knock-out kloner i epitelet i huden og munnhulen til mus, og gi en protokoll som beskriver trinnene som er nødvendige for å utføre en direkte in vivo   CRISPR-skjerm for tumordempergener. Denne tilnærmingen kan brukes på andre organer eller andre CRISPR/Cas9-teknologier som CRISPR-aktivering eller CRISPR-inaktivering for å studere geners biologiske funksjon under vevs homeostase eller i ulike sykdomsmiljøer.

Introduction

En av utfordringene for kreftforskning i postgenomisk tid er å utvinne den enorme mengden genomdata for årsakssammenhenger og identifisere noder i gennettverket som kan målrettes terapeutisk. Mens bioinformatiske analyser har bidratt enormt til disse målene, er etablering av effektive in vitro- og in vivo-modeller en forutsetning for å tyde kompleksiteten i biologiske systemer og sykdomstilstander og for å muliggjøre narkotikautvikling. Mens konvensjonelle transgene musemodeller har blitt brukt mye til in vivo kreftgenetikkstudier, har deres kostnads-, tids- og arbeidsintensive natur i stor grad forbudt systematisk analyse av hundrevis av putative kreftgener unraveled av moderne genomikk. For å overvinne denne flaskehalsen kombinerte vi en tidligere etablert ultralydstyrt i utero injeksjonsmetodikk1,2 med en CRISPR / Cas9 (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats) genredigeringsteknologi3 for samtidig å indusere og studere tap av funksjonsmutasjoner av hundrevis av gener i huden og munnhulen til en enkelt mus.

Metodikken som er beskrevet her, benytter ultralydstyrte injeksjoner av konstruerte lentivirus i fosterhulen til levende museembryoer på embryonal dag E9.5. Den lentivirale lasten som inneholder CRISPR/Cas9-komponenter, transduserer det enkeltlags overflateektoddermet, som senere gir opphav til epitelet i huden og munnhulen. Huden består av en ytre epidermis, etterfulgt av kjellermembran og dermis. Epidermis er et stratifisert epitel som består av et indre, basalt lag, som opprettholder kontakt med kjellermembranen og har proliferativ og stamcellekapasitet. Basallaget gir opphav til de differensierte lagene ovenfor, for eksempel spinøse, granulære og stratum corneum lag2,4. Lineage tracing studier viser at denne direkte in vivo CRISPR / Cas9 metoden genetisk manipulerer vev-bosatte stamceller i basallaget som vedvarer gjennom hele voksen alder. Siden lentivirus kan titreres for å transdusere E9,5 overflateeklatmen ved klonisk tetthet, kan denne metoden brukes til å generere mosaikkmus som huser tusenvis av diskrete gen-knock-out kloner. Neste generasjons sekvensering kan deretter brukes til å analysere effekten av CRISPR / Cas9-mediert genablasjon i disse klonene på en multiplekset måte5.

Vi brukte nylig denne metoden for å vurdere funksjonen til 484 gener som viser tilbakevendende mutasjoner i humant hode og nakke Squamous Cell Carcinoma (HNSCC)5. HNSCC er en ødeleggende kreft med en høy dødelighet på 40-50% og det er den sjette vanligste kreften over hele verden6. HNSCC oppstår i slimhinner i øvre luftvei eller munnhule og er forbundet med tobakk og alkoholforbruk eller human papillomavirus (HPV) infeksjon. Kutan Squamous Cell Carcinoma (SCC) er hudsvulster og representerer den nest vanligste kreftformen hos mennesker7. Kutan SCC og HNSCC er histologisk og molekylært svært like, med en høy prosentandel tilfeller som viser endring i TP53, PIK3CA, NOTCH1 og HRAS8. Mens det bare er en håndfull gener mutert ved høy frekvens, er det hundrevis av gener som finnes mutert ved lav frekvens (< 5%), et fenomen som ofte kalles langhalefordelingen. Ettersom flertallet av langhalegenene mangler biologisk eller klinisk validering, brukte vi denne in vivo CRISPR-screeningteknologien til å modellere funksjonstap av disse genene hos tumorutsatte mus med sensibiliserende mutasjoner i p53, Pik3ca eller Hras og identifiserte flere nye tumordempergener som samarbeider med p53, Pik3ca eller Hras for å utløse tumorutvikling5.

Her beskriver vi en detaljert protokoll for å generere multipleksede sgRNA lentivirale CRISPR sgRNA-biblioteker og utføre CRISPR / Cas9 gen knock-out skjermer i museoverflaten ectoderm. Vær oppmerksom på at denne metoden kan tilpasses for å innlemme andre genmanipuleringsteknologier som CRISPR-aktivering (CRISPRa) og CRISPR-inaktivering (CRISPRi) eller modifiseres for å målrette mot andre organsystemer i mus for å studere genfunksjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokollen ble godkjent og utført i samsvar med IACUC ved University of Toronto.

1. Design og kloning av samlede CRISPR-biblioteker

  1. Velg 4-5 sgRNAer som er rettet mot musegener av interesse fra ressurser som Broad Institute sgRNA designer (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) eller CHOPCHOP server (https://chopchop.cbu.uib.no). Velg et likt antall ikke-målrettede sgRNAer fra for eksempel Sanjana et al.9 for å generere en like stor ikke-målrettingskontroll gRNA-bibliotek.
  2. Mens du bygger sgRNA-bibliotekene, må du sørge for at det er nok dekning for hver sgRNA i det målrettede organsystemet. For musehuden er epidermis på E9,5 et enkelt lag som inneholder ~ 150 000 celler, hvorav de fleste har stamcellekapasitet4. Hvis lenti-viral transduksjon resulterer i 15-20% infektivitet, vil bare 18.000-24.000 celler bli transdusert på E9.5. Skaler eksperimentet deretter.
  3. For kloning og forsterkning av disse sgRNA-bibliotekene, legg til BsmBI enzymbegrensningssteder samt primerbinding av DNA-sekvenser til 5' og 3' enden av sgRNA og bestill den resulterende oligos i full lengde som samlet oligonukleotidbrikke (figur 1A).
    1. Legg til bibliotekspesifikke primersekvenser for å multiplekse forskjellige biblioteker på én brikke.
    2. Bruk de aktuelle primerparene til å forsterke hvert bibliotek separat fra den samlede oligo-brikken. I et PCR-rør blander du 25 μL 2x polymerase master mix, 20 μL DNase / RNase fritt vann, 5 ng oligo chip DNA, 2,5 μL passende fremoverprimer og 2,5 μL passende omvendt primer. Bruk 12-15 sykluser og forsterk med 98 °C denaturering, 63-67 °C gløding, 72 °C forlengelsesparametere for hver syklus i PCR-maskinen.
    3. Kjør PCR-produktet på en 2,5% agarose gel og rens ~ 100 bp PCR-produkt ved hjelp av et gel DNA-oppryddingssett.
  4. Forbered ryggraden plasmid.
    1. Fordøye 5 μg Cre-rekombininase som inneholder pLKO-Cre stuffer v3 plasmid med 2 μL BsmBI i 50 μL reaksjonsblanding i 1 t ved 55 °C, etterfulgt av 1 μL alkalisk fosfataseinkubasjon i 45 minutter ved 37 °C i henhold til produsentens anvisninger.
      MERK: Cre-rekombininase som inneholder pLKO-Cre stuffer v3 plasmid er en lenti-viral basert plasmid som inneholder Cre-recombinase enzymet for å fjerne Lox-Stop-Lox kassett i museceller og har også en U6-promotor for å drive uttrykket av sgRNA og tracrRNA. En versjon med Cas9 og uten Cas9 kan brukes og være tilgjengelig på Addgene #158030 og #158031.
    2. Kjør det fordøyde DNA-et på en 1% agarose gel og rens det 7 kb lineariserte vektorbåndet ved hjelp av et gel-DNA-oppryddingssett. Vær oppmerksom på at et 2 kb stuffer-bånd også skal være synlig som indikerer et vellykket sammendrag.
  5. Sett opp ligation reaksjon for å generere en sgRNA plasmid bibliotek.
    1. Bland 1 μg renset vektor og 30 ng renset PCR-innsats med 2 μL BsmBI, 5 μL T4 DNA-ligaer, 10 μM ATP og 1x buffer som er spesifikk for BsmBI. Inkuber ligasjonsblandingen over natten ved 37 °C. Bruk et ekstra rør som inneholder alle de ovennevnte materialene unntatt PCR-innsatsen som en negativ kontroll.
    2. Neste dag morgen renser du ligationblandingen ved hjelp av oligo-oppryddingssettet og elute i 7 μL RNase / DNase fritt vann.
  6. Elektroporate biblioteket i kompetente celler.
    1. Tilsett 2 μL eluted sgRNA bibliotek eller negativ kontroll ligation blanding til 25 μL av tinte elektrokompetente celler i pre-kjølte cuvettes (1,0 mm) på is. Elektroporate etter produsentens protokoll (10 μF, 600 Ohms, 1800 Volt). Til cuvette legge 975 μL av utvinning medium (eller SOC medium) innen 10 s av pulsen.
    2. Overfør elektroporerte celler til et kulturrør og inkuber i en time ved 37 °C i en bakteriell ristende inkubator ved 300 o/min.
  7. Beregn transformasjonseffektivitet og bibliotekdekning per sgRNA.
    1. Forbered en 100 ganger fortynning ved å overføre 10 μL av transformasjonsreaksjonen som inneholder celler elektroporert med sgRNA-bibliotek eller negativ kontrollligasjon til 990 μL recovery medium og bland godt.
    2. Plate 10 μL av den fortynnede transformasjonsblandingen på en forvarmet 10 cm LB + ampicillin (100 μg/L) agarplate. Dette resulterer i en 10.000 ganger fortynning av transformantene og bruk denne platen til å beregne transformasjonseffektiviteten. Utfør inkubasjon av platene ved 30 °C i 14–16 timer.
  8. Plate resten av transformasjonsreaksjonen ved å spre 100 μL gjenopprettede celler på hver plate av totalt 10 forvarmede 15 cm LB + ampicillin agarplater. Inkuber platene i 14–16 timer ved 30 °C. Vær oppmerksom på at veksten ved 30 °C minimerer rekombinasjonen mellom de to langterminalene i den virale plasmiden.
  9. Beregn transformasjonseffektiviteten for å vurdere kloningssuksess. Tell antall kolonier på fortynningsplaten som inneholder transformanter fra sgRNA-biblioteket eller negativ kontrollligasjon (10 cm plater, trinn 1,8,2). Negativ kontrollblanding bør ikke ha noen eller bare svært få kolonier. For å oppnå det totale antallet kolonier, multipliser antall kolonier med 10.000.
    MERK: Det totale antallet kolonier representerer en bibliotekdekning som skal være minimum 200x kolonier per sgRNA.
    1. Sørg for at et bibliotek med 2000 sgRNAer vil ha minst 400 000 kolonier. I tilfelle det ikke er nok kolonier, gjenta og sett opp mer elektroporasjon.
  10. Kvalitetskontroll: Fra fortynningsplaten velger du 20 kolonier og legger hver koloni til et individuelt kulturrør som inneholder 3 ml LB-medier + ampicillin. Inkuber alle 20 rør over natten ved 30 °C risting ved 250 o/min. Rens det plasmide DNA-et ved hjelp av mini-prep kit i henhold til produsentens instruksjoner og Sanger sekvens alle de 20 plasmid DNA-prøvene for å bekrefte at hver prøve har en annen sgRNA-sekvens ved hjelp av U6 primer (5'-GAG GGC CTA TTT CCC ATG ATT CC-3').
  11. Høst koloniene fra hver 15 cm tallerken.
    1. Tilsett 7 ml LB-medium, og skrap deretter koloniene av LB Agar-platen med en cellespreder. Bruk en 10 ml pipette til å overføre cellene til en 2 L steril konisk kolbe. Gjenta for alle plater og bassengbakterier i 2 L-kolben. Inkuber kolben i 2-3 timer risting ved 30 °C. Sentrifuger kulturen og samle pellets.
    2. Rens plasmid DNA ved hjelp av et maxi-plasmid rensesett.
  12. Ekstra kvalitetskontroll: Bruk 1 ng maxi-prep sgRNA bibliotek plasmid DNA og kjør en PCR-reaksjon ved hjelp av neste generasjons sekvensering primere i henhold til produsentens instruksjoner. Representasjonen av alle sgRNAer i biblioteket kan verifiseres av dyp sekvenseringsplattform.

2. Produksjon av høy titer lentivirus egnet for in vivo transduksjon

MERK: Utfør alle trinnene i denne delen av protokollen i et BSL2+-anlegg i et biosikkerhetsskap i klasse II, type A2. 293FT og spesielt 293NT-emballasjecellene gir mulighet for høyere virusproduksjon. Bruk celler med lav passasje (

  1. Forbered virale emballasjeceller.
    1. På dag 1, plate HEK293T celler på 6 poly-L-lysin belagt 15 cm plater ved 35% samløp i vekstmedier (DMEM + 10% FBS + 1% Penicillin-Streptomycin antibiotika løsning (w / v)). Inkuber celler over natten ved 37 °C, 5 % CO2.
    2. Når de belagte cellene er 70-80% konfluente og jevnt spredt, erstatt vekstmedier med 25 ml serum og antibiotikafrie DMEM-medier.
    3. Tilsett medier sakte på sidene av kolber ved fôring, da HEK293T- og 293NT-celler enkelt kan løsne fra vevskulturplast
  2. Forbered transfeksjonsblanding.
    1. Tilsett 65 μg lentiviral emballasje plasmider psPAX2, 43 μg VSV-G som uttrykker konvolutt plasmid pMD2.G, 65 μg sgRNA bibliotek plasmid og 240 μL av 1 mg / ml polyetylenimine (PEI) til 6 ml DMEM og virvel.
      MERK: Bruk alltid en uåpnet eller nylig åpnet flaske DMEM for transfeksjonen, da pH på dette trinnet er kritisk, og DMEM blir mer grunnleggende over tid når den er åpnet.
    2. Inkuber i 15 min ved romtemperatur. Denne transfeksjonsblandingen er nok for celler belagt på 6 x 15 cm plater med 870 cm2 overflateareal. Skaler transfeksjonsblandingen i henhold til kravene til eksperimentet.
  3. Transfeksjon av virale emballasjeceller.
    1. Etter 15 min inkubasjon, transfekt hver av de 15 cm platene ved å legge til 1 ml av transfeksjonsblandingen dråpevis gjennom hele platen. Inkuber ved 37 °C, 5 % CO2 i 8 timer.
    2. Etter inkubasjon, fjern det serumfrie mediet som inneholder transfeksjonsblandingen og tilsett 30 ml vanlige kulturmedier til de 15 cm platene og kulturen i 48 timer ved 37 °C, 5 % CO2.
  4. Etter 48 timer samler du det virale supernatanten og filtrerer gjennom 0,45 μm PVDF-filteret. Hold 1 ml av den virale supernatanten og oppbevar den ved -80 °C for kvalitetskontroll og viral titering.
  5. Konsentrer den virale supernatanten ved sukrosegradering sentrifugering i høyhastighets sentrifuge ved hjelp av SW28 rotorhode.
    1. Prime ultracentrifuge rør ved å vaske dem med 70% etanol, etterfulgt av 3 skyllinger med PBS. Fordel omtrent 30 ml av den virale supernatanten jevnt inn i hvert av 6-ultracentrifuge-røret.
    2. Pipette forsiktig til bunnen av hvert rør 4 ml av den 20% sukroseoppløsningen (20 g sukrose i 100 ml PBS). Plasser de seks ultracentrifuge rørene i de seks SW28 svingbøttene og nøyaktig balansere hvert motstående par bøtter ved å legge til eller fjerne viral supernatant.
    3. Sentrifuger viral supernatant ved 4 °C i minst 2 timer og opptil 4 timer ved 80 000 x g og 4 °C. Når sentrifugeringen er ferdig, kast forsiktig supernatanten.
    4. Tøm det gjenværende supernatantet ved å plassere ultracentrifuge rør opp ned på sterilt mykt papirhåndkle i minst 2 minutter og tørk av eventuelle dråper med supernatant inne i røret ved hjelp av et mykt papirhåndkle for å kvitte seg med gjenværende medium. En liten gråaktig hvit pellets kan være synlig nederst på røret.
    5. Tilsett 20-25 μL kald, frisk PBS til hvert rør. Tetningsrør med parafinfilm og inkuberer rør oppreist på is med skånsom risting på en orbital plattform shaker i ~ 2 timer.
    6. Bruk en 20 μL pipette, forsiktig løsne og resuspender pellets av det første røret, vær forsiktig så du ikke danner bobler. Overfør mediet til neste rør og gjenta prosessen til alle viruspellets har blitt løsnet og kombinert i ett rør på ca. 120-150 μL volum. Inkuber denne high-titer viral suspensjon for en annen ~ 2 h på is med mild risting.
    7. Overfør den virale suspensjonen til et 1,5 ml mikrosenterrør og snurr røret ved 4 °C i en nedkjølt og forhåndskjølt sentrifuge på bordplaten på 12 000 x g i 2 minutter. Aliquot den klare virale supernatanten forsiktig som 10 μL aliquots i separate 0,2 ml rør og lagre ved -80 °C. Kast pelletsen på bunnen av røret, da dette vil tette nålen under embryonale injeksjoner.
  6. Titrering av samlet CRISPR lentivirusbibliotek
    MERK: Den resulterende virale suspensjonen skal gi en omtrentlig 2000 ganger konsentrasjon og den resulterende virusløsningen og bør ha viral titer på 107-109, som er god nok for mer enn 100 E9.5 operasjoner beskrevet nedenfor.
    1. Frø R26-Lox-STOP-Lox-tdTomato mus embryonale fibroblaster (MEFs) eller R26-Lox-STOP-Lox-tdTomato primære keratinocytter eller andre Cre-reporter celle linje inn i en 2 x 6 brønnplate.
    2. Når cellen når ~ 40% samløp, er cellene klare for transduksjon. På den tiden, bestemme antall celler i en brønn for å muliggjøre beregning av viral titer senere. Endre mediene i Cre-reportercellene til vekstmedier supplert med 10 μg/ml polybren (=heksadimetrinbromid).
    3. Fortynn 1 μL konsentrert virus med 2 ml vekstmedier. Tilsett 0, 10, 50, 200 μL fortynnet viral suspensjon og 50 200 μL ikke-konsentrert virus fra trinn 2,4 og bland plater og inkuber over natten ved 37 °C, 5 % CO2.
    4. Fjern vekstmedier som inneholder virus neste dag, vask celler med PBS og erstatt med normale vekstmedier. Supernatanten på dette tidspunktet regnes fortsatt som viralt avfall og må avhendes i henhold til institusjonelle BSL2-forskrifter.
    5. Omtrent 36-48 timer etter transduksjon, vurdere Cre-mediert rekombinasjon av Lox-STOP-Lox-kassetten og uttrykk for tdTomato av FACS. Beregn viral titer. Beregn koloniformingsenheter (cfu)/ml ved hjelp av følgende formel:
      Equation 1
      MERK: Sammenligning mellom den konsentrerte virale suspensjonen med den ukonsentrerte virale supernatanten vil tillate å estimere suksessen til (1) viral produksjon samt (2) viral konsentrasjon. Alternativt kan viral titer estimeres ved hjelp av qRT-PCR-metode10. Storskala produksjon og konsentrasjon av lentivirus kan også utføres ved hjelp av en to-trinns konsentrasjon med en patronkonsentrasjon etterfulgt av ultracentrifugation som tidligere beskrevet2.

3. Ultra-lyd guidet kirurgi og injeksjon

MERK: Denne teknologien ble tilpasset fra4,11. Mikroinjeksjon rettet mot transduksjon av overflateepitelet må utføres på embryonal dag E9.5, når overflateekstodermen består av et enkelt lag og før dannelsen av periderm starter på E10, noe som vil forhindre transduksjon av dette basale laget. Fortrinnsvis sette opp mus på fredag, slik at den første mulige dagen med E9.5 embryoer er følgende mandag. Bruk Rosa26-Lox-STOP-LOX-Cas9-GFP-mus (Jackson Laboratory #024857) for optimal CRISPR/Cas9-effektivitet12.

  1. Sett opp passende mannlige og kvinnelige mus for tidsbelagte graviditeter 10 dager før ønsket kirurgi dato.
    1. Plug-check mus i løpet av de følgende dagene for å identifisere potensielt gravide mus. Bekreft graviditeten dagen før den planlagte operasjonen (dvs. E8.5) ved hjelp av ultralyd.
  2. Forbered den modifiserte Petri-parabolen.
    1. Bruk det dobbeltsidige klebrige båndet til å lime silikonmembranen på bunnen av Petri-parabolen som dekker den sirkulære åpningen. Bruk skarp saks, kutt en 2 x 10 mm oval åpning i silikonmembranen.
  3. Forberedelse av mikroinjeksjonssystemet
    1. Forbered injeksjonsnåler fra en tykkvegget glasskapillær ved hjelp av en mikropipettetrekker med følgende innstillinger: Trykk = 200; Varme = 769; Trekk = 0; Hastighet = 140; Tid = 100.
    2. Bruk fin saks for å kutte av nålespissen på det nivået der diameteren er ~ 30 μm. Skråstill kanylen med nålesliperen til 20° på en slipeplate av fin kvalitet med vanlig fukting i 20 minutter.
    3. Steriliser mikroinjeksjonsnålen ved å skyve 70% etanol med en 10 ml sprøyte med en 26 G1/2 nål. Bruk en 10 ml sprøyte og 26 G1/2 nål lastet med mineralolje, fyll mikroinjeksjonsnålen på nytt. Pass på at det ikke er noen bobler i mikroinjeksjonsnålen.
    4. Monter mikroinjektornålen på mikromanipulatoren i henhold til produsentens instruksjoner.
  4. Last nålen med viral sgRNA bibliotek.
    1. Pipette 10 μL viral suspensjon på en parafilm festet på en flat overflate.
    2. Bruk mikromanipulator til å utvise mineraloljen. Tilstedeværelsen av et lite volum olje i nålen vil forhindre at lentiviruset kommer i kontakt med stempelet. Last ca 4-5 μL viral suspensjon ved langsom aspirasjon uten luftbobler.
  5. Bedøv gravid mus ved hjelp av isofluran induksjonskammer. Sett oksygenregulatoren til 1 L/min og isofluran fordamper til 2 %. For å avgjøre om dyret er bedøvet, sjekk med tåklemme etter ~ 3-5 min i isofluraninduksjonskammer.
  6. Plasser den bedøvede dyr ventral side opp på oppvarmet kirurgi scenen (40 °C) og bruke kirurgi tape for å holde potene på plass med nese-kegle anestesirøret for konstant tilførsel av isofluran og oksygen til operasjonen er fullført.
  7. Bekreft E9.5 graviditet hvis det ikke ble gjort på E8.5.
    1. Påfør en liten mengde (~ 1/2 ts) av en hårfjerningskrem på magen og spre den over et område på 3 x 3 cm ved hjelp av en bomullsspisset applikator.
    2. Etter 2-3 min, fjern kremet forsiktig med gasbind eller vev og tørk området rent ved hjelp av PBS og 70% etanol.
    3. Bruk ultralyd sonde og gel, sjekk den gravide musen for embryonal dag E9.5. Vær oppmerksom på at dette også kan gjøres dagen før på E8.5 for å spare tid på selve operasjonsdagen.
    4. Fjern ultralydgel og tørk området rent ved hjelp av BPS og deretter 70% etanol for å desinfisere.
  8. Injiser 0,02 cc Buprenorfin smertestillende subkutant i musedammen.
  9. Kirurgisk eksponere livmoren
    1. Bruk sterile tang og saks, gjør et vertikalt ~ 2 cm snitt inn i musens hud.
    2. Ved hjelp av stumpe tang skiller huden rundt snittet fra bukhinnen.
    3. Bruk sterile tang og saks, kutt gjennom bukhinnen.
    4. Bruk stumpe tang, trekk forsiktig ut venstre og høyre livmorhorn og tell embryoene.
    5. Sett inn de fleste livmorhornene på nytt, men la den distale enden av ett livmorhorn som inneholder 3 embryoer eksponert.
    6. Bruk stumpe tang, skyv forsiktig og trekk livmoren med de 3 embryoene gjennom åpningen i silikonmembranen til den modifiserte Petri-parabolen.
    7. Stabiliser Petri-parabolen ved hjelp av kuber av modellering av leire.
  10. Stabiliser livmoren med de tre embryoene inne i Petri-parabolen ved hjelp av en silikonform. Flat ut silikonpluggen på siden av embryoene ved hjelp av en skarp kniv.
  11. Fyll opp Petri-retten med steril PBS. Skyll silisiummembranen på bunnen av Petri-parabolen med den gravide dammens mage og forhindrer dermed lekkasje.
  12. Flytt ultralydhodet inn i Petri-parabolen ~ 0,5 cm på toppen av det øverste embryoet og juster scenen slik at fosterhulen blir tydelig synlig i ultralydvisningen.
  13. Juster injektornålen forsiktig inn i den modifiserte Petri-parabolen. Bruk mikromanipulatoren til å plassere spissen av nålen innenfor ~ 5 mm av det øverste embryoet. Deretter veksler nålen frem og tilbake og beveger seg inn i planet der spissen vises den lyseste i ultralydbildet.
  14. Bruk mikromanipulatoren til å skyve nålen gjennom livmorveggen inn i fosterhulen.
  15. Injiser lentivirus som inneholder sgRNA-bibliotek.
    1. Forhåndsprogrammer injektoren til 62 nL og langsom injeksjonshastighet. Mikroinjektoren kan programmeres til å injisere spesifikke volumer med lav eller rask hastighet.
    2. Trykk på Injiser-knappen 8 ganger for totalt 496 nL per embryo. Juster volumet etter nødvendige behov og viral titer. Et viralt titer på 1 x 108 pfu/ml og 496 nL injeksjonsvolum vil resultere i omtrent 30% infektivitet.
    3. Gjenta samme prosedyre for andre to embryoer.
    4. Løft ultralydhodet og fjern silikonpluggen.
    5. Skyv forsiktig de 3 embryoene inn i muselivet ved hjelp av et sterilt bomullsbytte.
    6. Trekk forsiktig ut de neste 3 embryoene og gjenta injeksjonsprosedyren til ønsket antall embryoer injiseres.
      MERK: Ikke overskrid 30 min anestesi, da gravide dammer er mye mer sannsynlig å avbryte sine embryoer utover den tiden. En erfaren kirurg kan injisere opptil 12 embryoer innen 30 min kirurgi.
  16. Løft ultralydhodet, fjern mikromanipulatoren med nålen, aspirer PBS og fjern petriskålen. Bruk sterile våtservietter, absorbere eventuelle PBS som kan ha akkumulert i bukhulen.
  17. Lukk det bukhinneale snittet ved hjelp av absorberbare suturer. Bruk to stifter for å lukke snittet i bukhuden.
    MERK: Mens du utfører ultra-lyd styrt i utero operasjoner, bør det tas ytterste forsiktighet for å opprettholde et rent miljø, opprettholde sterilitet så mye som mulig og unngå eventuelle forurensninger. Hvis mer enn en operasjon må gjøres på samme dag, er det viktig å sterilisere disseksjonsinstrumentene ved hjelp av en perlesterilisator og rengjøre andre apparater som møter musevev rengjort med etanol. Dette øker i stor grad den høyere overlevelsen av embryoene etter operasjonen. Overlevelsesraten for kirurgimetoden beskrevet her er konsekvent mellom 80-100%.
  18. Behandling etter operasjonen.
    1. La den gravide kvinnen komme seg i et oppvarmet bur og observere i 15-30 min.
    2. Sjekk vaginal kanal for blod, som er et tidlig tegn på abort og komplikasjoner. For postoperativ smertelindring, lever administrere smertestillende to ganger om dagen i to dager etter operasjonen.
  19. Identifiser transinduserte embryoer/nyfødte Rosa26-Lox-STOP-Lox-Cas9-GFP-mus ved hjelp av et fluorescerende dissekeringsmikroskop, en fluorescerende proteinlykt og filterbriller eller ved genotyping for integrerte virale partikler i øre- eller haleklemmer.
    MERK: Mus identifiseres best ved hjelp av fluorescerende mikroskop frem til postnatal dag 3 før håret begynner å vokse.
  20. For å sikre nok dekning for CRISPR-biblioteket, beregn dekning basert på følgende parametere: E9.5 museoverflate ektoderm består av ~ 150 000 celler; transduksjon på ~ 20% resulterer i en minimal dobbel infeksjonsrate (~ 1/10 doble infiserte celler)4,5,11; Ved 20% infektivitet har hvert embryo 30.000 infiserte celler. Sørg for at minst 100 individuelle celler transduseres med en gitt sgRNA. For eksempel krever et basseng på 2000 sgRNAer 2 x 105 celler eller 6-7 dyr.

4. Dyp sekvenseringsprosedyre

  1. Ved eksperimentelt endepunkt som tumordannelse eller annen fenotype, ofre musen og høst vevet av interesse. Bruk DNA-ekstraksjonssett for blod og vev til å rense genomisk DNA etter produsentens protokoll. Før du starter DNA-ekstraksjon fra svulster, rengjør arbeidsbenken med DNA Erase og arbeid vekk fra laboratorieområdet der plasmider håndteres.
    MERK: Det er viktig å generere en referanseprøve for å tillate beregning av sgRNA-foldendringer over tid. Transinduserte embryoer 3 dager etter infeksjon eller transinduserte celler (se trinn 2. 6) kan fungere som referanseprøve for å bestemme sgRNA-representasjon i det opprinnelige biblioteket.
  2. Bruk 100 ng – 1,5 μg genomisk DNA som mal i en 50 μL preforsterkning PCR 1-reaksjon ved hjelp av de ytre primerne som er oppført i tabell 1 og PCR-programmet som er beskrevet i tabell 2. Sett opp nok reaksjon til å gi ønsket dekning.
    MERK: Sett opp den barkoding PCR-reaksjonen i et eget dedikert område av laboratoriet eller i en vevskulturhette som rengjøres grundig ved DNA-sletting for å unngå forurensning. Kjør negativ kontroll for hver PCR-plate med vann som mal for å sikre at det ikke er forurensning.
  3. Slå sammen alle PCR 1-reaksjoner og kjør 20 μL på en 1,5% kontroll agarose gel for å bekrefte vellykket forsterkning av et 600 bp-bånd.
  4. Bruk 5 μL av den samlede PCR1-reaksjonen som mal i en 50 μL PCR 2-reaksjon ved hjelp av unik strekkodet primerkombinasjon som er oppført i tabell 3 og PCR-programmet som er skissert i tabell 4. Kjør 50 μL PCR 2-reaksjon på en 2% agarose gel og rens 200bp-båndet ved hjelp av et gelekstraksjonssett i henhold til produsentens instruksjoner.
    MERK: Forforsterkningstrinnet er bare nødvendig for forsterkning av et komplekst transindusert vev. Hvis forsterke en enkelt svulst som antagelig utviklet danner en klonisk celle og dermed inneholder bare en enkelt sgRNA, kan man hoppe over pre-forsterkning PCR1 og fortsette med en gang med PCR2.
  5. Kvantifisere DNA-konsentrasjon ved hjelp av fluorometrisk kvantifisering og sendt for dyp sekvensering til sekvenseringsanlegget (f.eks. 1 million leser per svulst).
  6. Bruk Bowtie v1.2.3, som bare tillater uappet justerte justeringer, juster sekvensielle lesinger til sgRNA-bibliotek13. Lag en bowtie-indeks ved hjelp av bowtie-build-kommandoen som legger inn sgRNA-sekvensene i fasta-format. Tilordne leseoperasjoner ved hjelp av bowtie -kommandoen med alternativene -m 2 -v 1, som tillater maksimalt to uoverensstemmelser under lesejustering og forkaster leseoperasjoner som justerer mer enn én biblioteks sgRNA-sekvens. Vanligvis justeres mer enn 80 % av lesingene under disse parameterne.
  7. Bruk kommandoen MAGeCK count til å hente lesetellingstabellen ved hjelp av den justerte filen som inndata14. sgRNA-telletabellen kan brukes til nedstrømsanalyser som å bestemme differensial sgRNA(MAGeCK) og finne essensielle gener (BAGEL).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1A viser utformingen av oligonukleotidene for multipleksing av flere tilpassede CRISPR-biblioteker på en kostnadseffektiv måte på en enkelt 12k- eller 92k oligo-brikke. Når sgRNAene (blå fargekodet) er valgt, er oligonukleotidene designet med begrensningssteder (oransje farget BsmBI) og bibliotekspesifikke PCR-primerpar (grønn fargekodet). Flere biblioteker kan utformes ved å bruke unik kombinasjon av primerpar for multipleksing i en enkelt oligo-brikke. Når PCR forsterker bibliotekene ved hjelp av et bestemt PCR primerpar, må du alltid inkludere et vann bare negativ kontroll og kjøre alle reaksjonene på en agarose gel. Den negative kontrollbanen skal ikke ha noen bånd på 100 bp, mens bibliotekets forsterkede kjørefelt skal ha et enkelt 100 bp-bånd. Hvis det ikke er noe bånd, må du kontrollere at PCR-primerparet er valgt på riktig måte. Figur 1B viser kvalitetskontrolltrinnet til det klonede biblioteket og viral produksjon og konsentrasjonsprosedyre. Det bør tas hensyn til å bevare den likeverdige representasjonen av sgRNAer fra kloning til transduksjon. Neste generasjons sekvenseringsavlesninger av PCR forsterket DNA fra plasmid og lenti-viral bibliotek transduced celler bør vise en høy korrelasjon. Eventuelle avvik må analyseres nøye for å undersøke om representasjonen går tapt før eller etter lenti-viruspreparatet. Hvis sgRNA leser fra plasmid DNA viser ikke lik representasjon av sgRNAer, må den virale forberedelses- og konsentrasjonsprosedyren gjentas med forsiktighet. Hvis tapet av lik sgRNA-representasjon skjedde i plasmid DNA, må hele kloningsprosedyren gjentas, inkludert PCR-forsterkning av biblioteker fra oligo chip med reduserte forsterkningssykluser. Suksessen til CRISPR-bibliotekscreeningen avhenger kritisk av lik representasjon av sgRNAene som finnes i biblioteket.

Figur 2 viser ultralydstyrt mikroinjeksjon satt opp for manipulering av E9.5 embryoer i gravid mus. Hele oppsettet er plassert under et biosikkerhetsnivå klasse II-skap for å opprettholde den sterile tilstanden til hele prosedyren og for å unngå infeksjon av den gravide musen på grunn av kirurgiske prosedyrer. Det må utvises forsiktighet for å unngå å presse livmorhornene under injisering. Nålen må være veldig skarp, slik at såret på livmorveggen og fostermembranen er minimal.

Figur 3 viser resultatene av den ultra-lyd guidede injeksjonen av lenti-virus som bærer Cre-recombinase i E9.5 Lox-stop-Lox (LSL) Konfettimusvalper på barseldagen (P)0. Viral titer kan justeres for å få en passende transduksjonsdekning av epidermis. Mens høy titer av virus ville resultere i større dekning av musehuden, ville det også resultere i transduksjon av flere sgRNAer i samme celle som potensielt forvirrer resultatene. For å redusere flere transduksjoner av en enkelt celle, bør infeksjonsraten holdes <20%.

Figur 4 viser neste generasjons sekvenseringsavlesninger av PCR forsterket DNA fra plasmid og lenti-viral bibliotek transinduserte celler og leser også fra 4 representative svulster. sgRNA guider rettet mot Adam10 og Ripk4 er beriket i tumorprøver (trekanter og diamanter) sammenlignet med sgRNA presentasjon i plasmid basseng eller infiserte celler. Adam10 og Ripk4 fungerer som tumordempere5. Flere hundre svulster kan multiplekses ved å tilordne unike strekkoder til hver prøve og dypt sekvensert som beskrevet i protokollen.

Figure 1
Figur 1: Kloning av målrettet CRISPR-bibliotek. (A) Skjematisk som representerer utformingen av oligonukleotider for den 12 k eller 92 k tilpassede oligo-brikken. BsmBI (eller andre kompatible) begrensningsområder (oransje fargekodet og understreket) ble lagt til på hver side av sgRNA. Pilhoder indikerer BsmBI-kuttet sted. For hvert bibliotek ble et unikt par PCR-primere (grønn, brun og lilla fargekodet) lagt til, slik at den kan forsterkes spesielt ved hjelp av PCR fra den samlede brikken. Flere egendefinerte biblioteker kan multiplekses opptil 12k eller 92k oligos. (B) Graf som viser sgRNA-representasjon fra et CRISPR-bibliotek i plasmid DNA versus DNA fra celler transdusert med samme lentivirale bibliotek. Hver prikk representerer en støttelinje. Full representasjon ble opprettholdt etter transduksjon med en viss korrelasjon i overflod. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Bilde av det ultralydstyrte mikroinjeksjonsoppsettet. (A) Mus som bærer E9,5 embryoer ble bedøvet og plassert på en oppvarmet plattform med livmor eksponert i et PBS fylt modifisert Petri parabolkammer (stabilisert av fire modellering leire). Den blå halvrunde gummien støttet livmoren som inneholder embryoer, og injeksjonsnålen fra mikroinjektoren er plassert på høyre side. Ultralydskanningshodet ble montert på det øverste relé live-bildet til skjermen bak med nålehodet synlig. (B) Nærbilde ultra-lyd bilde av en E9.5 embryo. Lentiviral bibliotek ble injisert med nålen (sett på høyre side) i fosterhulen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Vellykket transduksjon av overflateepitelet i musen. Fluorescerende bilder av hele kroppen, munnhulen, tungen og ganen til nyfødte Cre-reporter LSL-Confetti-mus transdusert med Cre lentivirus (Inlet: tilsvarende hvite lysbilder). Skalastenger = 500 μm Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Dyp sekvensering av tumorprøver. Graf som viser sgRNA-representasjon fra et CRISPR-bibliotek i plasmid DNA versus DNA fra celler transdusert med samme lentivirale bibliotek og i tillegg til avlesninger fra 4 representative svulster. De røde og grønne sirklene betegner antall Adam10 og Ripk4 sgRNA leser i bibliotek og transinduserte celler, mens den røde trekanten representerer lesningene til Adam10 sgRNAer og den grønne diamanten representerer lesninger av Ripk4 sgRNAer identifisert i svulster fra separate HNSCC-mus som viser en 1000x foldberikelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

PCR1 fremover primer GAGGGCCTATTTCCCATGATTC
PCR1 omvendt primer CAAACCCAGGGCTGCCTTGGAA

Tabell 1: Primere for PCR1-reaksjon. De fremre og omvendte primerne som brukes til forsterkning av regionen rundt sgRNA-kassetten fra genomisk DNA av celler transdusert med lenti-viruset.

skritt temperatur Tid  
1 98 °C 30 sek
2 98 °C 10 sek
3 66 °C 30 sek
4 72 °C 15 sek 15 sykluser (trinn 2-4)
5 72 °C 2 min.
6 4 °C holde

Tabell 2: PCR1-syklusparametere. PCR-forhold som brukes til forsterkning av regionen rundt sgRNA-kassett fra genomisk DNA av celler transdusert med lenti-viruset.

501 FW AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATAGCCTACACTCTTTCCCTACACG
ACGCTCTTCCGATCTtgtggaaaggacgaaaCACCG
701 RV CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAGTAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT
CTTCCGATCTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC
* De understrekede basene indikerer Illumina (D501-510 for fremover og D701-712 for omvendt) strekkodeplassering som ble brukt til multipleksing.
* Røde fargede baser indikerer sekvensen som binder seg til målstedet på lentiviral CRISPR-plasmid. Denne regionen kan endres i henhold til lentiviral vektor som brukes.

Tabell 3: Barkoding Primers for PCR2 reaksjon. Primere som brukes til å strekkode forsterke hver tumorprøve (enten direkte fra genomisk DNA eller bruke produktene fra PCR1 som mal). Det understrekede området angir det unike strekkodeområdet som kan tilordnes for hvert utvalg for multipleksing i en dyp sekvenseringsreaksjon. De røde fargede basisparene angir målområdet i lentiviral konstruksjonen som disse primerne binder. Dette målområdet kan endres i henhold til typen lentiviral konstruksjon som brukes.

skritt temperatur Tid  
1 98 °C 30 sek
2 98 °C 10 sek
3 68 °C 30 sek
4 72 °C 15 sek 10 sykluser (trinn 2-4)
5 72 °C 2 min.
6 4 °C holde

Tabell 4: PCR2-syklusparametere. PCR forhold som brukes til å strekkode forsterke hver tumor prøve (enten direkte fra genomisk DNA eller bruke produktene fra PCR1 som mal).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CRISPR/Cas9 genomredigering har blitt mye brukt i in vitro- og in vivo-studier for å undersøke genfunksjoner og cellulære prosesser. De fleste in vivo-studier bruker CRISPR/Cas9 genredigerte celler podet inn i en dyremodell (allograft eller xenograft). Selv om dette er et kraftig verktøy for å studere kreftgenetikk og cellulære funksjoner, mangler det fortsatt det innfødte vevsmikromiljøet og kan fremkalle sår og / eller immunresponser.

For å overvinne disse utfordringene har flere grupper vært en pioner innen direkte in vivo CRISPR-tilnærminger som genererer flere, multipleksede autochthonous musemodeller de siste årene15,16,17,18. Disse prosjektene er vanligvis avhengige av adeno-assosiert virus (AAV) for å levere sgRNAer for å målrette organer. AAV tillater generering av svært høyere titer og dermed letter produksjonen høy titer virus som kreves for in vivo manipulasjoner. Imidlertid begrenser bruken av AAVs alvorlig antall gener som kan analyseres til ca 40-50 gener, da AAVs, i motsetning til lentivirus, ikke stabilt integreres i genomisk DNA, noe som gjør avlesning av sgRNA-biblioteker upraktisk. AAV-basert screening krever direkte avlesning av mutasjoner på målområder ved hjelp av for eksempel målrettet sekvensering av fangst. Multiplekset PCR-basert opptakssekvensering begrenser imidlertid antall mål som kan registreres, i et "screenable"-bibliotek vanligvis i rekkefølgentitalls 15,16,17,18.

Sammenlignet med AAV in vivo CRISPR-skjermer, bruker metodikken som er beskrevet her lentivirale sgRNAer. Gitt at lentivirale konstruksjoner integreres i målcellens DNA, kan sgRNA-representasjon analyseres i genomisk DNA som ligner på konvensjonelle CRISPR-skjermer19,20. Dermed tillater denne metodikken samtidig analyse av hundrevis av gener og kan sømløst skaleres opp selv til genomomfattende in vivo-skjermer. For eksempel vil en genom-bred skjerm med 78 000 sgRNAer og en dekning på 30x kreve ~ 90 embryoer som tidligere beskrevet for en lignende shRNA-skjerm4. Ettersom kullstørrelsene til de vanligste innavlede musestammene er rundt 8-12 valper / søppel, og en erfaren kirurg enkelt kan injisere alle mus i løpet av littere, vil bare ~ 10-12 dammer og operasjoner være nødvendig for en slik genomvid bred skjerm.

Suksessen til en in vivo-skjerm hengsler på høy titervirusproduksjon. Mens lentivirale konstruksjoner som uttrykker en sgRNA av interesse, cas9 og cre (f.eks, pSECC) er en praktisk og gjennomførbar alt-i-ett-løsning, har de emballasjegrensen for lentiviral capsid (~ 10 kb i total størrelse), noe som fører til generelt lavere viral titer. For å overvinne denne utfordringen bruker vi R26-LSL-Cas9-GFP-mus og en lenti-viral konstruksjon som bare inneholder Cre-rekombininase sammen med en sgRNA. Den resulterende lentiviral konstruksjonen er bare 7 kb i lengde og gir en viral titer på mer enn 108 PFU / ml.

Målrettede og spesifikke biblioteker kan raskt genereres på så lite som noen få dager, og det komplekse nettverket av genetiske interaksjoner kan studeres in vivo i løpet av få uker. Cas9-mediert mutagenese kan utføres enten i villtype mus for å studere organutvikling, homeostase eller sykdomsfenotyper (kreft, inflammatoriske hudsykdommer, etc.) eller kan lett kombineres med mus som har noen onkogene mutasjoner eller kombinasjon av mutasjoner for å modellere den genetiske statusen som finnes hos menneskelige pasienter. I tillegg kan kloningsmetoden raffineres til klone CRISPRa- eller CRISPRi-biblioteker ved å legge til kompatible begrensningssteder og sgRNA-sekvenser i alt-i-ett-plasmid. Vær oppmerksom på at alle bibliotekene som manipulerer genfunksjoner, ikke bare kan brukes i musemodeller, men også i andre dyremodeller og i organoidkulturer. Sammen fremhever denne metodikken verktøyet og gir en standard for å bruke direkte in vivo CRISPR for å integrere somatisk genredigering og musemodellering for raskt å vurdere genfunksjon in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av et prosjektstipend fra Canadian Institute of Health Research (CIHR 365252), Krembil Foundation og Ontario Research Fund Research Excellence Round 8 (RE08-065). Sampath Kumar Loganathan er mottaker av et kanadisk kreftforeningsstipend (BC-F-16#31919).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 micron filter Sigma S2HVU02RE
12k or 92k oligo chip Customarray Inc. (Genscript)
15 cm cell culture plates Corning
293FT Invitrogen R70007
293NT Systems Biosciences LV900A-1
Alkaline phosphatase NEB M0290L
Amplicillin Fisher Scientific BP1760-25
ATP NEB 9804S
BsmBI NEB R0580L
Chromic gut suture Covidien
Deep sequencing (Next-Seq or Hi-Seq) Illumina
DNA-cleanup kit Zymo Research D4008
DNAesy Blood and Tissue DNA extraction kit Qiagen 69506
Endura electrocompetent cells Lucigen 60242-1
Glass Capillaries Drummond 3-000-203-G/X
HEK293T cells ATCC CRL-3216
High-Speed Centrifuge Beckman Coulter MLS-50
LB Agar Wisent Technologies 800-011-LG
Micropipette puller Sutter Instrument P97
Mineral oil Sigma M5904
Mini-prep plasmid Kit Frogga Bio PDH300
Mouse oxygen anaesthesia system Visual Sonics
Nanoject II micromanipulator Drummond
NEBuffer 3.1 (Buffer for BsmBI) NEB R0580L
Needle sharpener Sutter Instrument BV-10
Oligo cleanup kit Zymo research D4060
PAGE purified illumina sequencing primer IDT DNA
PEI (polyethyleneimine) Sigma 408727-100ML
Permoplast modeling clay
Petridish with central opening Visual Sonics
pMD2.G Addgene 12259
psPAX2 Addgene 12260
Q5 Polymerase 2x Master mix NEB M0494L
Qubit Fluorometric Quantification Invitrogen Q33327
Semicircular Silicone plug Corning
Silicone membrane Visual Sonics
T4 DNA ligase NEB M0202L
Ultra-centrifuge tubes Beckman Coulter 344058
Vevo2000 ultrasound system Visual Sonics

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beronja, S., Fuchs, E. RNAi-mediated gene function analysis in skin. Methods in Molecular Biology. 961, 351-361 (2013).
  2. Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos. Nature Medicine. 16, 821-827 (2010).
  3. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343, 84-87 (2014).
  4. Beronja, S., et al. RNAi screens in mice identify physiological regulators of oncogenic growth. Nature. 501, 185-190 (2013).
  5. Loganathan, S. K., et al. Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling. Science. 367, 1264-1269 (2020).
  6. Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18, 269-282 (2018).
  7. Green, A. C., Olsen, C. M. Cutaneous squamous cell carcinoma: an epidemiological review. British Journal of Dermatology. 177, 373-381 (2017).
  8. Campbell, J. D., et al. pathway network, and immunologic features distinguishing squamous carcinomas. Cell Reports. 23, 194-212 (2018).
  9. Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11, 783-784 (2014).
  10. Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnology. 6, 34 (2006).
  11. Schramek, D., et al. Direct in vivo RNAi screen unveils myosin IIa as a tumor suppressor of squamous cell carcinomas. Science. 343, 309-313 (2014).
  12. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159, 440-455 (2014).
  13. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25 (2009).
  14. Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens. Genome Biology. 15, 554 (2014).
  15. Winters, I. P., Murray, C. W., Winslow, M. M. Towards quantitative and multiplexed in vivo functional cancer genomics. Nature Reviews Genetics. 19, 741-755 (2018).
  16. Rogers, Z. N., et al. Mapping the in vivo fitness landscape of lung adenocarcinoma tumor suppression in mice. Nature Genetics. 50, 483-486 (2018).
  17. Chow, R. D., et al. AAV-mediated direct in vivo CRISPR screen identifies functional suppressors in glioblastoma. Nature Neuroscience. 20, 1329-1341 (2017).
  18. Wang, G., et al. Mapping a functional cancer genome atlas of tumor suppressors in mouse liver using AAV-CRISPR–mediated direct in vivo screening. Science Advances. 4, 5508 (2018).
  19. Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. Pooled CRISPR-based genetic screens in mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (151), e59780 (2019).
  20. Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163, 1515-1526 (2015).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 165 in vivo CRISPR ultralydstyrt mikroinjeksjon langhale CRISPR-bibliotek musemodeller av kreft rask in vivo-skjerm
In Vivo CRISPR/Cas9 Screening for samtidig å evaluere genfunksjon i musehud og munnhule
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Loganathan, S. K., Malik, A.,… More

Loganathan, S. K., Malik, A., Langille, E., Luxenburg, C., Schramek, D. In Vivo CRISPR/Cas9 Screening to Simultaneously Evaluate Gene Function in Mouse Skin and Oral Cavity. J. Vis. Exp. (165), e61693, doi:10.3791/61693 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter