Summary
यहां हम एक तेजी से और प्रत्यक्ष वीवो CRISPR में वर्णन/Cas9 स्क्रीनिंग पद्धति अल्ट्रासाउंड का उपयोग कर-utero भ्रूण लेंटिवायरल इंजेक्शन में निर्देशित करने के लिए एक साथ त्वचा में कई जीन के कार्यों का आकलन और इम्यूनोसंटिम चूहों की मौखिक गुहा ।
Abstract
आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल (GEMM) जीन समारोह का आकलन करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है, मानव रोगों मॉडलिंग, और चिकित्सकीय रास्ते का आकलन करने के लिए पूर्व नैदानिक मॉडल के रूप में सेवारत । हालांकि, उनका समय, श्रम और लागत-प्रधान प्रकृति जीन समारोह के व्यवस्थित विश्लेषण के लिए उनकी उपयोगिता को सीमित करता है। जीनोम-संपादन प्रौद्योगिकियों में हाल की प्रगति उन सीमाओं को दूर करती है और एक मल्टीप्लेक्स और तेजी से तरीके से विशिष्ट माउस अंगों के भीतर सीधे विशिष्ट जीन क्षोभ के तेजी से उत्पादन के लिए अनुमति देती है। यहां, हम त्वचा के एपिथेलियम और चूहों के मौखिक गुहा के भीतर हजारों जीन नॉक-आउट क्लोन उत्पन्न करने के लिए एक CRISPR/Cas9-आधारित विधि (क्लस्टर नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट्स) का वर्णन करते हैं, और ट्यूमर दबाने वाले जीन के लिए वीवो क्रिस्पआर स्क्रीन में प्रत्यक्ष प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक कदमों का ब्यौरा देने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। यह दृष्टिकोण ऊतक होरोस्टेसिस के दौरान या विभिन्न रोग सेटिंग्स में जीन के जैविक कार्य का अध्ययन करने के लिए अन्य अंगों या अन्य CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकियों जैसे CRISPR-सक्रियण या CRISPR-निष्क्रियता पर लागू किया जा सकता है ।
Introduction
जीनोमिक युग के बाद कैंसर अनुसंधान के लिए चुनौतियों में से एक कारण जीन म्यूटेशन के लिए जीनोम डेटा की विशाल मात्रा मेरा और जीन नेटवर्क है कि चिकित्सकीय लक्षित किया जा सकता है में नोड्स की पहचान करने के लिए है । जबकि जैव सूचनाओं के विश्लेषणों ने इन लक्ष्यों की दिशा में काफी मदद की है, विट्रो में कुशल और वीवो मॉडल की स्थापना जैविक प्रणालियों और रोग राज्यों की जटिलता को समझने और दवा विकास को सक्षम करने के लिए एक शर्त है । जबकि पारंपरिक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल बड़े पैमाने पर वीवो कैंसर आनुवंशिकी अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है, उनकी लागत, समय और श्रम गहन प्रकृति काफी हद तक आधुनिक जीनोमिक्स द्वारा सुलझाया ख्यात कैंसर जीन के सैकड़ों के व्यवस्थित विश्लेषण निषिद्ध है । इस अड़चन को दूर करने के लिए, हमने एक CRISPR/Cas9 (क्लस्टर नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट्स) जीन संपादन प्रौद्योगिकी 3 के साथ एक साथ त्वचा में सैकड़ों जीन और एक ही माउस की मौखिक गुहा के नुकसान-समारोह म्यूटेशन को प्रेरित करने और अध्ययन करने के लिए गर्भाशय इंजेक्शन पद्धति1,2 में पहले से स्थापित अल्ट्रासाउंड-निर्देशित संयुक्त किया।
यहां वर्णित पद्धति भ्रूण दिवस E9.5 पर जीवित माउस भ्रूण के एमनियोटिक गुहा में इंजीनियर लेंटीवायरस के अल्ट्रासाउंड निर्देशित इंजेक्शन का उपयोग करती है। CRISPR/Cas9 घटकों युक्त लेंटीवायरल कार्गो एकल स्तरित सतह ectoderm, जो बाद में त्वचा और मौखिक गुहा के epithelium को जंम देता है ट्रांसड्यूस । त्वचा एक बाहरी एपिडर्मिस से बना है, जिसके बाद बेसमेंट झिल्ली और डर्मिस होता है। एपिडर्मिस एक स्तरीकृत एपिथेलियम है जो एक आंतरिक, बेसल परत से बना होता है, जो तहखाने की झिल्ली के साथ संपर्क बनाए रखता है और इसमें प्रोलिफेरेटिव और स्टेम सेल क्षमता होती है। बेसल परत ऊपर की विभेदित परतों को जन्म देती है जैसे कि स्पिनस, दानेदार और स्ट्रैटम कॉर्नियम लेयर्स2,4. वंश ट्रेसिंग अध्ययनों से पता चलता है कि वीवो CRISPR/Cas9 विधि में यह प्रत्यक्ष आनुवंशिक रूप से बेसल परत है कि वयस्कता भर में बनी हुई है के भीतर ऊतक निवासी स्टेम कोशिकाओं में हेरफेर । चूंकि लेंटीवायरस को क्लोनल घनत्व पर E9.5 सतह ectoderm को स्थानांतरित करने के लिए टाइटेड किया जा सकता है, इस विधि का उपयोग हजारों असतत जीन नॉक आउट क्लोन को शरण देने वाले मोज़ेक चूहों को उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। अगली पीढ़ी के अनुक्रमण तो एक मल्टीप्लेक्स तरीके से उन क्लोन के भीतर CRISPR/Cas9-मध्यस्थता जीन ablation के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है5।
हमने हाल ही में 484 जीन के कार्य का आकलन करने के लिए इस विधि का उपयोग किया है जो मानव सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (एचएनएससीसी)5में आवर्ती उत्परिवर्तन दिखाता है। एचएनएससीसी 40-50% की उच्च मृत्यु दर के साथ एक विनाशकारी कैंसर है और यहदुनियाभर में 6सबसे आम कैंसर है । एचएनएससीसी ऊपरी वायुमार्ग या मौखिक गुहा के म्यूकोसल अस्तर में उत्पन्न होता है और तंबाकू और शराब की खपत या मानव पेपिलोमावायरस (एचपीवी) संक्रमण से जुड़ा होता है। क्यूटनीस स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (एससीसी) त्वचा ट्यूमर हैं और मनुष्यों में दूसरे सबसे आम कैंसर का प्रतिनिधित्व करते हैं7। क्यूपनियस एससीसी और एचएनएससीसी हिस्टोलॉजिकल और आणविक रूप से बहुत समान हैं, जिसमें टीपी53, PIK3CA, पायदान1 और एचआरएएस8में परिवर्तन प्रदर्शित करने वाले मामलों का एक उच्च प्रतिशत है। जबकि उच्च आवृत्ति पर केवल मुट्ठी भर जीन उत्परिवर्तित होते हैं, कम आवृत्ति (एंड एलटी; 5%), एक घटना आमतौर पर लंबी पूंछ वितरण के रूप में संदर्भित एक घटना पर उत्परिवर्तित पाए जाते हैं । लंबी पूंछ वाले अधिकांश जीनों में जैविक या नैदानिक सत्यापन की कमी है, इसलिए हमने ट्यूमर-प्रवण चूहों में इन जीनों के मॉडल हानि-कार्य के लिए इस का उपयोग किया, जिसमें p53, Pik3ca या Hras में संवेदीकरण को संवेदनशील बनाने के साथ और कई उपन्यास ट्यूमर दमन जीन की पहचान की गई जो ट्यूमर विकास5को ट्रिगर करने के लिए p53, Pik3ca या Hras के साथ सहयोग करते हैं।
यहां, हम मल्टीप्लेक्सेड एसजीआरएनए लेंटिवायरल CRISPR sgRNA पुस्तकालयों को उत्पन्न करने और माउस सतह ectoderm में CRISPR/Cas9 जीन नॉक आउट स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं । ध्यान दें, इस पद्धति को अन्य जीन हेरफेर प्रौद्योगिकियों जैसे CRISPR सक्रियण (CRISPRa) और CRISPR निष्क्रियता (CRISPRi) को शामिल करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है या जीन कार्यों का अध्ययन करने के लिए माउस में अन्य अंग प्रणालियों को लक्षित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।
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Protocol
इस प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी और टोरंटो विश्वविद्यालय के IACUC के अनुसार प्रदर्शन किया गया था।
1. पूल्ड CRISPR पुस्तकालयों का डिजाइन और क्लोनिंग
- व्यापक संस्थान sgRNA डिजाइनर (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) या CHOPCHOP सर्वर (https://chopchop.cbu.uib.no) जैसे संसाधन से रुचि के माउस जीन को लक्षित करने वाले 4-5 sgRNAs का चयन करें । समान आकार के गैर-लक्षित नियंत्रण जीआरएनए लाइब्रेरी उत्पन्नकरने के लिए समान रूप से आकार के गैर-लक्षित एसजीआरएन से समान संख्या में गैर-लक्षित एसजीआरएन का चयन करें।
- SgRNA पुस्तकालयों का निर्माण करते समय, सुनिश्चित करें कि लक्षित अंग प्रणाली में प्रत्येक sgRNA के लिए पर्याप्त कवरेज है । माउस त्वचा के लिए, E9.5 पर एपिडर्मिस एक एकल परत है जिसमें ~ 150,000 कोशिकाएं होती हैं, जिनमें से अधिकांश में स्टेम सेल क्षमता4होती है। यदि लेंटी-वायरल ट्रांसडक्शन परिणाम 15-20% संक्रमित होता है, तो केवल 18,000-24,000 कोशिकाओं को E9.5 पर स्थानांतरित किया जाएगा। तदनुसार प्रयोग को स्केल करें।
- इन sgRNA पुस्तकालयों की क्लोनिंग और प्रवर्धन के लिए, BSmBI एंजाइम प्रतिबंध साइटों के साथ-साथ प्राइमर बाध्यकारी डीएनए दृश्यों को 5 ' और 3 ' SgRNA के अंत में जोड़ें और परिणामस्वरूप पूर्ण लंबाई ओलिगोस को पूल्ड ओलिगोन्यूक्लियोटाइड चिप(चित्रा 1A)के रूप में ऑर्डर करें ।
- एक चिप पर विभिन्न पुस्तकालयों मल्टीप्लेक्स के लिए, पुस्तकालय विशिष्ट प्राइमर दृश्यों को जोड़ें।
- उपयुक्त प्राइमर जोड़े का उपयोग करना, प्रत्येक पुस्तकालय को पूल किए गए ओलिगो चिप से अलग-अलग बढ़ाना। एक पीसीआर ट्यूब में, 2x पॉलीमरेज मास्टर मिक्स के 25 माइक्रोन, DNase/RNase मुक्त पानी के 20 माइक्रोन, ओलिगो चिप डीएनए के 5 एनजी, उपयुक्त फॉरवर्ड प्राइमर के २.५ माइक्रोन और उपयुक्त रिवर्स प्राइमर के २.५ माइक्रोन मिलाएं । पीसीआर मशीन में प्रत्येक चक्र के लिए 12-15 चक्रों का उपयोग करें और 98 डिग्री सेल्सियस डेनेट्यूशन, 63-67 डिग्री सेल्सियस एनीलिंग, 72 डिग्री सेल्सियस एक्सटेंशन पैरामीटर के साथ बढ़ाना।
- 2.5% एगर उठे जेल पर पीसीआर उत्पाद चलाएं और जेल डीएनए क्लीन-अप किट का उपयोग करके ~ 100 बीपी पीसीआर उत्पाद को शुद्ध करें।
- बैकबोन प्लाज्मिड तैयार करें।
- 55 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 1 घंटे के लिए बीएसएएमबीआई के 2 माइक्रोन के साथ पीएलएकओ-क्रे स्टफर वी 3 प्लाज्मिड युक्त क्रे-रिकॉम्बेन्टिन के 5 माइक्रोन को पचा लें, इसके बाद निर्माता के निर्देशों के अनुसार 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए क्षारीय फॉस्फेटे इनक्यूबेशन 1 माइक्रोन के बाद।
नोट: पीएलको-क्रे स्टफर वी 3 प्लाज्मिड युक्त क्रे-रिकॉम्बेन्नेस एक लेंटी-वायरल आधारित प्लाज्मिड है जिसमें माउस कोशिकाओं में लोक-स्टॉप-लोक्स कैसेट को हटाने के लिए क्रे-रीकॉम्बाइन एंजाइम होता है और sgRNA और tracrRNA की अभिव्यक्ति को चलाने के लिए एक U6 प्रमोटर भी है। Cas9 के साथ और Cas9 के बिना एक संस्करण का उपयोग किया जा सकता है और ऐडजीन #158030 और #158031 पर उपलब्ध है। - 1% एगर उठे जेल पर पचा डीएनए चलाएं और जेल डीएनए क्लीन-अप किट का उपयोग करके 7 केबी रैखिक वेक्टर बैंड को शुद्ध करें। नोट की, एक 2 kb स्टफर बैंड भी एक सफल डाइजेस्ट का संकेत दिखाई देना चाहिए ।
- 55 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 1 घंटे के लिए बीएसएएमबीआई के 2 माइक्रोन के साथ पीएलएकओ-क्रे स्टफर वी 3 प्लाज्मिड युक्त क्रे-रिकॉम्बेन्टिन के 5 माइक्रोन को पचा लें, इसके बाद निर्माता के निर्देशों के अनुसार 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए क्षारीय फॉस्फेटे इनक्यूबेशन 1 माइक्रोन के बाद।
- एक sgRNA प्लाज्मिड पुस्तकालय उत्पन्न करने के लिए लिगेशन प्रतिक्रिया की स्थापना की।
- शुद्ध वेक्टर के 1 माइक्रोन और शुद्ध पीसीआर डालने के 30 एनजी को बीएसएमबीआई के 2 माइक्रोन, टी 4 डीएनए लिगाज़ के 5 माइक्रोन, 10 माइक्रोनएम एटीपी और 1x बफर विशिष्ट के साथ बीएसएमबीआई के 10 एनजी मिलाएं। लिगेशन मिक्स को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। एक अतिरिक्त ट्यूब का उपयोग करें जिसमें पीसीआर डालने को छोड़कर उपरोक्त सभी सामग्रियों को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में शामिल किया जाता है।
- अगले दिन सुबह, ओलिगो क्लीन-अप किट का उपयोग करके लिगेशन मिश्रण को शुद्ध करें और RNase/DNase मुक्त पानी के 7 μL में elute ।
- पुस्तकालय को सक्षम कोशिकाओं में विद्युतीकृत करें।
- बर्फ पर पूर्व-ठंडा क्यूवेट (1.0 मिमी) में गल गए इलेक्ट्रोकंप्यूटेंट कोशिकाओं के 25 माइक्रोन में एल्यूटेड स्ग्रन लाइब्रेरी या नकारात्मक नियंत्रण लिगेशन मिश्रण का 2μL जोड़ें। निर्माता के प्रोटोकॉल (10 माइक्रोनएफ, 600 ओम, 1800 वोल्ट) का पालन करते हुए इलेक्ट्रोपोरेट। क्यूवेट में पल्स के 10 एस के भीतर रिकवरी मीडियम (या एसओसी मीडियम) का 975 माइक्रोन जोड़ें।
- इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं को एक कल्चर ट्यूब में स्थानांतरित करें और 300 आरपीएम पर एक बैक्टीरियल मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
- परिवर्तन दक्षता और प्रति SgRNA पुस्तकालय कवरेज का अनुमान है।
- 100 गुना कमजोर पड़ने की तैयारी करें 10 माइक्रोन को ट्रांसफर करके 10 माइक्रोन में एसग्रेना लाइब्रेरी या निगेटिव कंट्रोल लिगशन के साथ इलेक्ट्रोपाउज्ड सेल्स को रिकवरी मीडियम के 990 माइक्रोन में ट्रांसफर करें और अच्छी तरह से मिक्स करें।
- पतला परिवर्तन मिश्रण की प्लेट 10 माइक्रोन एक पूर्व गर्म 10 सेमी पौंड + एम्पिसिलिन (१०० μg/L) आगर प्लेट पर मिश्रण । इसके परिणामस्वरूप ट्रांसफॉर्मेंट के 10,000 गुना कमजोर पड़ने और परिवर्तन दक्षता की गणना करने के लिए इस प्लेट का उपयोग करें। 14-16 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों के इनक्यूबेशन प्रदर्शन करें।
- कुल 10 पूर्व गर्म 15 सेमी पौंड + एम्पिसिलिन आगर प्लेटों की प्रत्येक प्लेट पर बरामद कोशिकाओं के 100 माइक्रोन फैलाकर बाकी परिवर्तन प्रतिक्रिया की प्लेट करें। 14-16 घंटे के लिए प्लेटों को 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। ध्यान दें, 30 डिग्री सेल्सियस पर वृद्धि वायरल प्लाज्मिड के भीतर दो लंबे टर्मिनल के बीच पुनर्संयोजन को कम करती है।
- क्लोनिंग सफलता का आकलन करने के लिए, परिवर्तन दक्षता की गणना करें। एसग्रण लाइब्रेरी या निगेटिव कंट्रोल लिगेशन (10 सेमी प्लेट्स, स्टेप 1.8.2) से ट्रांसफॉर्मेंट युक्त कमजोर पड़ने वाली प्लेट पर कालोनियों की संख्या गिनें। नकारात्मक नियंत्रण मिश्रण किसी भी या केवल बहुत कम उपनिवेशों नहीं होना चाहिए। कॉलोनियों की कुल संख्या प्राप्त करने के लिए, कॉलोनियों की संख्या को 10,000 से गुणा करें।
नोट: उपनिवेशों की गणना की कुल संख्या एक पुस्तकालय कवरेज का प्रतिनिधित्व करता है जो एसजीआरएनए प्रति 200x कॉलोनियों का न्यूनतम होना चाहिए।- सुनिश्चित करें कि 2000 एसजीआरएनए के साथ एक पुस्तकालय में कम से कम 400,000 कॉलोनियां होंगी। यदि पर्याप्त कॉलोनियां नहीं हैं, तो दोहराएं और अधिक विद्युतपाउशन स्थापित करें।
- गुणवत्ता नियंत्रण: कमजोर पड़ने की प्लेट से, 20 कॉलोनियों को चुनें और प्रत्येक कॉलोनी को एक व्यक्तिगत संस्कृति ट्यूब में जोड़ें जिसमें एलबी मीडिया + एम्पिसिलिन की 3 एमएल होती है। 250 आरपीएम पर 30 डिग्री सेल्सियस मिलाते हुए रात भर सभी 20 ट्यूबों को इनक्यूबेट करें। निर्माता के निर्देशों और Sanger अनुक्रम के अनुसार मिनी तैयारी किट का उपयोग कर प्लाज्मिड डीएनए शुद्ध प्रत्येक नमूने को सत्यापित करने के लिए U6 प्राइमर (5'-GAG GGC सीटीए टीटीटीसी एटीटी एटीटी एटीटी सीसीटी-3') का उपयोग कर एक अलग sgRNA अनुक्रम है ।
- प्रत्येक 15 सेमी प्लेट से कॉलोनियों की कटाई करें।
- एलबी माध्यम के 7 एमएल जोड़ें, फिर सेल स्प्रेडर के साथ एलबी एगर प्लेट से कॉलोनियों को कुरेदें। कोशिकाओं को 2 एल बाँझ शंकु फ्लास्क में स्थानांतरित करने के लिए 10 एमएल पिपेट का उपयोग करें। 2 एल फ्लास्क में सभी प्लेटों और पूल बैक्टीरिया के लिए दोहराएं। 2-3 घंटे के लिए फ्लास्क को 30 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए इनक्यूबेट करें। संस्कृति को अपकेंद्रित्र करें और गोली इकट्ठा करें।
- मैक्सी-प्लाज्मिड शुद्धिकरण किट का उपयोग करके प्लाज्मिड डीएनए को शुद्ध करें।
- अतिरिक्त गुणवत्ता नियंत्रण: मैक्सी-प्रेप sgRNA पुस्तकालय प्लाज्मिड डीएनए के 1 एनजी का उपयोग करें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्राइमर का उपयोग करके एक पीसीआर प्रतिक्रिया चलाएं। पुस्तकालय में सभी एसजीआरएनए के प्रतिनिधित्व को डीप सीक्वेंसिंग प्लेटफॉर्म द्वारा सत्यापित किया जा सकता है।
2. वीवो ट्रांसडक्शन में उच्च टाइटर लेंटीवायरस का उत्पादन उपयुक्त है
नोट: एक कक्षा द्वितीय, टाइप A2 जैवसेफ्टी कैबिनेट में एक BSL2 + सुविधा में प्रोटोकॉल के इस खंड में सभी चरणों का प्रदर्शन करें । 293FT और विशेष रूप से 293NT पैकेजिंग कोशिकाएं उच्च वायरस उत्पादन के लिए अनुमति देती हैं। ट्रांसफेक्शन के लिए कम पैसेज ( 3. अल्ट्रा ध्वनि निर्देशित सर्जरी और इंजेक्शन नोट: इस तकनीक को4,11से अनुकूलित किया गया था । सतह एपिथेलियम के ट्रांजडक्शन की दिशा में सक्षम माइक्रोइंजेक्शन भ्रूणीय दिन E9.5 पर किया जाना चाहिए, जब सतह ectoderm एक परत के होते हैं और E10 से शुरू पेरिडर्म के गठन से पहले, जो इस बेसल परत के लेनदेन को रोकने होगा । अधिमानतः शुक्रवार को चूहों की स्थापना की है, ताकि E9.5 भ्रूण के साथ पहले संभव दिन अगले सोमवार है । इष्टतम CRISPR/Cas9 दक्षता12के लिए Rosa26-Lox-STOP-LOX-Cas9-GFP चूहों (जैक्सन प्रयोगशाला #024857) का उपयोग करें । 4. डीप सीक्वेंसिंग प्रक्रिया
नोट: हमेशा ट्रांसफैक्शन के लिए डीएमईएम की एक खुली या हाल ही में खोली गई बोतल का उपयोग करें, क्योंकि इस कदम पर पीएच महत्वपूर्ण है, और डीएमईएम एक बार खुलने के बाद समय के साथ अधिक बुनियादी हो जाता है।
नोट: जिसके परिणामस्वरूप वायरल निलंबन एक लगभग २,००० गुना एकाग्रता और जिसके परिणामस्वरूप वायरस समाधान उपज चाहिए और 10 7-109है, जो अधिक से अधिक १०० E9.5सर्जरीके लिए काफी अच्छा है के वायरल टाइटर होना चाहिए नीचे वर्णित है ।
नोट: अपने अकांरोहण वायरल सुपरनेट के साथ केंद्रित वायरल निलंबन के बीच तुलना (1) वायरल उत्पादन के साथ-साथ (2) वायरल एकाग्रता की सफलता का अनुमान लगाने की अनुमति देगी। वैकल्पिक रूप से, क्यूआरटी-पीसीआर विधि10का उपयोग करके वायरल टिटर का अनुमान लगाया जा सकता है। बड़े पैमाने पर उत्पादन और लेंटीवायरस की एकाग्रता भी एक कारतूस एकाग्रता के साथ एक दो कदम एकाग्रता का उपयोग कर प्रदर्शन किया जा सकता है जिसके बाद अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन के रूप में पहले वर्णित2।
नोट: संज्ञाहरण के 30 मिनट से अधिक नहीं है के रूप में गर्भवती बांधों बहुत अधिक है कि समय से परे अपने भ्रूण गर्भपात की संभावना है । एक अनुभवी सर्जन 30 मिनट की सर्जरी के भीतर 12 भ्रूण तक इंजेक्ट कर सकते हैं ।
नोट: गर्भाशय सर्जरी में निर्देशित अल्ट्रा-साउंड का प्रदर्शन करते समय, स्वच्छ वातावरण बनाए रखने, जितना संभव हो उतना बंध्यता बनाए रखने और किसी भी संभावित संदूषकों से बचने के लिए अत्यंत सावधानी बरती जानी चाहिए। यदि एक ही दिन एक से अधिक सर्जरी की जानी चाहिए, तो एक मनका स्टरलाइजर का उपयोग करके विच्छेदन उपकरणों को स्टरलाइज करना महत्वपूर्ण है और अन्य उपकरण को साफ करना जो माउस ऊतक को इथेनॉल से साफ करता है। यह सर्जरी के बाद भ्रूण के उच्च अस्तित्व को बहुत बढ़ाता है। सर्जरी विधि के लिए जीवित रहने की दर यहां वर्णित 80-100% के बीच लगातार है ।
नोट: चूहों को सबसे अच्छा फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके पोस्टनेटल दिन 3 तक पहचाना जाता है इससे पहले कि बाल बढ़ने लगते हैं।
नोट: समय के साथ SgRNA गुना परिवर्तनों की गणना करने की अनुमति देने के लिए एक संदर्भ नमूना उत्पन्न करना महत्वपूर्ण है। संक्रमण या ट्रांसड्यूडेड कोशिकाओं के बाद 3 दिन ट्रांसड्यूडेड भ्रूण (चरण 2. 6 देखें) मूल पुस्तकालय में sgRNA प्रतिनिधित्व निर्धारित करने के लिए संदर्भ नमूना के रूप में काम कर सकते हैं।
नोट: प्रयोगशाला के एक अलग समर्पित क्षेत्र में या एक ऊतक संस्कृति हुड में बार्कोडिंग पीसीआर प्रतिक्रिया स्थापित करें जिसे डीएनए द्वारा अच्छी तरह से साफ किया जाता है ताकि किसी भी संदूषण से बचा जा सके। यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोई प्रदूषण नहीं है, टेम्पलेट के रूप में पानी के साथ प्रत्येक पीसीआर प्लेट के लिए नकारात्मक नियंत्रण चलाएं।
नोट: पूर्व प्रवर्धन कदम केवल एक जटिल स्थानांतरित ऊतक के प्रवर्धन के लिए आवश्यक है । यदि एक ट्यूमर है कि संभवतः एक क्लोनल सेल के रूप में विकसित बढ़ाना और इस तरह सिर्फ एक sgRNA शामिल है, एक पूर्व प्रवर्धन PCR1 छोड़ सकते है और सीधे PCR2 के साथ दूर आगे बढ़ना ।
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Representative Results
चित्रा 1A एक 12k या 92k ओलिगो चिप में लागत प्रभावी तरीके से कई कस्टम CRISPR पुस्तकालयों मल्टीप्लेक्सिंग के लिए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के डिजाइन से पता चलता है । एक बार जब एसजीआरएनए (नीला रंग कोडित) का चयन किया जाता है, तो ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को प्रतिबंध साइटों (नारंगी रंग की बीएसएमबीआई) और पुस्तकालय विशिष्ट पीसीआर प्राइमर जोड़े (हरा रंग कोडित) के साथ डिज़ाइन किया जाता है। एक ओलिगो चिप में मल्टीप्लेक्सिंग के लिए प्राइमर जोड़े के अनूठे संयोजन का उपयोग करके कई पुस्तकालयों को डिजाइन किया जा सकता है। जब पीसीआर एक विशिष्ट पीसीआर प्राइमर जोड़ी का उपयोग कर पुस्तकालयों बढ़ाना, हमेशा एक पानी केवल नकारात्मक नियंत्रण शामिल है और एक agarose जेल पर सभी प्रतिक्रियाओं को चलाने के लिए । निगेटिव कंट्रोल लेन में 100 बीपी पर कोई बैंड नहीं होना चाहिए, जबकि लाइब्रेरी एम्पलीफायर लेन में सिंगल 100 बीपी बैंड होना चाहिए। यदि कोई बैंड नहीं है, तो सुनिश्चित करें कि पीसीआर प्राइमर जोड़ी का चयन उचित रूप से किया जाता है। चित्रा 1B क्लोन पुस्तकालय के गुणवत्ता नियंत्रण कदम और वायरल उत्पादन और एकाग्रता प्रक्रिया से पता चलता है । एसजीआरएनए के समान प्रतिनिधित्व को क्लोनिंग से लेकर ट्रांसडक्शन तक संरक्षित करने का ध्यान रखा जाना चाहिए । अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्लाज्मिड और लेंटी वायरल पुस्तकालय ट्रांसड्यूडेड कोशिकाओं से पीसीआर प्रवर्धित डीएनए के पढ़ता है एक उच्च संबंध दिखाना चाहिए । किसी भी विचलन का विश्लेषण ध्यान से यह जांचने के लिए किया जाना चाहिए कि लेटी-वायरस की तैयारी से पहले या बाद में प्रतिनिधित्व खो जाता है या नहीं। यदि SgRNA प्लाज्मिड डीएनए से पढ़ता है sgRNAs के समान प्रतिनिधित्व नहीं दिखा, तो वायरल तैयारी और एकाग्रता प्रक्रिया देखभाल के साथ दोहराया जाना चाहिए । यदि समान sgRNA प्रतिनिधित्व का नुकसान प्लाज्मिड डीएनए में हुआ, तो पूरी क्लोनिंग प्रक्रिया को कम प्रवर्धन चक्र के साथ ओलिगो चिप से पुस्तकालयों की पीसीआर प्रवर्धन सहित दोहराया जाना चाहिए । CRISPR पुस्तकालय स्क्रीनिंग की सफलता पुस्तकालय में मौजूद एसजीआरएनए के समान प्रतिनिधित्व पर गंभीर रूप से निर्भर करती है।
चित्रा 2 गर्भवती माउस में E9.5 भ्रूण में हेरफेर के लिए स्थापित अल्ट्रासाउंड निर्देशित माइक्रो इंजेक्शन से पता चलता है । पूरी प्रक्रिया की बाँझ स्थिति को बनाए रखने और शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के कारण गर्भवती माउस के किसी भी संक्रमण से बचने के लिए पूरे सेट-अप को जैव सुरक्षा स्तर वर्ग द्वितीय कैबिनेट के तहत रखा गया है। इंजेक्शन लगाते समय गर्भाशय के सींगों पर दबाव बनने से बचने के लिए सावधानी बरतनी चाहिए। सुई बहुत तेज होनी चाहिए, ताकि गर्भाशय की दीवार और एमनियोटिक झिल्ली पर घाव कम से कम हो।
चित्रा 3 के बाद दिन (पी) 0 में E9.5 Lox-stop-Lox (LSL) कंफ़ेटी माउस पिल्ले में क्रे-recombinase ले जाने लेंटी-वायरस के अल्ट्रा ध्वनि निर्देशित इंजेक्शन के परिणामों से पता चलता है । वायरल टाइटर को एपिडर्मिस का उचित ट्रांसडक्शन कवरेज प्राप्त करने के लिए समायोजित किया जा सकता है। जबकि वायरस के उच्च टाइटर माउस त्वचा के बड़े कवरेज में परिणाम होगा, यह भी एक ही संभावित परिणाम confounding कोशिका में कई sgRNAs के लेनदेन में परिणाम होगा । एक ही कोशिका के कई ट्रांसडक्शन को कम करने के लिए, संक्रमण दर को और एलटी;20% रखा जाना चाहिए।
चित्रा 4 से पता चलता है अगली पीढ़ी अनुक्रमण प्लाज्मिड और लेंटी वायरल पुस्तकालय ट्रांसड्यूस कोशिकाओं से पीसीआर प्रवर्धित डीएनए के पढ़ता है और यह भी 4 प्रतिनिधि ट्यूमर से पढ़ता है । प्लाज्मिड पूल या संक्रमित कोशिकाओं में sgRNA प्रस्तुति की तुलना में Adam10 और Ripk4 को लक्षित करने वाले sgRNA गाइड ट्यूमर नमूनों (त्रिकोण और हीरे) में समृद्ध होते हैं। Adam10 और Ripk4 ट्यूमर दबाने के रूप में कार्य5। प्रोटोकॉल में उल्लिखित प्रत्येक नमूने को अद्वितीय बारकोड और गहरे अनुक्रम को निर्दिष्ट करके कई सौ ट्यूमर को मल्टीप्लेक्स किया जा सकता है।
चित्रा 1: लक्षित CRISPR पुस्तकालय की क्लोनिंग। (क)12 कश्मीर या 92 k कस्टम ओलिगो चिप के लिए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के डिजाइन का प्रतिनिधित्व करने वाला योजनाबद्ध। SgRNA के प्रत्येक पक्ष पर BSmBI (या अन्य संगत) प्रतिबंध साइटों (नारंगी रंग कोडित और रेखांकित) जोड़े गए थे। तीर सिर BSmBI कट साइट का संकेत देते हैं। प्रत्येक पुस्तकालय के लिए, पीसीआर प्राइमर (हरा, भूरा और बैंगनी रंग कोडित) की एक अनूठी जोड़ी जोड़ी गई थी, ताकि इसे विशेष रूप से पूल्ड चिप से पीसीआर का उपयोग करके परिलक्षित किया जा सके। कई कस्टम पुस्तकालयों को 12k या 92k ओलिगो तक मल्टीप्लेक्स किया जा सकता है। (ख)प्लाज्मिड डीएनए बनाम डीएनए में एक CRISPR पुस्तकालय से sgRNA प्रतिनिधित्व दिखा ग्राफ एक ही लेंटीविरायल पुस्तकालय के साथ स्थानांतरित कोशिकाओं से । प्रत्येक डॉट एक गाइड का प्रतिनिधित्व करता है। बहुतायत में कुछ सहसंबंध के साथ लेनदेन के बाद पूर्ण प्रतिनिधित्व बनाए रखा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: अल्ट्रासाउंड निर्देशित माइक्रोइंजेक्शन सेट-अप की तस्वीर। (ए)E9.5 भ्रूण ले जाने वाले माउस को एनेस्थेटाइज्ड किया गया था और पीबीएस से भरे संशोधित पेट्री डिश चैंबर (चार मॉडलिंग क्ले द्वारा स्थिर) में उजागर गर्भाशय के साथ एक गर्म मंच पर रखा गया था। नीले अर्द्ध दौर रबर भ्रूण युक्त गर्भाशय का समर्थन किया और माइक्रोइंजेक्टर से इंजेक्शन सुई दाईं ओर तैनात है । अल्ट्रासाउंड स्कैन सिर सुई सिर दिखाई के साथ पीछे मॉनिटर करने के लिए शीर्ष रिलेिंग लाइव छवि पर मुहिम शुरू की थी । (ख)E9.5 भ्रूण की क्लोज-अप अल्ट्रा-साउंड इमेज । लेंटीविरायल पुस्तकालय को एमनियोटिक गुहा में सुई (दाईं ओर देखा गया) के साथ इंजेक्ट किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3: माउस में सतह एपिथेलियम का सफल लेनदेन। पूरे शरीर, मौखिक गुहा, जीभ, और नवजात क्रे के तालु की फ्लोरोसेंट छवियां-रिपोर्टर एलएसएल-कंफ़ेटी चूहों क्रे लेंटिवायरस (इनलेट: इसी सफेद प्रकाश छवियों) के साथ ट्रांसड्यूडेड। स्केल बार = 500 माइक्रोन कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: ट्यूमर के नमूनों की गहरी अनुक्रमण। एक ही लेंटीविरायल पुस्तकालय के साथ स्थानांतरित कोशिकाओं से प्लाज्मिड डीएनए बनाम डीएनए में एक CRISPR पुस्तकालय से sgRNA प्रतिनिधित्व दिखा ग्राफ और 4 प्रतिनिधि ट्यूमर से पढ़ता है के अलावा । लाल और हरे रंग की हलकों Adam10 और Ripk4 sgRNA की संख्या निरूपित पुस्तकालय और ट्रांसड्यूड कोशिकाओं में पढ़ता है, जबकि लाल त्रिकोण Adam10 sgRNAs के पढ़ता है और हरे हीरे का प्रतिनिधित्व करता है Ripk4 sgRNAs अलग HNSCC चूहों से ट्यूमर में पहचान की एक 1000x गुना संवर्धन दिखा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| पीसीआर1 फॉरवर्ड प्राइमर | गगनचक्सीटीसीटीसी |
| पीसीआर1 रिवर्स प्राइमर | CAAACCCAGGGCTGCCTTGGAA |
तालिका 1: पीसीआर1 प्रतिक्रिया के लिए प्राइमर। आगे और रिवर्स प्राइमर का उपयोग स्पिग्र्ना कैसेट के आसपास के क्षेत्र के प्रवर्धन के लिए किया जाता है जो लेंटी वायरस के साथ स्थानांतरित कोशिकाओं के जीनोमिक डीएनए से होता है।
| कहीं जाना | तापमान | समय | |
| 1 | 98 डिग्री सेल्सियस | 30 सेकंड | |
| 2 | 98 डिग्री सेल्सियस | 10 सेकंड | |
| 3 | 66 डिग्री सेल्सियस | 30 सेकंड | |
| 4 | 72 डिग्री सेल्सियस | 15 सेकंड | 15 चक्र (चरण 2-4) |
| 5 | 72 डिग्री सेल्सियस | 2 मिनट | |
| 6 | 4 डिग्री सेल्सियस | पकड |
तालिका 2: पीसीआर1 चक्र पैरामीटर। पीसीआर की स्थिति लेंटी वायरस के साथ स्थानांतरित कोशिकाओं के जीनोमिक डीएनए से SgRNA कैसेट आसपास के क्षेत्र के प्रवर्धन के लिए इस्तेमाल किया ।
| 501 एफडब्ल्यू | AATGATACGGCGACCACCGATGATCTACACTATAGCCCCCCCCACTCTCCCCCCACACACG एसीजीसीटीसीटीसीटीसीटीसीटीसीटीजीटीजीएएसीएसीसीजी |
||
| 701 आरवी | CAAGCAAGACGGCATACGAGATGGGATGGATGGATGGGGGGATGGGGGGGGGGGTGTGTGTGTGTGCTCT सीटीटीसीसीटीसीटीएएसीटीसीटीसीएएएसी |
||
| * रेखांकित कुर्सियां इलुमिना (फॉरवर्ड के लिए D501-510 और रिवर्स के लिए D701-712) बारकोड स्थान है कि मल्टीप्लेक्सिंग के लिए इस्तेमाल किया गया संकेत मिलता है । | |||
| * लाल रंग के आधार उस अनुक्रम को इंगित करते हैं जो लेंटीवायरल क्रिस्पर प्लाज्मिड पर लक्ष्य स्थल पर बांधते हैं। इस क्षेत्र को उपयोग किए गए लेंटीविरल वेक्टर के अनुसार संशोधित किया जा सकता है। | |||
तालिका 3: पीसीआर 2 प्रतिक्रिया के लिए बार्कोडिंग प्राइमर। प्राइमर प्रत्येक ट्यूमर नमूने को बढ़ाना (या तो सीधे जीनोमिक डीएनए से या टेम्पलेट के रूप में PCR1 से उत्पादों का उपयोग) को बढ़ाना बारकोड करने के लिए इस्तेमाल किया जाता था। रेखांकित क्षेत्र अद्वितीय बारकोड क्षेत्र को इंगित करता है जिसे एक गहरी अनुक्रमण प्रतिक्रिया में मल्टीप्लेक्सिंग के लिए प्रत्येक नमूने के लिए सौंपा जा सकता है। लाल रंग के आधार जोड़े लेंटीवायरल निर्माण में लक्ष्य क्षेत्र का संकेत देते हैं जो ये प्राइमर बांधते हैं। इस लक्ष्य क्षेत्र को उपयोग किए जाने वाले लेंटीविरल निर्माण के प्रकार के अनुसार संशोधित किया जा सकता है।
| कहीं जाना | तापमान | समय | |
| 1 | 98 डिग्री सेल्सियस | 30 सेकंड | |
| 2 | 98 डिग्री सेल्सियस | 10 सेकंड | |
| 3 | 68 डिग्री सेल्सियस | 30 सेकंड | |
| 4 | 72 डिग्री सेल्सियस | 15 सेकंड | 10 चक्र (चरण 2-4) |
| 5 | 72 डिग्री सेल्सियस | 2 मिनट | |
| 6 | 4 डिग्री सेल्सियस | पकड |
तालिका 4: पीसीआर 2 चक्र पैरामीटर। पीसीआर की स्थिति प्रत्येक ट्यूमर नमूने को बढ़ाना (या तो सीधे जीनोमिक डीएनए से या टेम्पलेट के रूप में PCR1 से उत्पादों का उपयोग) को बढ़ाना करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है।
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Discussion
CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन व्यापक रूप से इन विट्रो में और वीवो अध्ययन में जीन कार्यों और सेलुलर प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । वीवो अध्ययनों में अधिकांश CRISPR/Cas9 जीन संपादित कोशिकाओं का उपयोग एक पशु मॉडल (एलोबेड़ा या विद्वेष) में कलम करते हैं । हालांकि यह कैंसर आनुवंशिकी और सेलुलर कार्यों का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, यह अभी भी देशी ऊतक microenvironment का अभाव है और घायल और/
इन चुनौतियों से उबरने के लिए, कई समूहों ने वीवो CRISPR दृष्टिकोण में प्रत्यक्ष बीड़ा उठाया है, जो पिछले कुछ वर्षोंमें15, 16,17, 18मेंकई,मल्टीप्लेक्स किए गए ऑटोचथॉनस माउस मॉडल उत्पन्न करते हैं। ये परियोजनाएं आमतौर पर अंगों को लक्षित करने के लिए sgRNAs वितरित करने के लिए एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) पर भरोसा करती हैं। एएवी बहुत अधिक टाइटर के उत्पादन के लिए अनुमति देता है जिससे वीवो जोड़तोड़ में आवश्यक उच्च टाइटर वायरस के उत्पादन को सुविधाजनक बनाता है। हालांकि, AAVs का उपयोग गंभीर रूप से जीन की संख्या को सीमित करता है जिसका विश्लेषण लगभग 40-50 जीनों तक किया जा सकता है, क्योंकि एएवी, लेंटीवायरस के विपरीत, जीनोमिक डीएनए में स्थिर रूप से एकीकृत नहीं होते हैं, जिससे SgRNA पुस्तकालयों का पठनीय रूप से अव्यावहारिक हो जाता है । एएवी आधारित स्क्रीनिंग के लिए लक्षित साइटों में म्यूटेशन के सीधे रीडआउट की आवश्यकता होती है, उदाहरण के लिए, लक्षित कैप्चर अनुक्रमण का उपयोग करना। हालांकि, मल्टीप्लेक्स पीसीआर आधारित कैप्चर अनुक्रमण आमतौर पर दर्जनों15, 16, 17, 18के आदेश के लिए एक 'स्क्रीनेबल' पुस्तकालय में कब्जा करने योग्य लक्ष्यों की संख्या को प्रतिबंधित करता है।
वीवो CRISPR स्क्रीन में एएवी की तुलना में, यहां वर्णित पद्धति लेंटीविराल sgRNAs का उपयोग करता है । यह देखते हुए कि लेंटीवायरल निर्माण लक्ष्य कोशिका के डीएनए में एकीकृत होते हैं, एसजीआरएनए प्रतिनिधित्व का विश्लेषण जीनोमिक डीएनए में किसी भी पारंपरिक CRISPR स्क्रीन19,20के समान किया जा सकता है। इस प्रकार, यह पद्धति सैकड़ों जीनों के एक साथ विश्लेषण की अनुमति देती है और वीवो स्क्रीन में जीनोम-वाइड तक मूल रूप से बढ़ाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, 78,000 sgRNAs के साथ एक जीनोम-वाइड स्क्रीन और 30x के कवरेज के लिए ~ 90 भ्रूण की आवश्यकता होगी जैसा कि पहले समान श्र्ना स्क्रीन4के लिए वर्णित है। के रूप में सबसे आम inbred माउस उपभेदों के कूड़े के आकार के आसपास है 8-12 पिल्ले/कूड़े और एक अनुभवी सर्जन आसानी से एक littler के भीतर सभी चूहों सुई कर सकते हैं, केवल के बारे में ~10-12 बांधों और सर्जरी इस तरह के एक जीनोम चौड़ा स्क्रीन के लिए आवश्यक होगा ।
वीवो स्क्रीन में एक की सफलता उच्च टाइटर वायरस उत्पादन पर टिका है। जबकि लेंटीवायरल ब्याज की एक sgRNA व्यक्त करता है, Cas9 और Cre (जैसे, पीएसईसीसी) एक सुविधाजनक और व्यवहार्य ऑल-इन-वन समाधान हैं, उनके पास लेंटीविराल कैप्सिड (कुल आकार में ~ 10 किलोबी) के लिए पैकेजिंग सीमा है, जिससे समग्र रूप से कम वायरल टाइटर होता है। इस चुनौती से उबरने के लिए, हम R26-LSL-Cas9-GFP चूहों और एक लेंथी-वायरल निर्माण का उपयोग करते हैं जिसमें एक sgRNA के साथ केवल क्रे-रिकॉम्बिनेंट शामिल है। परिणामस्वरूप लेंटीविराल निर्माण लंबाई में केवल 7 केबी है और 108 पीएलयू/एमएल से अधिक का वायरल टाइटर पैदा करता है।
लक्षित और विशिष्ट पुस्तकालयों को जल्दी से कुछ दिनों के रूप में कम से कम उत्पन्न किया जा सकता है और आनुवंशिक बातचीत के जटिल नेटवर्क का कुछ हफ्तों के भीतर वीवो में अध्ययन किया जा सकता है। Cas9-मध्यस्थता वाले म्यूटेनेसिस को या तो जंगली प्रकार के चूहों में अंग विकास, होमोस्टेसिस या रोग फेनोटाइप (कैंसर, भड़काऊ त्वचा रोगों, आदि) का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है या मानव रोगियों में पाए जाने वाले आनुवंशिक स्थिति को मॉडल करने के लिए किसी भी ऑन्कोजेनिक म्यूटेशन या म्यूटेशन के संयोजन को आश्रय देने वाले चूहों के साथ आसानी से जोड़ा जा सकता है। इसके अलावा, क्लोनिंग पद्धति को सभी-इन-वन प्लाज्मिड में संगत प्रतिबंध साइटों और sgRNA दृश्यों को जोड़कर CRISPRA या CRISPRi पुस्तकालयों का क्लोन बनाने के लिए परिष्कृत किया जा सकता है। ध्यान दें, जीन कार्यों में हेरफेर करने वाले सभी पुस्तकालयों का उपयोग न केवल माउस मॉडल में बल्कि अन्य पशु मॉडलों और ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों में भी किया जा सकता है। साथ में, यह पद्धति उपयोगिता पर प्रकाश डालती है और वीवो में जीन फ़ंक्शन का तेजी से आकलन करने के लिए दैहिक जीन संपादन और माउस मॉडलिंग को एकीकृत करने के लिए वीवो CRISPR में प्रत्यक्ष उपयोग करने के लिए एक बॉयलरप्लेट प्रदान करती है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम को कनाडा के इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ रिसर्च (सीआईएचआर 365252), क्रेम्बिल फाउंडेशन और ओंटारियो रिसर्च फंड रिसर्च एक्सीलेंस राउंड 8 (आरई08-065) से एक परियोजना अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। संपत कुमार लोगनाथन कनाडा के कैंसर सोसायटी फेलोशिप (बीसी-एफ-16 #31919) के प्राप्तकर्ता हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 micron filter | Sigma | S2HVU02RE | |
| 12k or 92k oligo chip | Customarray Inc. (Genscript) | ||
| 15 cm cell culture plates | Corning | ||
| 293FT | Invitrogen | R70007 | |
| 293NT | Systems Biosciences | LV900A-1 | |
| Alkaline phosphatase | NEB | M0290L | |
| Amplicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| ATP | NEB | 9804S | |
| BsmBI | NEB | R0580L | |
| Chromic gut suture | Covidien | ||
| Deep sequencing (Next-Seq or Hi-Seq) | Illumina | ||
| DNA-cleanup kit | Zymo Research | D4008 | |
| DNAesy Blood and Tissue DNA extraction kit | Qiagen | 69506 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 60242-1 | |
| Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High-Speed Centrifuge | Beckman Coulter | MLS-50 | |
| LB Agar | Wisent Technologies | 800-011-LG | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Mini-prep plasmid Kit | Frogga Bio | PDH300 | |
| Mouse oxygen anaesthesia system | Visual Sonics | ||
| Nanoject II micromanipulator | Drummond | ||
| NEBuffer 3.1 (Buffer for BsmBI) | NEB | R0580L | |
| Needle sharpener | Sutter Instrument | BV-10 | |
| Oligo cleanup kit | Zymo research | D4060 | |
| PAGE purified illumina sequencing primer | IDT DNA | ||
| PEI (polyethyleneimine) | Sigma | 408727-100ML | |
| Permoplast modeling clay | |||
| Petridish with central opening | Visual Sonics | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| Q5 Polymerase 2x Master mix | NEB | M0494L | |
| Qubit Fluorometric Quantification | Invitrogen | Q33327 | |
| Semicircular Silicone plug | Corning | ||
| Silicone membrane | Visual Sonics | ||
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| Ultra-centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Vevo2000 ultrasound system | Visual Sonics |
References
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