Summary
פרוטוקול זה מתאר את הכנת פרוסות קליפת המוח ההיפוקמפוס-סנטורינאלית האופקית (HEC) מעכברים המציגים פעילות אדווה ספונטנית של גל חד. פרוסות מודגרות בתא החזקת ממשק פשוט והקלטות מבוצעות בתנאים שקועים עם נוזל שדרתי מלאכותי זורם במהירות כדי לקדם חמצון רקמות ואת הופעתה הספונטנית של פעילות ברמת הרשת.
Abstract
חריף קוסמים במוח מציע גישה ניסיונית ניתנת להפעלה כדי לקבל תובנות על הארגון והתפקוד של מעגלים עצביים עם רזולוציה של תא יחיד באמצעות אלקטרופיזיולוגיה, מיקרוסקופיה ופרמקולוגיה. עם זאת, שיקול מרכזי בתכנון ניסויים במבחנה הוא המידה שבה תכשירי פרוסות שונים מסכמים מחדש דפוסים נטורליסטיים של פעילות עצבית כפי שנצפו ב- vivo. במוח שלם, רשת ההיפוקמפוס מייצרת פעילות אוכלוסין מסונכרנת מאוד המשקפת את המצב ההתנהגותי של החיה, כפי שבא לידי ביטוי בתסביכי הגלים החדים (SWRs) המתרחשים במהלך מצבי ההתעוררות או השינה שאינה REM. SWRs וצורות אחרות של פעילות רשת יכולים לצוץ באופן ספונטני בפרוסות היפוקמפוס מבודדות בתנאים מתאימים. על מנת ליישם את ערכת הכלים החזקה של פרוסת המוח על חקירת פעילות רשת ההיפוקמפוס, יש צורך להשתמש בגישה המייעלת את בריאות הרקמות ושמירה על קישוריות תפקודית בתוך רשת ההיפוקמפוס. עכברים נוטרים באופן טרנס-קרדיאלי נוזל שדרתי מלאכותי קר המבוסס על סוכרוז. פרוסות אופקיות המכילות את ההיפוקמפוס נחתכות בעובי של 450 מיקרומטר כדי לשמר קישוריות סינפטית. פרוסות מתאוששות בתא בסגנון ממשק ומועברות לתא שקוע להקלטות. תא ההקלטה מיועד לתדלוק כפול של נוזל שדרתי מלאכותי בקצב זרימה גבוה כדי לשפר את החמצון של הפרוסה. פרוטוקול זה מניב רקמה בריאה המתאימה לחקירת פעילות רשת מורכבת וספונטנית במבחנה.
Introduction
מדידה אלקטרופיזיולוגית מפרוסות היפוקמפוס חיות במבחנה היא גישה ניסיונית רבת עוצמה עם יתרונות רבים. הנסיין יכול להשתמש במיקרוסקופ, מיקרומניפולטורים ומערכת הקלטה כדי לדמיין ולאסוף מדידות ישירות מתאי עצב בודדים ברקמה. פרוסות רקמות נגישות מאוד גם לצילום או משלוח תרופות לניסויים אופטוגנטיים, כימוגנטיים או תרופתיים.
רשת ההיפוקמפוס מייצרת פעילות אוכלוסין סינכרונית מאוד ב vivo, גלוי כמו תנודות בפוטנציאל השדה המקומי חוץ תאי1,2,3,4,5. שיטות פרוסת המוח כבר ממונפות כדי לקבל תובנה לתוך מנגנוני הסלולר והמעגלים שבבסיס תנודות רשת עצביות אלה. עבודת יסוד של מאייר ואח 'הוכיחה כי מתחמי גלים חדים (SWRs) יכולים לצוץ באופן ספונטני בפרוסות של ההיפוקמפוס הגחוני6,7. מחקרים מאוחרים יותר של חוקרים מרובים הבהירו בהדרגה היבטים רבים של SWRs, כולל תפקידם של נוירומודולטורים בוויסות מצב הרשת של ההיפוקמפוס8,9,10 והמנגנונים הסינפטיים המניעים את ההפעלה מחדש במבחנה של הרכבים עצביים שהיו פעילים בעבר במהלך התנהגות ב vivo11. ניסויים בפרוסות מוח סיפקו גם תובנה על תנודות טווח הגמא (30-100 הרץ), מצב רשת היפוקמפוס מובהק האמין לתמוך קידוד זיכרון להיזכר12,13. לבסוף, הכרה בתפקיד המרכזי של ההיפוקמפוס ומבנים הקשורים בפתופיזיולוגיה של אפילפסיה של האונה הרקתית14,15, חוקרים השתמשו בהכנות פרוסת היפוקמפוס כדי לחקור את הדור ואת התפשטות פעילות אפילפטיפורם. Carter et al. הוכיחו כי פרוסות קליפת המוח ההיפוקמפוס-entorhinal בשילוב שהוכנו מבעלי חיים אפילפטיים כרוניים יכול ליצור באופן ספונטני הפרשות אפילפטיפורם במבחנה16. לאחר מכן, Karlócai et al. חקר את המנגנונים שבבסיס הפרשות אפילפטיפורם בפרוסות היפוקמפוס באמצעות נוזל שדרתי מלאכותי שונה (ACSF) עם ריכוזי יון שונה (מופחת Mg2+ או גבוה K+) או תרופות נוספות (4AP או gabazine)17.
חוקרים פיתחו גישות רבות של פרוסות היפוקמפוס השונות בדרכים מרכזיות: (1) אזור ההיפוקמפוס הכלול בפרוסה (גב, ביניים או גחון); (2) נוכחות או היעדר רקמות חוץ-פימפו-קמפליות כגון קליפת המוח האנטורינלית; (3) הכיוון המשמש לחיתוך פרוסות (קורנל, קשת, אופקי או אלכסוני); ו-(4) התנאים שבהם נשמרת הרקמה לאחר ההחתמה (שקועה במלואה ב- ACSF או מוחזקת בממשק של ACSF ואוויר לח ועשיר קרבוגן).
הבחירה באיזו גישה חותכת להשתמש צריכה להיקבע על ידי המטרה הניסיונית. לדוגמה, פרוסות רוחביות או קורנליות של ההיפוקמפוס הגבי המתוחזק בתנאים שקועים שימשו ביעילות רבה לחקירת מעגלים תוך-פיוקמפוסים ופלסטיות סינפטית18,19,20. עם זאת, הכנות כאלה אינן יוצרות באופן ספונטני תנודות ברשת בקלות כמו פרוסות מההיפוקמפוס הגחוני21,22,23. למרות מצב של פעילות SWR מתמשכת ניתן לגרום על ידי גירוי tetanic בפרוסות רוחביות מן ההיפוקמפוס הגבי הגחוני24, SWRs ספונטניים נצפו בקלות רבה יותר פרוסות הגחון7,25.
הבחנה פיזיולוגית ואנטומית אינהרנטית בין ההיפוקמפוס הגבי לבין ההיפוקמפוס הגחוני נתמכת על ידי מחקרים המבוצעים הן ב- vivo והן במבחנה26. הקלטות בחולדות חשפו מקצבי תטא עקביים מאוד לאורך ההיפוקמפוס הגבי והבינוני, אך קוהרנטיות לקויה בין אזור הגחון לשאר ההיפוקמפוס27. SWRs ב vivo מפיצים בקלות בין ההיפוקמפוס הגבי והבינוני, ואילו SWRs שמקורם בהיפוקמפוס הגחוני נשארים לעתיםקרובות מקומיים 28. התחזיות האסוציאטיביות שמקורן בנוירונים פירמידליים CA3 המתגוררים בפרויקט ההיפוקמפוס הגבי והבינוני למרחקים ארוכים לאורך הציר האורך של ההיפוקמפוס. תחזיות CA3 שמקורן באזורים גחוני להישאר מקומיים יחסית, ולכן נוטים פחות להיות מנותק במהלך תהליך ההחתכה29,30. לפיכך, פרוסות גחון עשויות לשמר טוב יותר את הרשת החוזרת הנחוצה ליצירת סנכרון אוכלוסין. הנטייה של פרוסות גחון כדי ליצור פעילויות רשת ספונטניות במבחנה עשויה גם לשקף רגישות פנימית גבוהה יותר של נוירונים פירמידליים או עיכוב GABAergic חלש יותר בהיפוקמפוס הגחוני בהשוואה לאזורים הגביים יותר31. ואכן, פרוסות היפוקמפוס הגחוני רגישים יותר לפעילות אפילפטיפורם32,33. לפיכך, מחקרים רבים של תנודות רשת ספונטניות8,9,11,24 או פתולוגי16,34,35,36 תנודות רשת השתמשו באופן מסורתי בגישה חתוכה אופקית, לפעמים עם זווית קלה בכיוון הקדמי-עורפי, אשר מניב פרוסות רקמה במקביל למישור הרוחבי של ההיפוקמפוס הגחוני.
קישוריות הרשת מושפעת באופן בלתי נמנע מהליך ההחתכה, שכן תאים רבים בפרוסה ינותק. הזווית ועובי הפרוסה והרקמה שנשמרו בהכנה יש לשקול לייעל את הקישוריות במעגלי העניין. מחקרים רבים השתמשו בפרוסות קליפת המוח האופקית המשולבת של ההיפוקמפוס -entorhinal (HEC) כדי לחקור אינטראקציות בין שני המבנים בהקשר של תנודות רשת פיזיולוגיות או פתולוגיות. Roth et al. ביצע הקלטות כפולות משדה המשנה CA1 של ההיפוקמפוס ושכבה V של קליפת המוח האנטורינאלית המדיאלית כדי להדגים התפשטות של פעילות SWR באמצעות פרוסת HEC37. מחקרים רבים על פעילות אפילפטיפורם השתמשו בהכנת פרוסת HEC כדי לחקור כיצד הפרשות אפילפטיפורם מתפשטות דרך רשת קורטיקוהיפוקאמפל16,35,36,38. חשוב לציין כי שימור הלולאה קורטיקוהיפוקאמפל שלם אינו תנאי מוקדם עבור SWRs ספונטניים, הפרשות אפילפטיפורם, או תנודות גמא; תנודות רשת יכולות להיווצר בפרוסות רוחביות של ההיפוקמפוס הגבי או הגחוני ללא רקמות פרהיפוקמפוס מחוברות21,22,23, 25,39,40,41. גורם חשוב יותר עבור הדור הספונטני של תנודות רשת בפרוסות היפוקמפוס עשוי להיות עובי של כל פרוסה, כמו פרוסה עבה יותר (400-550 מיקרומטר) ישמור קישוריות יותר ברשת CA2/CA3 חוזרת21,22,25.
למרות פרוסות HEC אופקי זוויתי (לחתוך עם זווית של כ 12 ° בכיוון הקדמי-עורפי) שימשו כדי ללמוד את הקישוריות הפונקציונלית של לולאת corticohippocampal11,16,34,35,42, הכנות זוויתיות כאלה אינם נדרשים לפעילות רשת ספונטנית43,44,45. עם זאת, השימוש במישור חתך זוויתי מאפשר לחוקר להכין באופן סלקטיבי פרוסות המשמרות בצורה הטובה ביותר את הלאמלה בעלת הכיוון הרוחבי של ההיפוקמפוס הגחוני או הבינוני, תלוי אם מוחלת זווית כלפי מטה או כלפי מעלה (איור 1). גישה זו דומה מבחינה מושגית לזו המשמשת את Papatheodoropoulos et al., 2002, אשר ניתח כל היפוקמפוס חינם ולאחר מכן השתמש במסוק רקמות כדי ליצור פרוסות רוחביות לאורך כל ציר הגב הגחוני21. לאור ההבחנה התפקודית הנ"ל בין ההיפוקמפוס הגחוני והידוכי הגבי, החוקרים צריכים לשקול את המקור האנטומי של פרוסות בעת תכנון ניסויים או פרשנות תוצאות. שימוש ברמפת אגר במהלך הליך ההחתכה הוא דרך פשוטה לייצר פרוסות מההיפוקמפוס הבינוני או הגחוני.
פרוסות היפוקמפוס יכולות להישמר בתא שקוע (עם הרקמה שקועה לחלוטין ב- ACSF), או בתא בסגנון ממשק (למשל, אוסלו או תא האס, עם פרוסות מכוסות רק על ידי סרט דק של מדיה זורמת). תחזוקת ממשק משפר חמצון של הרקמה, אשר מקדם הישרדות עצבית ומאפשר רמות גבוהות מתמשכת של פעילות interneuronal. באופן מסורתי, תנאי הקלטה שקועים משתמשים בקצב זרימה ACSF איטי יותר שאינו מספק חמצון רקמות נאות לביטוי יציב של תנודות ברמת הרשת. בפרוסות היפוקמפוס שקועות תנודות גמא הנגרמות על ידי קרבאכול נצפו רק באופן ארעי46,47, בעוד שהם יכולים להישמר ביציבות בתאי הקלטה ממשק10,48,49. ככזה, מחקרים רבים של פעילות ספונטנית מורכבת במבחנה הסתמכו על חדרי הקלטה ממשק לחקור מתחמי גל חדאדווה 6,7,8,9,10,25,37, תנודות גמא10,13, ופעילות אפילפטיפורם16,38,45,47.
בתא הקלטה בסגנון שקוע, ניתן להשתמש במטרה של מיקרוסקופ טבילה כדי לדמיין תאים בודדים ולמקד באופן סלקטיבי תאים בעלי מראה בריא להקלטות. ההכנה שקועה גם מאפשר שליטה עדינה על milieu הסלולר, כמו טבילה מקלה על פיזור מהיר של תרופות או תרכובות אחרות לרקמה. לפיכך, מתודולוגיה שונה שבה תנודות רשת יציבות נשמרות בתנאים שקועים מייצגת גישה ניסיונית רבת עוצמה. גישה זו באה לידי ביטוי על ידי העבודה של Hájos et al., שבו פרוסות ההיפוקמפוס להתאושש בתא החזקה בסגנון ממשק פשוט במשך כמה שעות לפני ההעברה לתא הקלטה שקוע שונה עם קצב זרימה גבוה של ACSF (~ 6 mL / min) כדי לשפר את אספקת החמצן לרקמה12,48,49. בתנאים אלה, ניתן לשמור על רמות גבוהות של פעילות interneuron ותנודת רשת ספונטנית יציבה בתא הקלטה שקוע. גישה זו שונה מאפשרת לחוקרים לבצע הקלטות תיקון תא שלם מונחה חזותית ולאפיין את תרומתם של סוגי תאים שזוהו מורפולוגית לתנודות גמא הנגרמות על ידי carbachol12. SWRs יכול להתרחש גם באופן ספונטני פרוסות היפוקמפוס שקוע עם קצב זרימה מהיר של ACSF11,48,49. מאייר ואח ' הדגימו כי פרוסות היפוקמפוס שהתאוששו בתא ממשק לפני המעבר לתא הקלטה שקוע הציגו באופן אמין SWRs ספונטניים, ואילו פרוסות שהתאוששו שקועות בכומתה לפני ההעברה לתא הקלטה שקוע הראו תגובות שדה קטנות יותר, רמות נמוכות יותר של זרמים סינפטיים ספונטניים, ורק לעתים רחוקות מאוד הציגו SWRsספונטניים 43. Schlingloff et al. השתמשו במתודולוגיה משופרת זו כדי להדגים את תפקידם של תאי סל מבטאים parvalbumin בדור של SWRs ספונטני44.
הפרוטוקול הבא מציג שיטת חתך שבאמצעותה ניתן לשחזר נוירונים פעילים באופן ספונטני בפרוסות היפוקמפוס אופקיות בתנאי ממשק ולאחר מכן להישמר בתא הקלטה שקוע המתאים למניפולציות תרופתיות או אופטוגנטיות והקלטות מונחות ויזואלית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת קולומביה (AC-AAAU9451).
1. הכנת פתרונות
- הכינו פתרון חיתוך סוכרוז לחיתוך כמתואר בטבלה 1.
הערה: לאחר הכנת 1 L של פתרון סוכרוז, להקפיא כמות קטנה (כ 100-200 מ"ל) במגש קרח. קוביות קרח סוכרוז קפואות אלה יתמזגו לתוך תרחיף קרח (ראה שלב 4.3). - הכן נוזל שדרתי מלאכותי (ACSF) להקלטה כמתואר בטבלה 2.
- הכן 1 M של NaCl עבור פיפטות גירוי על ידי המסת 0.05844 גרם של NaCl ב 1 מ"ל של מים מטוהרים כי כבר מסונן כדי להסיר מתכות עקבות וזיהומים אחרים.
הערה: פתרון חיתוך סוכרוז ו- ACSF צריך להיות מוכן טרי עבור כל ניסוי.
2. הכינו רמפת אגר
- הכן 4% אגר (למשל, 2 גרם אגר ב 50 מ"ל של מים) על ידי המסת אבקת אגר לתוך מים מטוהרים כי כבר מסונן כדי להסיר מתכות עקבות וזיהומים אחרים. מחממים את התערובת במיקרוגל עד שהיא רק מתחילה לרתיחה (כ 30-60 שניות). יוצקים את האגר המותך לתבנית ומאפשרים לו להתקרר ולהתמצק ב-4 מעלות צלזיוס במקרר בשיפוע של כ-12 מעלות.
הערה: עבור עובש, ניתן להשתמש בכל מיכל זכוכית או פלסטיק להגדיר בזווית, עם אגר מותך מספיק שפכו כדי ליצור רמפה של 4 ס"מ אורך כ 0.8 ס"מ גובה.
3. לביים את אזור ההחתכה
- מלא 400 מל המכילה תא התאוששות פרוסה עם כ 250 מל של ACSF; מניחים אותו באמבט מים מחומם ל 32 מעלות צלזיוס ולהתחיל מבעבע עם קרבוגן (95% גז חמצן / 5% גז פחמן דו חמצני).
הערה: מלאו את ההתאוששות בנוזל מספיק כדי למקם את רשת הניילון של תא המעצר ממש על פני הפתרון, כך שהפרוסות יוחזקו בממשק של תערובת התמיסה החמה והאוויר (איור 1). מניחים חתיכות קטנות של נייר עדשה על רשת ניילון. הפרוסות ישכבו על גבי נייר העדשה, אשר מאוחר יותר ניתן להשתמש בהם כדי להעביר פרוסות בנפרד לתא ההקלטה (ראה שלב 6.6). - מניחים בקבוקון עם תמיסת סוכרוז לתוך דלי קרח כדי לצנן ולהתחיל מבעבע עם פחמימן.
הערה: יש לחמם ולצנן את תמיסת ההתאוששות והסוכרוז, בהתאמה, עם קרבוגן מבעבע לפחות 30 דקות לפני שהעכבר ממוקם בתא האיזופלוראן. - מוציאים את המגש של קוביות קרח תמיסת סוכרוז קפואה מראש מהמקפיא ומניחים על הספסל להפשרה חלקית.
- מניחים חצי אחד של סכין גילוח נקי פיפיות למיקרוטום ומכיילים במידת הצורך. מניחים בצד את החצי השני של סכין הגילוח לשימוש במהלך הניתוח.
- הפעל קו קרבוגן ובדיקת טמפרטורה לתוך תא השיתוך ולהקיף בקרח כדי לצנן את התא.
- מכינים ספסל נקי או שולחן מכוסה בשני רפידות ספיגה חד פעמיות. לפרוס את כל כלי הניתוח ושלוש חתיכות של קלטת מעבדה על כרית שמאל, שבו זלוף transcardial יבוצע.
הערה: כלי ניתוח כוללים מספריים בון קטן, מספריים dissector, מרית גדולה / כף, microspatula, אזמל עם להב חדש, מרית, מספריים כירורגיים חדים / בוטים, מלקחיים רקמות גדולות, מלקחיים רקמה קטנה (ראה טבלה של חומרים). - על כרית סופגת אחרת מימין לאזור הזירוי, מניחים פיסת נייר סינון עגולה לתוך המכסה של צלחת פטרי זכוכית בקוטר 100 מ"מ. מניחים את החלק התחתון של צלחת פטרי ליד המכסה ומניחים קו קרבוגן לתוך שתי חתיכות של המנה.
- השתמש סכין גילוח או אזמל לחתוך רמפה קטנה של אגר (כ 4 ס"מ לאורך המשטח הזוויתי, 0.8 ס"מ גובה, 2 ס"מ רוחב). חותכים חתיכה של הרמפה מהקצה הגבוה ולהפוך אותו כדי ליצור בלוק גיבוי של אגר. השתמש דבק cyanoacrylate כדי להדביק את רמפת אגר בלוק גיבוי לפלטפורמת החיתוך ולהניח בצד.
הערה: בלוק הגיבוי של אגר מסייע לייצב את המוח במהלך החיתוך ומספק משטח שעליו ניתן לנתח רקמות מיותרות מכל פרוסה(איור 1).
4. זלוף טרנסקרדיאלי
- להשעות מזרק קיבולת 60 מ"ל כמו מאגר עבור פתרון חיתוך סוכרוז כ 18 סנטימטרים מעל הספסל (למשל, באמצעות מהדק מסתובב שלושה ראשים על עמוד אנכי). מחברים את הצינור לתחתית המאגר, מפעילים את הצינור דרך מהדק רולר, ומחברים את הקצה השני של הצינור למחט נקייה של 20 ג'י.
- מלאו את מאגר ה-60 מ"ל בכ-30 מ"ל של תמיסת סוכרוז צוננת והכוונו קו קרבוגן לתוך מאגר סוכרוז כדי לבעבע ללא הרף את הפרפוזיט.
הערה: ודא כי סוכרוז זורם דרך צינורות ומחט ללא כל בועות לכודים. קצב הזרימה צריך להיות מהיר מספיק כדי שיהיה זרם קבוע ומתמשך של סוכרוז נוטף מהמחט. - באמצעות בלנדר, למחוץ ולערבב את סוכרוז קפוא לתוך תרחיף קרח ולהשתמש מרית גדול / כפית כדי להפיץ את תרחיף.
- מניחים כמות קטנה של תרחיף סוכרוז סביב הקצוות של מכסה צלחת פטרי זכוכית. מוסיפים כמות קטנה של תרחיף סוכרוז לתחתית צלחת פטרי.
- מוסיפים בערך 20-30 מ"ל של תרחיף סוכרוז למאגר נוזלי הזיעה, ומערבבים אותו היטב עם 30 מ"ל של סוכרוז נוזלי צונן עד שהמאגר מכיל תערובת של סוכרוז קר מאוד, נוזלי בעיקר עם תמיסת שארית קפואה.
- הנח את העכבר לתוך תא המחובר לאייד isoflurane. עם חמצן זורם בערך 2 L / min, להפוך את החוגה של מאדה כדי לספק isoflurane ב 5% ריכוז ולהתחיל טיימר.
הערה: שמור על טיימר זה הולך לאורך כל ההחתכה כדי לאמוד כמה מהר הפרוסות מתקבלות. ההליך צריך להיעשות מהר ככל האפשר, כך שהחתכה הושלמה, והרקמה מתאוששת בתא הממשק תוך 15-20 דקות מהחיה הנכנסת לתא האיזופלורן. צפה בעכבר כדי להבטיח מצב של הרדמה עמוקה מושגת. לאחר מינימום של 5 דקות, העכבר צריך להיות מורדם עמוק ולא מגיב לצבוט בוהן. - מיד לפני הסרת העכבר מתא איזופלוראן, מלאו את מכסה צלחת פטרי בתמיסת סוכרוז צוננת לעומק של כ-3-5 מ"מ ומלאו את תחתית צלחת הפטרי בתמיסת סוכרוז צוננת לעומק של כ-1.0 ס"מ.
- מעבירים במהירות את העכבר למשטח הספיגה השמאלי ומשתמשים ב-3 פיסות הסרט כדי לאבטח את המזנבות והזנב. בצע קמצוץ בוהן אחורי כדי לוודא שהעכבר אינו מגיב לפני ביצוע חתך כלשהו. באמצעות מלקחיים רקמה גדולה ומספריים כירורגיים, אוהל את העור ולעשות חתך לאורך מתחתית עצם החזה לחלק העליון של החזה. באמצעות מלקחיים למשוך על עצם החזה ולהשתמש במספריים לחתוך דרך הסרעפת.
הערה: המיקום הראשוני של העכבר וכמה חתכים ראשונים כדי לנתק את הסרעפת צריך להתבצע מהר ככל האפשר כדי להבטיח שהעכבר לא יחזור להכרה. כדי להבטיח עומק נאות של הרדמה לאורך כל ההליך, חרוט האף יכול להיות ממוקם על העכבר כדי לספק isoflurane במהלך זלוף. - השתמש במספריים כדי לחתוך דרך כלוב הצלעות מכל צד, חיתוך בתנועה אחת גדולה לכיוון הנקודה שבה forelimb פוגש את הגוף. עם המלקחיים, להניף את החלק הקדמי של כלוב הצלעות משם למעלה לכיוון הראש, ולאחר מכן להסיר אותו באופן מלא עם חתך אופקי באמצעות מספריים גדולים. להחזיק את הלב במקום באמצעות מלקחיים גדולים ולהכניס את מחט זלוף 20 G לתוך החדר השמאלי. ברגע שהמחט ממוקמת כראוי, הצד השמאלי של הלב צריך להחוויר במהירות כמו פתרון סוכרוז מצונן ממלא את החדר.
- השתמש מספריים dissector קטן לחתוך לתוך אטריום הנכון ולאפשר את הדם לזרום מתוך מערכת הדם. אם החתכים מבוצעים כראוי, צריך להיות נזק מינימלי ללב, וזה צריך להמשיך לשאוב לאורך כל הזעתר.
הערה: חתיכות מגולגלות של נייר טישו יכול לשמש כדי לפתיל את דם פתרון סוכרוז מהלב ולשמור על הראות של מחט זלוף במהלך ההליך. - ודא כי מחט זלוף נשאר במקום ולא נופל מתוך החדר השמאלי. עם קצב זרימה ומיקום נאותים, הכבד יתחיל להחוויר לצבע שיזוף/בז' בהיר עם 20-30 שניות.
- לאחר 30-45 שניות, השתמש במספריים הגדולים כדי לערוף את ראשו של העכבר. מחזיקים את הראש ביד שמאל, דוחפים או מקלפים את העור מהגולגולת. אצל חיה מפוזרת היטב, הגולגולת צריכה להיות חיוורת מאוד, והמוח צריך להופיע בצבע ורוד בהיר מאוד (מתקרב לבן) דרך הגולגולת ללא כלי דם גלויים בבירור.
5. לחלץ את המוח לחתוך פרוסות
- באמצעות מספריים בון קטן, לעשות שני חתכים לרוחב דרך הגולגולת לכיוון קו האמצע בחלק הקדמי של הגולגולת, ליד העיניים. לעשות שני חתכים נוספים משני צדי בסיס הגולגולת.
- מעבירים את הראש לתחתית צלחת הפטרי מזכוכית, שם הוא אמור להיות שקוע בעיקר בתמיסת סוכרוז צוננת. השתמש במספריים בון קטנים כדי לחתוך את קו האמצע לאורך הגולגולת, מושך עם המספריים כדי למזער את הנזק לרקמת המוח הבסיסית. באמצעות מלקחיים רקמה קטנה, לתפוס בחוזקה כל צד של הגולגולת להניף אותו למעלה והתרחקות מהמוח, כמו פתיחת ספר.
- השתמש באצבעות יד שמאל כדי להחזיק את מדפים של הגולגולת פתוח ולהכניס את microspatula מתחת למוח ליד נורות חוש הריח. להפוך את המוח מתוך הגולגולת לתוך סוכרוז ולהשתמש microspatula לנתק את גזע המוח. לשטוף את המוח כדי להסיר כל שאריות דם, פרווה, או רקמות אחרות.
- השתמש מרית גדולה / כף להעביר את המוח למכסה של צלחת פטרי זכוכית. כאשר החצי השני של סכין הגילוח בעל הקצוות הכפולים הוקצה בעבר, בצע שני חתכים קורונל כדי להסיר תחילה את המוח הקטן ולאחר מכן את החלק הצדדי ביותר של המוח, כולל נורות הריח (איור 1).
- החל דבק ציאנואקרילאט על רמפת אגר. בקצרה מאוד למקם את המוח על פיסת נייר מסנן יבש באמצעות מלקחיים רקמה גדולה ולאחר מכן מיד להעביר אותו רמפת אגר, הצבת פני השטח הגחוני של המוח על דבק.
הערה: עבור פרוסות של ההיפוקמפוס ביניים, המוח צריך להיות מכוון עם הקדמי הפונה במעלה השיפוע של הרמפה, ואת האחורי קרוב יותר הלהב. עבור פרוסות של ההיפוקמפוס הגחוני, לכוון את המוח עם הקצה האחורי הצביע במורד השיפוע של הרמפה, עם הקצה האחורי בחלק העליון של הרמפה, רחוק יותר מן הלהב. בכל מקרה, המוח צריך להיות ממוקם בחלק העליון של הרמפה, כך שהמשטח החתוך של המוח יוצר קשר עם בלוק הגיבוי של אגר(איור 1). - מניחים את פלטפורמת ההחתכה עם האגר והמוח לתוך תא ההחתכה של המיקרוטום וטובלים לחלוטין בתמיסת סוכרוז צוננת. השתמש מרית גדולה / כף להעביר כמה תרחיף סוכרוז לתא, תוך ערבוב להמיס כל סוכרוז קפוא במהירות להוריד את הטמפרטורה של התערובת ~ 1 -2 מעלות צלזיוס.
הערה: צפה במד הטמפרטורה לאורך כל ההחתכה. אם תמיסת סוכרוז מתחממת מעל 3 מעלות צלזיוס, מוסיפים עוד תרחיף ומערבבים כדי להוריד את הטמפרטורה. - חותכים פרוסות בעובי של 450 מיקרומטר עם מהירות microtome מוגדר 0.07 מ"מ / s. כאשר כל פרוסה משוחררת, השתמש במלקחיים של הרקמה הקטנה ובאזמל חד כדי להפריד תחילה בין שתי ההמיספרות, ולאחר מכן כדי לחתוך רקמה עד שהפרוסה תורכב בעיקר מאזורי ההיפוקמפוס והפרהיפוס(איור 1).
- השתמש פיפטה העברת פלסטיק להעביר את הפרוסות בנפרד לתא שחזור ממשק, להבטיח כי הם ממוקמים בממשק של ACSF ואת האוויר עם רק מניסקוס דק של ACSF מכסה את הפרוסות. סגור בחוזקה את מכסה התא ואפשר לפרוסות להתאושש ב 32 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
- לאחר ההתאוששות הראשונית ב 32 מעלות צלזיוס, להביא את תא התאוששות ממשק מתוך אמבט המים ומניחים על stirrer להגדיר למהירות איטית, כך בר ערבוב מגנטי מקדם את זרימת הדם של ACSF בתוך התא. אפשרו לו להתקרר בהדרגה לטמפרטורת החדר כשהפרוסות מתאוששות למשך 90 דקות נוספות. ודא כי תא ההתאוששות הוא מבעבע ללא הרף עם פחמימן ולא לאפשר בועות גדולות להילכד מתחת לפרוסות.
6. בצע הקלטות של פוטנציאל שדה מקומי (LFP) של פעילות ספונטנית
- היכונו להקלטות LFP על ידי הפעלת כל הציוד הדרוש, כולל המחשב שבו פועלת תוכנת הרכישה, הצג המחובר למחשב, הממריץ, המיקרו-מניפולטור, בקר הטמפרטורה, מקור אור המיקרוסקופ, המצלמה המחוברת למיקרוסקופ, מגבר המיקרואלקטרוניקה, הדיגיטייזר והמשאבה הפריפריאלית. אם אתה משתמש במערכת ואקום מרכזית, פתח את שסתום הקיר כדי להכין את קו הוואקום שיסיר את ACSF מתא ההקלטה.
- מלאו את המאגר המחומם ב- ACSF, ולאחר מכן הניחו קצה אחד של הצינור לתוך ה-400 מל המכילה את ה- ACSF המבעבע. הפעל את המשאבה peristaltic כדי לכוון ACSF מן הכף 400 מ"ל אל המאגר מחומם, ומהמאגר ואילך לתא ההקלטה. הקש או צבוט את הצינור כדי לשחרר את כל בועות לכודים.
- כוונן את המשאבה המיליסטית כדי להבטיח שקצב הזרימה של ACSF דרך תא ההקלטה יהיה מהיר (~ 8-10 מ"ל/דקה). השתמש בבדיקת טמפרטורה כדי להבטיח כי ACSF הוא 32 °C (69 °F) במרכז תא ההקלטה.
הערה: אם ACSF מועבר לתא ההקלטה באמצעות משאבה פריסטלית, קצב זרימה גבוה עלול לגרום לתנודות משמעותיות בקצב הזרימה. ניתן להשיג קצבי זרימה עקביים באמצעות עמעום פועם פשוט המורכב מסדרה של מזרקים ריקים המשולבים בצנרת (איור 2). - הכן גירוי והקלטת פיפטות מנימים זכוכית בורוסיליקט באמצעות משיכה חוט מחומם. יש להגדיר את פרוטוקול Puller להניב פיפטות עם התנגדות של 2-3 MOhm לגירוי או אלקטרודות הקלטה פוטנציאליות שדה מקומי.
- מילוי פיפטות גירוי עם 1 M NaCl ו- LFP פיפטות עם ACSF.
- להדק בקצרה את הצינור ולכבות את המשאבה כדי להשהות את זרימת ACSF. מעבירים פרוסה לתא ההקלטה בעזרת מלקחיים עדינים כדי לתפוס פינה בנייר העדשה שהפרוסה מונחת עליו- הפרוסה תידבק לנייר העדשה. מניחים את נייר העדשה ופורסים לתא ההקלטה כשהפרוסה פונה כלפי מטה, ואז "מקלפים" את נייר העדשה ומשאירים את הפרוסה שקועה בתא ההקלטה. אבטחו את הפרוסה בעזרת נבל.
הערה: ניתן לרכוש נבלים המיוצרים מראש או מיוצרים במעבדה באמצעות חתיכת נירוסטה בצורת U או פלטינה וסיבי ניילון משובחים. - מניחים פיפטה גירוי מלא NaCl במיקרומניפולטור ידני ולאט לאט לקדם את קצה פיפטה לתוך פני השטח של הפרוסה (למשל, בשכבת רדיואטום שכבה) בזווית של כ 30-45 מעלות. ברגע שקצה הפיפט נכנס לרקמה, מקדמים את הפיפט קדימה לאט ונמנעים מתנועות גדולות בכיוון לרוחב או אנכי שעלולות לגרום נזק לאקסונים שלא לצורך בתוך הפרוסה. מניחים את קצה פיפטה לפחות 50-100 מיקרומטר עמוק לתוך הפרוסה, כדי למנוע תאים ליד פני השטח שנפגעו במהלך השיתוך.
- הנח פיפטה LFP מלאה ACSF לתוך מחזיק פיפטה מחובר micromanipulator ממונע. החל לחץ חיובי קל מאוד באמצעות לחץ הפה או מזרק 1 מ"ל מחובר באמצעות שסתום stopcock ואורך קצר של צינורות למחזיק פיפטה.
הערה: מיקום פיפטות LFP בתוך הפרוסה כדי לתעד את אותות העניין: במקרה של אדוות גל חדות, פיפטה LFP אחת צריכה להיות ממוקמת בפירמידת השכבות (SP) ופיפט שני בשכבה רדיואטום (SR). תצורה זו מאפשרת הקלטות בו-זמניות של הגל החד השלילי ב-SR ותנודת האדווה בתדר גבוה ב-SP (איור 3). - באמצעות micromanipulator לאט לקדם את קצה פיפטה LFP לאזור העניין (למשל, שכבת תא פירמידלי CA1) בזווית של כ 30-45 °. מניחים את קצה פיפטה לפחות 50-100 מיקרומטר עמוק לתוך הפרוסה, כדי למנוע תאים ליד פני השטח שנפגעו במהלך השיתוך. תוך כדי קידום פיפטה LFP, לספק ללא הרף דופק בדיקת מתח קטן באמצעות תוכנת הרכישה ולצפות לעלייה פתאומית בהתנגדות אלקטרודה. הדבר עשוי להצביע על כך שהפיפט סתומה או נלחצה כנגד תא.
- לאחר פיפטה LFP ממוקם באזור של עניין, בזהירות לשחרר את הלחץ החיובי על ידי פתיחת השסתום על צינורות מחובר מחזיק פיפטה.
- כדי להקליט את ה- LFP במיקום שני בו-זמנית, חזור על שלבים 6.8-6.10 עם פיפטה ומיקרו-מניפולטור שני.
- השתמש במגבר microelectrode בתצורת ההידוק הנוכחית כדי לתעד פעילות ספונטנית בפוטנציאל השדה המקומי לאחר שימוש בפונקציית איזון הגשר בתוכנת הרכישה כדי לתקן את ההתנגדות לסדרה של פיפטה. SWRs ספונטניים יופיעו כהטיות חיוביות בפוטנציאל החוץ-תאי של שכבת SP (איור 3).
- על מנת לתעד פוטנציאל שדה מעורר, השתמש בממריצים המחוברים לדיגיטייזר כדי לספק פעימת מתח מרובע קצרה (200 אותנו) דרך פיפטה גירוי מלא NaCl. כוונן את חוגת מתח הגירוי כדי לעורר מגוון משרעת תגובה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מוצגות להלן הקלטות מייצגות מפרוסות HEC שהוכנו כמתואר בפרוטוקול זה. לאחר התאוששות בתא מעצר ממשק (איור 1C), פרוסות מועברות בנפרד לתא הקלטה שקוע (איור 2B). תא ההקלטה מסופק עם ACSF רווי קרבוגן באמצעות משאבה פריסטלית(איור 2A). המשאבה שואבת תחילה ACSF מן הכף מחזיק לתוך מאגר מחומם. קווי קרבוגן ממוקמים הן לתוך ההחזקה והן למאגר המחומם כדי לספק חמצון מתמשך של התקשורת. עמעום פועם, המורכב מסדרה של מזרקים מלאים באוויר, ממוקם בין המשאבה peristaltic ותא ההקלטה כדי למזער את התנודות בקצב הזרימה המיוצר על ידי פריסטאלזה מהירה. כיס האוויר בכל מזרק סופג את השינויים בלחץ הנגרמים על ידי כל מחזור של המשאבה, כך תא ההקלטה מקבל זרימה חלקה ועקבית של ACSF52,53. תנור מוטבע ממוקם לאחר עמעום הפעימה מבטיח כי הטמפרטורה של ACSF מוחזק ב 32 מעלות צלזיוס כפי שהוא נכנס לתא ההקלטה.
בדוגמה זו, תא ההקלטה של superfusion בעל שני משטחים מורכב משלוש שכבות המודפסות בתלת-ממד (איור 2B). השכבה התחתונה יש מגזרה מלבנית כדי להתאים כיסוי, מאובטח עם שומן ואקום. השכבה האמצעית מכילה את החצי התחתון של תא אליפטי מוארך, עם שני תמיכות אופקיות. חוט ניילון תלוי על פני תמיכות אלה (בערך כל 0.5 מ"מ) ומאובטח עם דבק ציאנואקרילאט. הפרוסה תנוח על חוט זה מתוח. השכבה העליונה מכילה את החצי העליון של התא הסגלגל יחד עם בארות קטנות שלתוכו כדורי הקרקע כסף כלוריד ניתן למקם. הצורה הסגלגלה המוארכת של התא נועדה לקדם זרימה למינארית מהירה של ACSF.
איור 3 מציג הקלטות מייצגות מפרוסות HEC שהוכנו בהתאם לפרוטוקול זה. כדי להעריך בתחילה את בריאות הפרוסות, הפוטנציאלים הפוסט-סינפטיים של השדה (fPSPs) מתעוררים ברדיואטום השכבה (SR) באמצעות פיפטה מלאה ב- 1 M של NaCl. בפרוסות בריאות, גירוי חשמלי אמור לייצר fPSP עם מטח סיבים טרום-סינפטי קטן ופוטנציאל פוסט-סינפטי גדול עם ירידה ראשונית מהירה(איור 3B, בפינה השמאלית העליונה). בפרוסות בריאות, אדוות גל חד ספונטניות (SWRs) נראות כהטיות חיוביות ב- LFP בפירמידת השכבות (איור 3B, משמאל למטה). בפרוסות תת-אופטימליות fPSPs מעוררים מראים מטח סיבים גדול ופוטנציאל פוסט-סינפטי קטן יחסית, ופרוסות כאלה אינן מראות SWRs ספונטניים(איור 3B, נכון). SWRs במבחנה מציגים מאפיינים התואמים לתיאורים שפורסמו: פוטנציאל שדה חיובי בשכבת SP עם תנודה בתדר גבוה מכוסה, יחד עם פוטנציאל שדה שלילי בשכבת SR (איור 3C). SWR יחיד שהוקלט ב- CA2 מצוין בכוכבית(איור 3C, מימין). SWRs בפרוסות HEC מקורם במעגלים חוזרים של CA2/CA3 ומתפשטים ל- CA1. SWR יחיד שנצפה בשכבת CA2 ו- CA1 SP מצוין בכוכבית(איור 3D, מימין). בדוגמה מייצגת זו, CA2 SWR (ירוק) מוביל כי ב CA1 (כחול) על ידי כמה אלפיות שניה, כפי שמוצג בשכבת העל של מעטפת SWR (מסונן ב 2-30 הרץ) נרשם בכל אזור.
איור 1: הכנת פרוסות קליפת המוח האופקית בזווית היפוקמפוס-סנטורינאל (HEC). ( א) אני לא יכוללעשות את זה. (i)לאחר חילוץ המוח, לבצע שני חתכים coronal עם סכין גילוח כדי להסיר את החלקים האחוריים והקצינים של המוח. רמפתאגר נוצרת משתי מנות זוויתיות המודבקות לפלטפורמת המיקרוטום. כדי להכין פרוסות של ההיפוקמפוס הבינוני, מניחים את בלוק המוח על רמפת אגר עם המשטח הקדמי הפונה במעלה המדרון ומקשרים עם החלק המגבה הגבוה של הרמפה. כדי להכין פרוסות של היפוקמפוס גחוני יותר, מניחים את בלוק המוח על רמפת אגר עם המשטח הקדמי הפונה במורד המדרון, כך משטח לחתוך האחורי יוצר קשר עם החלק האחורי הגבוה של הרמפה. (iii)כמו כל פרוסה הוא שוחרר, לבצע כמה חתכים נוספים עם אזמל להפריד את ההמיספרות ולהסיר רקמה מיותרת. (B) תמונה מייצגת של הפרוסה המתקבלת עם גרעיני תא המסומנים על-ידי DAPI. (C) בתא שחזור ממשק, פרוסות ממוקמות על חתיכות נייר עדשה על גבי רשת נירוסטה או ניילון, רמה עם פני השטח של ACSF. מבעבע קרמי מעביר קרבוגן לתוך התא ובר ערבוב מגנטי מערבב ללא הרף את הנוזל בתא. סרט דק של ACSF מכסה את המשטח העליון של הפרוסה, שיפור דיפוזיה של חמצן מהאוויר לח עשיר קרבוגן של התא. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תא הקלטה כפול של עירוי-על עם עמעום פועם בצינורות המסירה של ACSF. (A) דיאגרמה של מערכת עירוי העל. ACSF מחומם ל 32 °C (60 °F), כל הזמן מבעבע עם גז קרבוגן, ומועבר בערך 8-10 מ"ל / דקה באמצעות משאבה פריסטלטית עם עמעום פועם המורכב מסדרה של מזרקים מלאים באוויר. (B)תא ההקלטה מורכב משלוש שכבות המודפסות בתלת-ממד, שבמרכזן נימה של ניילון. הפרוסה נשענת על חוט מתוח זה ו- ACSF זורם מעל ומתחת לרקמה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הקלטות מייצגות של גלים חדים ספונטניים מפרוסות HEC. (A) דיאגרמה פשוטה של פרוסת HEC המציגה את עמדות אלקטרודות ההקלטה והגירוי. (B)הקלטות מייצגות של פעילות LFP הן מפרוסה פעילה ובריאה והן מפרוסה תת-אופטימלית. הפרוסה הבריאה (משמאל, בירוק) מציגה תגובות שדה גדולות ומעוררות ואדוות גל חד ספונטניות (SWRs), הנראות כהטיות חיוביות המתרחשות באופן לא סדיר בפוטנציאל השדה המקומי של שכבת SP. לעומת זאת, פרוסה לא בריאה מציגה תגובות שדה קטנות ומעוררות וללא פעילות ספונטנית (נכון, באפור). (C) הקלטות מייצגות של SWRs באזור CA2, המורכבות מהטיה שלילית ב- LFP בשכבת ה- SR ותנודה בתדר גבוה עם הסטה חיובית המשמשת כבסיס ב- LFP בשכבת SP. פסגות בכל ערוץ הגדולות משלוש סטיות תקן של משרעת האות מודגשות באדום. מסנן פס של 2-30 הרץ מבודד את המעטפה החיובית והשלילית הבסיסית של הגל החד בשכבת SP ו- SR, בהתאמה, בעוד מסנן פס של 80-250 הרץ משמש לבידוד התנודות בתדר גבוה של האדווה בשכבת SP. (ד) SWRs במבחנה להפיץ מ CA2/CA3 ל CA1. בהקלטות מייצגות אלה, SWRs ב- CA2 (ירוק, תחתון) קודמים לזה שב- CA1 (כחול, עליון) בכמה אלפיות שניה. פסגות בכל ערוץ הגדולות משלוש סטיות תקן של משרעת האות מודגשות באדום. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| משקל מולקולרי (גרם / מול) | ריכוז סופי (mM) | גרם / 1 L סוכרוז חיתוך פתרון | ||
| סוכרוז | C12H22O11 | 342.3 | 195 | 66.749 |
| נתרן כלורי | נקלה (נקל) | 58.44 | 10 | 0.584 |
| גלוקוז | C6H12O6 | 180.08 | 10 | 1.801 |
| סודיום ביקרבונט | נהקו3 | 84.01 | 25 | 2.1 |
| אשלגן כלורי | KCl | 74.55 | 2.5 | 0.186 |
| נתרן פוספט מונובאסי נטול מים | NaH2PO4 | 137.99 | 1.25 | 0.173 |
| נתרן פירובט | C3H3נאו3 | 110.04 | 2 | 0.22 |
| ריכוז מלאי (ז) | ריכוז סופי (mM) | מיליליטר / 1L סוכרוז חיתוך פתרון | ||
| סידן כלורי | CaCl2 | 1 | 0.5 | 0.5 |
| מגנזיום כלוריד | MgCl2 | 1 | 7 | 7 |
טבלה 1: הרכב פתרון חיתוך סוכרוז. התחל עם כ 0.75 L של מים מטוהרים כי כבר מסונן כדי להסיר מתכות עקבות וזיהומים אחרים. ממיסים כל מוצק תוך ערבוב הפתרון עם מוט ערבוב מגנטי. לאחר כל מוצקים מומסים, גז פחמימוגן בועה דרך הפתרון במשך 10 דקות. הוסיפו את הפתרונות MgCl2 ו-CaCl 2 והוסיפו מים כדי להביא את הנפח הכולל ל-1 L. ערבבו עם מוט ערבוב מגנטי למשך 10 דקות כדי להבטיח שהפתרון מעורבב באופן אחיד. osmolarity צריך להיות בין 315 ו 325 mOsm, ואת ה- pH צריך להיות כ 7.4.
| משקל מולקולרי (גרם / מול) | ריכוז סופי (mM) | גרם / 2L ACSF | ||
| נתרן כלורי | נקלה (נקל) | 58.44 | 125 | 14.61 |
| גלוקוז | C6H12O6 | 180.08 | 12.5 | 4.502 |
| סודיום ביקרבונט | נהקו3 | 84.01 | 25 | 4.201 |
| אשלגן כלורי | KCl | 74.55 | 3.5 | 0.522 |
| נתרן פוספט מונובאסי נטול מים | NaH2PO4 | 137.99 | 1.25 | 0.345 |
| חומצה אסקורבית | C6H8O6 | 176.12 | 1 | 0.352 |
| נתרן פירובט | C3H3נאו3 | 110.04 | 3 | 0.66 |
| ריכוז מלאי (ז) | ריכוז סופי (mM) | מיליליטר / 2L ACSF | ||
| סידן כלורי | CaCl2 | 1 | 1.6 | 3.2 |
| מגנזיום כלוריד | MgCl2 | 1 | 1.2 | 2.4 |
טבלה 2: הרכב של נוזל שדרתי מלאכותי. התחל עם כ 1.5 L של מים מטוהרים כי כבר מסונן כדי להסיר מתכות עקבות וזיהומים אחרים. ממיסים כל מוצק תוך ערבוב הפתרון עם מוט ערבוב מגנטי. לאחר כל מוצקים מומסים, גז פחמימוגן בועה דרך הפתרון במשך 10 דקות. הוסיפו את הפתרונות MgCl2 ו-CaCl 2 והוסיפו מים כדי להביא את הנפח הכולל ל-2 ל' מערבבים עם מוט ערבוב מגנטי למשך 10 דקות כדי להבטיח שהפתרון מעורבב באופן אחיד. osmolarity צריך להיות בין 315 ו 325 mOsm, ואת ה- pH צריך להיות כ 7.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ישנם מספר צעדים בפרוטוקול חיתוך זה שנועד לקדם את בריאות הרקמות ולהעדיף את הופעתה של פעילות רשת נטורליסטית ספונטנית: העכבר חדור באופן טרנסקרדיאלי עם פתרון חיתוך סוכרוז מצונן; פרוסות קליפת המוח האופקית-סנטוריניאלית (HEC) נחתכות בעובי של 450 מיקרומטר מההיפוקמפוס הבינוני או הגחוני; פרוסות להתאושש בממשק של ACSF מחומם ואוויר לח, פחמימן עשיר; במהלך הקלטות פרוסות הם superfused עם ACSF מחומם ל 32 °C (60 °F) ונמסר בקצב זרימה מהיר עם superfusion משטח כפול בתא הקלטה שקוע.
בריאות פרוסה היא בעלת חשיבות עליונה עבור הדור של תנודות רשת במבחנה. בעלי חיים צעירים יניבו פרוסות בריאות יותר, ובדרך כלל עם עכברים צעירים או מתבגרים ניתן לדלג על שלב זלוף transcardial. ככל שבעלי חיים מזדקנים, קשה יותר ויותר להכין פרוסות בריאות, אך כמה חקירות (כגון מודלים של מחלות או מחקרים אורך) מחייבות שימוש בבעלי חיים בוגרים או מזדקנים. דנגלר ואח ', למשל, השתמשו perfusions transcardial בהכנת פרוסות HEC מן pilocarpine שטופלו באופן כרוני אפילפטית מבוגרים עכברים50. עם עכברים בוגרים, זה מועיל לבצע זלוף transcardial עם פתרון חיתוך סוכרוז מצונן כדי לקרר את הרקמה, לנקות את הדם מהמוח, ולהפחית פעילות מטבולית לפני הסרת המוח מן הגולגולת51. חשוב לציין, עם זאת, כי perfusions transcardial דורשים הכשרה להתבצע כראוי יש לנקוט כדי להבטיח כי ההליך מתבצע במהירות באופן שאינו מהווה סיכון לרווחת בעלי החיים. כאשר הדבר אפשרי, יש לתכנן ניסויים לשימוש בבעלי חיים צעירים כדי למנוע שימוש בדלקות פרפוסיות טרנסקרדיאליות. בהכנת פרוסה תת-אופטימלית, לא יהיו מספיק תאים בריאים, במיוחד אינטרנציונלים, כדי לתמוך בתנודות רשת מתמשכות. כדי להעריך את בריאות הפרוסה במהלך הניסוי, כדאי לתעד תחילה פוטנציאל שדה מעורר (לדוגמה, עם פיפטה גירוי פיפטה הקלטה בשכבה רדיואטום, SR). בפרוסה בריאה, גירוי בשכבת ה-SR יעורר פוטנציאל פוסט-סינפטי גדול (fPSP) עם מטח סיבים טרום-סינפטי קטן יחסית(איור 3).
הפרוסות המיוצרות על ידי פרוטוקול זה הן פרוסות קליפת המוח ההיפוקמפוס-סנטורינאל (HEC) אופקיות בזווית. חשוב לציין, לא הכללת רקמת parahippocampal ולא לחתוך זווית נחוצים עבור פרוסות ההיפוקמפוס כדי ליצור באופן ספונטני פעילויות רשת כגון SWRs. ואכן, מחקרים רבים השתמשו בפרוסות היפוקמפוס אופקיות או רוחביות כדי לחקור היבטים של25,40,41,44 או תנודות רשת פתולוגיות33,38. בפרוטוקול זה מיקום המוח על רמפת אגר מאפשר לנסיין לייצר באופן סלקטיבי פרוסות נוספות מההיפוקמפוס הגחוני או הבינוני (איור 1), אשר עשוי להיות מועיל למטרות ניסיוניות שלוקחות בחשבון את ההטרוגניות התפקודית הקיימת לאורך ציר האורך של ההיפוקמפוס26,31. אם המקור האנטומי של הפרוסות אינו גורם, ניתן לשלול את רמפת האגאר ומישור חיתוך אופקי אמיתי יניב פרוסות של ההיפוקמפוס הבינוני לגחוני. כאשר כל פרוסת רקמה אופקית משוחררת, ניתן להסיר את רוב החלקים המופרזים של הפרוסה בשלושה חתכים פשוטים, ולהשאיר פרוסה מלבנית בערך המכילה את ההיפוקמפוס וכמה רקמות מסביב, כולל אזור הפרהיפוסמפוס(איור 1). ניתוח נוסף יכול להתבצע כדי להסיר את כל רקמות extrahippocampal, אבל הכללת הרקמה שמסביב מועיל, בכך נבל פרוסה ניתן למקם בקלות כך חוטי ניילון לא לנוח על פני ההיפוקמפוס הנכון. כפי שנדון לעיל, פרוסת HEC המשולבת היא גם הכנה שימושית שבה לחקור רשת קורטיקוהיפוקמפוסלית גדולה יותר בהקשר של37 פיזיולוגי אופתולוגי 16,35,36,38 תנודות ברשת.
הגורם העיקרי בפרוטוקול זה הוא לייעל את אספקת החמצן לרקמה, הן בשלב ההחלמה והן במהלך ההקלטות. מחקרים רבים של תנודות רשת מבוצעים בפרוסות המועברות ישירות מהמיקרוטום לתא הקלטת ממשק ומותר להתאושש עם תולדות מתמשכות של ACSF טרי. לאחר מספר שעות של התאוששות, הקלטות לאחר מכן ניתן לבצע באותו תא ממשק. לכן, פרוסות מוחזקות בממשק של ACSF ואוויר לח עשיר קרבוגן למשך כל הניסוי. במתודולוגיה החלופית המוצגת בפרוטוקול זה, פרוסות מתאוששות בתא מעצר בסגנון ממשק למשך שעתיים לפחות לפני שפרוסות בודדות מועברות לתא הקלטה בסגנון שקוע עם קצבי זרימה מהירים מספיק של ACSF. פרוסות שהוכנו בתנאים אלה יכולות להפגין תנודות גמא יציבות12 או פעילות SWR ספונטנית43. התאוששות פרוסות בתא מעצר בסגנון ממשק היא צעד קריטי: מאייר ואח 'הוכיחו כי פרוסות אשר להתאושש בכומתה שקועה לחלוטין ACSF להפגין פוטנציאל שדה מעורר קטן יותר, זרמים פוסט-סינפטיים ספונטניים תכופים פחות, ורק לעתים רחוקות לייצר פעילות רשת ספונטנית43. באופן דומה, Hájos et al. הראה כי קצבי זרימה ACSF מהירים לגרום לתדירות גבוהה יותר של זרמים פוסט-סינפטיים מעכבים ספונטניים, מה שמרמז על פעילות אינטראורונית משופרת49. במהלך תקופת ההקלטה, superfusion כפול משטח אינו הכרחי לחלוטין, בתנאי תא ההקלטה מחזיק נפח קטן יחסית של ACSF נמסר בקצב זרימה מהיר (לפחות 6 מ"ל / דקה)43. תא ההקלטה המודפס בתלת-ממד המוצג בפרוטוקול זה (איור 2B) הוא חסכוני יחסית ואפשרות פשוטה, אך ישנם גם תאי הקלטה שקועים מסחרית המיועדים להחזיק כרכים קטנים יותר, לקדם זרימה למינארית של המדיה, או לספק עירוי-על של משטח כפול (בניגוד לתאי הקלטה מעגליים, למשל, המאפשרים נפח מת עודף של ACSF).
בעוד פרוטוקול זה מאפשר אחד להקליט תנודות ברשת ללא הדרישה של תא הקלטה ממשק מסורתי, ישנן מספר מגבלות. למרות פרוסות מוחזקים בממשק ACSF-אוויר במהלך תקופת ההחלמה, הם אינם מקבלים נצח מתמשך של מדיה טרייה כפי שקורה בתאי הקלטה ממשק בסגנון האס המסורתי. יש להעביר פרוסות בנפרד (באמצעות מלקחיים עדינים) מתא ההתאוששות לתא ההקלטה השקוע. יתר על כן, קצבי זרימה מהירים עלולים לגרום לחוסר יציבות וחפצי תנועה בעייתיים עבור הקלטות מסוימות, במיוחד אם ACSF מועבר עם משאבה פריסטלית. על מנת לשמור על קצב זרימה מהיר ולמזער הפרעות מכניות, ניתן לשלב מערכת זלוף פשוטה (איור 2). זה dampener פועם פועל באמצעות אפקט Windkessel52, שבו מזרקים ריקים מכילים כיסי אוויר הפועלים כמו מאגרים אלסטיים, סופג את הלחץ התנודתי שנוצר על ידי רולים של משאבה פריסטלטית53. עם זאת, שילוב של עמעום דופק יכול להוסיף אורך לצינורות המספק ACSF לתא ההקלטה ולהשפיע על אספקת חמצן לפרוסה. קצבי זרימה צריכים להיות מהירים רק ככל הנדרש כדי להניב תנודות רשת יציבות, ואם משאבה פריסטלית משמשת זה צריך באופן אידיאלי להיות משאבה המשתמשת במספר רב של רולים (> 12) כדי למזער את הפעימות הנגרמות על ידי peristalsis, למנוע את השימוש של עמעום פועם, ולהבטיח כי צינורות המספק ACSF לתא ההקלטה הוא קצר ככל האפשר. הקלטות המבוצעות עם קצב זרימה מהיר מחייבות גם כמויות גדולות של ACSF, אשר עשוי להיות בעייתי אם ניסויים דורשים תוספת של תרופות יקרות או יקרות או תרכובות לתקשורת. למרות תא superfusion כפול משטח דורש תא הקלטה שנבנה במיוחד עם שני כניסות נוזלים כדי לספק מדיה מחומצנת לשני צידי הפרוסה, תנודות רשת ספונטניות ניתן לראות עם קצבי זרימה מתונים ACSF48. פרוטוקול זה משתמש הן בקצב זרימה מהיר (מיוצב עם עמעום פועם) והן בתא סופר-עירוי בעל שני משטחים כדי לשפר את הסבירות להתבוננות בפעילות ספונטנית.
לבסוף, לפרוטוקול זה יש תשואה נמוכה לגבי מספר הפרוסות המיוצרות לכל בעל חיים. חתך אופקי בעובי של 450 מיקרומטר מניב מספר קטן של פרוסות HEC בכיוון המועדף (שבו הפרוסה מקבילה ביעילות לציר הרוחבי של ההיפוקמפוס). מבין פרוסות אלה, בדרך כלל, רק אחד או שניים לכל היפוקמפי מציג פעילות SWR ספונטנית, פחות ממה שדווח במקומותאחרים 43. למרות פרוסות עבות ככל הנראה מכילים מידה רבה יותר של קישוריות חוזרת, חיתוך פרוסות מעט דקות יותר (400 מיקרומטר) עשוי להניב מספר גדול יותר לכל עכבר של פרוסות בכיוון רוחבי עם פעילות SWR. בנוסף, הסבירות כי פרוסות מרובות להפגין פעילות SWR ספונטנית עשוי להיות גבוה יותר בניסויים לנצל פרוסות אופקיות או כלפי מטה אמיתי זווית של ההיפוקמפוס הגחוני. הפרוטוקול הנוכחי משלב שימוש בפרוסות אופקיות בזווית כלפי מעלה של ההיפוקמפוס הבינוני, אשר עשוי להיות פחות סביר להפגין פעילות רשת ספונטנית בהשוואה לפרוסות מן ההיפוקמפוס הגחוני25,26,31. לבסוף, פרוטוקול זה השתמש בפרוסות מעכברים מתבגרים ומבוגרים. בעוד perfusions transcardial יכול לשפר את איכות הפרוסות מבעלי חיים מבוגרים, הסבירות של התבוננות בפעילויות רשת ספונטניות עשוי להשתפר על ידי שימוש בפרוסות מבעלי חיים צעירים12,41,44.
לסיכום, פרוטוקול זה מציג גישת חתך מוח עכבר המניב פרוסות קליפת המוח ההיפוקמפוס-סנטורינל אופקית זוויתית מהיווצרות היפוקמפוס ביניים או גחוני שיכול להפגין פעילות רשת ספונטנית מורכבת בצורה של מתחמי גל חדים אדווה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחבר אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחבר רוצה להודות לסטיב סיגלבאום על התמיכה. המימון ניתן על ידי 5R01NS106983-02, כמו גם 1 F31 NS13466-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Lulzbot | LulzBot TAZ 6 | |
| Acute brain slice incubation holder | NIH 3D Print Exchange | 3DPX-001623 | Designed by ChiaMing Lee, available at https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623 |
| Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma Aldrich | A9187-500MG | |
| Ag-Cl ground pellets | Warner | 64-1309, (E205) | |
| agar | Becton, Dickinson | 214530-500g | |
| ascorbic acid | Alfa Aesar | 36237 | |
| beaker (250 mL) | Kimax | 14000-250 | |
| beaker (400 mL) | Kimax | 14000-400 | |
| biocytin | Sigma Aldrich | B4261 | |
| blender | Oster | BRLY07-B00-NP0 | |
| Bonn scissors, small | becton, Dickinson | 14184-09 | |
| borosilicate glass capillaries with filament (O.D. 1.5 mm, I.D. 0.86 mm, length 10 cm) | Sutter Instruments | BF150-86-10HP | Fire polished capillaries are preferable. |
| calcium chloride solution (1 M) | G-Biosciences | R040 | |
| camera | Olympus | OLY-150 | |
| compressed carbogen gas (95% oxygen / 5% carbon dioxide) | Airgas | X02OX95C2003102 | |
| compressed oxygen | Airgas | OX 200 | |
| constant voltage isolated stimulator | Digitimer Ltd. | DS2A-Mk.II | |
| coverslips (22x50 mm) | VWR | 16004-314 | |
| cyanoacrylate adhesive | Krazy Glue | KG925 | Ideally use the brush-on form for precision |
| data acquisition software | Axograph | N/A | Any equivalent software (e.g. pClamp) would work. |
| Dell Precision T1500 Tower Workstation Desktop | Dell | N/A | Catalog number will depend on specific computer - any computer will work as long as it can run electrophysiology acquisition software. |
| Digidata 1440A | Molecular Devices | 1-2950-0367 | |
| digital timer | VWR | 62344-641 | 4-channel Traceable timer |
| disposable absorbant pads | VWR | 56616-018 | |
| dissector scissors | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| double-edge razor blades | Personna | BP9020 | |
| dual automatic temperature controller | Warner Instrument Corporation | TC-344B | |
| dual-surface or laminar-flow optimized recording chamber | N/A | N/A | The chamber presented in this protocol is custom made. A commercial equivalent would be the RC-27L from Warner Instruments. |
| equipment rack | Automate Scientific | FR-EQ70" | A rack is not strictly necessary but useful for organizing electrophysiology |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethyiether)- N,N,N',N'-teetraacetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | 324626-25GM | |
| filter paper | Whatman | 1004 070 | |
| fine scale | Mettler Toledo | XS204DR | |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| glass petri dish (100 x 15 mm) | Corning | 3160-101 | |
| glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G8877-250MG | |
| ice buckets | Sigma Aldrich | BAM168072002-1EA | |
| isoflurane vaporizer | General Anesthetic Services | Tec 3 | |
| lab tape | Fisher Scientific | 15-901-10R | |
| lens paper | Fisher Scientific | 11-996 | |
| light source | Olympus | TH4-100 | |
| magnesium chloride solution (1 M) | Quality Biological | 351-033-721EA | |
| magnetic stir bars | Fisher Scientific | 14-513-56 | Catalog number will be dependent on the size of the stir bar. |
| micromanipulator | Luigs & Neumann | SM-5 | |
| micromanipulator (manual) | Scientifica | LBM-2000-00 | |
| microscope | Olympus | BX51WI | |
| microspatula | Fine Science Tools | 10089-11 | |
| monitor | Dell | 2007FPb | |
| MultiClamp 700B Microelectrode Amplifier | Molecular Devices | MULTICLAMP 700B | The MultiClamp 700B should include headstages, pipette holders, and a model cell. |
| N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), (HEPES) | Sigma Aldrich | H3375-25G | |
| needle (20 gauge, 1.5 in length) | Becton, Dickinson | 305176 | |
| nylon filament | YLI Wonder Invisible Thread | 212-15-004 | size 0.004. This cat. # is from Amazon.com |
| nylon mesh | Warner Instruments Corporation | 64-0198 | |
| perstaltic pump | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
| Phosphocreatine di(tris) salt | Sigma Aldrich | P1937-1G | |
| pipette holders | Molecular Devices | 1-HL-U | |
| platinum wire | World Precision | PT0203 | |
| polylactic acid (PLA) filament | Ultimaker | RAL 9010 | |
| potassium chloride | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| potassium gluconate | Sigma Aldrich | 1550001-200MG | |
| potassium hydroxide | Sigma Aldrich | 60377-1KG | |
| razor blades | VWR | 55411-050 | |
| roller clamp | World Precision Instruments | 14041 | |
| scale | Mettler Toledo | PM2000 | |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| slice harp | Warner | SHD-26GH/2 | |
| sodium bicarbonate | Fisher Chemical | S233-500 | |
| sodium chloride | Sigma Aldrich | S9888-1KG | |
| sodium phosphate monobasic anhydrous | Fisher Chemical | S369-500 | |
| sodium pyruvate | Fisher Chemical | BP356-100 | |
| spatula | VWR | 82027-520 | |
| spatula/spoon, large | VWR | 470149-442 | |
| sterile scalpel blades | Feather | 72044-10 | |
| stirrer / hot plate | Corning | 6795-220 | |
| stopcock valves, 1-way | World Precision Instruments | 14054 | |
| stopcock valves, 3-way | World Precision Instruments | 14036 | |
| sucrose | Acros Organics | AC177142500 | |
| support for swivel clamps | Fisher Scientific | 14-679Q | |
| surgical scissors, sharp/blunt | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| syringe (1 mL) | Becton, Dickinson | 309659 | |
| syringe (60 mL with Luer-Lok tip) | Becton, Dickinson | 309653 | |
| three-pronged clamp | Fisher Scientific | 05-769-8Q | |
| tissue forceps, large | Fine Science Tools | 11021-15 | |
| tissue forceps, small | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| tubing | Tygon | E-3603 | ID 1/16 inch, OD 3/16 inch |
| tubing | Tygon | R-3603 | ID 1/8 inch, OD 1/4 inch |
| vacuum grease | Dow Corning | 14-635-5D | |
| vibrating blade microtome | Leica | VT 1200S | |
| vibration-dampening table with faraday cage | Micro-G / TMC-ametek | 2536-516-4-30PE | |
| volumetric flask (1 L) | Kimax | KIM-28014-1000 | |
| volumetric flask (2 L) | PYREX | 65640-2000 | |
| warm water bath | VWR | 1209 |
References
- Buzsáki, G., Lai-Wo, S., Vanderwolf, C. H. Cellular bases of hippocampal EEG in the behaving rat. Brain Research Reviews. 6, 139-171 (1983).
- Buzsáki, G. Hippocampal sharp waves: Their origin and significance. Brain Research. 398, 242-253 (1986).
- Buzsáki, G., Horváth, Z., Urioste, R., Hetke, J., Wise, K.
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents — EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews Neuroscience. 13, 407-420 (2012).
- Buzsáki, G. Hippocampal sharp wave-ripple: A cognitive biomarker for episodic memory and planning. Hippocampus. 25, 1073 (2015).
- Maier, N., et al. Reduction of high-frequency network oscillations (ripples) and pathological network discharges in hippocampal slices from connexin 36-deficient mice. Journal of Physiology. 541, 521-528 (2002).
- Maier, N., Nimmrich, V., Draguhn, A. Cellular and network mechanisms underlying spontaneous sharp wave-ripple complexes in mouse hippocampal slices. Journal of Physiology. 550, 873-887 (2003).
- ul Haq, R., et al. Adrenergic modulation of sharp wave-ripple activity in rat hippocampal slices. Hippocampus. 22, 516-533 (2012).
- ul Haq, R., et al. Serotonin dependent masking of hippocampal sharp wave ripples. Neuropharmacology. 101, 188-203 (2016).
- Maier, P., Kaiser, M. E., Grinevich, V., Draguhn, A., Both, M. Differential effects of oxytocin on mouse hippocampal oscillations in vitro. European Journal of Neuroscience. 44, 2885-2898 (2016).
- Mizunuma, M., et al. Unbalanced excitability underlies offline reactivation of behaviorally activated neurons. Nature Neuroscience. 17, 503-505 (2014).
- Hájos, N., et al. Spike timing of distinct types of GABAergic interneuron during hippocampal gamma oscillations in vitro. Journal of Neuroscience. 24, 9127-9137 (2004).
- Geschwill, P., et al. Synchronicity of excitatory inputs drives hippocampal networks to distinct oscillatory patterns. Hippocampus. , (2020).
- Rutecki, P. A., Grossmann, R. G., Armstrong, D., Irish-Loewen, S. Electrophysiological connections between the hippocampus and entorhinal cortex in patients with complex partial seizures. Journal of Neurosurgery. 70, 667-675 (1989).
- Lothman, E. W., Bertram, E. H., Stringer, J. L.
- Carter, D. S., Deshpande, L. S., Rafiq, A., Sombati, S., Delorenzo, R. J. Characterization of spontaneous recurrent epileptiform discharges in hippocampal - cortical slices prepared from chronic epileptic animals. Seizure: European Journal of Epilepsy. 20, 218-224 (2011).
- Karlócai, M. R., et al. Physiological sharp wave-ripples and interictal events in vitro: What's the difference. Brain. 137, 463-485 (2014).
- Leroy, F., et al. Input-timing-dependent plasticity in the hippocampal CA2 region and its potential role in social memory. Neuron. 95, 1089-1102 (2017).
- Sun, Q., et al. Proximodistal heterogeneity of hippocampal CA3 pyramidal neuron intrinsic properties, connectivity, and reactivation during memory recall. Neuron. 95, 656-672 (2017).
- Masurkar, A. V., et al. Medial and lateral entorhinal cortex differentially excite deep versus superficial CA1 pyramidal neurons. Cell Reports. 18, 1-13 (2017).
- Papatheodoropoulos, C., Kostopoulos, G. Spontaneous, low frequency (∼2-3 Hz) field activity generated in rat ventral hippocampal slices perfused with normal medium. Brain Research Bulletin. 57, 187-193 (2002).
- Papatheodoropoulos, C., Kostopoulos, G. Spontaneous GABAA-dependent synchronous periodic activity in adult rat ventral hippocampal slices. Neuroscience Letters. 319, 17-20 (2002).
- Kubota, D., Colgin, L. L., Casale, M., Brucher, F. A., Lynch, G.
- Behrens, C. J., Van Den Boom, L. P., De Hoz, L., Friedman, A., Heinemann, U. Induction of sharp wave - complexes in vitro and reorganization of hippocampal networks. Nature Neuroscience. 8, 1560-1567 (2005).
- Kouvaros, S., Papatheodoropoulos, C. Prominent differences in sharp waves, ripples and complex spike bursts between the dorsal and the ventral rat hippocampus. Neuroscience. 352, 131-143 (2017).
- Strange, B. A., Witter, M. P., Lein, E. S., Moser, E. I. Functional organization of the hippocampal longitudinal axis. Nature Reviews Neuroscience. 15, 655-669 (2014).
- Patel, J., Fujisawa, S., Berényi, A., Royer, S., Buzsáki, G. Traveling Theta Waves along the Entire Septotemporal Axis of the Hippocampus. Neuron. 75, 410-417 (2012).
- Patel, J., Schomburg, E. W., Berényi, A., Fujisawa, S., Buzsáki, G. Local generation and propagation of ripples along the septotemporal axis of the hippocampus. Journal of Neuroscience. 33, 17029-17041 (2013).
- Fricke, R., Cowan, W. M. An autoradiographic study of the commissural and ipsilateral hippocampo-dentate projections in the adult rat. Journal of Comparative Neurology. 181, 253-269 (1978).
- Ishizuka, N. O. R., Weber, J., Amaral, D. G. Organization of intrahippocampal projections originating from CA3 pyramidal cells in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 623, 580-623 (1990).
- Papatheodoropoulos, C. Electrophysiological evidence for long-axis intrinsic diversification of the hippocampus. Frontiers in Bioscience - Landmark. 23, 109-145 (2018).
- Gilbert, M., Racine, R. J., Smith, G. K. Epileptiform burst responses in ventral vs dorsal hippocampal slices. Brain Research. 361, 389-391 (1985).
- Papatheodoropoulos, C., Moschovos, C., Kostopoulos, G. Greater contribution of N-methyl-D-aspartic acid receptors in ventral compared to dorsal hippocampal slices in the expression and long-term maintenance of epileptiform activity. Neuroscience. 135, 765-779 (2005).
- Jones, R. S. G., Heinemann, U. Synaptic and intrinsic responses of medial entorhinal cortical cells in normal and magnesium-free medium in vitro. Journal of Neurophysiology. 59, (1988).
- Rafiq, A., Delorenzo, R. J., Coulter, D. A. Generation and propagation of epileptiform discharges in a combined entorhinal cortex / hippocampal slice. Journal of Neurophysiology. 70, 1962-1974 (1993).
- Stoop, R., Pralong, E. Functional connections and epileptic spread between hippocampus, entorhinal cortex and amygdala in a modified horizontal slice preparation of the rat brain. European Journal of Neuroscience. 12, 3651-3663 (2000).
- Roth, F. C., Beyer, K. M., Both, M., Draguhn, A., Egorov, A. V. Downstream effects of hippocampal sharp wave ripple oscillations on medial entorhinal cortex layer V neurons in vitro. Hippocampus. 26, 1493-1508 (2016).
- Bertsche, A., Bruehl, C., Pietz, J., Draguhn, A. Region- and pattern-specific effects of glutamate uptake blockers on epileptiform activity in rat brain slices. Epilepsy Research. 88, 118-126 (2010).
- Wu, C., Shen, H., Luk, W. P., Zhang, L. A fundamental oscillatory state of isolated rodent hippocampus. Journal of Physiology. 540, 509-527 (2002).
- Colgin, L. L., Jia, Y., Sabatier, J. M., Lynch, G. Blockade of NMDA receptors enhances spontaneous sharp waves in rat hippocampal slices. Neuroscience Letters. 385, 46-51 (2005).
- Ellender, T. J., Nissen, W., Colgin, L. L., Mann, E. O., Paulsen, O. Priming of hippocampal population bursts by individual perisomatic-targeting interneurons. The Journal of Neuroscience. 30, 5979-5991 (2010).
- Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. A. Comparison of different slicing planes in preservation of major hippocampal pathway fibers in the mouse. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 1-17 (2017).
- Maier, N., Morris, G., Johenning, F. W., Schmitz, D. An approach for reliably investigating hippocampal sharp wave-ripples in vitro. PLoS One. 4, 6925 (2009).
- Schlingloff, D., Kali, S., Freund, T. F., Hajos, N., Gulyas, A. I. Mechanisms of sharp wave initiation and ripple generation. Journal of Neuroscience. 34, 11385-11398 (2014).
- McCloskey, D. P., Scharfman, H. E. Progressive, potassium-sensitive epileptiform activity in hippocampal area CA3 of pilocarpine-treated rats with recurrent seizures. Epilepsy Research. 97, 92-102 (2011).
- McMahon, L. L., Williams, J. H., Kauer, J. A. Functionally distinct groups of interneurons identified during rhythmic carbachol oscillations in hippocampus in vitro. Journal of Neuroscience. 18, 5640-5651 (1998).
- Pöschel, B., Heinemann, U., Draguhn, A. High frequency oscillations in the dentate gyrus of rat hippocampal slices induced by tetanic stimulation. Brain Research. 959, 320-327 (2003).
- Hájos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. European Journal of Neuroscience. 29, 319-327 (2009).
- Hájos, N., Mody, I. Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content. Journal of Neuroscience Methods. 183, 107-113 (2009).
- Dengler, C. G., Yue, C., Takano, H., Coulter, D. A. Massively augmented hippocampal dentate granule cell activation accompanies epilepsy development. Nature Publishing Group. , 1-17 (2017).
- Ting, J. T., et al. Preparation of acute brain slices using an optimized N -methyl-D-glucamine protective recovery method. Journal of Visualized Experiments. 132, 1-13 (2018).
- Westerhof, N., Lankhaar, J. W., Westerhof, B. E.
- Shi, W. X., Bunney, B. S. A small volume chamber for electrical recording from submerged brain slices and a pulse-free medium supply system using a peristalic pump. Journal of Neuroscience Methods. 35, 235-240 (1990).
