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Neuroscience

एक्यूट माउस ब्रेन स्लाइसिंग सहज हिप्पोकैम्पल नेटवर्क गतिविधि की जांच करने के लिए

Published: August 28, 2020 doi: 10.3791/61704
Automatic Translation
1
1Department of Neuroscience, Mortimer B. Zuckerman Mind Brain Behavior Institute, Columbia University

Summary

यह प्रोटोकॉल सहज तेज-तरंग तरंग गतिविधि का प्रदर्शन करने वाले चूहों से क्षैतिज हिप्पोकैम्पल-एंटोराइनल कॉर्टेक्स (एचईसी) स्लाइस की तैयारी का वर्णन करता है। स्लाइस एक सरलीकृत इंटरफेस होल्डिंग चैंबर में इनक्यूबेटेड कर रहे हैं और रिकॉर्डिंग ऊतक ऑक्सीजन और नेटवर्क स्तर गतिविधि के सहज उद्भव को बढ़ावा देने के लिए तेजी से बहने वाले कृत्रिम मस्तिष्कद्रावण के साथ जलमग्न परिस्थितियों में किया जाता है।

Abstract

तीव्र कृंतक मस्तिष्क टुकड़ा करने की क्रिया इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, माइक्रोस्कोपी और फार्माकोलॉजी का उपयोग करके एकल-कोशिका संकल्प के साथ तंत्रिका सर्किट के संगठन और कार्य में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए एक ट्रैक्टेबल प्रयोगात्मक दृष्टिकोण प्रदान करती है। हालांकि, इन विट्रो प्रयोगों के डिजाइन में एक प्रमुख विचार यह है कि विभिन्न स्लाइस तैयारी वीवो में देखे गए तंत्रिका गतिविधि के प्राकृतिक पैटर्न को फिर से रीकैपिटेट करती हैं। बरकरार मस्तिष्क में, हिप्पोकैम्पस नेटवर्क जानवर के व्यवहार स्थिति को प्रतिबिंबित करने वाली अत्यधिक सिंक्रोनाइज्ड जनसंख्या गतिविधि उत्पन्न करता है, जैसा कि तेज-तरंग तरंग परिसरों (एसडब्ल्यूआर) द्वारा उदाहरण दिया जाता है जो जागने वाले उपभोगात्मक राज्यों या गैर-रेम नींद के दौरान होते हैं। एसडब्ल्यूआर और नेटवर्क गतिविधि के अन्य रूप उचित परिस्थितियों में अलग हिप्पोकैम्पस स्लाइस में अनायास उभर सकते हैं। हिप्पोकैम्पस नेटवर्क गतिविधि की जांच के लिए शक्तिशाली मस्तिष्क टुकड़ा टूलकिट लागू करने के लिए, एक दृष्टिकोण का उपयोग करना आवश्यक है जो ऊतक स्वास्थ्य को अनुकूलित करता है और हिप्पोकैम्पल नेटवर्क के भीतर कार्यात्मक कनेक्टिविटी के संरक्षण को अनुकूलित करता है। चूहों को ठंडे सुक्रोज आधारित कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ के साथ ट्रांसकार्डेस किया जाता है। हिप्पोकैम्पस युक्त क्षैतिज स्लाइस सिनैप्टिक कनेक्टिविटी को संरक्षित करने के लिए 450 माइक्रोन की मोटाई पर काटे जाते हैं। स्लाइस एक इंटरफ़ेस शैली कक्ष में ठीक हो जाते हैं और रिकॉर्डिंग के लिए एक जलमग्न कक्ष में स्थानांतरित कर दिए जाते हैं। रिकॉर्डिंग कक्ष को स्लाइस के ऑक्सीजन में सुधार करने के लिए उच्च प्रवाह दर पर कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ की दोहरी सतह सुपरफ्यूजन के लिए डिज़ाइन किया गया है। यह प्रोटोकॉल विट्रो मेंजटिल और सहज नेटवर्क गतिविधि की जांच के लिए उपयुक्त स्वस्थ ऊतकों की पैदावार करता है।

Introduction

विट्रो में हिप्पोकैम्पस स्लाइस रहने से इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल माप कई फायदों के साथ एक शक्तिशाली प्रयोगात्मक दृष्टिकोण है। प्रयोगकर्ता ऊतक में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स से माप की कल्पना और संग्रह करने के लिए माइक्रोस्कोप, माइक्रोमैनीपुलेटर और एक रिकॉर्डिंग सिस्टम का उपयोग कर सकता है। ऊतक स्लाइस ऑप्टोजेनेटिक, केमोजेनेटिक या औषधीय प्रयोगों के लिए फोटोस्मुलेशन या दवा वितरण के लिए भी बहुत सुलभ हैं।

हिप्पोकैम्पल नेटवर्क वीवो मेंअत्यधिक समकालिक जनसंख्या गतिविधि उत्पन्न करता है , जो बाह्य स्थानीय क्षेत्र की क्षमता 1 , 2 ,3,4,5में आदोलन के रूप में दिखाईदेताहै । मस्तिष्क टुकड़ा तरीकों सेलुलर और सर्किट इन न्यूरोनल नेटवर्क दोलन अंतर्निहित तंत्र में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए लीवरेज किया गया है । मैयर एट अल से मूलभूत कार्य ने यह दर्शाया कि तेज तरंग-तरंग परिसर (एसडब्ल्यूआर) वेंट्रल हिप्पोकैम्पस6,7के स्लाइस में अनायास उभर सकते हैं। कई जांचकर्ताओं के बाद के अध्ययनों ने धीरे-धीरे एसडब्ल्यूआर के कई पहलुओं को स्पष्ट कर दिया है, जिसमें हिप्पोकैम्पस8,9,10 और सिनैप्टिक तंत्र के नेटवर्क राज्य को विनियमित करने में न्यूरोमोडुलेटर की भूमिका शामिल है जो वीवो11 में व्यवहार के दौरान पहले सक्रिय न्यूरोनल कलाकारों की सक्रियता को चलाते हैं। मस्तिष्क के टुकड़े प्रयोगों ने गामा रेंज दोलन (30-100 हर्ट्ज) में भी अंतर्दृष्टि प्रदान की है, जो एक अलग हिप्पोकैम्पस नेटवर्क राज्य है जो स्मृति एन्कोडिंग का समर्थन करता है और12,13को याद करता है। अंत में, लौकिक पालि मिर्गी14, 15के रोगविज्ञान में हिप्पोकैम्पस और संबद्ध संरचनाओं की केंद्रीय भूमिका को पहचानतेहुए,शोधकर्ताओं ने मिर्गी गतिविधि की पीढ़ी और प्रचार की जांच करने के लिए हिप्पोकैम्पर स्लाइस तैयारी का उपयोग किया है। कार्टर एट अल ने प्रदर्शन किया कि लंबे समय से मिर्गी के जानवरों से तैयार संयुक्त हिप्पोकैम्पल-एंटोरानल कॉर्टेक्स स्लाइस अनायास ही विट्रो16में मिर्गी के निस्सरण उत्पन्न कर सकते हैं । इसके बाद, कार्लोकाई एट अल ने परिवर्तित आयन सांद्रता (कम एमजी2 + या ऊंचा कश्मीर+)या जोड़ा गई दवाओं (4AP या गैबज़ीन)17के साथ संशोधित कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ (ACSF) का उपयोग करके हिप्पोकैम्पस स्लाइस में मिर्गी के निस्सरण अंतर्निहित तंत्र का पता लगाया।

जांचकर्ताओं ने कई हिप्पोकैम्पल स्लाइस दृष्टिकोण विकसित किए हैं जो प्रमुख तरीकों से भिन्न होते हैं: (1) स्लाइस (पृष्ठीय, मध्यवर्ती, या वेंट्रल) में निहित हिप्पोकैम्पस का क्षेत्र; (2) एंटोरानियल कॉर्टेक्स जैसे एक्सट्रािप्पोकैम्पल ऊतकों की उपस्थिति या अनुपस्थिति; (3) स्लाइस (कोरोनल, सगित्तल, क्षैतिज, या तिरछा) को काटने के लिए उपयोग किया जाने वाला अभिविन्यास; और (4) जिन स्थितियों के तहत ऊतक टुकड़ा करने की क्रिया के बाद बनाए रखा जाता है (पूरी तरह से ACSF में जलमग्न या ACSF और humidified, कार्बोजन से भरपूर हवा के इंटरफेस पर आयोजित) ।

जिसका उपयोग करने के लिए टुकड़ा करने की क्रिया का चुनाव प्रायोगिक उद्देश्य द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए । उदाहरण के लिए , जलमग्न परिस्थितियों में बनाए गए पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस के ट्रांसवर्स या कोरोनेल स्लाइस का उपयोग इंट्राएचपी्पोकैम्पल सर्किटरी और सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी 18,19,20की जांच के लिए बहुत प्रभावीढंगसे किया गया है । हालांकि , इस तरह की तैयारी अनायास नेटवर्क दोलनों को वेंट्रल हिप्पोकैम्पस21 , 22,23से स्लाइस के रूप में आसानी से उत्पन्न नहीं करती है । यद्यपि पृष्ठीय और वेंट्रल हिप्पोकैम्पस24से ट्रांसवर्स स्लाइस में टेटानिक उत्तेजना से लगातार एसडब्ल्यूआर गतिविधि की स्थिति को प्रेरित किया जा सकता है, लेकिन वेंट्रल स्लाइस 7,25में सहज एसडब्ल्यूआर अधिक आसानी से मनायाजाताहै।

पृष्ठीय और वेंट्रल हिप्पोकैम्पस के बीच एक अंतर्निहित शारीरिक और शारीरिक अंतर वीवो और इन विट्रो26दोनों में किए गए अध्ययनों द्वारा समर्थित है। चूहों में रिकॉर्डिंग से पता चला कि पृष्ठीय और मध्यवर्ती हिप्पोकैम्पस में दृढ़ता से सुसंगत थीटा लय, फिर भी वेंट्रल क्षेत्र और बाकी हिप्पोकैम्पस27के बीच खराब सामंजस्य। वीवो में एसडब्ल्यूआर पृष्ठीय और मध्यवर्ती हिप्पोकैम्पस के बीच आसानी से प्रचारित होते हैं, जबकि वेंट्रल हिप्पोकैम्पस में उत्पन्न होने वाले एसडब्ल्यूआरएस अक्सर स्थानीय28रहते हैं। CA3 पिरामिड न्यूरॉन्स से निकलने वाले संघीय अनुमान जो पृष्ठीय और मध्यवर्ती हिप्पोकैम्पस परियोजना में रहते हैं, हिप्पोकैम्पस की देशांतर धुरी के साथ लंबी दूरी की परियोजना करते हैं। वेंट्रल क्षेत्रों से निकलने वाले CA3 अनुमान अपेक्षाकृत स्थानीय रहते हैं, और इस प्रकार टुकड़ा करने की प्रक्रिया29,30के दौरान कटे होने की संभावना कम होती है। इसलिए, वेंट्रल स्लाइस जनसंख्या सिंक्रोनी उत्पन्न करने के लिए आवश्यक आवर्ती नेटवर्क को बेहतर संरक्षित कर सकते हैं। विट्रो में सहज नेटवर्क गतिविधियों को उत्पन्न करने के लिए वेंट्रल स्लाइस की प्रवृत्ति अधिक पृष्ठीय क्षेत्रों की तुलना में वेंट्रल हिप्पोकैम्पस में पिरामिड न्यूरॉन्स या कमजोर गाबएर्गिक अवरोध की उच्च आंतरिक उत्तेजना को भी प्रतिबिंबित कर सकतीहै। दरअसल , वेंट्रल हिप्पोकैम्पल स्लाइस मिर्गी गतिविधि32,33के लिए अतिसंवेदनशीलहोतेहैं। इस प्रकार, सहज शारीरिक8,9,11, 24या पैथोलॉजिकल16,34, 35,36नेटवर्क दोलनों के कई अध्ययनों नेपारंपरिक रूप से क्षैतिज टुकड़ा करने वाले दृष्टिकोण का उपयोग किया है, कभी-कभी फ्रंटो-ऑक्सीपिटल दिशा में मामूली कोण के साथ, जो वेंट्रल हिप्पोकैम्पस के ट्रांसवर्स विमान के समानांतर ऊतक स्लाइस पैदा करता है।

नेटवर्क कनेक्टिविटी टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया से अपरिहार्य रूप से प्रभावित होती है क्योंकि स्लाइस में कई कोशिकाएं कटे हो जाएंगी। स्लाइस के कोण और मोटाई और तैयारी में बनाए गए ऊतक को ब्याज के सर्किट में कनेक्टिविटी को अनुकूलित करने के लिए माना जाना चाहिए। कई अध्ययनों ने शारीरिक या रोग नेटवर्क दोलनों के संदर्भ में दो संरचनाओं के बीच बातचीत का पता लगाने के लिए क्षैतिज संयुक्त हिप्पोकैम्पल-एंटोराइनल कॉर्टेक्स स्लाइस (एचईसी) का उपयोग किया है। रोथ एट अल ने एचईसी स्लाइस37के माध्यम से एसडब्ल्यूआर गतिविधि के प्रचार को प्रदर्शित करने के लिए हिप्पोकैम्पस के CA1 उपक्षेत्र और मध्यवर्ती एनटोरिनल कॉर्टेक्स के लेयर वी से दोहरी रिकॉर्डिंग की। मिर्गी की गतिविधि के कई अध्ययनों ने एचईसी स्लाइस तैयारी का उपयोग यह जांचने के लिए किया है कि कॉर्टिकोहिप्पोकैम्पल नेटवर्क16, 35 , 36,38के माध्यम से मिर्गी का निस्सरण कैसे प्रचारित होता है । यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि अक्षुण्ण कोर्टिकोहिप्पोकैम्पल लूप का संरक्षण सहज एसडब्ल्यूआर, मिर्गी के निर्वहन, या गामा दोलनों के लिए एक शर्त नहीं है; नेटवर्क दोलन पृष्ठीय या वेंट्रल हिप्पोकैम्पस के ट्रांसवर्स स्लाइस में उत्पन्न किए जा सकते हैं जिसमें 21 ,22, 23,25,39, 40,41नहीं जुड़े होते हैं । हिप्पोकैम्पस स्लाइस में नेटवर्क दोलनों की सहज पीढ़ी के लिए एक अधिक महत्वपूर्ण कारक प्रत्येक स्लाइस की मोटाई हो सकती है, क्योंकि एक मोटा टुकड़ा (400-550 माइक्रोन) CA2/CA3 आवर्ती नेटवर्क21, 22,25में अधिक कनेक्टिविटी को संरक्षित करेगा।

यद्यपि कोणीय क्षैतिज एचईसी स्लाइस (फ्रंटो-ऑक्सीपिटल दिशा में लगभग 12 डिग्री कोण के साथ कटौती) का उपयोग कॉर्टिकोहिप्पोकैम्पल लूप11, 16,34,35,42के कार्यात्मक कनेक्टिविटी का अध्ययन करने के लिए किया गया है, लेकिन सहज नेटवर्क गतिविधि43,44,45के लिए ऐसी कोण तैयारियों की आवश्यकता नहीं है। हालांकि, एक कोण टुकड़ा करने की क्रिया विमान का उपयोग अन्वेषक को चुनिंदा स्लाइस बनाने की अनुमति देता है जो या तो वेंट्रल या मध्यवर्ती हिप्पोकैम्पस के ट्रांसवर्सली-उन्मुख लैमेल को सबसे अच्छा संरक्षित करता है, इस पर निर्भर करता है कि नीचे या ऊपर का कोण लागू किया जाता है(चित्रा 1)। यह दृष्टिकोण संकल्पनात्मक रूप से पापाथियोडोरोपोलोस एट अल द्वारा उपयोग किए जाने वाले समान है। 2002, जिन्होंने प्रत्येक हिप्पोकैम्पस को मुक्त किया और फिर पूरे पृष्ठीय-वेंट्रल एक्सिस21के साथ ट्रांसवर्स स्लाइस बनाने के लिए एक ऊतक हेलिकॉप्टर का उपयोग किया। वेंट्रल और पृष्ठीय-मध्यवर्ती हिप्पोकैम्पस के बीच उपरोक्त कार्यात्मक भेदों के आलोक में, जांचकर्ताओं को प्रयोगों को डिजाइन करते समय या परिणामों की व्याख्या करते समय स्लाइस की शारीरिक उत्पत्ति पर विचार करना चाहिए। टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया के दौरान एक आगर रैंप का उपयोग करना या तो मध्यवर्ती या वेंट्रल हिप्पोकैम्पस से स्लाइस का उत्पादन करने का एक सरल तरीका है।

हिप्पोकैम्पल स्लाइस या तो एक जलमग्न कक्ष में बनाए रखा जा सकता है (ऊतक पूरी तरह से ACSF में डूबे के साथ), या एक इंटरफेस शैली कक्ष (जैसे, ओस्लो या हास चैंबर, केवल बहने वाले मीडिया की एक पतली फिल्म द्वारा कवर स्लाइस के साथ)। इंटरफ़ेस रखरखाव ऊतक के ऑक्सीजन को बढ़ाता है, जो न्यूरोनल अस्तित्व को बढ़ावा देता है और इंटर्नयूरॉनल गतिविधि के निरंतर उच्च स्तर के लिए अनुमति देता है। परंपरागत रूप से, जलमग्न रिकॉर्डिंग की स्थिति धीमी ACSF प्रवाह दर का उपयोग करती है जो नेटवर्क-स्तर दोलनों की स्थिर अभिव्यक्ति के लिए पर्याप्त ऊतक ऑक्सीजन प्रदान नहीं करती है। जलमग्न हिप्पोकैम्पल स्लाइस में कार्बाचोल-प्रेरित गामा दोलनों को केवल क्षणिक रूप से 46,47देखा जाता है, जबकि उन्हें इंटरफेस रिकॉर्डिंग कक्षों10,48,49में स्थिर रूप से बनाए रखा जा सकता है। इस प्रकार, विट्रो में जटिल सहज गतिविधि के कई अध्ययनों ने तेज-लहर तरंग परिसरों6,7,8,9,10,25,37,गामा दोलनों10, 13,और मिर्गी गतिविधि16,38,45, 47की जांच करने के लिए इंटरफेस रिकॉर्डिंग कक्षों पर भरोसा किया है।

एक जलमग्न शैली रिकॉर्डिंग कक्ष में, एक विसर्जन माइक्रोस्कोप उद्देश्य व्यक्तिगत कोशिकाओं की कल्पना और चुनिंदा रिकॉर्डिंग के लिए स्वस्थ दिखने कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । जलमग्न तैयारी सेलुलर परिवेश पर ठीक नियंत्रण की अनुमति देती है, क्योंकि पनडुब्बी ऊतक को दवाओं या अन्य यौगिकों के तेजी से प्रसार की सुविधा प्रदान करती है। इस प्रकार, एक संशोधित पद्धति जिसमें जलमग्न परिस्थितियों में स्थिर नेटवर्क दोलन बनाए रखा जाता है, एक शक्तिशाली प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है। इस दृष्टिकोण को Hájos et al., जिसमें हिप्पोकैम्पस स्लाइस एक संशोधित जलमग्न रिकॉर्डिंग चैंबर में स्थानांतरित करने से पहले कई घंटे के लिए एक सरलीकृत इंटरफेस शैली होल्डिंग चैंबर में ठीक करने के ऊतक12,४८, ४९के लिए ऑक्सीजन की आपूर्ति बढ़ाने के लिए उदाहरण है । इन परिस्थितियों में, इंटरन्यूरॉन गतिविधि और स्थिर सहज नेटवर्क दोलनों के उच्च स्तर को जलमग्न रिकॉर्डिंग कक्ष में बनाए रखा जा सकता है। यह संशोधित दृष्टिकोण जांचकर्ताओं को नेत्रहीन निर्देशित पूरे सेल पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग करने की अनुमति देता है और कार्बाचोल-प्रेरित गामा दोलन12में रूपात्मक रूप से पहचाने गए सेल प्रकारों के योगदान की विशेषता है। एसडब्ल्यूआर भी एसीएसएफ11,48 ,49की तेज प्रवाह दर के साथ जलमग्न हिप्पोकैम्पल स्लाइस में अनायास होसकताहै। Maier एट अल का प्रदर्शन किया है कि हिप्पोकैम्पल स्लाइस कि एक इंटरफ़ेस चैंबर में एक जलमग्न रिकॉर्डिंग चैंबर मज़बूती से सहज SWRs प्रदर्शित करने के लिए हस्तांतरण से पहले बरामद किया, जबकि स्लाइस है कि एक जलमग्न रिकॉर्डिंग चैंबर में स्थानांतरित करने से पहले एक बीकर में डूबे बरामद छोटे पैदा क्षेत्र प्रतिक्रियाओं, सहज सिनैप्टिक धाराओं के निचले स्तर से पता चला, और केवल बहुत कम ही सहज SWRS४३प्रदर्शित । श्लिंगलॉफ एट अल ने सहज एसडब्ल्यूआरएस44की पीढ़ी में परवलबुमिन व्यक्त करने वाली टोकरी कोशिकाओं की भूमिका को प्रदर्शित करने के लिए इस बेहतर कार्यप्रणाली का उपयोग किया।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल एक टुकड़ा करने की क्रिया विधि प्रस्तुत करता है जिसके माध्यम से क्षैतिज हिप्पोकैम्पल स्लाइस में अनायास सक्रिय न्यूरॉन्स को इंटरफ़ेस स्थितियों के तहत बरामद किया जा सकता है और बाद में औषधीय या ऑप्टोजेनेटिक जोड़तोड़ और नेत्रहीन निर्देशित रिकॉर्डिंग के लिए उपयुक्त एक जलमग्न रिकॉर्डिंग कक्ष में बनाए रखा जा सकता है।

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Protocol

यहां वर्णित सभी तरीकों को कोलंबिया विश्वविद्यालय (एसी-AAAU9451) में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. समाधान तैयार करें

  1. टेबल 1में वर्णित स्लाइसिंग के लिए सुक्रोज कटिंग समाधान तैयार करें।
    नोट: सुक्रोज समाधान के 1 एल तैयार करने के बाद, एक बर्फ ट्रे में एक छोटी राशि (लगभग 100-200 एमएल) फ्रीज करें। इन जमे हुए सुक्रोज बर्फ क्यूब्स को एक बर्फीले घोल में मिश्रित किया जाएगा (चरण 4.3 देखें)।
  2. तालिका 2में वर्णित रिकॉर्डिंग के लिए कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ (ACSF) तैयार करें।
  3. 1 मिलियन शुद्ध पानी में एनएसीएल के 0.05844 ग्राम को भंग करके उत्तेजना पिपेट के लिए एनएसीएल का 1 एम तैयार करें जिसे ट्रेस धातुओं और अन्य अशुद्धियों को दूर करने के लिए फ़िल्टर किया गया है।
    नोट: सुक्रोज कटिंग समाधान और ACSF प्रत्येक प्रयोग के लिए ताजा तैयार किया जाना चाहिए ।

2. आगर रैंप तैयार

  1. ट्रेस धातुओं और अन्य अशुद्धियों को दूर करने के लिए फ़िल्टर किए गए शुद्ध पानी में एगर पाउडर को भंग करके 4% एगर (उदाहरण के लिए, 50 मिली हुई पानी में 2 ग्राम आगर) तैयार करें। मिश्रण को माइक्रोवेव में तब तक गर्म करें जब तक कि यह सिर्फ उबालना शुरू न कर ले (लगभग 30-60 एस)। पिघले हुए एगर को एक मोल्ड में डालें और इसे लगभग 12 डिग्री झुकाव पर फ्रिज में 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा और जमना करने की अनुमति दें।
    नोट: एक मोल्ड के लिए, कोई भी कोण पर सेट किसी भी ग्लास या प्लास्टिक कंटेनर का उपयोग कर सकता है, जिसमें पर्याप्त पिघला हुआ एगर लंबाई में 4 सेमी और ऊंचाई में लगभग 0.8 सेमी का रैंप बनाने के लिए डाला जाता है।

3. स्लाइसिंग क्षेत्र का मंच

  1. एक 400 एमएल बीकर भरें जिसमें एक स्लाइस रिकवरी चैंबर होता है जिसमें एसीएसएफ का लगभग 250 एमएल होता है; इसे 32 डिग्री सेल्सियस तक गर्म पानी के स्नान में रखें और कार्बोजन (95% ऑक्सीजन गैस/
    नोट: समाधान की सतह पर होल्डिंग चैंबर के नायलॉन जाल को रखने के लिए वसूली बीकर को बस पर्याप्त तरल पदार्थ के साथ भरें, ताकि स्लाइस गर्म समाधान मिश्रण और हवा(चित्रा 1)के इंटरफ़ेस पर आयोजित किए जाएंगे। नायलॉन की जाली पर लेंस पेपर के छोटे-छोटे टुकड़े रखें। स्लाइस लेंस पेपर के शीर्ष पर रखेंगे, जिसका उपयोग बाद में स्लाइस को व्यक्तिगत रूप से रिकॉर्डिंग कक्ष में स्थानांतरित करने के लिए किया जा सकता है (चरण 6.6 देखें)।
  2. ठंडा करने के लिए एक बर्फ बाल्टी में सुक्रोज समाधान के साथ एक फ्लास्क रखें और कार्बोजन के साथ बुदबुदाना शुरू करें।
    नोट: रिकवरी बीकर और सुक्रोज समाधान को क्रमशः गर्म और ठंडा किया जाना चाहिए, जिसमें माउस को आइसोफ्लुन कक्ष में रखे जाने से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए कार्बोजन बुदबुदाने के साथ किया जाना चाहिए।
  3. फ्रीजर से प्रीमेड, फ्रोजन सुक्रोज सॉल्यूशन आइस क्यूब्स की ट्रे को बाहर निकालें और बेंच पर आंशिक रूप से गल जाएं।
  4. एक साफ दोधारी रेजर ब्लेड का एक आधा माइक्रोटोम में रखें और यदि आवश्यक हो तो कैलिब्रेट करें। विच्छेदन के दौरान उपयोग के लिए रेजर ब्लेड के दूसरे आधे हिस्से को अलग करें।
  5. टुकड़ा करने की क्रिया कक्ष में एक कार्बोजन लाइन और तापमान जांच चलाते हैं और कक्ष ठंडा करने के लिए बर्फ के साथ चारों ओर।
  6. दो डिस्पोजेबल शोषक पैड के साथ कवर एक साफ बेंच या टेबल तैयार करें। बाएं पैड पर सभी विच्छेदन उपकरण और प्रयोगशाला टेप के तीन टुकड़े करें, जहां ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन किया जाएगा।
    नोट: विच्छेदन उपकरण छोटे बॉन कैंची, विच्छेदन कैंची, बड़े स्पैटुला/चम्मच, माइक्रोस्पाटुला, नए ब्लेड के साथ स्केलपेल, स्पैटुला, तेज/कुंद सर्जिकल कैंची, बड़े ऊतक संदंश, और छोटे ऊतक संदंश शामिल है (सामग्री की मेजदेखें) ।
  7. परफ्यूजन क्षेत्र के दाईं ओर अन्य शोषक पैड पर, फिल्टर पेपर का एक गोलाकार टुकड़ा 100 मिमी व्यास ग्लास पेट्री डिश के ढक्कन में रखें। पेट्री डिश के नीचे ढक्कन के बगल में रखें और डिश के दोनों टुकड़ों में एक कार्बोजन लाइन रखें।
  8. आगर के एक छोटे से रैंप (कोण सतह के साथ लगभग 4 सेमी, ऊंचाई में 0.8 सेमी, चौड़ाई में 2 सेमी) को काटने के लिए एक रेजर ब्लेड या स्केलपेल का उपयोग करें। लंबे छोर से रैंप का एक टुकड़ा काट लें और आगर का समर्थन ब्लॉक बनाने के लिए इसे रिवर्स करें। आगर रैंप और स्लाइसिंग मंच के लिए ब्लॉक का समर्थन और अलग सेट करने के लिए साइनोक्रिलेट चिपकने वाला का उपयोग करें।
    नोट: आगर का समर्थन ब्लॉक टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान मस्तिष्क को स्थिर करने में मदद करता है और एक सतह प्रदान करता है जिस पर प्रत्येकटुकड़ा (चित्रा 1)से अनावश्यक ऊतकों को दूर करना है।

4. ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन

  1. बेंचटॉप से लगभग 18 इंच ऊपर सुक्रोज कटिंग समाधान के लिए जलाशय के रूप में 60 एमएल क्षमता वाली सिरिंज को निलंबित करें (उदाहरण के लिए, एक ऊर्ध्वाधर पोस्ट पर तीन आयामी कुंडा क्लैंप का उपयोग करके)। जलाशय के नीचे ट्यूबिंग संलग्न करें, एक रोलर क्लैंप के माध्यम से ट्यूबिंग चलाएं, और ट्यूब के दूसरे छोर को एक साफ 20 जी सुई से कनेक्ट करें।
  2. 60 एमएल जलाशय को लगभग 30 एमएल ठंडा सुक्रोज समाधान के साथ भरें और लगातार परफ्यूसेट को बुलबुला करने के लिए सुक्रोजन जलाशय में एक कार्बोजन लाइन को निर्देशित करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि सुक्रोज ट्यूबिंग और सुई के माध्यम से बिना किसी फंसे बुलबुले के बह रहा है। प्रवाह दर सिर्फ काफी तेजी से सुई से टपकाव सुक्रोज की एक स्थिर, नित्य धारा है होना चाहिए ।
  3. एक ब्लेंडर का उपयोग करना, एक बर्फीले घोल में जमे हुए सुक्रोज को क्रश और ब्लेंड करें और घोल को वितरित करने के लिए बड़े स्पैटुला/चम्मच का उपयोग करें।
    1. ग्लास पेट्री डिश ढक्कन के किनारों के चारों ओर सुक्रोज घोल की एक छोटी मात्रा रखें। पेट्री डिश बॉटम में थोड़ी मात्रा में सुक्रोज घोल डालें।
    2. पर्फ्यूजन द्रव जलाशय में सुक्रोज घोल के लगभग 20-30 एमएल जोड़ें, इसे ठंडा तरल सुक्रोज के 30 एमएल के साथ अच्छी तरह से मिलाएं जब तक जलाशय में बहुत ठंडा, मुख्य रूप से तरल सुक्रोज का मिश्रण होता है कुछ अवशेष जमे हुए समाधान के साथ।
  4. माउस को आइसोफ्लुरेन वाष्पीकरण से जुड़े कक्ष में रखें। लगभग 2 एल/मिनट पर बहने वाली ऑक्सीजन के साथ, वाष्पीकरण के डायल को 5% एकाग्रता पर आइसोफ्लाणे वितरित करने और एक टाइमर शुरू करने के लिए बदल दें।
    नोट: इस टाइमर को टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान जाते रहें ताकि यह पता लगाया जा सके कि स्लाइस कितनी जल्दी प्राप्त किए जाते हैं। प्रक्रिया जितनी जल्दी हो सके किया जाना चाहिए, जैसे कि टुकड़ा करने की क्रिया पूरी हो गई है, और ऊतक आइसोफ्लुन कक्ष में प्रवेश करने वाले जानवर के 15-20 मिनट के भीतर इंटरफेस चैंबर में ठीक हो रहा है। गहरी संज्ञाहरण की स्थिति को सुनिश्चित करने के लिए माउस देखें। न्यूनतम 5 मिनट के बाद, माउस को गहराई से एनेस्थेटाइज्ड और उंगलियों के चुटकी के लिए अनुत्तरदायी होना चाहिए।
  5. आइसोफलुने कक्ष से माउस को हटाने से तुरंत पहले, पेट्री डिश ढक्कन को लगभग 3-5 मिमी की गहराई तक ठंडा सुक्रोज समाधान के साथ भरें और पेट्री डिश बॉटम को लगभग 1.0 सेमी की गहराई तक ठंडा सुक्रोज समाधान के साथ भरें।
  6. माउस को बाएं शोषक पैड पर जल्दी से स्थानांतरित करें और अग्रअंगों और पूंछ को सुरक्षित करने के लिए टेप के 3 टुकड़ों का उपयोग करें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि माउस किसी भी चीरा लगाने से पहले अनुत्तरदायी है, एक हिंडलम्ब पैर की अंगुली करें। बड़े ऊतक संदंश और सर्जिकल कैंची का उपयोग करना, त्वचा तम्बू और उरोस्थि के नीचे से छाती के ऊपर करने के लिए एक लंबाई चीरा बनाते हैं । संदंश का उपयोग उरोस्थि पर खींच और डायाफ्राम के माध्यम से कटौती करने के लिए कैंची का उपयोग करें।
    नोट: माउस की प्रारंभिक स्थिति और डायाफ्राम को तोड़ने के लिए पहले कई चीरों को जितनी जल्दी हो सके माउस को चेतना हासिल नहीं करता है, जितनी जल्दी हो सके प्रदर्शन किया जाना चाहिए। प्रक्रिया के दौरान संज्ञाहरण की पर्याप्त गहराई सुनिश्चित करने के लिए, परफ्यूजन के दौरान आइसोफ्लारेन देने के लिए माउस पर नाक शंकु रखा जा सकता है।
  7. प्रत्येक तरफ रिब पिंजरे के माध्यम से काटने के लिए कैंची का उपयोग करें, बिंदु की ओर एक बड़ी गति में काटने जहां अग्रभाग शरीर से मिलता है। संदंश के साथ, रिब पिंजरे के सामने और सिर की ओर दूर स्विंग, और फिर पूरी तरह से बड़ी कैंची का उपयोग कर एक क्षैतिज कटौती के साथ इसे हटा दें । बड़े संदंश का उपयोग करके दिल को रखें और 20 ग्राम परफ्यूजन सुई को बाएं वेंट्रिकल में डालें। एक बार सुई सही ढंग से तैनात है, दिल के बाईं ओर जल्दी से पीला होना चाहिए के रूप में ठंडा सुक्रोज समाधान वेंट्रिकल भरता है ।
  8. सही एट्रियम में कटौती करने के लिए छोटे विच्छेदन कैंची का उपयोग करें और रक्त को संचार प्रणाली से बाहर बहने दें। यदि चीरों को सही ढंग से किया जाता है, तो दिल को न्यूनतम नुकसान होना चाहिए, और इसे पूरे परफ्यूजन में पंप करना जारी रखना चाहिए।
    नोट: ऊतक कागज के लुढ़का-अप टुकड़े दिल से रक्त और सुक्रोज समाधान दूर बाती और प्रक्रिया के दौरान परफ्यूजन सुई की दृश्यता बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  9. सुनिश्चित करें कि परफ्यूजन सुई जगह में रहती है और बाएं वेंट्रिकल से बाहर नहीं गिरती है। एक उचित प्रवाह दर और प्लेसमेंट के साथ, जिगर 20-30 एस के साथ एक हल्के तन/बेज रंग को पीला करने के लिए शुरू कर देंगे ।
  10. 30-45 एस के बाद, माउस को काटना करने के लिए बड़ी कैंची का उपयोग करें। सिर को बाएं हाथ में धारण करना, त्वचा को खोपड़ी से दूर धकेलें या छील लें। एक अच्छी तरह से छिद्रित जानवर में, खोपड़ी बहुत पीली होनी चाहिए, और मस्तिष्क को स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाली रक्त वाहिकाओं के बिना खोपड़ी के माध्यम से एक बहुत हल्का गुलाबी रंग (सफेद आ रहा है) दिखाई देना चाहिए।

5. मस्तिष्क निकालें और स्लाइस काटें

  1. छोटे बॉन कैंची का उपयोग करना, खोपड़ी के सामने, आंखों के पास की ओर खोपड़ी के माध्यम से दो पार्श्व कटौती करें। खोपड़ी के आधार के दोनों ओर दो अतिरिक्त कटौती करें।
  2. सिर को ग्लास पेट्री डिश के नीचे स्थानांतरित करें जहां इसे ज्यादातर ठंडा सुक्रोज समाधान में डुबोया जाना चाहिए। खोपड़ी की लंबाई के साथ मिडलाइन को काटने के लिए छोटे बॉन कैंची का उपयोग करें, अंतर्निहित मस्तिष्क ऊतक को नुकसान को कम करने के लिए कैंची के साथ खींचें। छोटे ऊतक संदंश का उपयोग करना, दृढ़ता से खोपड़ी के प्रत्येक पक्ष को समझ और इसे स्विंग और मस्तिष्क से दूर, एक किताब खोलने की तरह ।
  3. बाएं हाथ की उंगलियों का उपयोग खोपड़ी के फ्लैप को खुला रखने के लिए और घ्राण बल्ब के पास मस्तिष्क के नीचे माइक्रोस्पटुला डालें। खोपड़ी से बाहर मस्तिष्क को सुक्रोज में फ्लिप करें और मस्तिष्क स्टेम को तोड़ने के लिए माइक्रोस्पटेला का उपयोग करें। किसी भी अवशिष्ट रक्त, फर, या अन्य ऊतकों को दूर करने के लिए मस्तिष्क को धोएं।
  4. कांच पेट्री डिश के ढक्कन में मस्तिष्क को स्थानांतरित करने के लिए बड़े स्पैटुला/चम्मच का उपयोग करें। दोधारी रेजर ब्लेड के दूसरे आधे हिस्से के साथ पहले अलग सेट, दो कोरोनल कटौती करने के लिए पहले सेरिबैलम को दूर करने और फिर घ्राण बल्ब(चित्रा 1)सहित मस्तिष्क के सबसे पूर्वकाल भाग, ।
  5. आगर रैंप पर सायनोएक्रिलेट चिपकने वाला लगाएं। बहुत संक्षेप में बड़े ऊतक संदंश का उपयोग कर सूखी फिल्टर कागज के एक टुकड़े पर मस्तिष्क जगह है और फिर तुरंत यह आगर रैंप पर स्थानांतरित, चिपकने वाला पर मस्तिष्क की वेंट्रल सतह रखकर ।
    नोट: मध्यवर्ती हिप्पोकैम्पस के स्लाइस के लिए, मस्तिष्क को रैंप की ढलान का सामना करने वाले पूर्वकाल और ब्लेड के करीब पीछे के साथ उन्मुख होना चाहिए। वेंट्रल हिप्पोकैम्पस के स्लाइस के लिए, पूर्वकाल के अंत के साथ मस्तिष्क को उन्मुख ने रैंप की ढलान को इंगित किया, रैंप के शीर्ष पर पीछे के अंत के साथ, ब्लेड से आगे। या तो मामले में, मस्तिष्क रैंप के शीर्ष पर तैनात किया जाना चाहिए, जैसे कि मस्तिष्क की कोरोनली कट सतह आगर समर्थन ब्लॉक(चित्रा 1)से संपर्क करता है ।
  6. आगर और मस्तिष्क के साथ टुकड़ा करने की क्रिया मंच को माइक्रोटोम के टुकड़ा करने की क्रिया कक्ष में रखें और पूरी तरह से ठंडा सुक्रोज समाधान के साथ विसर्जित करें। बड़े स्पैटुला/चम्मच का उपयोग करने के लिए कक्ष में कुछ सुक्रोज घोल हस्तांतरण, किसी भी जमे हुए सुक्रोज पिघलाने के लिए सरगर्मी और तेजी से मिश्रण के तापमान को नीचे लाने के लिए ~1-2 डिग्री सेल्सियस ।
    नोट: टुकड़ा करने की क्रिया भर में तापमान गेज देखो । यदि सुक्रोज समाधान 3 डिग्री सेल्सियस से ऊपर गर्म होता है, तो अधिक घोल जोड़ें और तापमान को वापस नीचे लाने के लिए मिलाएं।
  7. माइक्रोटॉम गति के साथ 450 माइक्रोन की मोटाई पर स्लाइस काटें 0.07 मिमी/ जैसा कि प्रत्येक टुकड़ा मुक्त होता है, छोटे ऊतक संदंश और एक तेज स्केलपेल का उपयोग पहले दो गोलार्द्धों को अलग करने के लिए, और फिर ऊतक को काटने के लिए जब तक टुकड़ा मुख्य रूप से हिप्पोकैम्पस और पैराहिप्पोकैम्पल क्षेत्रों(चित्रा 1) केहोते हैं।
  8. स्लाइस को व्यक्तिगत रूप से इंटरफ़ेस रिकवरी चैंबर में स्थानांतरित करने के लिए प्लास्टिक ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि वे एसीएसएफ के इंटरफ़ेस और हवा में तैनात हैं, जिसमें स्लाइस को कवर करने वाले ACSF की केवल एक पतली मेनिस्कस है। कक्ष के ढक्कन को कसकर बंद करें और स्लाइस को 30 मिनट के लिए 32 डिग्री सेल्सियस पर ठीक होने दें।
  9. 32 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक वसूली के बाद, इंटरफ़ेस रिकवरी चैंबर को पानी के स्नान से बाहर लाएं और धीमी गति से सेट पर रखें ताकि चुंबकीय हलचल बार कक्ष के भीतर एसीएसएफ के परिसंचरण को बढ़ावा दे। इसे धीरे-धीरे कमरे के तापमान में ठंडा करने की अनुमति दें क्योंकि स्लाइस अतिरिक्त 90 मिनट के लिए ठीक हो जाते हैं। सुनिश्चित करें कि रिकवरी चैंबर लगातार कार्बोजन के साथ बुलबुला है और स्लाइस के नीचे बड़े बुलबुले फंसने की अनुमति नहीं देता है।

6. सहज गतिविधि की स्थानीय क्षेत्र क्षमता (एलएफपी) रिकॉर्डिंग करें

  1. अधिग्रहण सॉफ्टवेयर चलाने वाले कंप्यूटर, कंप्यूटर से जुड़े मॉनिटर, उत्तेजक, माइक्रोमैनीपुलेटर, तापमान नियंत्रक, माइक्रोस्कोप लाइट सोर्स, माइक्रोस्कोप से जुड़े कैमरे, माइक्रोइलेक्ट्रोड एम्पलीफायर, डिजिटाइजर और पर्सिस्टाल्टिक पंप सहित सभी आवश्यक उपकरणों को चालू करके एलएफपी रिकॉर्डिंग के लिए तैयार करें। यदि केंद्रीय वैक्यूम सिस्टम का उपयोग कर रहे हैं, तो वैक्यूम लाइन तैयार करने के लिए दीवार वाल्व खोलें जो रिकॉर्डिंग कक्ष से ACSF को हटा देगा।
  2. एसीएसएफ के साथ गर्म जलाशय भरें, फिर बुदबुदाती ACSF युक्त 400 एमएल बीकर में ट्यूबिंग के एक छोर रखें। पेरिस्टाल्टिक पंप को 400 एमएल बीकर से गर्म जलाशय तक और जलाशय से आगे रिकॉर्डिंग कक्ष तक सीधे एसीएसएफ को चालू करें। किसी भी फंसे हुए बुलबुले को छोड़ने के लिए टयूबिंग पर टैप करें या चुटकी करें।
  3. यह सुनिश्चित करने के लिए पेरिस्टाल्टिक पंप को समायोजित करें कि रिकॉर्डिंग चैंबर के माध्यम से ACSF प्रवाह दर तेज है (~ 8-10 एमएल/मिनट)। रिकॉर्डिंग कक्ष के केंद्र में ACSF 32 डिग्री सेल्सियस है सुनिश्चित करने के लिए एक तापमान जांच का उपयोग करें।
    नोट: यदि ACSF एक peristaltic पंप का उपयोग कर रिकॉर्डिंग चैंबर के लिए दिया जाता है, एक उच्च प्रवाह दर प्रवाह दर में एक महत्वपूर्ण उतार चढ़ाव में परिणाम कर सकते हैं । ट्यूबिंग(चित्रा 2)में एकीकृत खाली सिरिंज की एक श्रृंखला से मिलकर एक साधारण स्पंदन डैम्टर का उपयोग करके लगातार प्रवाह दरों को प्राप्त किया जा सकता है।
  4. एक गर्म फिलामेंट पुलर का उपयोग करके बोरोसिलिकेट ग्लास केशिकाओं से उत्तेजना और रिकॉर्डिंग पिपेट तैयार करें। पुलर प्रोटोकॉल को उत्तेजना या स्थानीय क्षेत्र संभावित रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के लिए 2-3 MOhm के प्रतिरोध के साथ पिपेट उपज के लिए कॉन्फ़िगर किया जाना चाहिए।
  5. एसीएसएफ के साथ 1 एम एनएसीएल और एलएफपी पिपेट के साथ उत्तेजना पिपेट भरें।
  6. संक्षेप में टयूबिंग क्लैंप और ACSF के प्रवाह को थामने के लिए पंप बंद कर देते हैं। लेंस पेपर के एक कोने को समझने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करके रिकॉर्डिंग कक्ष में एक टुकड़ा स्थानांतरित करें टुकड़ा आराम कर रहा है- टुकड़ा लेंस पेपर से चिपक जाएगा। लेंस पेपर रखें और नीचे का सामना करना पड़ टुकड़ा के साथ रिकॉर्डिंग कक्ष में टुकड़ा, तो "छील" दूर लेंस कागज रिकॉर्डिंग कक्ष में डूबे टुकड़ा छोड़ । वीणा का उपयोग करके स्लाइस को सुरक्षित करें।
    नोट: हार्प्स को स्टेनलेस स्टील या प्लेटिनम और ठीक नायलॉन फिलामेंट के यू-आकार के टुकड़े का उपयोग करके पूर्व-निर्मित या इन-लैब खरीदा जा सकता है।
  7. मैनुअल माइक्रोमैनीपुलेटर में एनएसीएल से भरे उत्तेजना पिपेट रखें और धीरे-धीरे पिपेट की नोक को स्लाइस (जैसे स्ट्रैटम रेडिएटम लेयर में) की सतह में लगभग 30-45 डिग्री के कोण पर आगे बढ़ाएं। एक बार जब पिपेट की नोक ऊतक में प्रवेश करती है, तो पिपेट को धीरे-धीरे आगे बढ़ाएं और पार्श्व या ऊर्ध्वाधर दिशा में बड़े आंदोलनों से परहेज करें जो टुकड़े के भीतर अक्षों को अनावश्यक रूप से नुकसान पहुंचा सकता है। टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान क्षतिग्रस्त हो गए सतह के पास कोशिकाओं से बचने के लिए स्लाइस में कम से कम 50-100 माइक्रोन गहरी पिपेट की नोक रखें।
  8. मोटराइज्ड माइक्रोमैनीपुलेटर से जुड़े पिपेट होल्डर में एक ACSF से भरे एलएफपी पिपेट रखें। या तो मुंह के दबाव या एक स्टॉपकॉक वाल्व के माध्यम से जुड़े 1 एमएल सिरिंज और पिपेट धारक को टयूबिंग की एक छोटी लंबाई का उपयोग करके एक बहुत ही हल्का सकारात्मक दबाव लागू करें।
    नोट: ब्याज के संकेतों को रिकॉर्ड करने के लिए स्लाइस के भीतर एलएफपी पिपेट की स्थिति: तेज लहर लहर के मामले में, एक एलएफपी पिपेट को स्ट्रैटम पिरामिड (एसपी) में रखा जाना चाहिए और स्ट्रैटम रेडिएटम (एसआर) में एक दूसरा पिपेट। यह विन्यास एसआर में नकारात्मक तेज लहर की एक साथ रिकॉर्डिंग और सपा में उच्च आवृत्ति तरंग दोलन(चित्रा 3)के लिए अनुमति देता है।
  9. माइक्रोमैनीपुलेटर का उपयोग धीरे-धीरे एलएफपी पिपेट की नोक को लगभग 30-45 डिग्री के कोण पर ब्याज (उदाहरण के लिए, सीए1 पिरामिड सेल लेयर) के क्षेत्र में आगे बढ़ाता है। टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान क्षतिग्रस्त हो गए सतह के पास कोशिकाओं से बचने के लिए स्लाइस में कम से कम 50-100 माइक्रोन गहरी पिपेट की नोक रखें। एलएफपी पिपेट को आगे बढ़ाते हुए, अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके लगातार एक छोटा वोल्टेज परीक्षण पल्स वितरित करें और इलेक्ट्रोड प्रतिरोध में अचानक वृद्धि के लिए देखें। इससे यह संकेत मिल सकता है कि पिपेट को एक सेल के खिलाफ भरा या दबाया गया है।
  10. एक बार एलएफपी पिपेट ब्याज के क्षेत्र में तैनात है, ध्यान से पिपेट धारक से जुड़ी ट्यूबिंग पर वाल्व खोलने के द्वारा सकारात्मक दबाव जारी।
  11. एलएफपी को एक साथ दूसरे स्थान पर रिकॉर्ड करने के लिए, दूसरे पिपेट और माइक्रोमैनीपुलेटर के साथ 6.8-6.10 चरणों को दोहराएं।
  12. पिपेट के श्रृंखला प्रतिरोध के लिए सही करने के लिए अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में पुल संतुलन समारोह का उपयोग करने के बाद स्थानीय क्षेत्र की क्षमता में सहज गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए वर्तमान क्लैंप विन्यास में माइक्रोइलेक्ट्रोड एम्पलीफायर का उपयोग करें। सहज एसडब्ल्यूआर एसपी लेयर(चित्र 3)की बाहुलकर क्षमता में सकारात्मक विक्षेप के रूप में दिखाई देगा।
  13. क्षेत्र की क्षमता को रिकॉर्ड करने के लिए, एनएसीएल से भरे उत्तेजना पिपेट के माध्यम से एक छोटी (200 यूएस) स्क्वायर वोल्टेज पल्स देने के लिए डिजिटाइज़र से जुड़े उत्तेजकों का उपयोग करें। प्रतिक्रिया आयामों की एक श्रृंखला पैदा करने के लिए उत्तेजना वोल्टेज डायल समायोजित करें।

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Representative Results

यहां प्रस्तुत एचईसी स्लाइस से प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग के रूप में इस प्रोटोकॉल में वर्णित तैयार कर रहे हैं । एक इंटरफेस होल्डिंग चैंबर(चित्रा 1C)में वसूली के बाद, स्लाइस व्यक्तिगत रूप से एक जलमग्न रिकॉर्डिंग चैंबर(चित्रा 2B)में स्थानांतरित कर रहे हैं । रिकॉर्डिंग चैंबर को पेरिस्टाल्टिक पंप(चित्रा 2 ए)का उपयोग करके कार्बोजन-संतृप्त ACSF के साथ आपूर्ति की जाती है। पंप पहले एक गर्म जलाशय में एक होल्डिंग बीकर से ACSF खींचता है । मीडिया की निरंतर ऑक्सीजन प्रदान करने के लिए कार्बोजन लाइनों को होल्डिंग बीकर और गर्म जलाशय दोनों में रखा जाता है। हवा से भरी सीरिंज की एक श्रृंखला से मिलकर एक स्पंदन डैम्टर, तेजी से पेरिस्टलसिस द्वारा उत्पादित प्रवाह दर में उतार-चढ़ाव को कम करने के लिए पेरिस्टाल्टिक पंप और रिकॉर्डिंग चैंबर के बीच में तैनात किया जाता है। प्रत्येक सिरिंज में हवा की जेब पंप के प्रत्येक चक्र के कारण दबाव में परिवर्तन को अवशोषित करती है, ताकि रिकॉर्डिंग चैंबर को ACSF52, 53का एक चिकनी और सुसंगत प्रवाह प्राप्त हो। स्पंदन डैमिंगर के बाद स्थित एक इनलाइन हीटर यह सुनिश्चित करता है कि रिकॉर्डिंग कक्ष में प्रवेश करते ही एसीएसएफ का तापमान 32 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित किया जाता है।

इस उदाहरण में, दोहरी सतह सुपरफ्यूजन रिकॉर्डिंग कक्ष में तीन 3 डी-मुद्रित परतें(चित्रा 2B)होती हैं। नीचे की परत में वैक्यूम तेल के साथ सुरक्षित एक कवरस्लिप फिट करने के लिए आयताकार कटआउट होता है। मध्य परत में एक लम्बी अंडाकार कक्ष का निचला आधा हिस्सा होता है, जिसमें दो क्षैतिज समर्थन होते हैं। नायलॉन फिलामेंट इन समर्थनों (लगभग हर 0.5 मिमी) में ताना जाता है और साइनोएक्रेलेट चिपकने वाला के साथ सुरक्षित होता है। टुकड़ा इस ताना फिलामेंट के शीर्ष पर आराम करेंगे। शीर्ष परत में छोटे कुओं के साथ अंडाकार कक्ष का ऊपरी आधा हिस्सा होता है जिसमें चांदी के क्लोराइड ग्राउंड छर्रों को रखा जा सकता है। कक्ष के लम्बी अंडाकार आकार ACSF के तेजी से laminar प्रवाह को बढ़ावा देने के लिए डिज़ाइन किया गया है ।

चित्रा 3 इस प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार एचईसी स्लाइस से प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग प्रस्तुत करता है। शुरू में स्लाइस स्वास्थ्य का आकलन करने के लिए, फील्ड पोस्टसिनैप्टिक क्षमता (एफपीएसपी) को एनएसीएल के 1 एम से भरे पाइपेट का उपयोग करके स्ट्रैटम रेडिएटम (एसआर) में पैदा किया जाता है। स्वस्थ स्लाइस में, विद्युत उत्तेजना को एक छोटे से प्रेसिनैप्टिक फाइबर वॉली और तेजी से प्रारंभिक वंश(चित्र 3बी, ऊपरी बाएं)के साथ एक बड़ी पोस्टसाइनाप्टिक क्षमता के साथ एक एफपीएसपी का उत्पादन करना चाहिए। स्वस्थ स्लाइस में, सहज तेज-तरंग तरंग (एसडब्ल्यूआर) स्ट्रैटम पिरामिड (चित्रा 3बी, निचले बाएं)में एलएफपी में सकारात्मक विक्षेप के रूप में दिखाई देती है। एफपीएसपी पैदा किए गए उप-ोप्टिमल स्लाइस में एक बड़ी फाइबर वॉली और अपेक्षाकृत छोटी पोस्टसिनैप्टिक क्षमता दिखाई देती है, और इस तरह के स्लाइस सहज एसडब्ल्यूआर(चित्र 3बी, दाएं)नहीं दिखाते हैं। एसडब्ल्यूआर इन विट्रो प्रकाशित विवरणों के अनुरूप विशेषताओं को दिखाते हैं: एसपी लेयर में एक मढ़ा उच्च आवृत्ति दोलन के साथ एक सकारात्मक क्षेत्र क्षमता, एसआर परत(चित्रा 3C)में एक नकारात्मक क्षेत्र क्षमता के साथ बनती है। CA2 में दर्ज एक एसडब्ल्यूआर को एक तारांकन(चित्रा 3सी, दाएं)के साथ इंगित किया जाता है। एचईसी स्लाइस में SWRs CA2/CA3 आवर्ती सर्किट के भीतर निकलती है और CA1 को प्रचारित करती है। CA2 और CA1 एसपी लेयर में देखा गया एक एकल एसडब्ल्यूआर एक तारांकन(चित्रा 3डी, दाएं)के साथ इंगित किया जाता है। इस प्रतिनिधि उदाहरण में, CA2 SWR (ग्रीन) कई मिलीसेकंड द्वारा CA1 (नीला) में जाता है, जैसा कि प्रत्येक क्षेत्र में दर्ज एसडब्ल्यूआर लिफाफे (2-30 हर्ट्ज पर फ़िल्टर) के ओवरले में दिखाया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: क्षैतिज कोण हिप्पोकैम्पल-एंटोरानल कॉर्टेक्स (एचईसी) स्लाइस की तैयारी। (A) (i)मस्तिष्क निकालने के बाद, मस्तिष्क के पीछे और पूर्वकाल के हिस्सों को हटाने के लिए एक रेजर ब्लेड के साथ दो कोरोनल कट करें। 2आगर रैंप माइक्रोटोम स्लाइसिंग प्लेटफॉर्म से चिपके दो कोण वाले हिस्सों से बनता है । मध्यवर्ती हिप्पोकैम्पस के स्लाइस तैयार करने के लिए, ढलान का सामना करना पड़ पूर्वकाल सतह के साथ आगर रैंप पर मस्तिष्क ब्लॉक जगह है और रैंप के लंबे समर्थन भाग के साथ संपर्क बनाने । अधिक वेंट्रल हिप्पोकैम्पस के स्लाइस तैयार करने के लिए, ढलान के नीचे का सामना कर रही पूर्वकाल की सतह के साथ आगर रैंप पर मस्तिष्क ब्लॉक रखें, ताकि पीछे की कट सतह रैंप के लंबे समर्थन वाले हिस्से से संपर्क करे। (iii)चूंकि प्रत्येक टुकड़ा मुक्त हो जाता है, गोलार्द्धों को अलग करने और अनावश्यक ऊतकों को हटाने के लिए स्केलपेल के साथ कई और कटौती करें। (ख)डीएपीआई द्वारा लेबल किए गए सेल नाभिक के साथ परिणामी स्लाइस की प्रतिनिधि छवि। (ग)एक इंटरफेस रिकवरी चैंबर में, स्लाइस एक स्टेनलेस स्टील या नायलॉन जाल, ACSF की सतह के साथ स्तर के शीर्ष पर लेंस कागज के टुकड़ों पर रखा जाता है । एक सिरेमिक बबलर कार्बोजेन को कक्ष में पहुंचाता है और एक चुंबकीय हलचल बार लगातार कक्ष में तरल पदार्थ घोला जा सकता है। ACSF की एक पतली फिल्म टुकड़ा की शीर्ष सतह को शामिल किया गया, चैंबर की आर्द्र कार्बोजन से भरपूर हवा से ऑक्सीजन के प्रसार को बढ़ाने । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: ACSF डिलीवरी ट्यूबिंग में स्पंदन डैम्टर के साथ दोहरी सतह सुपरफ्यूजन रिकॉर्डिंग चैंबर। (A)सुपरफ्यूजन सिस्टम का आरेख। ACSF को 32 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जाता है, लगातार कार्बोजन गैस के साथ बुलबुला किया जाता है, और हवा से भरे सीरिंज की एक श्रृंखला से मिलकर एक स्पंदन गीला के साथ एक पेरिस्टाल्टिक पंप का उपयोग करके लगभग 8-10 एमएल/मिन पर वितरित किया जाता है। (ख)रिकॉर्डिंग चैंबर में तीन 3डी-प्रिंटेड लेयर होती हैं, जिसके बीच नायलॉन फिलामेंट के साथ ताना जाता है । टुकड़ा इस ताना फिलामेंट पर टिकी हुई है और ACSF ऊतक के ऊपर और नीचे बहती है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एचईसी स्लाइस से सहज तेज लहर लहर के प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग । (क)एचईसी स्लाइस का एक सरलीकृत आरेख जो रिकॉर्डिंग और उत्तेजना इलेक्ट्रोड की स्थिति को दिखाता है । (ख)एक सक्रिय, स्वस्थ टुकड़ा और एक उप-प्रतिस्थापन टुकड़ा दोनों से एलएफपी गतिविधि की प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग। स्वस्थ टुकड़ा (बाएं, हरे रंग में) बड़े पैदा क्षेत्र प्रतिक्रियाओं और सहज तेज लहर लहर (SWRs), सपा परत के स्थानीय क्षेत्र क्षमता में अनियमित होने वाली सकारात्मक विक्षेप के रूप में दिखाई से पता चलता है । इसके विपरीत, एक अस्वस्थ टुकड़ा छोटे पैदा क्षेत्र प्रतिक्रियाओं और कोई सहज गतिविधि (सही, ग्रे में) से पता चलता है । (ग)सीए2 क्षेत्र में एसडब्ल्यूआर की प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग, जिसमें एसआर लेयर में एलएफपी में नकारात्मक विक्षेप और एसपी लेयर में एलएफपी में अंतर्निहित सकारात्मक विक्षेप के साथ उच्च आवृत्ति दोलन शामिल है । प्रत्येक चैनल में चोटियों संकेत आयाम के तीन मानक विचलन से अधिक लाल रंग में प्रकाश डाला जाता है । 2-30 हर्ट्ज का एक बैंडपास फिल्टर क्रमशः एसपी और एसआर लेयर में तेज लहर के अंतर्निहित सकारात्मक और नकारात्मक लिफाफे को अलग करता है, जबकि एसपी लेयर में लहर के उच्च आवृत्ति दोलन को अलग करने के लिए 80-250 हर्ट्ज के बैंडपास फिल्टर का उपयोग किया जाता है। (घ) वीट्रो में एसडब्ल्यूआर CA2/CA3 से CA1 तक प्रचारित करते हैं । इन प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग में, CA2 में SWRs (हरा, नीचे) से पहले कि CA1 (नीले, शीर्ष) में कई मिलीसेकंड द्वारा । प्रत्येक चैनल में चोटियों संकेत आयाम के तीन मानक विचलन से अधिक लाल रंग में प्रकाश डाला जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

आणविक वजन (ग्राम/मोल) अंतिम एकाग्रता (एमएमएम) ग्राम / 1 एल सुक्रोज कटिंग समाधान
इक्षु शर्करा C12H22O11 342.3 195 66.749
सादा नमक नैक 58.44 10 0.584
ग्‍लूकोज़ C6H12O6 180.08 10 1.801
सोडियम बाइकार्बोनेट नाहको3 84.01 25 2.1
पोटेशियम क्लोराइड केसीएल 74.55 2.5 0.186
सोडियम फॉस्फेट मोनोबेसिक निर्जल एनएएच2पीओ4 137.99 1.25 0.173
सोडियम पायरुवेट C3H3नाओ3 110.04 2 0.22
स्टॉक एकाग्रता (एम) अंतिम एकाग्रता (एमएमएम) मिलीलीटर/1L सुक्रोज कटिंग समाधान
कैल्शियम क्लोराइड सीएसीएल2 1 0.5 0.5
मैग्नीशियम क्लोराइड एमजीसीएल2 1 7 7

तालिका 1: सुक्रोज कटिंग समाधान की संरचना। शुद्ध पानी के लगभग 0.75 एल के साथ शुरू करें जिसे ट्रेस धातुओं और अन्य अशुद्धियों को दूर करने के लिए फ़िल्टर किया गया है। एक चुंबकीय हलचल बार के साथ समाधान मिश्रण करते हुए प्रत्येक ठोस भंग। एक बार जब सभी ठोस भंग हो जाते हैं, तो 10 मिनट के लिए समाधान के माध्यम से बुलबुला कार्बोजेन गैस। एमजीसीएल2 और सीएसीएल2 समाधान जोड़ें और कुल मात्रा को 1 एल में लाने के लिए पानी जोड़ें। 10 मिनट के लिए एक चुंबकीय हलचल बार के साथ मिश्रण करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि समाधान समान रूप से मिश्रित है। ऑस्मोलारिटी 315 और 325 एमओएम के बीच होनी चाहिए, और पीएच लगभग 7.4 होना चाहिए।

आणविक वजन (ग्राम/मोल) अंतिम एकाग्रता (एमएमएम) ग्राम / 2L ACSF
सादा नमक नैक 58.44 125 14.61
ग्‍लूकोज़ C6H12O6 180.08 12.5 4.502
सोडियम बाइकार्बोनेट नाहको3 84.01 25 4.201
पोटेशियम क्लोराइड केसीएल 74.55 3.5 0.522
सोडियम फॉस्फेट मोनोबेसिक निर्जल एनएएच2पीओ4 137.99 1.25 0.345
एस्कॉर्बिक एसिड C6H8O6 176.12 1 0.352
सोडियम पायरुवेट C3H3नाओ3 110.04 3 0.66
स्टॉक एकाग्रता (एम) अंतिम एकाग्रता (एमएमएम) मिलीलीटर/2L ACSF
कैल्शियम क्लोराइड सीएसीएल2 1 1.6 3.2
मैग्नीशियम क्लोराइड एमजीसीएल2 1 1.2 2.4

तालिका 2: कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ की संरचना। शुद्ध पानी के लगभग 1.5 एल के साथ शुरू करें जिसे ट्रेस धातुओं और अन्य अशुद्धियों को दूर करने के लिए फ़िल्टर किया गया है। एक चुंबकीय हलचल बार के साथ समाधान मिश्रण करते हुए प्रत्येक ठोस भंग। एक बार जब सभी ठोस भंग हो जाते हैं, तो 10 मिनट के लिए समाधान के माध्यम से बुलबुला कार्बोजेन गैस। एमजीसीएल2 और सीएसीएल2 समाधान जोड़ें और कुल मात्रा को 2 एल में लाने के लिए पानी जोड़ें। 10 मिनट के लिए एक चुंबकीय हलचल बार के साथ मिश्रण करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि समाधान समान रूप से मिश्रित है। ऑस्मोलारिटी 315 और 325 एमओएम के बीच होनी चाहिए, और पीएच लगभग 7.4 होना चाहिए।

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Discussion

ऊतक स्वास्थ्य को बढ़ावा देने और सहज प्रकृतिवादी नेटवर्क गतिविधि के उद्भव के पक्ष में डिज़ाइन किए गए इस स्लाइसिंग प्रोटोकॉल में कई कदम हैं: माउस को ठंडा सुक्रोज काटने के समाधान के साथ ट्रांसकार्डेली रूप से परफ्यूस किया जाता है; क्षैतिज-एंटोराइनल कॉर्टेक्स (एचईसी) स्लाइस मध्यवर्ती या वेंट्रल हिप्पोकैम्पस से 450 माइक्रोन की मोटाई पर काटे जाते हैं; स्लाइस गर्म ACSF और आर्द्रीकृत, कार्बोजन से भरपूर हवा के इंटरफेस पर ठीक हो जाते हैं; रिकॉर्डिंग स्लाइस के दौरान ACSF के साथ 32 डिग्री सेल्सियस तक गर्म और एक जलमग्न रिकॉर्डिंग कक्ष में दोहरी सतह सुपरफ्यूजन के साथ एक तेज प्रवाह दर पर दिया जाता है।

विट्रो मेंनेटवर्क दोलनों के उत्पादन के लिए स्लाइस स्वास्थ्य सर्वोपरि महत्व का है । युवा जानवरों को और अधिक स्वस्थ स्लाइस निकलेगा, और आम तौर पर किशोर या किशोर चूहों के साथ ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन कदम को छोड़ दिया जा सकता है। जानवरों की उम्र के रूप में, स्वस्थ स्लाइस बनाना तेजी से मुश्किल हो जाता है, फिर भी कुछ जांच (जैसे रोग मॉडल या देशांतर अध्ययन) वयस्क या उम्र बढ़ने वाले जानवरों के उपयोग की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, डेंगलर एट अल ने पिलोकार्पाइन से एचईसी स्लाइस की तैयारी में ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन का उपयोग किया-लंबे समय से मिर्गी के वयस्क चूहों50का इलाज किया। वयस्क चूहों के साथ, ऊतक को ठंडा करने, मस्तिष्क से रक्त को साफ करने और खोपड़ी51से मस्तिष्क को हटाने से पहले मेटाबोलिक गतिविधि को कम करने के लिए ठंडा सुक्रोज काटने के समाधान के साथ एक ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन करना फायदेमंद है। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन को सही ढंग से प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है और यह सुनिश्चित करने के लिए सावधानी बरती जानी चाहिए कि प्रक्रिया जल्दी और इस तरह से की जाए जिससे पशु कल्याण के लिए जोखिम न हो । जब संभव हो, प्रयोगों को युवा जानवरों का उपयोग करने के लिए डिज़ाइन किया जाना चाहिए ताकि ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन के उपयोग को बाधित किया जा सके। एक उप-प्रतिस्थापन स्लाइस तैयारी में, चल रहे नेटवर्क दोलनों का समर्थन करने के लिए पर्याप्त स्वस्थ कोशिकाएं, विशेष रूप से इंटरन्यूरॉन नहीं होंगे। प्रयोग के दौरान स्लाइस स्वास्थ्य का आकलन करने के लिए, यह पहले रिकॉर्ड करने के लिए उपयोगी है क्षेत्र क्षमता (उदाहरण के लिए, एक उत्तेजना पिपेट और स्ट्रैटम रेडिएटम,एसआर में एक रिकॉर्डिंग पिपेट के साथ)। एक स्वस्थ टुकड़ा में, एसआर परत में उत्तेजना अपेक्षाकृत छोटे प्रेसिनैप्टिक फाइबर वॉली(चित्रा 3)के साथ एक बड़े क्षेत्र पोस्टसिनैप्टिक क्षमता (एफपीएसपी) का आह्वान करेगी।

इस प्रोटोकॉल द्वारा उत्पादित स्लाइस क्षैतिज हिप्पोकैम्पल-एंटोराइनल कॉर्टेक्स (एचईसी) स्लाइस कोण हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि न तो पैराहिप्पोकैम्पल ऊतक को शामिल किया गया है और न ही कोण में कटौती हिप्पोकैम्पस स्लाइस के लिए आवश्यक है ताकि अनायास एसडब्ल्यूआर जैसी नेटवर्क गतिविधियां उत्पन्न की जा सके। वास्तव में, कई अध्ययनों में क्षैतिज या ट्रांसवर्स हिप्पोकैम्पल स्लाइस का उपयोग शारीरिक25,40 , 41,44या पैथोलॉजिकल नेटवर्क दोलनों 33, 38के पहलुओं से पूछताछ करने के लिए किया गया है । इस प्रोटोकॉल में मस्तिष्क को आगर रैंप पर रखने से प्रयोगकर्ता को वेंट्रल या मध्यवर्ती हिप्पोकैम्पस(चित्रा 1)से अधिक स्लाइस का उत्पादन करने की अनुमति दी जाती है , जो प्रयोगात्मक उद्देश्यों के लिए फायदेमंद हो सकता है जो हिप्पोकैम्पस26,31की देशांतर धुरी के साथ मौजूद कार्यात्मक विषमता को ध्यान में रखते हैं । यदि स्लाइस की शारीरिक उत्पत्ति एक कारक नहीं है, तो आगर रैंप को बाहर रखा जा सकता है और एक सच्चे क्षैतिज काटने वाले विमान मध्यवर्ती-से-वेंट्रल हिप्पोकैम्पस के स्लाइस प्राप्त करेंगे। जैसा कि प्रत्येक क्षैतिज ऊतक टुकड़ा मुक्त किया जाता है, स्लाइस के अधिकांश बाहरी हिस्सों को तीन सरल कटौती के साथ हटाया जा सकता है, जिसमें मोटे तौर पर आयताकार टुकड़ा होता है जिसमें हिप्पोकैम्पस और कुछ आसपास के ऊतक होते हैं, जिनमें पैराहिप्पोकैम्पल क्षेत्र(चित्रा 1)शामिल है। इसके अलावा विच्छेदन सभी एक्सथिप्पोकैम्पस ऊतकों को हटाने के लिए किया जा सकता है, लेकिन आसपास के ऊतकों को शामिल करना फायदेमंद है, जिसमें स्लाइस वीणा को आसानी से रखा जा सकता है ताकि नायलॉन फिलामेंट्स हिप्पोकैम्पस में उचित रूप से आराम न करें। जैसा कि ऊपर चर्चा की गई है, संयुक्त एचईसी स्लाइस भी एक उपयोगी तैयारी है जिसके साथ शारीरिक 37 या पैथोलॉजिकल16,35, 36,38नेटवर्क दोलनों के संदर्भ में एक बड़े कोर्टिकोहिप्पोकैम्पल नेटवर्क की जांच करना है।

इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कारक वसूली चरण के दौरान और रिकॉर्डिंग के दौरान ऊतक को ऑक्सीजन की आपूर्ति का अनुकूलन करना है। नेटवर्क दोलनों के कई अध्ययन स्लाइस में किए जाते हैं जिन्हें सीधे माइक्रोटॉम से इंटरफ़ेस रिकॉर्डिंग चैंबर में स्थानांतरित किया जाता है और ताजा ACSF के नित्य परफ्यूजन के साथ ठीक होने की अनुमति दी जाती है। वसूली के कई घंटों के बाद, रिकॉर्डिंग फिर एक ही इंटरफेस कक्ष में किया जा सकता है। इस प्रकार, प्रयोग की पूरी अवधि के लिए ACSF और आर्द्र कार्बोजेन से भरपूर हवा के इंटरफेस पर स्लाइस आयोजित किए जाते हैं। इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत वैकल्पिक पद्धति में, स्लाइस एक इंटरफ़ेस-स्टाइल होल्डिंग चैंबर में कम से कम दो घंटे के लिए ठीक हो जाते हैं इससे पहले कि व्यक्तिगत स्लाइस को पर्याप्त तेजी से ACSF प्रवाह दरों के साथ एक जलमग्न शैली रिकॉर्डिंग कक्ष में स्थानांतरित कर दिया जाता है। इन परिस्थितियों में तैयार स्लाइस स्थिर गामा दोलन12 या सहज एसडब्ल्यूआर गतिविधि43प्रदर्शित कर सकते हैं। एक इंटरफ़ेस शैली होल्डिंग चैंबर में स्लाइस वसूली एक महत्वपूर्ण कदम है: Maier एट अल का प्रदर्शन किया है कि स्लाइस जो एक बीकर में पूरी तरह से ACSF में डूबे हुए छोटे पैदा क्षेत्र क्षमता, कम लगातार सहज पोस्टसाइनाप्टिक धाराओं का प्रदर्शन, और केवल शायद ही कभी सहज नेटवर्क गतिविधि४३का उत्पादन । इसी तरह, हाजोस एट अल ने दिखा दिया कि तेजी से ACSF प्रवाह दरों के परिणामस्वरूप सहज निरोधात्मक वाशियवादी धाराओं की उच्च आवृत्ति होती है, जो बेहतर इंटरन्यूरोनल गतिविधि49का सुझाव देती है। रिकॉर्डिंग अवधि के दौरान, दोहरी सतह सुपरफ्यूजन कड़ाई से आवश्यक नहीं है, बशर्ते रिकॉर्डिंग चैंबर एक तेज प्रवाह दर (कम से कम 6 एमएल/न्यूनतम)43पर वितरित ACSF की एक अपेक्षाकृत छोटी मात्रा रखती है। इस प्रोटोकॉल(चित्रा 2B)में प्रस्तुत 3 डी मुद्रित रिकॉर्डिंग कक्ष अपेक्षाकृत लागत प्रभावी और एक सरल विकल्प है, लेकिन छोटे वॉल्यूम रखने, मीडिया के लैमिनर प्रवाह को बढ़ावा देने, या दोहरी सतह सुपरफ्यूजन प्रदान करने के लिए डिज़ाइन किए गए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जलमग्न रिकॉर्डिंग कक्ष भी हैं, या दोहरी सतह सुपरफ्यूजन प्रदान करते हैं (परिपत्र रिकॉर्डिंग कक्षों के विपरीत, उदाहरण के लिए, जो ACSF की अतिरिक्त मृत मात्रा की अनुमति देते हैं)।

हालांकि यह प्रोटोकॉल एक पारंपरिक इंटरफ़ेस रिकॉर्डिंग चैंबर की आवश्यकता के बिना नेटवर्क दोलनों को रिकॉर्ड करने की अनुमति देता है, कई सीमाएं हैं। हालांकि स्लाइस वसूली अवधि के दौरान ACSF-एयर इंटरफेस में आयोजित कर रहे हैं, वे ताजा मीडिया के नित्य परफ्यूजन प्राप्त नहीं के रूप में पारंपरिक हास शैली इंटरफेस रिकॉर्डिंग कक्षों में होता है । स्लाइस को रिकवरी चैंबर से जलमग्न रिकॉर्डिंग चैंबर में व्यक्तिगत रूप से स्थानांतरित किया जाना चाहिए (ठीक संदंश का उपयोग करना) । इसके अलावा, तेज प्रवाह दरों में कुछ रिकॉर्डिंग के लिए अस्थिरता और गति कलाकृतियों समस्याग्रस्त हो सकता है, खासकर अगर ACSF एक peristaltic पंप के साथ दिया जाता है । तेज प्रवाह दरों को बनाए रखने और यांत्रिक गड़बड़ी को कम करने के लिए, एक साधारण स्पंदन डैमर को परफ्यूजन सिस्टम(चित्रा 2)में एकीकृत किया जा सकता है। यह स्पंदन डैम्टर विंडकेसेल प्रभाव52का उपयोग करके संचालित होता है, जिसमें खाली सीरिंज में हवा की जेब होती है जो लोचदार जलाशयों के रूप में कार्य करती है, जो पेरिस्टाल्टिक पंप53के रोलर्स द्वारा उत्पन्न अस्थिर दबाव को अवशोषित करती है। हालांकि, एक पल्स डैमिंग का समावेश ट्यूबिंग में लंबाई जोड़ सकता है जो रिकॉर्डिंग चैंबर में ACSF बचाता है और स्लाइस को ऑक्सीजन की आपूर्ति को प्रभावित करता है। प्रवाह दरों के रूप में ही तेजी से के रूप में स्थिर नेटवर्क दोलन उपज के लिए आवश्यक है होना चाहिए, और अगर एक peristaltic पंप का इस्तेमाल किया जाता है यह आदर्श रोलर्स की एक बड़ी संख्या का उपयोग करता है (>12) के लिए पेरिस्टलसिस की वजह से स्पंदन को कम करने के लिए, एक स्पंदन गीला के उपयोग को रोकना, और यह सुनिश्चित करें कि टयूबिंग कि रिकॉर्डिंग चैंबर के लिए ACSF उद्धार के रूप में संभव के रूप में कम है । तेज प्रवाह दरों के साथ किए गए रिकॉर्डिंग में भी ACSF की बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है, जो समस्याग्रस्त हो सकती है यदि प्रयोगों के लिए मूल्यवान या महंगी दवाओं या यौगिकों को मीडिया में शामिल करने की आवश्यकता होती है। यद्यपि दोहरी सतह वाले सुपरफ्यूजन कक्ष को स्लाइस के दोनों किनारों पर ऑक्सीजनयुक्त मीडिया देने के लिए दो तरल पदार्थ इनलेट्स के साथ एक विशेष रूप से निर्मित रिकॉर्डिंग चैंबर की आवश्यकता होती है, लेकिन सहज नेटवर्क दोलनों को मध्यम ACSF प्रवाह दरों48के साथ देखा जा सकता है। यह प्रोटोकॉल सहज गतिविधि को देखने की संभावना में सुधार करने के लिए एक तेज प्रवाह दर (स्पंदन डैमर के साथ स्थिर) और दोहरी सतह सुपरफ्यूजन चैंबर दोनों का उपयोग करता है।

अंत में, इस प्रोटोकॉल में प्रति पशु उत्पादित स्लाइस की संख्या के संबंध में कम उपज है। 450 माइक्रोन की मोटाई के साथ क्षैतिज टुकड़ा करने की क्रिया पसंदीदा अभिविन्यास पर एचईसी स्लाइस की एक छोटी संख्या पैदा करती है (जिसमें टुकड़ा प्रभावी रूप से हिप्पोकैम्पस के ट्रांसवर्स धुरी के समानांतर होता है)। इन स्लाइस में से, आमतौर पर, प्रति हिप्पोकैम्पी केवल एक या दो सहज एसडब्ल्यूआर गतिविधि प्रदर्शित करते हैं, कम सेकहीं ४३की सूचना दी गई है । हालांकि मोटे स्लाइस संभवतः आवर्ती कनेक्टिविटी की एक बड़ी डिग्री होते हैं, थोड़ा पतले स्लाइस (४०० μm) काटने SWR गतिविधि के साथ ट्रांसवर्सली उन्मुख स्लाइस के माउस प्रति अधिक संख्या में उपज सकता है । इसके अलावा, संभावना है कि कई स्लाइस मज़बूती से सहज एसडब्ल्यूआर गतिविधि प्रदर्शित करते हैं, प्रयोगों में अधिक हो सकते हैं जो वेंट्रेल हिप्पोकैम्पस के सच्चे क्षैतिज या नीचे कोण वाले स्लाइस का उपयोग करते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल में मध्यवर्ती हिप्पोकैम्पस के ऊपर की ओर कोण वाले क्षैतिज स्लाइस के उपयोग को शामिल किया गया है, जो वेंट्रलहिप्पोकैम्पस25, 26,31से स्लाइस की तुलना में सहज नेटवर्क गतिविधि प्रदर्शित करने की संभावना कम हो सकती है। अंत में, इस प्रोटोकॉल किशोर और वयस्क चूहों से स्लाइस का इस्तेमाल किया। जबकि ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन पुराने जानवरों से स्लाइस की गुणवत्ता मेंसुधार कर सकते हैं,12, 41,44छोटे जानवरों से स्लाइस के उपयोग से सहज नेटवर्क गतिविधियों को देखने की संभावना में सुधार हो सकता है।

संक्षेप में, यह प्रोटोकॉल एक माउस मस्तिष्क टुकड़ा करने का दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है जो मध्यवर्ती या वेंट्रेल हिप्पोकैम्पल गठन से क्षैतिज हिप्पोकैम्पस-एंटोराइनल कॉर्टेक्स स्लाइस को इंगित करता है जो तेज तरंग-तरंग परिसरों के रूप में जटिल सहज नेटवर्क गतिविधि प्रदर्शित कर सकता है।

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Disclosures

लेखक के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक समर्थन के लिए स्टीव सीगलबॉम का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । वित्तपोषण 5R01NS106983-02 के साथ-साथ 1 F31 NS113466-01 द्वारा प्रदान किया जाता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D printer Lulzbot LulzBot TAZ 6
Acute brain slice incubation holder NIH 3D Print Exchange 3DPX-001623 Designed by ChiaMing Lee, available at https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt Sigma Aldrich A9187-500MG
Ag-Cl ground pellets Warner 64-1309, (E205)
agar Becton, Dickinson 214530-500g
ascorbic acid Alfa Aesar 36237
beaker (250 mL) Kimax 14000-250
beaker (400 mL) Kimax 14000-400
biocytin Sigma Aldrich B4261
blender Oster BRLY07-B00-NP0
Bonn scissors, small becton, Dickinson 14184-09
borosilicate glass capillaries with filament (O.D. 1.5 mm, I.D. 0.86 mm, length 10 cm) Sutter Instruments BF150-86-10HP Fire polished capillaries are preferable.
calcium chloride solution (1 M) G-Biosciences R040
camera Olympus OLY-150
compressed carbogen gas (95% oxygen / 5% carbon dioxide) Airgas X02OX95C2003102
compressed oxygen Airgas OX 200
constant voltage isolated stimulator Digitimer Ltd. DS2A-Mk.II
coverslips (22x50 mm) VWR 16004-314
cyanoacrylate adhesive Krazy Glue KG925 Ideally use the brush-on form for precision
data acquisition software Axograph N/A Any equivalent software (e.g. pClamp) would work.
Dell Precision T1500 Tower Workstation Desktop Dell N/A Catalog number will depend on specific computer - any computer will work as long as it can run electrophysiology acquisition software.
Digidata 1440A Molecular Devices 1-2950-0367
digital timer VWR 62344-641 4-channel Traceable timer
disposable absorbant pads VWR 56616-018
dissector scissors Fine Science Tools 14082-09
double-edge razor blades Personna BP9020
dual automatic temperature controller Warner Instrument Corporation TC-344B
dual-surface or laminar-flow optimized recording chamber N/A N/A The chamber presented in this protocol is custom made. A commercial equivalent would be the RC-27L from Warner Instruments.
equipment rack Automate Scientific FR-EQ70" A rack is not strictly necessary but useful for organizing electrophysiology
Ethylene glycol-bis(2-aminoethyiether)- N,N,N',N'-teetraacetic acid (EGTA) Sigma Aldrich 324626-25GM
filter paper Whatman 1004 070
fine scale Mettler Toledo XS204DR
Flaming/Brown micropipette puller Sutter Instruments P-97
glass petri dish (100 x 15 mm) Corning 3160-101
glucose Fisher Scientific D16-1
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate Sigma Aldrich G8877-250MG
ice buckets Sigma Aldrich BAM168072002-1EA
isoflurane vaporizer General Anesthetic Services Tec 3
lab tape Fisher Scientific 15-901-10R
lens paper Fisher Scientific 11-996
light source Olympus TH4-100
magnesium chloride solution (1 M) Quality Biological 351-033-721EA
magnetic stir bars Fisher Scientific 14-513-56 Catalog number will be dependent on the size of the stir bar.
micromanipulator Luigs & Neumann SM-5
micromanipulator (manual) Scientifica LBM-2000-00
microscope Olympus BX51WI
microspatula Fine Science Tools 10089-11
monitor Dell 2007FPb
MultiClamp 700B Microelectrode Amplifier Molecular Devices MULTICLAMP 700B The MultiClamp 700B should include headstages, pipette holders, and a model cell.
N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), (HEPES) Sigma Aldrich H3375-25G
needle (20 gauge, 1.5 in length) Becton, Dickinson 305176
nylon filament YLI Wonder Invisible Thread 212-15-004 size 0.004. This cat. # is from Amazon.com
nylon mesh Warner Instruments Corporation 64-0198
perstaltic pump Harvard Apparatus 70-2027
Phosphocreatine di(tris) salt Sigma Aldrich P1937-1G
pipette holders Molecular Devices 1-HL-U
platinum wire World Precision PT0203
polylactic acid (PLA) filament Ultimaker RAL 9010
potassium chloride Sigma Aldrich P3911-500G
potassium gluconate Sigma Aldrich 1550001-200MG
potassium hydroxide Sigma Aldrich 60377-1KG
razor blades VWR 55411-050
roller clamp World Precision Instruments 14041
scale Mettler Toledo PM2000
scalpel handle Fine Science Tools 10004-13
slice harp Warner SHD-26GH/2
sodium bicarbonate Fisher Chemical S233-500
sodium chloride Sigma Aldrich S9888-1KG
sodium phosphate monobasic anhydrous Fisher Chemical S369-500
sodium pyruvate Fisher Chemical BP356-100
spatula VWR 82027-520
spatula/spoon, large VWR 470149-442
sterile scalpel blades Feather 72044-10
stirrer / hot plate Corning 6795-220
stopcock valves, 1-way World Precision Instruments 14054
stopcock valves, 3-way World Precision Instruments 14036
sucrose Acros Organics AC177142500
support for swivel clamps Fisher Scientific 14-679Q
surgical scissors, sharp/blunt Fine Science Tools 14001-12
syringe (1 mL) Becton, Dickinson 309659
syringe (60 mL with Luer-Lok tip) Becton, Dickinson 309653
three-pronged clamp Fisher Scientific 05-769-8Q
tissue forceps, large Fine Science Tools 11021-15
tissue forceps, small Fine Science Tools 11023-10
transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-7M
tubing Tygon E-3603 ID 1/16 inch, OD 3/16 inch
tubing Tygon R-3603 ID 1/8 inch, OD 1/4 inch
vacuum grease Dow Corning 14-635-5D
vibrating blade microtome Leica VT 1200S
vibration-dampening table with faraday cage Micro-G / TMC-ametek 2536-516-4-30PE
volumetric flask (1 L) Kimax KIM-28014-1000
volumetric flask (2 L) PYREX 65640-2000
warm water bath VWR 1209
 

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Whitebirch, A. C. Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity. J. Vis. Exp. (162), e61704, doi:10.3791/61704 (2020).

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