Summary
Dit protocol beschrijft de voorbereiding van horizontale hippocampal-entorhinal cortex (HEC) plakjes van muizen die spontane scherpe golf rimpelactiviteit vertonen. Plakjes worden geïncubeerd in een vereenvoudigde interface-holdingkamer en opnames worden uitgevoerd onder ondergedompelde omstandigheden met snelstromende kunstmatige cerebrospinale vloeistof om weefsel oxygenatie en de spontane opkomst van activiteit op netwerkniveau te bevorderen.
Abstract
Acute knaagdierhersenensnijden biedt een tracteerbare experimentele aanpak om inzicht te krijgen in de organisatie en functie van neurale circuits met eencellige resolutie met behulp van elektrofysiologie, microscopie en farmacologie. Een belangrijke overweging bij het ontwerp van in vitro experimenten is echter de mate waarin verschillende segmentpreparaten naturalistische patronen van neurale activiteit zoals waargenomen in vivo samenvatten. In de intacte hersenen genereert het hippocampale netwerk sterk gesynchroniseerde populatieactiviteit die de gedragstoestand van het dier weerspiegelt, zoals wordt geïllustreerd door de scherpegolfrimpelcomplexen (SWR's) die optreden tijdens het ontwaken van verbruikstoestanden of niet-REM-slaap. SWR's en andere vormen van netwerkactiviteit kunnen spontaan ontstaan in geïsoleerde hippocampale plakjes onder de juiste omstandigheden. Om de krachtige brain slice toolkit toe te passen op het onderzoek naar hippocampale netwerkactiviteit, is het noodzakelijk om een aanpak te gebruiken die de weefselgezondheid en het behoud van functionele connectiviteit binnen het hippocampale netwerk optimaliseert. Muizen zijn transcardieel doordrenkt met kunstmatige cerebrospinale vloeistof op basis van koude sucrose. Horizontale plakjes met de hippocampus worden gesneden met een dikte van 450 μm om synaptische connectiviteit te behouden. Plakjes herstellen zich in een interface-achtige kamer en worden overgebracht naar een ondergedompelde kamer voor opnames. De opnamekamer is ontworpen voor dubbele oppervlaktesuperfusie van kunstmatige cerebrospinale vloeistof met een hoog debiet om de oxygenatie van de plak te verbeteren. Dit protocol levert gezond weefsel op dat geschikt is voor het onderzoek van complexe en spontane netwerkactiviteit in vitro.
Introduction
Elektrofysiologische meting van levende hippocampale plakjes in vitro is een krachtige experimentele aanpak met tal van voordelen. De experimenteerder kan een microscoop, micromanipulatoren en een opnamesysteem gebruiken om metingen van individuele neuronen in het weefsel direct te visualiseren en te verzamelen. Weefselplakken zijn ook zeer toegankelijk voor fotostimulatie of medicijnafgifte voor optogenetische, chemogenetische of farmacologische experimenten.
Het hippocampale netwerk genereert zeer synchrone populatieactiviteit in vivo, zichtbaar als oscillaties in het extracellulaire lokale veldpotentieel1,2,3,4,5. Hersenschijfmethoden zijn gebruikt om inzicht te krijgen in de cellulaire en circuitmechanismen die ten grondslag liggen aan deze neuronale netwerkschommelingen. Fundamenteel werk van Maier et al. toonde aan dat scherpe golf-rimpelcomplexen (SWR's) spontaan kunnen ontstaan in plakjes van de ventrale hippocampus6,7. Latere studies van meerdere onderzoekers hebben geleidelijk vele aspecten van SWR 's opgehelderd, waaronder de rol van neuromodulatoren bij het reguleren van de netwerktoestand van de hippocampus8,9,10 en de synaptische mechanismen die de in vitro reactivering stimuleren van neuronale ensembles die eerder actief waren tijdens gedrag in vivo11. Hersensegmentexperimenten hebben ook inzicht gegeven in de oscillatie van het gammabereik (30-100 Hz), een duidelijke hippocampale netwerkstatus waarvan wordt aangenomen dat deze geheugencodering ondersteunt en12,13terugroept. Ten slotte, het erkennen van de centrale rol van de hippocampus en bijbehorende structuren in de pathofysiologie van temporale kwab epilepsie14,15, onderzoekers hebben hippocampale plakpreparaten gebruikt om de generatie en propagatie van epileptiforme activiteit te onderzoeken. Carter et al. toonden aan dat gecombineerde hippocampal-entorhinale cortex plakjes bereid van chronisch epileptische dieren spontaan epileptiforme afscheidingen kunnen genereren in vitro16. Vervolgens onderzochten Karlócai et al. de mechanismen die ten grondslag liggen aan epileptiforme lozingen in hippocampale plakjes met behulp van gemodificeerde kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) met gewijzigde ionenconcentraties (verlaagde Mg2+ of verhoogde K+) of toegevoegde geneesmiddelen (4AP of gabazine)17.
Onderzoekers hebben tal van hippocampale segmentbenaderingen ontwikkeld die op belangrijke manieren verschillen: (1) het gebied van de hippocampus in de plak (dorsaal, gemiddeld of ventral); (2) de aan- of afwezigheid van extrahippocampale weefsels zoals de entorhinale cortex; (3) de oriëntatie die wordt gebruikt om plakjes te snijden (coronaal, sagittaal, horizontaal of schuin); en (4) de omstandigheden waaronder het weefsel wordt onderhouden na het snijden (volledig ondergedompeld in ACSF of vastgehouden op het raakvlak van ACSF en bevochtigde, carbogenrijke lucht).
De keuze van de gebruiksbenadering moet worden bepaald door de experimentele doelstelling. Transversale of coronale plakjes van de dorsale hippocampus die onder ondergedompelde omstandigheden worden gehouden , zijn bijvoorbeeld zeer effectief gebruikt voor het onderzoek naar intrahippocampale circuits en synaptische plasticiteit18,19,20. Dergelijke preparaten genereren echter niet spontaan netwerkschommelingen zo gemakkelijk als plakjes uit de ventrale hippocampus21,22,23. Hoewel een toestand van aanhoudende SWR-activiteit kan worden geïnduceerd door tetanische stimulatie in dwarse plakjes van de dorsale en ventrale hippocampus24, worden spontane SWR 's gemakkelijker waargenomen in ventrale plakjes7,25.
Een inherent fysiologisch en anatomisch onderscheid tussen de dorsale en ventrale hippocampus wordt ondersteund door studies die zowel in vivo als in vitro26zijn uitgevoerd . Opnames bij ratten toonden sterk coherente thetaritmes in de dorsale en intermediaire hippocampus, maar slechte samenhang tussen het ventrale gebied en de rest van de hippocampus27. SWR's in vivo vermeerderen zich gemakkelijk tussen de dorsale en intermediaire hippocampus, terwijl SWR's die afkomstig zijn uit de ventrale hippocampus vaak lokaal blijven28. De associatieprojecties afkomstig van CA3 piramidale neuronen die zich in de dorsale en intermediaire hippocampus bevinden, projecteren lange afstanden langs de lengteas van de hippocampus. CA3-projecties afkomstig uit ventrale regio 's blijven relatief lokaal en zullen dus minder snel worden doorgesneden tijdens het snijproces29,30. Ventrale segmenten kunnen daarom het terugkerende netwerk dat nodig is om populatiesynchronisatie te genereren, beter behouden. De neiging van ventrale segmenten om spontane netwerkactiviteiten in vitro te genereren , kan ook een hogere intrinsieke prikkelbaarheid van piramidale neuronen of zwakkere GABAergische remming in de ventrale hippocampus weerspiegelen in vergelijking met meer dorsale regio 's31. Ventrale hippocampale plakjes zijn inderdaad vatbaarder voor epileptiforme activiteit32,33. Zo hebben veel studies van spontane fysiologische8,9,11,24 of pathologische16,34, 35,36 netwerkschommelingen traditioneel een horizontale snijbenadering gebruikt, soms met een lichte hoek in de fronto-occipitale richting, die weefselschijfjes oplevert parallel aan het dwarsvlak van de ventrale hippocampus.
Netwerkconnectiviteit wordt onvermijdelijk beïnvloed door de snijprocedure, omdat veel cellen in het segment worden doorgesneden. De hoek en dikte van de plak en het weefsel dat in het preparaat wordt vastgehouden, moeten worden overwogen om de connectiviteit in de betrokken circuits te optimaliseren. Veel studies hebben horizontale gecombineerde hippocampal-entorhinale cortex slices (HEC) gebruikt om interacties tussen de twee structuren te verkennen in de context van fysiologische of pathologische netwerkschommelingen. Roth et al. voerden dubbele opnamen uit vanuit het CA1-subveld van de hippocampus en laag V van de mediale entorhinale cortex om de voortplanting van SWR-activiteit door het HEC-segment37aan te tonen. Veel studies naar epileptiforme activiteit hebben het HEC-plakpreparaat gebruikt om te onderzoeken hoe epileptiforme lozingen zich voortplanten via het corticohippocampale netwerk16,35,36,38. Het is belangrijk op te merken dat het behoud van de intacte corticohippocampale lus geen vereiste is voor spontane ZVR's, epileptiforme ontladingen of gamma-oscillaties; netwerkschommelingen kunnen worden gegenereerd in dwarssegmenten van de dorsale of ventrale hippocampus zonder aangebouwde parahippocampale weefsels21,22,23, 25,39,40,41. Een belangrijkere factor voor de spontane generatie van netwerkschommelingen in hippocampale segmenten kan de dikte van elke segment zijn, omdat een dikker segment (400-550 μm) meer connectiviteit in het CA2/CA3 terugkerende netwerk21,22,25zal behouden .
Hoewel schuine horizontale HEC-segmenten (gesneden met een hoek van ongeveer 12° in de fronto-occipitale richting) zijn gebruikt om de functionele connectiviteit van de corticohippocampale lus11,16,34,35,42te bestuderen , zijn dergelijke schuine preparaten niet vereist voor spontane netwerkactiviteit43,44,45. Het gebruik van een schuin snijvlak stelt de onderzoeker echter in staat om selectief plakjes te maken die het beste de transversaal georiënteerde lamellen van de ventrale of intermediaire hippocampus behouden, afhankelijk van het feit of een neerwaartse of een opwaartse hoek wordt toegepast (figuur 1). Deze benadering is conceptueel vergelijkbaar met die van Papatheodoropoulos et al., 2002, die elke hippocampus vrij ontleedden en vervolgens een weefselhelikopter gebruikten om dwarse plakjes te maken langs de hele dorsaal-ventrale as21. In het licht van het bovengenoemde functionele onderscheid tussen de ventrale en dorsaal-intermediaire hippocampus, moeten onderzoekers bij het ontwerpen van experimenten of het interpreteren van resultaten rekening houden met de anatomische oorsprong van plakjes. Het gebruik van een agar ramp tijdens de snijprocedure is een eenvoudige manier om bij voorkeur plakjes te produceren van de tussenliggende of ventrale hippocampus.
Hippocampale plakjes kunnen worden onderhouden in een ondergedompelde kamer (met het weefsel volledig ondergedompeld in ACSF), of een interface-achtige kamer (bijv. Oslo- of Haas-kamer, met plakjes die alleen worden bedekt door een dunne film van vloeiende media). Interfaceonderhoud verbetert de oxygenatie van het weefsel, wat de neuronale overleving bevordert en een aanhoudend hoog niveau van interneuronale activiteit mogelijk maakt. Traditioneel gebruiken ondergedompelde opnameomstandigheden een langzamer ACSF-debiet dat onvoldoende weefsel oxygenatie biedt voor stabiele expressie van oscillaties op netwerkniveau. In ondergedompelde hippocampale plakjes worden carbachol-geïnduceerde gamma-oscillaties slechts tijdelijk waargenomen46,47, terwijl ze stabiel kunnen worden onderhouden in interface-opnamekamers10,48,49. Als zodanig hebben veel studies naar complexe spontane activiteit in vitro vertrouwd op interface-opnamekamers om scherpegolfrimpelcomplexen6, 7,8,9,10,25,37, gamma-oscillaties10,13en epileptiforme activiteit16,38,45,47te onderzoeken .
In een opnamekamer in ondergedompelde stijl kan een onderdompelingsmicroscoopdoelstelling worden gebruikt om individuele cellen te visualiseren en selectief te richten op gezond uitziende cellen voor opnames. Het ondergedompelde preparaat maakt ook een fijne controle over het cellulaire milieu mogelijk, omdat onderdompeling een snelle verspreiding van geneesmiddelen of andere verbindingen naar het weefsel vergemakkelijkt. Een gewijzigde methodologie waarbij stabiele netwerkschommelingen onder ondergedompelde omstandigheden worden gehandhaafd, vertegenwoordigt dus een krachtige experimentele aanpak. Deze benadering wordt geïllustreerd door het werk van Hájos et al., waarin hippocampale plakjes zich enkele uren in een vereenvoudigde interface-achtige houdkamer herstellen voordat ze worden overgeplaatst naar een gewijzigde ondergedompelde opnamekamer met een hoog debiet van ACSF (~ 6 ml / min) om de zuurstoftoevoer naar het weefsel te verbeteren12,48,49. Onder deze omstandigheden kunnen hoge niveaus van interneuronactiviteit en stabiele spontane netwerkschommelingen in een ondergedompelde opnamekamer worden gehandhaafd. Deze gewijzigde aanpak stelt de onderzoekers in staat om visueel geleide hele-cel patchklemopnamen uit te voeren en de bijdrage van morfologisch geïdentificeerde celtypen aan carbachol-geïnduceerde gamma-oscillaties12te karakteriseren. SWR 's kunnen ook spontaan voorkomen in ondergedompelde hippocampale plakjes met een snel debiet van ACSF11,48,49. Maier et al. toonden aan dat hippocampale plakjes die zich in een interfacekamer herstelden voordat ze naar een ondergedompelde opnamekamer werden gebracht, op betrouwbare wijze spontane SWR's vertoonden, terwijl plakjes die zich vóór de overdracht naar een ondergedompelde opnamekamer onder water herstelden, kleinere opgeroepen veldreacties vertoonden, lagere niveaus van spontane synaptische stromen vertoonden en slechts zeer zelden spontane ZVR'svertoonden 43. Schlingloff et al. gebruikten deze verbeterde methodologie om de rol van parvalbumine-uitdrukkende mandcellen in de generatie van spontane SWR 's aan te tonen44.
Het volgende protocol presenteert een snijmethode waarmee spontaan actieve neuronen in horizontale hippocampale plakjes onder interfaceomstandigheden kunnen worden hersteld en vervolgens kunnen worden onderhouden in een ondergedompelde opnamekamer die geschikt is voor farmacologische of optogenetische manipulaties en visueel geleide opnamen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van Columbia University (AC-AAAU9451).
1. Bereid oplossingen voor
- Bereid sacharosesnijoplossing voor het snijden zoals beschreven in tabel 1.
OPMERKING: Vries na het bereiden van 1 L sacharoseoplossing een kleine hoeveelheid (ongeveer 100-200 ml) in in een ijslade. Deze bevroren sacharose ijsblokjes worden gemengd tot een ijzige slurry (zie stap 4.3). - Bereid kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) voor op opname zoals beschreven in tabel 2.
- Bereid 1 M NaCl voor op stimulatiepipets door 0,05844 g NaCl op te lossen in 1 ml gezuiverd water dat is gefilterd om sporenmetalen en andere onzuiverheden te verwijderen.
OPMERKING: Sucrose-snijoplossing en ACSF moeten voor elk experiment vers worden bereid.
2. Bereid een oprit voor
- Bereid 4% agar (bijv. 2 g agar in 50 ml water) door agarpoeder op te lossen in gezuiverd water dat is gefilterd om sporenmetalen en andere onzuiverheden te verwijderen. Verwarm het mengsel in een magnetron tot het net begint te koken (ongeveer 30-60 s). Giet de gesmolten agar in een mal en laat het afkoelen en stollen op 4 °C in een koelkast op een helling van ongeveer 12°.
OPMERKING: Voor een mal kan men elke glazen of plastic container onder een hoek gebruiken, met voldoende gesmolten agar erin gegoten om een helling van 4 cm lang en ongeveer 0,8 cm hoog te vormen.
3. Plaats het snijgebied
- Vul een bekerglas van 400 ml met een plakterugwinningskamer met ongeveer 250 ml ACSF; plaats het in een waterbad verwarmd tot 32 °C en begin te borrelen met carbogen (95% zuurstofgas/5% kooldioxidegas).
OPMERKING: Vul het terugwinningsbekerglas met net genoeg vloeistof om het nylon gaas van de houdkamer helemaal aan het oppervlak van de oplossing te plaatsen, zodat plakjes op het raakvlak van het mengsel van warme oplossingen en de lucht worden gehouden (figuur 1). Leg kleine stukjes lenspapier op het nylon gaas. De plakjes liggen bovenop het lenspapier, dat later kan worden gebruikt om plakjes afzonderlijk naar de opnamekamer over te brengen (zie stap 6.6). - Doe een kolf met de sacharose-oplossing in een ijsemmer om te koelen en begin te borrelen met carbogen.
OPMERKING: De herstelbeker en sucrose-oplossing moeten respectievelijk worden opgewarmd en gekoeld, waarbij carbogen minstens 30 minuten borrelen voordat de muis in de isofluraankamer wordt geplaatst. - Haal de lade met kant-en-klare, bevroren sacharose-oplossing ijsblokjes uit de vriezer en plaats deze op de bank om gedeeltelijk te ontdooien.
- Plaats de helft van een schoon scheermes met dubbele rand in de microtome en kalibreer indien nodig. Zet de andere helft van het scheermesje opzij voor gebruik tijdens de dissectie.
- Voer een carbogenlijn en temperatuursonde in de snijkamer en omring met ijs om de kamer te koelen.
- Maak een schone bank of tafel bedekt met twee wegwerp absorberende pads. Leg alle dissectiegereedschappen en drie stukken labtape op het linkerkussen, waar de transcardiële perfusie zal worden uitgevoerd.
OPMERKING: Dissectiegereedschappen omvatten kleine Bonn-scharen, dissectorschaar, grote spatel / lepel, microspatiula, scalpel met nieuw mes, spatel, scherpe / stompe chirurgische schaar, grote weefseldop en kleine weefseldop (zie tabel met materialen). - Plaats aan de andere absorberende pad rechts van het perfusiegebied een cirkelvormig stuk filterpapier in het deksel van een glazen Petrischaal met een diameter van 100 mm. Plaats de bodem van de Petrischaal naast het deksel en plaats een carbogenlijn in beide stukken van de schaal.
- Gebruik een scheermesje of scalpel om een kleine helling van agar te snijden (ongeveer 4 cm langs het schuine oppervlak, 0,8 cm hoog, 2 cm breed). Snijd een stuk van de helling af van het hoge uiteinde en draai het om om een steunblok van agar te creëren. Gebruik cyanoacrylaatlijm om de agarhelling en het steunblok op het snijplatform aan te brengen en opzij te zetten.
OPMERKING: Het steunblok van agar helpt de hersenen te stabiliseren tijdens het snijden en biedt een oppervlak waarop onnodige weefsels van elke plak kunnen worden verwijderd (figuur 1).
4. Transcardiale perfusie
- Hang een spuit met een capaciteit van 60 ml op als reservoir voor sacharosesnijoplossing ongeveer 18 inch boven het tafelblad (bijv. met behulp van een draaiklem met drie tanden op een verticale paal). Bevestig de slang aan de onderkant van het reservoir, voer de slang door een rolklem en sluit het andere uiteinde van de buis aan op een schone naald van 20 G.
- Vul het reservoir van 60 ml met ongeveer 30 ml gekoelde sacharoseoplossing en richt een carbogenlijn in het sacharosereservoir om het perfusaat voortdurend te bubbelen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de sacharose door de slang en naald stroomt zonder opgesloten bubbels. Het debiet moet net snel genoeg zijn om een constante, continue stroom druipende sucrose uit de naald te hebben. - Plet en meng met behulp van een blender de bevroren sacharose tot een ijzige slurry en gebruik de grote spatel/lepel om de slurry te verdelen.
- Plaats een kleine hoeveelheid sucrose slurry rond de randen van het glazen Petri schoteldeksel. Voeg een kleine hoeveelheid sucrose slurry toe aan de Bodem van de Petrischaal.
- Voeg ongeveer 20-30 ml sacharoseslurry toe aan het perfusievloeistofreservoir en meng het goed met de 30 ml gekoelde vloeibare sacharose totdat het reservoir een mengsel van zeer koude, overwegend vloeibare sacharose bevat met een bevroren restoplossing.
- Plaats de muis in een kamer die is aangesloten op een isofluraanverdamper. Met zuurstof die bij ongeveer 2 L/min stroomt, draait u de wijzerplaat van de vaporizer om isofluraan te leveren bij een concentratie van 5% en start u een timer.
OPMERKING: Houd deze timer gaande tijdens het snijden om te meten hoe snel de plakjes worden verkregen. De procedure moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd, zodat het snijden is voltooid en weefsel zich binnen 15-20 minuten van het binnendringen van de isofluraankamer in de interfacekamer herstelt. Let op de muis om ervoor te zorgen dat een staat van diepe anesthesie wordt bereikt. Na minimaal 5 minuten moet de muis diep verdoofd zijn en niet reageren op teenknijpen. - Vlak voordat u de muis uit de isofluraankamer haalt, vult u het deksel van de Petrischaal met gekoelde sacharoseoplossing tot een diepte van ongeveer 3-5 mm en vult u de Bodem van de Petrischaal met gekoelde sacharoseoplossing tot een diepte van ongeveer 1,0 cm.
- Breng de muis snel over naar de linker absorberende pad en gebruik de 3 stukken tape om de voorpoten en staart vast te zetten. Voer een achterpotenknijper uit om ervoor te zorgen dat de muis niet reageert voordat een incisie wordt uitgevoerd. Met behulp van de grote weefsel forceps en chirurgische schaar, tent de huid en maak een lengte-incisie van de onderkant van het borstbeen naar de bovenkant van de borst. Trek met de tang het borstbeen omhoog en gebruik de schaar om door het middenrif te snijden.
OPMERKING: De eerste positionering van de muis en eerst verschillende incisies om het middenrif te verbreken, moeten zo snel mogelijk worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de muis niet weer bij bewustzijn komt. Om een voldoende diepte van anesthesie tijdens de procedure te garanderen, kan een neuskegel op de muis worden geplaatst om isofluraan te leveren tijdens de perfusie. - Gebruik de schaar om aan elke kant door de ribbenkast te snijden en snijd in één grote beweging naar het punt waar de voorpoot het lichaam ontmoet. Zwaai met de tang de voorkant van de ribbenkast weg en omhoog naar het hoofd en verwijder deze vervolgens volledig met een horizontale snede met behulp van de grote schaar. Houd het hart op zijn plaats met behulp van de grote tang en steek de 20 G perfusienaald in de linkerventrikel. Zodra de naald correct is geplaatst, moet de linkerkant van het hart snel verbleken als gekoelde sacharose-oplossing de ventrikel vult.
- Gebruik de kleine dissector schaar om in het rechter atrium te snijden en laat het bloed uit de bloedsomloop stromen. Als de incisies correct worden uitgevoerd, moet er minimale schade aan het hart zijn en moet het gedurende de hele perfusie blijven pompen.
OPMERKING: Opgerolde stukjes tissuepapier kunnen worden gebruikt om bloed en sucrose-oplossing uit het hart af te voeren en de zichtbaarheid van de perfusienaald tijdens de procedure te behouden. - Zorg ervoor dat de perfusienaald op zijn plaats blijft en niet uit de linkerventrikel valt. Met een goed debiet en plaatsing begint de lever te verbleken tot een lichtbruine/beige kleur met 20-30 s.
- Gebruik na 30-45 s de grote schaar om de muis te onthoofden. Houd het hoofd in de linkerhand, duw of pel de huid weg van de schedel. Bij een goed doordrenkt dier moet de schedel erg bleek zijn en moeten de hersenen een zeer lichtroze kleur (naderend wit) door de schedel lijken zonder duidelijk zichtbare bloedvaten.
5. Haal de hersenen eruit en snijd plakjes
- Maak met behulp van de kleine Bonn-schaar twee zijdelingse sneden door de schedel naar de middellijn aan de voorkant van de schedel, in de buurt van de ogen. Maak twee extra sneden aan weerszijden van de basis van de schedel.
- Breng het hoofd over op de bodem van de glazen Petrischaal waar het meestal moet worden ondergedompeld in gekoelde sacharose-oplossing. Gebruik de kleine Bonn-schaar om de middellijn langs de lengte van de schedel af te snijden en trek omhoog met de schaar om schade aan het onderliggende hersenweefsel te minimaliseren. Met behulp van de kleine weefselkracht, pak je elke kant van de schedel stevig vast en zwaai je hem omhoog en weg van de hersenen, zoals het openen van een boek.
- Gebruik de vingers van de linkerhand om de schedelflappen open te houden en steek de microspatiula onder de hersenen in de buurt van de reukbollen. Draai de hersenen uit de schedel in de sucrose en gebruik de microspatula om de hersenstam te scheiden. Was de hersenen om resten van bloed, vacht of andere weefsels te verwijderen.
- Gebruik de grote spatel/lepel om de hersenen over te brengen naar het deksel van de glazen Petrischaal. Met de andere helft van het dubbelgerande scheermesje dat eerder opzij is gezet, maak je twee coronale sneden om eerst het cerebellum te verwijderen en vervolgens het meest voorste deel van de hersenen, inclusief de reukbollen (figuur 1).
- Breng cyanoacrylaatlijm aan op de agar ramp. Plaats de hersenen heel kort op een stuk droog filterpapier met behulp van de grote weefseldop en breng het vervolgens onmiddellijk over naar de agar-helling en plaats het ventrale oppervlak van de hersenen op de lijm.
OPMERKING: Voor plakjes van de tussenliggende hippocampus moeten de hersenen worden georiënteerd met de voorste naar boven gericht op de helling van de helling en de achterste dichter bij het blad. Voor plakjes van de ventrale hippocampus oriënteren de hersenen met het voorste uiteinde naar beneden gericht op de helling van de helling, met het achterste uiteinde aan de bovenkant van de helling, verder weg van het blad. In beide gevallen moeten de hersenen aan de bovenkant van de helling worden geplaatst, zodat het coronaal gesneden oppervlak van de hersenen contact maakt met het agar-backingblok (figuur 1). - Plaats het snijplatform met de agar en de hersenen in de snijkamer van de microtome en dompel volledig onder met gekoelde sacharoseoplossing. Gebruik de grote spatel/lepel om wat sacharoseslurry naar de kamer over te brengen, roer om bevroren sacharose te smelten en breng de temperatuur van het mengsel snel naar ~1-2 °C.
OPMERKING: Let op de temperatuurmeter tijdens het snijden. Als de sacharoseoplossing boven de 3 °C opwarmt, voeg dan meer drijfmest toe en meng om de temperatuur weer naar beneden te brengen. - Snijd plakjes met een dikte van 450 μm met de microtome snelheid ingesteld op 0,07 mm/s. Terwijl elke plak wordt bevrijd, gebruikt u de kleine weefselkracht en een scherpe scalpel om eerst de twee hemisferen te scheiden en vervolgens weefsel weg te snijden totdat de plak voornamelijk bestaat uit de hippocampus en parahippocampale gebieden (figuur 1).
- Gebruik een plastic transferpipet om de plakjes afzonderlijk over te brengen naar de interfaceterugwinningskamer, zodat ze op de interface van de ACSF en de lucht worden geplaatst met slechts een dunne meniscus van ACSF die de plakjes bedekt. Sluit het deksel van de kamer goed en laat plakjes gedurende 30 minuten herstellen bij 32 °C.
- Breng na het eerste herstel bij 32 °C de interfaceterugwinningskamer uit het waterbad en plaats deze op een roerder die op een lage snelheid is ingesteld, zodat de magnetische roerstaaf de circulatie van ACSF in de kamer bevordert. Laat het geleidelijk afkoelen tot kamertemperatuur terwijl de plakjes nog eens 90 minuten herstellen. Zorg ervoor dat de terugwinningskamer voortdurend met carbogen wordt besmijd en laat grote bellen niet vast komen te zitten onder de plakjes.
6. Voer LFP-opnames (Local Field Potential) uit van spontane activiteiten
- Bereid u voor op LFP-opnamen door alle benodigde apparatuur in te schakelen, inclusief de computer met de acquisitiesoftware, de monitor die op de computer is aangesloten, de stimulatoren, de micromanipulator, de temperatuurregelaar, de microscooplichtbron, de microscoopcamera, de micro-lectrodeversterker, de digitizer en de peristaltische pomp. Als u een centraal vacuümsysteem gebruikt, opent u de wandklep om de vacuümlijn voor te bereiden die ACSF uit de opnamekamer verwijdert.
- Vul het verwarmde reservoir met ACSF en plaats vervolgens één uiteinde van de slang in het bekerglas van 400 ml met het borrelende ACSF. Schakel de peristaltische pomp in om ACSF van het bekerglas van 400 ml naar het verwarmde reservoir en van het reservoir naar de opnamekamer te leiden. Tik of knijp in de slang om vastzittende bubbels los te laten.
- Stel de peristaltische pomp in om ervoor te zorgen dat het ACSF-debiet door de opnamekamer snel is (~ 8-10 ml/min). Gebruik een temperatuursonde om ervoor te zorgen dat de ACSF zich in het midden van de opnamekamer 32 °C bevindt.
OPMERKING: Als ACSF met een peristaltische pomp aan de opnamekamer wordt geleverd, kan een hoog debiet leiden tot een aanzienlijke fluctuatie in het debiet. Consistente debieten kunnen worden bereikt met behulp van een eenvoudige pulsatiedemper bestaande uit een reeks lege spuiten die in de slang zijn geïntegreerd (figuur 2). - Bereid stimulatie- en opnamepizetten voor van borosilicaatglascapillairen met behulp van een verwarmde filamenttrekker. Het trekkerprotocol moet worden geconfigureerd om pipetten met een weerstand van 2-3 MOhm op te leveren voor stimulatie of lokale veldpotentiaal opname-elektroden.
- Vul stimulatiepipets met 1 M NaCl en LFP pipetten met ACSF.
- Klem de slang kort vast en schakel de pomp uit om de stroom van ACSF te pauzeren. Breng een plak met fijne tang over in de opnamekamer om een hoek van het lenspapier vast te pakken dat het plakje op het plakje laat rusten. Plaats het lenspapier en snijd in de opnamekamer met de plak naar beneden gericht en "pel" vervolgens het lenspapier weg en laat het plakje ondergedompeld in de opnamekamer. Zet de plak vast met een harp.
OPMERKING: Harpen kunnen vooraf worden gemaakt of in het lab worden gemaakt met behulp van een U-vormig stuk roestvrij staal of platina en fijn nylon filament. - Plaats een met NaCl gevulde stimulatiepipet in de handmatige micromanipulator en schuif de punt van de pipet langzaam op in het oppervlak van de plak (bijv. in de stratum radiatumlaag) onder een hoek van ongeveer 30-45°. Zodra de punt van de pipet in het weefsel komt, schuift u de pipet langzaam naar voren en onthoudt u zich van grote bewegingen in de zijdelingse of verticale richting die axonen in de plak onnodig kunnen beschadigen. Plaats de punt van de pipet minstens 50-100 μm diep in de plak om te voorkomen dat cellen in de buurt van het oppervlak beschadigd zijn tijdens het snijden.
- Plaats een met ACSF gevulde LFP-pipet in de pipethouder die aan de gemotoriseerde micromanipulator is bevestigd. Breng een zeer lichte positieve druk aan met behulp van monddruk of een spuit van 1 ml die via een afsluitkraanklep en een korte slanglengte op de pipethouder is aangesloten.
OPMERKING: Plaats LFP-pipetten in de plak om de signalen van belang vast te leggen: in het geval van scherpe golfrimpelingen moet één LFP-pipet in de stratum pyramidale (SP) en een tweede pipet in het stratum radiatum (SR) worden geplaatst. Deze configuratie maakt gelijktijdige opnames mogelijk van de negatieve scherpe golf in de SR en de hoogfrequente rimpeloscillatie in de SP (figuur 3). - Met behulp van de micromanipulator wordt de punt van de LFP-pipet langzaam onder een hoek van ongeveer 30-45° in het interessegebied (bijv. de CA1-piramidecellaag) gebracht. Plaats de punt van de pipet minstens 50-100 μm diep in de plak om te voorkomen dat cellen in de buurt van het oppervlak beschadigd zijn tijdens het snijden. Terwijl u de LFP-pipet vooruitgaat, levert u voortdurend een kleine spanningstestpuls met behulp van de acquisitiesoftware en let u op een plotselinge toename van de elektrodeweerstand. Dit kan erop wijzen dat de pipet verstopt is of tegen een cel is gedrukt.
- Zodra de LFP-pipet in het interessegebied is geplaatst, laat u de positieve druk voorzichtig los door de klep te openen op de slang die aan de pipethouder is bevestigd.
- Als u de LFP tegelijkertijd op een tweede locatie wilt opnemen, herhaalt u stap 6.8-6.10 met een tweede pipet en micromanipulator.
- Gebruik de micro-lectrodeversterker in de huidige klemconfiguratie om spontane activiteit in het lokale veldpotentieel vast te leggen na het gebruik van de brugbalansfunctie in de acquisitiesoftware om de serieweerstand van de pipet te corrigeren. Spontane SWR's verschijnen als positieve doorbuigingen in het extracellulaire potentiaal van de SP-laag (figuur 3).
- Om opgeroepen veldpotentiaalen vast te leggen, gebruikt u de stimulatoren die op de digitizer zijn aangesloten om een korte (200 us) vierkante spanningspuls door de met NaCl gevulde stimulatiepipet te leveren. Pas de stimulatiespanningsknop aan om een reeks responsamplitudes op te roepen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier worden representatieve opnames gepresenteerd van HEC-segmenten die zijn voorbereid zoals beschreven in dit protocol. Na herstel in een interfacehouderkamer (figuur 1C) worden plakjes afzonderlijk overgebracht naar een ondergedompelde opnamekamer (figuur 2B). De opnamekamer wordt geleverd met carbogen-verzadigde ACSF met behulp van een peristaltische pomp (figuur 2A). De pomp trekt eerst ACSF uit een snavel in een verwarmd reservoir. Carbogen-lijnen worden in zowel het bekerglas als het verwarmde reservoir geplaatst om continue oxygenatie van de media te bieden. Tussen de peristaltische pomp en de opnamekamer bevindt zich een pulsatiedemper, bestaande uit een reeks met lucht gevulde spuiten, om de schommelingen in het debiet veroorzaakt door snelle peristaltiek te minimaliseren. De luchtzak in elke spuit absorbeert de drukveranderingen veroorzaakt door elke cyclus van de pomp, zodat de opnamekamer een soepele en consistente stroom van ACSF52,53ontvangt. Een inline kachel die na de pulsatiedemper wordt geplaatst, zorgt ervoor dat de temperatuur van de ACSF op 32 °C wordt gehouden wanneer deze de opnamekamer binnenkomt.
In dit voorbeeld bestaat de dual-surface superfusie-opnamekamer uit drie 3D-geprinte lagen (figuur 2B). De onderste laag heeft een rechthoekige uitsparing voor een afdeklip, vastgezet met vacuümvet. De middelste laag bevat de onderste helft van een langwerpige ovale kamer, met twee horizontale steunen. Nylon filament wordt over deze steunen gespannen (ongeveer elke 0,5 mm) en vastgezet met cyanoacrylaatlijm. De plak zal bovenop dit gespannen filament rusten. De bovenste laag bevat de bovenste helft van de ovale kamer samen met kleine putten waarin de zilverchloride gemalen pellets kunnen worden geplaatst. De langwerpige ovale vorm van de kamer is ontworpen om een snelle laminaire stroom van ACSF te bevorderen.
Figuur 3 bevat representatieve opnames van HEC-segmenten die volgens dit protocol zijn voorbereid. Om in eerste instantie de gezondheid van segmenten te beoordelen, worden veldpostynaptische potentialen (fPSP's) opgeroepen in het stratum radiatum (SR) met behulp van een pipet gevuld met 1 M NaCl. In gezonde plakjes moet elektrische stimulatie een fPSP produceren met een kleine presynaptische vezelvolleybal en een groot postsynaptisch potentieel met een snelle initiële afdaling (figuur 3B, linksboven). In gezonde plakjes zijn spontane scherpegolfrimpelingen (SWR's) zichtbaar als positieve afbuigingen in de LFP in de stratum pyramidale (figuur 3B, linksonder). In suboptimale plakjes tonen opgeroepen fPSP's een grote vezelvolleybal en een relatief klein postsynaptisch potentieel, en dergelijke plakjes vertonen geen spontane SWR's (figuur 3B, rechts). SWR's in vitro tonen kenmerken die consistent zijn met gepubliceerde beschrijvingen: een positief veldpotentieel in de SP-laag met een bedekte hoogfrequente oscillatie, gekoppeld aan een negatief veldpotentieel in de SR-laag (figuur 3C). Een enkele in CA2 geregistreerde SWR wordt aangegeven met een sterretje (figuur 3C, rechts). SWR's in HEC-segmenten zijn afkomstig uit CA2/CA3-terugkerende circuits en worden doorgegeven aan CA1. Een enkele SWR die in de SP-laag CA2 en CA1 wordt waargenomen, wordt aangegeven met een sterretje (figuur 3D, rechts). In dit representatieve voorbeeld leidt de CA2-SWR (groen) die in CA1 (blauw) met enkele milliseconden, zoals wordt weergegeven in de overlay van de SWR-envelop (gefilterd op 2-30 Hz) die in elke regio is opgenomen.
Figuur 1: Voorbereiding van horizontale schuine hippocampal-entorhinale cortex (HEC) plakjes. (A) (i) Voer na het extraheren van de hersenen twee coronale sneden uit met een scheermesje om de achterste en voorste delen van de hersenen te verwijderen. (ii) De agar ramp bestaat uit twee schuine delen die op het microtome snijplatform zijn gelijmd. Om plakjes van de tussenliggende hippocampus te bereiden, plaatst u het hersenblok op de agar-helling met het voorste oppervlak naar boven gericht op de helling en maakt u contact met het hoge ruggedeelte van de helling. Om plakjes meer ventrale hippocampus te bereiden, plaatst u het hersenblok op de agar-helling met het voorste oppervlak naar beneden gericht op de helling, zodat het achterste gesneden oppervlak contact maakt met het hoge ruggedeelte van de helling. (iii) Naarmate elke plak wordt bevrijd, voert u nog een aantal sneden uit met de scalpel om de hemisferen te scheiden en onnodig weefsel te verwijderen. (B) Representatieve afbeelding van het resulterende segment met celkernen gelabeld door DAPI. (C) In een interface-terugwinningskamer worden plakjes op stukjes lenspapier geplaatst bovenop een roestvrijstalen of nylon gaas, vlak met het oppervlak van de ACSF. Een keramische bubbler transporteert carbogen in de kamer en een magnetische roerstaaf mengt voortdurend de vloeistof in de kamer. Een dunne film ACSF bedekt het bovenste oppervlak van de plak, waardoor de verspreiding van zuurstof uit de vochtige carbogenrijke lucht van de kamer wordt verbeterd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Dubbele oppervlakte superfusie opnamekamer met pulsatiedemper in de ACSF-toedieningsslang. (A) Diagram van het superfusiesysteem. ACSF wordt opgewarmd tot 32 °C, constant besmeurd met carbogengas en geleverd bij ongeveer 8-10 ml/min met behulp van een peristaltische pomp met een pulsatiedemper bestaande uit een reeks met lucht gevulde spuiten. (B) De opnamekamer bestaat uit drie 3D-geprinte lagen, waarvan het midden is gespannen met nylon filament. De plak rust op dit gespannen filament en ACSF stroomt boven en onder het weefsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve opnames van spontane scherpe golfrimpelingen uit HEC-plakjes. (A) Een vereenvoudigd diagram van het HEC-segment met de posities van de opname- en stimulatie-elektroden. (B) Representatieve opnamen van LFP-activiteit uit zowel een actief, gezond segment als een suboptimale segment. De gezonde plak (links, in het groen) toont grote opgeroepen veldreacties en spontane scherpegolfrimpelingen (SWR's), zichtbaar als onregelmatig voorkomende positieve afbuigingen in het lokale veldpotentieel van de SP-laag. Een ongezond segment toont daarentegen kleine opgeroepen veldreacties en geen spontane activiteit (rechts, in grijs). (C) Representatieve opnames van SWR's in het CA2-gebied, bestaande uit een negatieve doorbuiging in het LFP in de SR-laag en een hoogfrequente oscillatie met een onderliggende positieve doorbuiging in het LFP in de SP-laag. Pieken in elk kanaal groter dan drie standaardafwijkingen van de signaalamplitude worden rood gemarkeerd. Een bandpassfilter van 2-30 Hz isoleert de onderliggende positieve en negatieve envelop van de scherpe golf in respectievelijk de SP- en SR-laag, terwijl een bandpassfilter van 80-250 Hz wordt gebruikt om de hoogfrequente oscillatie van de rimpeling in de SP-laag te isoleren. D) SWR's in vitro vermeerderen van CA2/CA3 naar CA1. In deze representatieve opnamen gaan SWR's in CA2 (groen, onder) vooraf aan die in CA1 (blauw, boven) met enkele milliseconden. Pieken in elk kanaal groter dan drie standaardafwijkingen van de signaalamplitude worden rood gemarkeerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| molecuulgewicht (gram / mol) | eindconcentratie (mM) | gram / 1 L sacharose snijoplossing | ||
| Sacharose | C12H22O11 | 342.3 | 195 | 66.749 |
| Natriumchloride | Nacl | 58.44 | 10 | 0.584 |
| Glucose | C6H12O6 | 180.08 | 10 | 1.801 |
| natriumbicarbonaat | NaHCO | 84.01 | 25 | 2.1 |
| kaliumchloride | Kcl | 74.55 | 2.5 | 0.186 |
| natriumfosfaat monobasic watervrij | Nah2PO4 | 137.99 | 1.25 | 0.173 |
| natriumpyruvaat | C3H3nao3 | 110.04 | 2 | 0.22 |
| voorraadconcentratie (M) | eindconcentratie (mM) | milliliter / 1L sacharose snijoplossing | ||
| calciumchloride | CaCl2 | 1 | 0.5 | 0.5 |
| magnesiumchloride | MgCl2 | 1 | 7 | 7 |
Tabel 1: Samenstelling van sacharose snijoplossing. Begin met ongeveer 0,75 L gezuiverd water dat is gefilterd om sporenmetalen en andere onzuiverheden te verwijderen. Los elke vaste stof op terwijl u de oplossing mengt met een magnetische roerstaaf. Zodra alle vaste stoffen zijn opgelost, bellen carbogen gas door de oplossing gedurende 10 minuten. Voeg de MgCl2- en CaCl2-oplossingen toe en voeg water toe om het totale volume op 1 L te brengen. Meng gedurende 10 minuten met een magnetische roerstaaf om ervoor te zorgen dat de oplossing gelijkmatig wordt gemengd. De osmolariteit moet tussen 315 en 325 mOsm zijn en de pH moet ongeveer 7,4 zijn.
| molecuulgewicht (gram / mol) | eindconcentratie (mM) | gram / 2L ACSF | ||
| Natriumchloride | Nacl | 58.44 | 125 | 14.61 |
| Glucose | C6H12O6 | 180.08 | 12.5 | 4.502 |
| natriumbicarbonaat | NaHCO | 84.01 | 25 | 4.201 |
| kaliumchloride | Kcl | 74.55 | 3.5 | 0.522 |
| natriumfosfaat monobasic watervrij | Nah2PO4 | 137.99 | 1.25 | 0.345 |
| Ascorbinezuur | C6H8O6 | 176.12 | 1 | 0.352 |
| natriumpyruvaat | C3H3nao3 | 110.04 | 3 | 0.66 |
| voorraadconcentratie (M) | eindconcentratie (mM) | milliliter / 2L ACSF | ||
| calciumchloride | CaCl2 | 1 | 1.6 | 3.2 |
| magnesiumchloride | MgCl2 | 1 | 1.2 | 2.4 |
Tabel 2: Samenstelling van kunstmatige cerebrospinale vloeistof. Begin met ongeveer 1,5 L gezuiverd water dat is gefilterd om sporenmetalen en andere onzuiverheden te verwijderen. Los elke vaste stof op terwijl u de oplossing mengt met een magnetische roerstaaf. Zodra alle vaste stoffen zijn opgelost, bellen carbogen gas door de oplossing gedurende 10 minuten. Voeg de MgCl2- en CaCl2-oplossingen toe en voeg water toe om het totale volume op 2 L te brengen. Meng gedurende 10 minuten met een magnetische roerstaaf om ervoor te zorgen dat de oplossing gelijkmatig wordt gemengd. De osmolariteit moet tussen 315 en 325 mOsm zijn en de pH moet ongeveer 7,4 zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn verschillende stappen in dit snijprotocol dat is ontworpen om de gezondheid van weefsels te bevorderen en de opkomst van spontane naturalistische netwerkactiviteit te bevorderen: de muis is transcardieel doordrenkt met gekoelde sacharose-snijoplossing; horizontaal-entorhinale cortex (HEC) plakjes worden gesneden op een dikte van 450 μm van de tussenliggende of ventrale hippocampus; plakjes herstellen zich op het raakvlak van verwarmde ACSF en bevochtigde, carbogenrijke lucht; tijdens opnames worden plakjes met ACSF opgewarmd tot 32 °C en geleverd met een snel debiet met dual-surface superfusie in een ondergedompelde opnamekamer.
Slice health is van het grootste belang voor het genereren van netwerk oscillaties in vitro. Jonge dieren zullen meer gezonde plakjes opleveren, en over het algemeen kan bij juveniele of adolescente muizen de transcardiale perfusiestap worden overgeslagen. Naarmate dieren ouder worden, wordt het steeds moeilijker om gezonde plakjes te maken, maar sommige onderzoeken (zoals ziektemodellen of longitudinale studies) vereisen het gebruik van volwassen of ouder wordende dieren. Dengler et al., bijvoorbeeld, gebruikten transcardiale perfusies bij de bereiding van HEC-plakjes van met pilocarpine behandelde chronisch epileptische volwassen muizen50. Bij volwassen muizen is het gunstig om een transcardiale perfusie uit te voeren met gekoelde sacharose snijoplossing om het weefsel te koelen, bloed uit de hersenen te verwijderen en de metabolische activiteit te verminderen voordat de hersenen uit de schedel worden verwijderd51. Het is echter belangrijk op te merken dat transcardiële perfusies vereisen dat de opleiding correct wordt uitgevoerd en dat ervoor moet worden gezorgd dat de procedure snel en op een manier wordt uitgevoerd die geen risico vormt voor het dierenwelzijn. Indien mogelijk moeten experimenten worden opgezet om jonge dieren te gebruiken om het gebruik van transcardiële perfusies uit te sluiten. In een suboptimale plakvoorbereiding zullen er niet genoeg gezonde cellen zijn, met name interneurons, om voortdurende netwerkschommelingen te ondersteunen. Om de gezondheid van segmenten tijdens het experiment te beoordelen, is het handig om eerst opgeroepen veldpotentiaalen vast te leggen (bijvoorbeeld met een stimulatiepipet en een opnamepipet in het stratum radiatum, SR). In een gezonde plak zal stimulatie in de SR-laag een groot veld postsynaptisch potentieel (fPSP) oproepen met een relatief kleine presynaptische vezelvolley (figuur 3).
De plakjes geproduceerd door dit protocol zijn schuine horizontale hippocampal-entorhinal cortex (HEC) plakjes. Belangrijk is dat noch de opname van parahippocampaal weefsel, noch de schuine snede nodig zijn voor hippocampale plakjes om spontaan netwerkactiviteiten zoals SWR's te genereren. Inderdaad, veel studies hebben horizontale of transversale hippocampale segmenten gebruikt om aspecten van fysiologische25,40, 41,44of pathologische netwerkoscillations33,38te ondervragen . In dit protocol stelt de plaatsing van de hersenen op een agar ramp de experimenteerder in staat om selectief meer plakjes te produceren uit de ventrale of intermediaire hippocampus (figuur 1), wat gunstig kan zijn voor experimentele doelstellingen die rekening houden met de functionele heterogeniteit die bestaat langs de lengteas van de hippocampus26,31. Als de anatomische oorsprong van de plakjes geen factor is, kan de agar-helling worden uitgesloten en zal een echt horizontaal snijvlak plakjes van de tussenliggende tot ventrale hippocampus opleveren. Naarmate elke horizontale weefselschijf wordt bevrijd, kunnen de meeste vreemde delen van de plak worden verwijderd met drie eenvoudige sneden, waardoor een ongeveer rechthoekige plak overblijft die de hippocampus en een omliggend weefsel bevat, waaronder het parahippocampale gebied (figuur 1). Verdere dissectie kan worden uitgevoerd om alle extrahippocampale weefsels te verwijderen, maar de opname van omliggend weefsel is gunstig, omdat de plakjeharp gemakkelijk zo kan worden geplaatst dat de nylon filamenten niet over de hippocampus rusten. Zoals hierboven besproken, is het gecombineerde HEC-segment ook een nuttig preparaat om een groter corticohippocampaal netwerk te onderzoeken in de context van fysiologisch37 of pathologisch16,35,36,38 netwerkoscillaties.
De belangrijkste factor in dit protocol is het optimaliseren van de zuurstoftoevoer naar het weefsel, zowel tijdens de herstelfase als tijdens de opnames. Veel studies van netwerkschommelingen worden uitgevoerd in segmenten die rechtstreeks van de microtome naar een interface-opnamekamer worden overgebracht en die kunnen herstellen met voortdurende perfusie van verse ACSF. Na enkele uren herstel kunnen opnames vervolgens in dezelfde interfacekamer worden uitgevoerd. Zo worden plakjes gehouden op het raakvlak van ACSF en vochtige carbogen-rijke lucht voor de volledige duur van het experiment. In de alternatieve methodologie die in dit protocol wordt gepresenteerd, herstellen segmenten zich gedurende ten minste twee uur in een interface-achtige houdkamer voordat afzonderlijke segmenten worden overgebracht naar een opnamekamer in ondergedompelde stijl met voldoende snelle ACSF-stroomsnelheden. Segmenten bereid onder deze omstandigheden kunnen stabiele gamma-oscillatiesvertonen 12 of spontane SWR-activiteit43. Slice recovery in een interface-achtige holdingkamer is een cruciale stap: Maier et al. toonden aan dat plakjes die zich volledig onderdompelen in ACSF kleinere opgeroepen veldpotentialen vertonen, minder frequente spontane postsynaptische stromen en slechts zelden spontane netwerkactiviteit produceren43. Evenzo toonden Hájos et al. aan dat snelle ACSF-debieten resulteren in een hogere frequentie van spontane remmende postynaptische stromen, wat wijst op verbeterde interneuronale activiteit49. Tijdens de opnameperiode is superfusie met twee oppervlakken niet strikt noodzakelijk, op voorwaarde dat de opnamekamer een relatief klein volume ACSF bevat dat wordt geleverd met een snel debiet (ten minste 6 ml/min)43. De in dit protocol gepresenteerde 3D-geprinte opnamekamer (figuur 2B) is een relatief kosteneffectieve en eenvoudige optie, maar er zijn ook commercieel beschikbare ondergedompelde opnamekamers die zijn ontworpen om kleinere volumes vast te houden, de laminaire stroom van de media te bevorderen of superfusie met twee oppervlakken te bieden (in tegenstelling tot bijvoorbeeld cirkelvormige opnamekamers die overtollig dood volume ACSF mogelijk maken).
Hoewel dit protocol het mogelijk maakt om netwerkschommelingen op te nemen zonder de vereiste van een traditionele interface-opnamekamer, zijn er verschillende beperkingen. Hoewel plakjes tijdens de herstelperiode in de ACSF-luchtinterface worden gehouden, ontvangen ze geen voortdurende perfusie van verse media zoals gebeurt in traditionele interface-opnamekamers in Haas-stijl. Plakjes moeten afzonderlijk (met fijne tang) van de terugwinningskamer naar de ondergedompelde opnamekamer worden overgebracht. Bovendien kunnen snelle stroomsnelheden instabiliteit en bewegingsartefacten veroorzaken die problematisch zijn voor sommige opnamen, vooral als ACSF wordt geleverd met een peristaltische pomp. Om een snel debiet te behouden en mechanische storingen te minimaliseren, kan een eenvoudige pulsatiedemper in het perfusiesysteem worden geïntegreerd (figuur 2). Deze pulsatiedemper werkt met behulp van het Windkessel-effect52, waarin lege spuiten luchtzakken bevatten die fungeren als elastische reservoirs, waarbij de fluctuerende druk wordt opgenomen die wordt gegenereerd door de rollen van de peristaltische pomp53. Het opnemen van een pulsdemper kan echter lengte toevoegen aan de slang die ACSF levert aan de opnamekamer en de zuurstoftoevoer naar de plak beïnvloedt. Debieten mogen alleen zo snel zijn als nodig is om stabiele netwerkschommelingen op te leveren, en als een peristaltische pomp wordt gebruikt, moet het idealiter een pomp zijn die een groot aantal rollen (> 12) gebruikt om de pulsatie veroorzaakt door peristaltiek te minimaliseren, het gebruik van een pulsatiedemper uit te sluiten en ervoor te zorgen dat de slang die ACSF naar de opnamekamer levert zo kort mogelijk is. Opnames uitgevoerd met snelle stroomsnelheden vereisen ook grote hoeveelheden ACSF, wat problematisch kan zijn als experimenten de toevoeging van waardevolle of dure medicijnen of verbindingen aan de media vereisen. Hoewel een superfusiekamer met twee oppervlakken een speciaal geconstrueerde opnamekamer met twee vloeistofinlaten nodig heeft om zuurstofrijke media aan beide zijden van de plak te leveren, kunnen spontane netwerkschommelingen worden waargenomen met matige ACSF-stroomsnelheden48. Dit protocol maakt gebruik van zowel een snel debiet (gestabiliseerd met een pulsatiedemper) als een dual-surface superfusiekamer om de kans op het observeren van spontane activiteit te verbeteren.
Ten slotte heeft dit protocol een lage opbrengst wat betreft het aantal geproduceerde plakjes per dier. Horizontaal snijden met een dikte van 450 μm levert een klein aantal HEC-segmenten op bij de voorkeursrichting (waarbij de plak effectief parallel loopt aan de dwarsas van de hippocampus). Van deze segmenten vertoont doorgaans slechts één of twee per hippocampi spontane SWR-activiteit, minder dan elders is gemeld43. Hoewel dikkere plakjes vermoedelijk een grotere mate van terugkerende connectiviteit bevatten, kan het snijden van iets dunnere plakjes (400 μm) een groter aantal transversaal georiënteerde segmenten met SWR-activiteit opleveren. Bovendien kan de kans dat meerdere segmenten op betrouwbare wijze spontane SWR-activiteit vertonen hoger zijn in experimenten die echte horizontale of neerwaartse schuine segmenten van de ventrale hippocampus gebruiken. Het huidige protocol omvat het gebruik van naar boven gerichte horizontale segmenten van de tussenliggende hippocampus , die mogelijk minder waarschijnlijk spontane netwerkactiviteit vertonen in vergelijking met segmenten van de ventrale hippocampus25,26,31. Ten slotte gebruikte dit protocol plakjes van adolescente en volwassen muizen. Hoewel transcardiale perfusies de kwaliteit van plakjes van oudere dieren kunnen verbeteren , kan de kans op het observeren van spontane netwerkactiviteiten worden verbeterd door het gebruik van plakjes van jongere dieren12,41,44.
Kortom, dit protocol presenteert een muis hersenen snijden aanpak die schuine horizontale hippocampal-entorhinale cortex plakjes van de tussenliggende of ventrale hippocampale vorming die complexe spontane netwerkactiviteit in de vorm van scherpe golf-rimpelcomplexen kan vertonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur heeft niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteur wil Steve Siegelbaum bedanken voor zijn steun. Financiering wordt verstrekt door 5R01NS106983-02 en 1 F31 NS113466-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Lulzbot | LulzBot TAZ 6 | |
| Acute brain slice incubation holder | NIH 3D Print Exchange | 3DPX-001623 | Designed by ChiaMing Lee, available at https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623 |
| Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma Aldrich | A9187-500MG | |
| Ag-Cl ground pellets | Warner | 64-1309, (E205) | |
| agar | Becton, Dickinson | 214530-500g | |
| ascorbic acid | Alfa Aesar | 36237 | |
| beaker (250 mL) | Kimax | 14000-250 | |
| beaker (400 mL) | Kimax | 14000-400 | |
| biocytin | Sigma Aldrich | B4261 | |
| blender | Oster | BRLY07-B00-NP0 | |
| Bonn scissors, small | becton, Dickinson | 14184-09 | |
| borosilicate glass capillaries with filament (O.D. 1.5 mm, I.D. 0.86 mm, length 10 cm) | Sutter Instruments | BF150-86-10HP | Fire polished capillaries are preferable. |
| calcium chloride solution (1 M) | G-Biosciences | R040 | |
| camera | Olympus | OLY-150 | |
| compressed carbogen gas (95% oxygen / 5% carbon dioxide) | Airgas | X02OX95C2003102 | |
| compressed oxygen | Airgas | OX 200 | |
| constant voltage isolated stimulator | Digitimer Ltd. | DS2A-Mk.II | |
| coverslips (22x50 mm) | VWR | 16004-314 | |
| cyanoacrylate adhesive | Krazy Glue | KG925 | Ideally use the brush-on form for precision |
| data acquisition software | Axograph | N/A | Any equivalent software (e.g. pClamp) would work. |
| Dell Precision T1500 Tower Workstation Desktop | Dell | N/A | Catalog number will depend on specific computer - any computer will work as long as it can run electrophysiology acquisition software. |
| Digidata 1440A | Molecular Devices | 1-2950-0367 | |
| digital timer | VWR | 62344-641 | 4-channel Traceable timer |
| disposable absorbant pads | VWR | 56616-018 | |
| dissector scissors | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| double-edge razor blades | Personna | BP9020 | |
| dual automatic temperature controller | Warner Instrument Corporation | TC-344B | |
| dual-surface or laminar-flow optimized recording chamber | N/A | N/A | The chamber presented in this protocol is custom made. A commercial equivalent would be the RC-27L from Warner Instruments. |
| equipment rack | Automate Scientific | FR-EQ70" | A rack is not strictly necessary but useful for organizing electrophysiology |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethyiether)- N,N,N',N'-teetraacetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | 324626-25GM | |
| filter paper | Whatman | 1004 070 | |
| fine scale | Mettler Toledo | XS204DR | |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| glass petri dish (100 x 15 mm) | Corning | 3160-101 | |
| glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G8877-250MG | |
| ice buckets | Sigma Aldrich | BAM168072002-1EA | |
| isoflurane vaporizer | General Anesthetic Services | Tec 3 | |
| lab tape | Fisher Scientific | 15-901-10R | |
| lens paper | Fisher Scientific | 11-996 | |
| light source | Olympus | TH4-100 | |
| magnesium chloride solution (1 M) | Quality Biological | 351-033-721EA | |
| magnetic stir bars | Fisher Scientific | 14-513-56 | Catalog number will be dependent on the size of the stir bar. |
| micromanipulator | Luigs & Neumann | SM-5 | |
| micromanipulator (manual) | Scientifica | LBM-2000-00 | |
| microscope | Olympus | BX51WI | |
| microspatula | Fine Science Tools | 10089-11 | |
| monitor | Dell | 2007FPb | |
| MultiClamp 700B Microelectrode Amplifier | Molecular Devices | MULTICLAMP 700B | The MultiClamp 700B should include headstages, pipette holders, and a model cell. |
| N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), (HEPES) | Sigma Aldrich | H3375-25G | |
| needle (20 gauge, 1.5 in length) | Becton, Dickinson | 305176 | |
| nylon filament | YLI Wonder Invisible Thread | 212-15-004 | size 0.004. This cat. # is from Amazon.com |
| nylon mesh | Warner Instruments Corporation | 64-0198 | |
| perstaltic pump | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
| Phosphocreatine di(tris) salt | Sigma Aldrich | P1937-1G | |
| pipette holders | Molecular Devices | 1-HL-U | |
| platinum wire | World Precision | PT0203 | |
| polylactic acid (PLA) filament | Ultimaker | RAL 9010 | |
| potassium chloride | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| potassium gluconate | Sigma Aldrich | 1550001-200MG | |
| potassium hydroxide | Sigma Aldrich | 60377-1KG | |
| razor blades | VWR | 55411-050 | |
| roller clamp | World Precision Instruments | 14041 | |
| scale | Mettler Toledo | PM2000 | |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| slice harp | Warner | SHD-26GH/2 | |
| sodium bicarbonate | Fisher Chemical | S233-500 | |
| sodium chloride | Sigma Aldrich | S9888-1KG | |
| sodium phosphate monobasic anhydrous | Fisher Chemical | S369-500 | |
| sodium pyruvate | Fisher Chemical | BP356-100 | |
| spatula | VWR | 82027-520 | |
| spatula/spoon, large | VWR | 470149-442 | |
| sterile scalpel blades | Feather | 72044-10 | |
| stirrer / hot plate | Corning | 6795-220 | |
| stopcock valves, 1-way | World Precision Instruments | 14054 | |
| stopcock valves, 3-way | World Precision Instruments | 14036 | |
| sucrose | Acros Organics | AC177142500 | |
| support for swivel clamps | Fisher Scientific | 14-679Q | |
| surgical scissors, sharp/blunt | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| syringe (1 mL) | Becton, Dickinson | 309659 | |
| syringe (60 mL with Luer-Lok tip) | Becton, Dickinson | 309653 | |
| three-pronged clamp | Fisher Scientific | 05-769-8Q | |
| tissue forceps, large | Fine Science Tools | 11021-15 | |
| tissue forceps, small | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| tubing | Tygon | E-3603 | ID 1/16 inch, OD 3/16 inch |
| tubing | Tygon | R-3603 | ID 1/8 inch, OD 1/4 inch |
| vacuum grease | Dow Corning | 14-635-5D | |
| vibrating blade microtome | Leica | VT 1200S | |
| vibration-dampening table with faraday cage | Micro-G / TMC-ametek | 2536-516-4-30PE | |
| volumetric flask (1 L) | Kimax | KIM-28014-1000 | |
| volumetric flask (2 L) | PYREX | 65640-2000 | |
| warm water bath | VWR | 1209 |
References
- Buzsáki, G., Lai-Wo, S., Vanderwolf, C. H. Cellular bases of hippocampal EEG in the behaving rat. Brain Research Reviews. 6, 139-171 (1983).
- Buzsáki, G. Hippocampal sharp waves: Their origin and significance. Brain Research. 398, 242-253 (1986).
- Buzsáki, G., Horváth, Z., Urioste, R., Hetke, J., Wise, K. High-frequency network oscillation in the hippocampus. Science. 256, 1025-1027 (1992).
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents — EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews Neuroscience. 13, 407-420 (2012).
- Buzsáki, G. Hippocampal sharp wave-ripple: A cognitive biomarker for episodic memory and planning. Hippocampus. 25, 1073 (2015).
- Maier, N., et al. Reduction of high-frequency network oscillations (ripples) and pathological network discharges in hippocampal slices from connexin 36-deficient mice. Journal of Physiology. 541, 521-528 (2002).
- Maier, N., Nimmrich, V., Draguhn, A. Cellular and network mechanisms underlying spontaneous sharp wave-ripple complexes in mouse hippocampal slices. Journal of Physiology. 550, 873-887 (2003).
- ul Haq, R., et al. Adrenergic modulation of sharp wave-ripple activity in rat hippocampal slices. Hippocampus. 22, 516-533 (2012).
- ul Haq, R., et al. Serotonin dependent masking of hippocampal sharp wave ripples. Neuropharmacology. 101, 188-203 (2016).
- Maier, P., Kaiser, M. E., Grinevich, V., Draguhn, A., Both, M. Differential effects of oxytocin on mouse hippocampal oscillations in vitro. European Journal of Neuroscience. 44, 2885-2898 (2016).
- Mizunuma, M., et al. Unbalanced excitability underlies offline reactivation of behaviorally activated neurons. Nature Neuroscience. 17, 503-505 (2014).
- Hájos, N., et al. Spike timing of distinct types of GABAergic interneuron during hippocampal gamma oscillations in vitro. Journal of Neuroscience. 24, 9127-9137 (2004).
- Geschwill, P., et al. Synchronicity of excitatory inputs drives hippocampal networks to distinct oscillatory patterns. Hippocampus. , (2020).
- Rutecki, P. A., Grossmann, R. G., Armstrong, D., Irish-Loewen, S. Electrophysiological connections between the hippocampus and entorhinal cortex in patients with complex partial seizures. Journal of Neurosurgery. 70, 667-675 (1989).
- Lothman, E. W., Bertram, E. H., Stringer, J. L. Functional anatomy of hippocampal seizures. Progress in Neurobiology. 37, 1-82 (1991).
- Carter, D. S., Deshpande, L. S., Rafiq, A., Sombati, S., Delorenzo, R. J. Characterization of spontaneous recurrent epileptiform discharges in hippocampal - cortical slices prepared from chronic epileptic animals. Seizure: European Journal of Epilepsy. 20, 218-224 (2011).
- Karlócai, M. R., et al. Physiological sharp wave-ripples and interictal events in vitro: What's the difference. Brain. 137, 463-485 (2014).
- Leroy, F., et al. Input-timing-dependent plasticity in the hippocampal CA2 region and its potential role in social memory. Neuron. 95, 1089-1102 (2017).
- Sun, Q., et al. Proximodistal heterogeneity of hippocampal CA3 pyramidal neuron intrinsic properties, connectivity, and reactivation during memory recall. Neuron. 95, 656-672 (2017).
- Masurkar, A. V., et al. Medial and lateral entorhinal cortex differentially excite deep versus superficial CA1 pyramidal neurons. Cell Reports. 18, 1-13 (2017).
- Papatheodoropoulos, C., Kostopoulos, G. Spontaneous, low frequency (∼2-3 Hz) field activity generated in rat ventral hippocampal slices perfused with normal medium. Brain Research Bulletin. 57, 187-193 (2002).
- Papatheodoropoulos, C., Kostopoulos, G. Spontaneous GABAA-dependent synchronous periodic activity in adult rat ventral hippocampal slices. Neuroscience Letters. 319, 17-20 (2002).
- Kubota, D., Colgin, L. L., Casale, M., Brucher, F. A., Lynch, G. Endogenous waves in hippocampal slices. Journal of Neurophysiology. 89, 81-89 (2003).
- Behrens, C. J., Van Den Boom, L. P., De Hoz, L., Friedman, A., Heinemann, U. Induction of sharp wave - complexes in vitro and reorganization of hippocampal networks. Nature Neuroscience. 8, 1560-1567 (2005).
- Kouvaros, S., Papatheodoropoulos, C. Prominent differences in sharp waves, ripples and complex spike bursts between the dorsal and the ventral rat hippocampus. Neuroscience. 352, 131-143 (2017).
- Strange, B. A., Witter, M. P., Lein, E. S., Moser, E. I. Functional organization of the hippocampal longitudinal axis. Nature Reviews Neuroscience. 15, 655-669 (2014).
- Patel, J., Fujisawa, S., Berényi, A., Royer, S., Buzsáki, G. Traveling Theta Waves along the Entire Septotemporal Axis of the Hippocampus. Neuron. 75, 410-417 (2012).
- Patel, J., Schomburg, E. W., Berényi, A., Fujisawa, S., Buzsáki, G. Local generation and propagation of ripples along the septotemporal axis of the hippocampus. Journal of Neuroscience. 33, 17029-17041 (2013).
- Fricke, R., Cowan, W. M. An autoradiographic study of the commissural and ipsilateral hippocampo-dentate projections in the adult rat. Journal of Comparative Neurology. 181, 253-269 (1978).
- Ishizuka, N. O. R., Weber, J., Amaral, D. G. Organization of intrahippocampal projections originating from CA3 pyramidal cells in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 623, 580-623 (1990).
- Papatheodoropoulos, C. Electrophysiological evidence for long-axis intrinsic diversification of the hippocampus. Frontiers in Bioscience - Landmark. 23, 109-145 (2018).
- Gilbert, M., Racine, R. J., Smith, G. K. Epileptiform burst responses in ventral vs dorsal hippocampal slices. Brain Research. 361, 389-391 (1985).
- Papatheodoropoulos, C., Moschovos, C., Kostopoulos, G. Greater contribution of N-methyl-D-aspartic acid receptors in ventral compared to dorsal hippocampal slices in the expression and long-term maintenance of epileptiform activity. Neuroscience. 135, 765-779 (2005).
- Jones, R. S. G., Heinemann, U. Synaptic and intrinsic responses of medial entorhinal cortical cells in normal and magnesium-free medium in vitro. Journal of Neurophysiology. 59, (1988).
- Rafiq, A., Delorenzo, R. J., Coulter, D. A. Generation and propagation of epileptiform discharges in a combined entorhinal cortex / hippocampal slice. Journal of Neurophysiology. 70, 1962-1974 (1993).
- Stoop, R., Pralong, E. Functional connections and epileptic spread between hippocampus, entorhinal cortex and amygdala in a modified horizontal slice preparation of the rat brain. European Journal of Neuroscience. 12, 3651-3663 (2000).
- Roth, F. C., Beyer, K. M., Both, M., Draguhn, A., Egorov, A. V. Downstream effects of hippocampal sharp wave ripple oscillations on medial entorhinal cortex layer V neurons in vitro. Hippocampus. 26, 1493-1508 (2016).
- Bertsche, A., Bruehl, C., Pietz, J., Draguhn, A. Region- and pattern-specific effects of glutamate uptake blockers on epileptiform activity in rat brain slices. Epilepsy Research. 88, 118-126 (2010).
- Wu, C., Shen, H., Luk, W. P., Zhang, L. A fundamental oscillatory state of isolated rodent hippocampus. Journal of Physiology. 540, 509-527 (2002).
- Colgin, L. L., Jia, Y., Sabatier, J. M., Lynch, G. Blockade of NMDA receptors enhances spontaneous sharp waves in rat hippocampal slices. Neuroscience Letters. 385, 46-51 (2005).
- Ellender, T. J., Nissen, W., Colgin, L. L., Mann, E. O., Paulsen, O. Priming of hippocampal population bursts by individual perisomatic-targeting interneurons. The Journal of Neuroscience. 30, 5979-5991 (2010).
- Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. A. Comparison of different slicing planes in preservation of major hippocampal pathway fibers in the mouse. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 1-17 (2017).
- Maier, N., Morris, G., Johenning, F. W., Schmitz, D. An approach for reliably investigating hippocampal sharp wave-ripples in vitro. PLoS One. 4, 6925 (2009).
- Schlingloff, D., Kali, S., Freund, T. F., Hajos, N., Gulyas, A. I. Mechanisms of sharp wave initiation and ripple generation. Journal of Neuroscience. 34, 11385-11398 (2014).
- McCloskey, D. P., Scharfman, H. E. Progressive, potassium-sensitive epileptiform activity in hippocampal area CA3 of pilocarpine-treated rats with recurrent seizures. Epilepsy Research. 97, 92-102 (2011).
- McMahon, L. L., Williams, J. H., Kauer, J. A. Functionally distinct groups of interneurons identified during rhythmic carbachol oscillations in hippocampus in vitro. Journal of Neuroscience. 18, 5640-5651 (1998).
- Pöschel, B., Heinemann, U., Draguhn, A. High frequency oscillations in the dentate gyrus of rat hippocampal slices induced by tetanic stimulation. Brain Research. 959, 320-327 (2003).
- Hájos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. European Journal of Neuroscience. 29, 319-327 (2009).
- Hájos, N., Mody, I. Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content. Journal of Neuroscience Methods. 183, 107-113 (2009).
- Dengler, C. G., Yue, C., Takano, H., Coulter, D. A. Massively augmented hippocampal dentate granule cell activation accompanies epilepsy development. Nature Publishing Group. , 1-17 (2017).
- Ting, J. T., et al. Preparation of acute brain slices using an optimized N -methyl-D-glucamine protective recovery method. Journal of Visualized Experiments. 132, 1-13 (2018).
- Westerhof, N., Lankhaar, J. W., Westerhof, B. E. The arterial windkessel. Medical and Biological Engineering and Computing. 47, 131-141 (2009).
- Shi, W. X., Bunney, B. S. A small volume chamber for electrical recording from submerged brain slices and a pulse-free medium supply system using a peristalic pump. Journal of Neuroscience Methods. 35, 235-240 (1990).
