Summary
このプロトコルは、自発的な鋭波波リップル活性を示すマウスからの水平海馬内皮質(HEC)スライスの調製を記述する。スライスは、簡略化されたインターフェース保持室でインキュベートされ、記録は、組織の酸素化とネットワークレベルの活動の自発的な出現を促進するために、流れの速い人工脳脊髄液と水没条件下で行われます。
Abstract
急性げっ歯類の脳スライスは、電気生理学、顕微鏡法、薬理学を用いた単細胞分解能を用いた神経回路の組織と機能に関する洞察を得るための、難解な実験的アプローチを提供します。しかし、 インビトロ 実験の設計における大きな考慮事項は、異なるスライス調製物が 、生体内で 観察される神経活動の自然主義的パターンをどの程度再現するかを示す。無傷の脳では、海馬ネットワークは、覚めの完了状態または非レム睡眠中に起こる鋭波波性複合体(SRS)によって例示されるように、動物の行動状態を反映する高度に同期した集団活動を生成する。SRSおよび他の形態のネットワーク活動は、適切な条件下で孤立した海馬スライス中に自発的に出現する可能性がある。強力な脳スライスツールキットを海馬ネットワーク活動の調査に適用するためには、組織の健康と海馬ネットワーク内の機能的な接続性の維持を最適化するアプローチを利用する必要があります。マウスは、経皮的に冷たいショ糖ベースの人工脳脊髄液と浸透する。海馬を含む水平スライスは、シナプス接続性を維持するために450 μmの厚さで切断されます。スライスはインターフェイススタイルのチャンバで回復し、記録のために水没した部屋に移される。記録室はスライスの酸素化を改善するために高流量の人工脳脊髄液の二重表面の重ね合たちのために設計されている。このプロトコルは、複雑で自発的なネットワーク活動の調査に適した健康な組織 をvitroで生成します。
Introduction
生体外の生きた海馬スライスからの電気生理学的測定は、多くの利点を有する強力な実験的アプローチである。実験者は顕微鏡、マイクロマニピュレーター、および記録システムを使用して、組織内の個々のニューロンから測定値を直接可視化し、収集することができます。組織スライスは光遺伝学的、化学遺伝学的、または薬理学的実験のための光刺激または薬物送達にも非常にアクセス可能である。
海馬ネットワークは、生体内で高度に同期的な集団活動を生成し、細胞外局所的なフィールドポテンシャル1、2、3、4、5の振動として見える。脳スライス法は、これらの神経ネットワーク振動の根底にある細胞および回路メカニズムに関する洞察を得るために活用されてきた。Maierらの基礎的な研究は、鋭波波波紋成(SRS)が腹側海馬6,7のスライスに自発的に出現できることを実証した。複数の研究者からのその後の研究は、海馬8、9、10のネットワーク状態を調節する神経調節因子の役割およびvivo11での行動の間に以前に活動していた神経アンサンブルのインビトロ再活性化を促進するシナプス機構を含む、SDRの多くの側面を徐々に解明してきた。脳スライス実験はまた、ガンマ範囲振動(30〜100Hz)、記憶符号化とリコール12、13をサポートすると考えられている明確な海馬ネットワーク状態への洞察を提供している。最後に、側頭葉てんかん14,15の病態生理学における海馬および関連する構造の中心的役割を認識し、研究者は海馬スライス製剤を使用しててんかん活動の発生および伝播を調査した。Carterららは、慢性てんかん動物から調製された海馬-内皮質スライスを組み合わせることで、vitro16で自発的にてんかん放電を発生させることができることを実証した。その後、Karlócaiらは、改変されたイオン濃度(Mg2+または上昇K+)または薬物(4APまたはガバジン)17を有する改変された人工脳脊髄液(ACSF)を用いて海馬スライス中のてんかん分泌物の基礎となるメカニズムを探った。
研究者は、重要な方法で異なる多数の海馬スライスアプローチを開発しました:(1)スライスに含まれる海馬の領域(側線、中間体、または腹側);(2)内皮質などの海馬外組織の有無。(3)スライス(コロナ、矢状、水平、または斜め)をカットするために使用される方向。(4)スライス後に組織が維持される条件(ACSFに完全に沈水するか、ACSFのインターフェースで保持され、加湿された、カルボゲンが豊富な空気)。
どのスライスアプローチを使用するかを選択することは、実験目的によって決定されるべきである。例えば、水没条件下で維持された眼海馬の横方向またはコロナスライスは、海馬内回路およびシナプス可塑性18、19、20の調査に非常に有効に使用されてきた。しかし、このような調製物は、腹側海馬21、22、23からのスライスほど容易にネットワーク振動を発生させるものではない。持続的なSWR活性の状態は、背側および腹側海馬24からの横切りスライスにおけるテタニック刺激によって誘発され得るが、腹側スライス7,25において自発的なSWRがより容易に観察される。
側方海馬と腹側海馬の間に固有の生理学的および解剖学的な区別は、生体内およびインビトロ26の両方で行われる研究によって支えられている。ラットにおける記録は、側腹および中間海馬全体にわたって強く一貫したシータリズムを明らかにしたが、腹側領域と海馬27の残りの部分との間の一貫性が悪い。生体内のSRSは、裏側海馬と中間海馬の間で容易に伝播し、腹側海馬に由来するSDRはしばしば局所的な28のままである。海馬の縦軸に沿って、裏側および中間海馬に存在するCA3錐体ニューロンに由来する関連投影法。腹側領域から発生するCA3投影は比較的局所的であり、したがって、スライスプロセス29、30の間に切断される可能性が低い。したがって、腹側スライスは、人口同期を生成するために必要な繰り返しネットワークをよりよく保存する可能性があります。vitroで自発的なネットワーク活動を発生させる腹側スライスの傾向は、より多くの側側領域31と比較して、錐体ニューロンの高い固有興奮性または腹側海馬におけるGABAergic阻害の高い固有の興奮性を反映してもよい。確かに、腹側海馬のスライスは、てんかん活動32、33に対してより敏感である。したがって、自発的な生理学的8、9、11、24または病理学的16、34、35、36ネットワーク振動の多くの研究は、伝統的に、時には腹側海馬の横面に平行な組織スライスを生み出す前頭後頭方向にわずかな角度で、水平スライスアプローチを使用してきました。
スライス処理によって、スライスの多くのセルが切断されることで、ネットワーク接続が不可避的に影響を受けます。目的の回路の接続性を最適化するために、準備中に保持されるスライスと組織の角度と厚さを考慮する必要があります。多くの研究は、生理学的または病理学的ネットワーク振動の文脈で2つの構造間の相互作用を探求するために水平結合海馬-内皮質スライス(HEC)を利用しています。Rothらは、海馬のCA1サブフィールドと内側の内皮質の層Vから二重記録を行い、HECスライス37を通してSWR活性の伝播を実証した。てんかんの活動の多くの研究は、てんかんの排出がコルチコヒッポカンネットワーク16、35、36、38を介して伝播する方法を調査するためにHECスライス調製を使用しています。無傷のコルチコヒッポカンピカルループの保存は、自発的なSVR、てんかんの排出、またはガンマ振動の前提条件ではないことを注意することが重要です。ネットワーク振動は、付着した海馬組織21、22、23、25、39、40、41を伴わない、側側または腹側海馬の横切れスライスで生成することができる。海馬スライスにおけるネットワーク振動の自発的発生のためのより重要な要因は、厚いスライス(400〜550 μm)がCA2/CA3の再発ネットワーク21、22、25でより多くの接続を維持するので、各スライスの厚さである可能性があります。
角度付き水平HECスライス(前頭部後頭部方向に約12°の角度でカット)は、コルチコヒッポカンピカルループ11、16、34、35、42の機能的接続性を研究するために使用されてきたが、そのような斜めの準備は、自発的なネットワーク活動43、44、45のために必要とされない。しかし、斜めのスライス平面を使用すると、下向きまたは上向きの角度が適用されるかに応じて、研究者が腹側または中間海馬の横方向の層板を最もよく保存するスライスを選択的に作成することができます(図1)。このアプローチは、パパテオドロプロスら、2002年に使用される方法と概念的に似ており、各海馬を自由に解剖し、組織チョッパーを使用して、側腹側全軸21に沿って横切りスライスを作成した。腹側と側側中海馬の機能的な区別に照らして、研究者は実験を設計したり結果を解釈したりする際に、スライスの解剖学的起源を考慮する必要があります。スライス手順中に寒天ランプを使用することは、中間海馬または腹側海馬のいずれかからスライスを優先的に生成する簡単な方法です。
海馬スライスは、水没したチャンバー(組織がACSFに完全に浸漬された)またはインターフェイススタイルのチャンバー(例えば、オスロまたはハースチャンバー、流れる媒体の薄膜のみで覆われたスライス)のいずれかで維持することができます。インターフェースの維持は、組織の酸素化を促進し、神経細胞の生存を促進し、ニューロン間活動の持続的な高レベルを可能にする。従来、沈められた記録条件は、ネットワークレベル振動の安定した発現のために十分な組織酸素化を提供しない、より遅いACSF流量を使用する。水没した海馬スライスでは、カルバコール誘発ガンマ振動は一過性に観察されるだけであるが、それらは界面記録室10、48、49で安定的に維持することができる。このように、vitroの複雑な自発的活動の多くの研究は、鋭波波波の複合体6、7、8、9、10、25、37、ガンマ振動10、38、45、47を調査するためにインターフェース記録室に依存してきました。
水没式記録室では、浸漬顕微鏡の目的を使用して個々の細胞を可視化し、記録のために健康的な細胞を選択的にターゲットにすることができます。水没した製剤はまた、水没が組織への薬物または他の化合物の急速な拡散を促進するので、細胞ミリューを細かく制御することを可能にする。したがって、水没条件下で安定したネットワーク振動が維持される修正方法論は、強力な実験アプローチを表す。このアプローチは、組織12、48、49への酸素供給を増強するためにACSF(〜6 mL/min)の高い流量を有する改変された水没記録室に移る前に、海馬スライスが簡略化されたインターフェーススタイルの保持室で数時間回復するハホスらの働きによって例示される。これらの条件下では、高レベルのニューロン間活動と安定した自発的ネットワーク振動を、水中記録室に維持することができる。この変更アプローチにより、研究者は視覚的に誘導された全細胞パッチクランプ記録を行い、形態学的に同定された細胞タイプがカルバコール誘導ガンマ振動12に寄与することを特徴付けることを可能にする。SRS は、ACSF11、48、49の速い流量を持つ水没した海馬スライスでも自然発生する可能性があります。Maierら et al. 水没した記録室に移る前にインターフェース室で回収された海馬スライスが確実に自発的なSWRを示したのに対し、水没した記録室に移る前にビーカーに沈んだスライスは、より小さな呼び起動場応答を示し、自発的なシナプス電流のレベルが低く、自発的なSWR43を示すことはほとんどありませんでした。Schlingloffらは、この改良された方法論を用いて、自発的なSRS44の生成におけるパルブアルブミン発現バスケット細胞の役割を実証した。
次のプロトコルは、水平海馬スライス中の自発的に活動するニューロンを界面条件下で回収し、その後、薬理学的または光遺伝学的操作および視覚的に導かれた記録に適した水没記録室で維持することができるスライス法を提示する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ここで説明するすべての方法は、コロンビア大学の施設動物のケアと使用委員会によって承認されています (AC-AAAU9451).
1. ソリューションの準備
- 表1に記載されているように、スクロース切断液をスライス用に用意する。
注:1 Lのショ糖溶液を調製した後、少量(約100〜200mL)を氷トレイに凍らせます。これらの冷凍スクロースアイスキューブは氷のスラリーにブレンドされます(ステップ4.3を参照)。 - 表2に記載されているように記録するための人工脳脊髄液(ACSF)を準備する。
- 微量金属やその他の不純物を除去するために濾過された精製水の1 mLにNaClの0.05844 gを溶解することによって刺激ピペットのためのNaClの1 Mを準備する。
注: スクロース切断ソリューションと ACSF は、実験ごとに新しい準備をする必要があります。
2. 寒天ランプを準備する
- 寒天4%(例えば、50mLの水中の寒天の2g)を、微量金属やその他の不純物を除去するために濾過された精製水に寒天粉末を溶解して調製する。沸騰し始めるまで電子レンジで加熱します(約30〜60s)。溶融した寒天をカビに注ぎ、約12°の傾斜で冷蔵庫で4°Cで冷却し、固化させます。
注:金型の場合、ガラスまたはプラスチック製の容器を斜めに使用でき、十分な溶融寒天が注がれ、長さ4cm、高さ約0.8cmのランプを形成します。
3. スライス領域をステージングする
- 約250 mLのACSFでスライス回収チャンバーを含む400 mLビーカーを充填します。32°Cに温めた水浴に入れ、カルボーゲン(95%酸素ガス/5%炭酸ガス)でバブリングを開始します。
注:溶液の表面に保持室のナイロンメッシュを配置するのに十分な流体で回収ビーカーを充填し、スライスが暖かい溶液混合物と空気の界面で保持されるようにします(図1)。ナイロンメッシュに小さなレンズ紙を置きます。スライスはレンズ紙の上に置かれ、後でスライスを記録チャンバーに個別に転送するために使用できます(ステップ6.6を参照)。 - スクロース溶液を入れたフラスコをアイスバケツに入れ、冷やし、カルボーゲンで泡立ち始めます。
注:回復ビーカーとショ糖溶液は、マウスがイオブルランチャンバーに置かれる前に、少なくとも30分間カーボーゲンバブリングで、それぞれ温め、冷やされるべきです。 - 冷凍庫から事前に作られた冷凍スクロース溶液アイスキューブのトレイを引き出し、ベンチに置いて部分的に解凍します。
- きれいな両刃のカミソリの刃の半分をミクロトームに入れ、必要に応じてキャリブレーションします。解剖中に使用するためにカミソリの刃の残りの半分を脇に置きます。
- スライシングチャンバーにカルボゲンラインと温度プローブを実行し、チャンバーを冷やすために氷で囲みます。
- 2つの使い捨て可能な吸収パッドで覆われたきれいなベンチまたはテーブルを準備しなさい。左パッドにすべての解剖ツールと3枚のラボテープをレイアウトし、そこで心筋灌流を行います。
注:解剖ツールには、小さなボンハサミ、ディスセクターハサミ、大きなへら/スプーン、マイクロスパチュラ、新しいブレード付きメス、へら、シャープ/鈍い手術用ハサミ、大きな組織鉗子、小さな組織鉗子が含まれます( 材料表を参照)。 - 灌流領域の右側にある他の吸収パッドに、直径100mmガラスペトリ皿の蓋に円形の濾紙を置きます。ペトリ皿の底を蓋の隣に置き、カルボーゲンラインを皿の両方に入れます。
- かみそりの刃またはメスを使用して寒天の小さなランプ(角度付き表面に沿って約4センチ、高さ0.8cm、幅2cm)をカットします。高い端からランプの一部を切り取り、それを逆にして寒天のバッキングブロックを作成します。シアノアクリル酸接着剤を使用して、寒天ランプとバッキングブロックをスライスプラットフォームに貼り付け、脇に置きます。
注:寒天のバッキングブロックは、スライス中に脳を安定させるのに役立ち、各スライスから不要な組織を解剖する表面を提供します(図1)。
4. 心筋透析
- ショ糖切断液のリザーバとして60 mL容量シリンジを、ベンチトップより約18インチ上に吊り下げる(例えば、垂直ポストに3本のスイベルクランプを使用する)。貯留槽の底部にチューブを取り付け、ローラークランプを通してチューブを実行し、チューブのもう一方の端を清潔な20G針に接続します。
- 60 mLの貯蔵所に約30 mLの冷蔵スクロース溶液を充填し、カルボーゲンラインをスクロース貯蔵所に向けて、ペルフューザを継続的に泡立てるようにします。
注:ショ糖が閉じ込められた泡なしでチューブと針を通って流れていることを確認してください。流量は、針からスクロースを滴下する安定した、継続的な流れを持っているのに十分な速さでなければなりません。 - ブレンダーを使用して、凍ったスラリーに冷凍スクロースをつぶしてブレンドし、大きなスパチュラ/スプーンを使用してスラリーを分配します。
- ガラスペトリ皿蓋の端の周りに少量のスクロースラリーを置きます。ペトリ皿底に少量のスクローススラリーを加えます。
- 約20〜30mLのスクロースラリーを灌流液貯留層に加え、冷たい液体スクロースの30mLとよく混合し、貯水池に非常に冷たい、主に液体スクロースと残骸の凍結溶液の混合物が含まれるまで混合します。
- イオブルーラン気化器に接続されたチャンバーにマウスを置きます。約2 L/分で酸素が流れる状態で、気化器のダイアルを回してイオブルランを5%濃度で送り、タイマーを開始します。
注:スライスの過程を通して、スライスが取得される速度を測定するために、このタイマーを維持してください。この手順は、スライスが完了し、イオブルランチャンバーに入る動物の15〜20分以内に、組織がインターフェースチャンバーで回復するような、できるだけ早く行う必要があります。マウスを見て、深い麻酔の状態が確実に達成されるようにします。最低5分後、マウスは深く麻酔され、つま先のピンチに反応しないはずです。 - イゾフルランチャンバーからマウスを取り外す直前に、ペトリ皿の蓋に約3〜5mmの深さまで冷やしたスクロース溶液を充填し、ペトリ皿底部に約1.0cmの深さまで冷やしたスクロース溶液を充填します。
- マウスを左吸収パッドに素早く移し、3枚のテープを使用して前肢と尾を固定します。後肢のつまみを行い、切開が行われる前にマウスが反応しないようにします。大きな組織鉗子と手術用はさみを使用して、皮膚をテントし、胸骨の底から胸の上まで長い切開を行います。鉗子を使用して胸骨を引き上げ、はさみを使用して横隔膜を切断します。
注:マウスの初期位置と、ダイヤフラムを切断する最初のいくつかの切開は、マウスが意識を取り戻さないようにできるだけ早く行う必要があります。処置を通して十分な麻酔の深さを保障するために、鼻コーンは、灌流の間にイオブルランを提供するためにマウスに置くことができる。 - はさみを使用して両側のリブケージを切り取り、前肢が体と出会うポイントに向かって1つの大きな動きをカットします。鉗子で、リブケージの前部を頭に向かって上に振り、大きなはさみを使って水平カットで完全に取り外します。大きな鉗子を使用して心臓を所定の位置に保持し、左心室に20G灌流針を挿入します。針が正しく配置されると、冷やしたショ糖溶液が心室を満たすので、心臓の左側はすぐに青白くなります。
- 右心房に切断し、血液が循環系から流れ出るように小さなディスセクターハサミを使用してください。切開が正しく行われれば、心臓への損傷は最小限に抑えられるはずであり、灌流を通してポンピングを続けるべきである。
注:組織紙のロールアップ部分は、心臓から血液およびスクロース溶液を吸い取り、手順中に灌流針の可視性を維持するために使用することができます。 - 灌流針が所定の位置に留まり、左心室から落ちないようにしてください。適切な流量と配置により、肝臓は20〜30 sの薄い日焼け/ベージュ色に青ざめ始めます。
- 30~45sの後、大きなはさみを使ってマウスの首を切ります。左手に頭を持ち、頭蓋骨から皮膚を押したり剥がしたりします。よく浸透した動物では、頭蓋骨は非常に青白く、脳ははっきりと見える血管なしで頭蓋骨を通して非常に薄いピンク色(白に近づく)に見えるはずです。
5. 脳を抽出し、スライスをカット
- 小さなボンハサミを使用して、目の近くの頭蓋骨の前部の正中線に向かって頭蓋骨を横切り2回カットします。頭蓋骨のベースの両側に2つの追加のカットを行います。
- ガラスペトリ皿の底に頭を移し、冷やしたスクロース溶液に浸す必要があります。小さなボンハサミを使用して頭蓋骨の長さに沿って正中線を切り取り、はさみで引き上げて脳組織の損傷を最小限に抑えます。小さなティッシュ鉗子を使って、頭蓋骨の両側をしっかりとつかみ、本を開くような脳から上下に振り回す。
- 左手の指を使って頭蓋骨のフラップを開いたままにし、嗅球の近くの脳の下にマイクロスパチュラを挿入します。頭蓋骨からスクロースに脳を反転し、脳幹を切断するためにマイクロスパチュラを使用しています。脳を洗って、残った血液、毛皮、または他の組織を取り除きます。
- 大きなへら/スプーンを使用して、ガラスペトリ皿の蓋に脳を移します。両刃のカミソリブレードの残りの半分は、以前に脇に置いて、最初に小脳を取り除くために2つのコロナカットを行い、次に嗅球を含む脳の最も前部を取り除きます(図1)。
- 寒天ランプにシアノアクリル酸接着剤を塗布します。非常に簡単に大きな組織鉗子を使用して乾燥したフィルターペーパーの一部に脳を置き、すぐに寒天ランプに移し、脳の腹側表面を接着剤に置きます。
注:中間海馬のスライスの場合、脳は前部がランプの斜面を向き、後部がブレードに近い方向に向ける必要があります。腹側海馬のスライスの場合、前端がランプの斜面を指し示し、後端をランプの上部に、ブレードから遠ざけて脳を向けます。いずれの場合も、脳の上部に脳を配置し、脳のコロナカット面が寒天バッキングブロックに接触するようにする必要があります(図1)。 - 寒天と脳を持つスライスプラットフォームをミクロトームのスライスチャンバーに入れ、冷やしたスクロース溶液で完全に浸します。大きなスパチュラ/スプーンを使用してショ糖スラリーをチャンバーに移し、攪拌して冷凍スクロースを溶かし、混合物の温度を1〜2°Cに急速に下げます。
注:スライス全体の温度計を確認してください。スクロース溶液が3°C以上に温まった場合は、スラリーを加えて混ぜて温度を下げます。 - マイクロトーム速度を0.07mm/sに設定して、厚さ450μmのスライスをカットします。各スライスが解放されると、小さな組織鉗子と鋭いメスを使用して最初に2つの半球を分離し、次にスライスが主に海馬領域と海馬部領域からなるまで組織を切り取る(図1)。
- プラスチックトランスファーピペットを使用して、スライスをインターフェイス回復チャンバに個別に転送し、ACSFのインターフェースと、スライスを覆うACSFの薄い半月板だけで空気に配置されるようにします。チャンバーの蓋をしっかりと閉じ、スライスを32°Cで30分間回収します。
- 32°Cでの最初の回復の後、水浴からインターフェース回復チャンバーを持って来て、磁気攪拌棒がチャンバー内のACSFの循環を促進するように遅い速度に設定された攪拌機の上に置きます。スライスがさらに90分間回復するにつれて、徐々に室温まで冷却します。回復チャンバーが継続的にカルボーゲンで泡立ち、大きな泡がスライスの下に閉じ込められることを許可しないことを確認してください。
6. 自発的な活動の局所的なフィールド電位(LFP)の記録を行う
- 取得ソフトウェアを実行しているコンピュータ、コンピュータに接続されたモニタ、刺激装置、マイクロマニピュレータ、温度コントローラ、顕微鏡光源、顕微鏡取り付けカメラ、マイクロ電極アンプ、デジタイザ、およびペリスタリックポンプを含むすべての必要な機器をオンにしてLFP記録の準備をします。中央真空システムを使用する場合は、壁弁を開いて、記録チャンバからACSFを除去する真空ラインを準備します。
- 加熱された貯留層をACSFで満たし、バブリングACSFを含む400 mLビーカーにチューブの一端を置きます。蠕動ポンプをオンにして、ACSFを400 mLビーカーから加熱された貯水池に向け、リザーバーから記録室に向けます。チューブをタップまたはピンチして、閉じ込められた泡を解放します。
- 蠕動ポンプを調整して、記録チャンバーを通るACSFの流量が速い(~8~10 mL/min)ことを確認します。温度プローブを使用して、記録チャンバの中央にACSFが32°Cであることを確認します。
注: ACSF が蠕動ポンプを使用して記録チャンバに配信される場合、流量が高いと、流量が著しい変動を招く可能性があります。一貫した流速は、チューブに統合された一連の空のシリンジからなる単純な脈動ダンパーを使用して達成することができる(図2)。 - 加熱フィラメントプーラーを使用して、ホウケイ酸ガラス毛細血管からの刺激と記録ピペットを準備します。プーラープロトコルは、刺激または局所電界電位記録電極用に2-3 MOhmの抵抗を持つピペットを得るように構成する必要があります。
- 刺激ピペットを1 M NaClとLFPピペットにACSFで充填します。
- 配管を短時間クランプし、ポンプをオフにして ACSF のフローを一時停止します。細かい鉗子を使ってスライスをレンズ紙の角をつかみ、スライスがレンズ紙に貼り付けます。レンズペーパーとスライスを記録室に入れ、スライスを下にして、レンズ紙を「皮をむく」し、スライスを記録室に沈めたままにします。ハープを使用してスライスを固定します。
注:ハープは、ステンレス鋼またはプラチナと細かいナイロンフィラメントのU字型の部分を使用して、事前に作られたか、またはラボで作られています。 - 手動マイクロマニピュレータにNaClで満たされた刺激ピペットを入れ、ピペットの先端をスライスの表面(例えば、 地層ラジタム 層)に約30〜45°の角度でゆっくりと進めます。ピペットの先端が組織に入ったら、ピペットをゆっくりと前進させ、スライス内の軸索を不必要に損傷する可能性のある横方向または垂直方向の大きな動きを控えます。スライス中に損傷した表面近くの細胞を避けるために、ピペットの先端をスライスの深さ50~100μm以上に入れる。
- ACSFで満たされたLFPピペットを電動マイクロマニピュレータに取り付けたピペットホルダーに入れ、下さい。口の圧力またはストップコック弁を介して接続された1 mLのシリンジを使用して非常に軽い正圧を適用し、管の短い長さをピペットホルダーに適用します。
注:興味の信号を記録するためにスライス内にLFPピペットを配置する:鋭波波波の場合、1つのLFPピペットは、層ピラミッド(SP)と層ラジタム(SR)の第2ピペットに配置する必要があります。この構成により、SRの負の鋭波とSPの高周波リップル振動の同時記録が可能になります(図3)。 - マイクロマニピュレータを使用すると、約30〜45°の角度で、LFPピペットの先端を対象領域(CA1ピラミッド型セル層など)にゆっくりと進めます。スライス中に損傷した表面近くの細胞を避けるために、ピペットの先端をスライスの深さ50~100μm以上に入れる。LFPピペットを進めながら、取得ソフトウェアを使用して小さな電圧テストパルスを継続的に供給し、電極抵抗の急激な増加を監視します。これは、ピペットが詰まったり、細胞に押し付けられたりしたことを示している可能性があります。
- LFPピペットが対象領域に配置されたら、ピペットホルダーに取り付けられたチューブのバルブを開けて、慎重に正圧を放出します。
- LFPを2番目の場所に同時に記録するには、ステップ6.8~6.10を2番目のピペットとマイクロマニピュレータで繰り返します。
- 現在のクランプ構成のマイクロ電極アンプを使用して、取得ソフトウェアでブリッジバランス機能を使用してピペットの直列抵抗を補正した後、局所的なフィールドポテンシャルで自発的な活動を記録します。自発的なSRはSP層の細胞外電位に正の偏向として現れる(図3)。
- 呼び起こされる電位を記録するために、デジタイザに接続された刺激装置を使用して、NaClで満たされた刺激ピペットを通して短い(200 us)の方形電圧パルスを供給します。刺激電圧ダイヤルを調整して、応答振幅の範囲を呼び起こします。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ここでは、このプロトコルで説明したように準備されたHECスライスからの代表的な録音を示します。インターフェース保持室(図1C)での回復後、スライスは水没した記録室に個別に移される(図2B)。記録チャンバには、蠕動ポンプを用いてカルボゲン飽和ACSFが供給される(図2A)。ポンプは最初に保持ビーカーから熱い貯蔵所にACSFを引き出す。カルボーゲンラインは、メディアの連続酸素化を提供するために、保持ビーカーと加熱された貯蔵所の両方に配置されます。一連の空気充填シリンジからなる脈動ダンパーは、蠕動ポンプと記録室の間に位置し、急速な蠕動によって生成される流量の変動を最小限に抑える。各シリンジ中のエアポケットは、ポンプの各サイクルによって引き起こされる圧力の変化を吸収し、記録チャンバーがACSF52,53のスムーズで一貫した流れを受け取るようにする。脈動の湿器の後に置かれるインラインヒーターは記録の部屋に入るACSFの温度が32°Cで保持されることを保障する。
この例では、二重表面の重合記録室は3つの3Dプリント層で構成されています(図2B)。底の層は真空グリースで固定されたカバースリップに合うために長方形の切り抜きを有する。中間層は、2つの水平支持を有する細長い楕円形の部屋の下半分を含んでいる。ナイロンフィラメントは、これらのサポート(およそ0.5mmごく一つ)に張られ、シアノアクリル酸接着剤で固定されています。スライスは、この張られたフィラメントの上に置きます。最上層には、楕円形の部屋の上半分と、塩化銀の地盤ペレットを配置できる小さな井戸が含まれています。チャンバの細長い楕円形はACSFの速い層流を促進するように設計されている。
図3 は、このプロトコルに従って準備されたHECスライスからの代表的な記録を示しています。最初にスライスの健康状態を評価するために、NaClの1 Mで満たされたピペットを使用して、フィールドポストナプティクスポテンシャル(fPSP)が 地層放射状 (SR)で呼び起こされます。健全なスライスでは、電気刺激は、小さなシナプス前繊維ボレーと急速な初期降下を有する大きな心内症電位を有するfPSPを生成すべきである(図3B、左上)。健全なスライスでは、自然の鋭波波波波(SRS)は 、角層ピラミッド のLFPで正の偏向として見えます(図3B、左下)。最適でないスライスでは、fPSPsが大きな繊維のボレーと比較的小さなポストナプティクス電位を示し、そのようなスライスは自発的なSRSを示さない(図3B、右)。 SR in vitro は、公開された説明と一致する特性を示す:SR層における負のフィールド電位と組み合わせた高周波振動を有するSP層における正のフィールドポテンシャル(図3C)。CA2 に記録された単一の SWR は、アスタリスク (図 3C、右) で示されます。HEC スライスの SRS は CA2/CA3 の再電流回路内で発生し、CA1 に伝搬します。CA2 および CA1 SP 層で観測された単一の SWR は、アスタリスクで示されます (図 3D、 右)。この代表的な例では、CA2 SWR(緑)は、各領域で記録されたSWRエンベロープ(2~30 Hzでフィルタリング)のオーバーレイに示すように、数ミリ秒でCA1(青)に導きます。
図1:水平斜角海馬内皮質(HEC)スライスの調製.(A)(i)脳を抽出した後、カミソリの刃で2つのコロナカットを行い、脳の後部と前部を取り除く。(ii)寒天ランプはミクロトームスライスプラットフォームに接着された2つの斜めの部分で形成される。中間海馬のスライスを準備するには、脳ブロックを寒天ランプに置き、前表面が斜面を上に向け、ランプの背部の高い後ろ盾部分に接触します。より多くの腹側海馬のスライスを準備するには、後部切断面がランプの背の高いバッキング部分に接触するように、脳ブロックを前サーフェスが斜面を下に向けて寒天ランプに置きます。(iii)各スライスが解放されると、メスでさらにいくつかのカットを行い、半球を分離し、不要な組織を取り除きます。(B) DAPI によって標識された細胞核を有する結果のスライスの代表的な画像。(C)界面回復室では、スライスは、ACSFの表面とレベル、ステンレス鋼またはナイロンメッシュの上にレンズ紙の部分に配置されます。セラミックバブラーはカルボーゲンをチャンバーに運び、磁気スターバーはチャンバー内の流体を絶えず混合します。ACSFの薄膜は、チャンバーの湿気のあるカルボーゲン豊富な空気からの酸素の拡散を高めるスライスの上面をカバーしています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ACSF送達チューブに脈動ダンパーを備えたデュアル表面超灌流記録室。(A)スーパーフュージョンシステムの図。ACSFは32°Cに温め、常にカルボーゲンガスで泡立ち、一連の空気充填シリンジからなる脈動ダンパー付きの蠕動ポンプを使用して約8〜10 mL/minで送達されます。(B)記録室は3Dプリント層で構成され、その中央にはナイロンフィラメントが張り付いています。スライスは、この張られたフィラメントの上に置き、ACSFは組織の上下に流れます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:HECスライスからの自発的な鋭波波波の代表的な記録。(A)記録電極と刺激電極の位置を示すHECスライスの簡略図である。(B) アクティブで健康的なスライスと最適でないスライスの両方からのLFPアクティビティの代表的な記録。健全なスライス(左、緑)は、SP層の局所的なフィールド電位に不規則に発生する正の偏向として見える、大きな呼び起動されたフィールド応答および自発的な鋭波波(SRS)を示す。対照的に、不健康なスライスは、小さな呼び起こされるフィールド応答と自発的な活動を示さない(右、灰色)。(C)CA2領域におけるSRの代表的な記録は、SR層におけるLFPにおける負の偏向と、SP層におけるLFPにおける下層的な正の偏向を有する高周波振動からなる。各チャンネルのピークは、信号振幅の標準偏差が3つよりも大きい場合は赤色でハイライト表示されます。2~30 Hzのバンドパスフィルタは、SP層とSR層の鋭波の元になる正と負のエンベロープをそれぞれ分離し、80~250 Hzのバンドパスフィルタを使用してSP層のリップルの高周波振動を分離します。(D)インビトロのSRS は CA2/CA3 から CA1 に伝播する。これらの代表的な録音では、CA2 (緑、下) の SRS は CA1 (青、上) の数ミリ秒の前に置きます。各チャンネルのピークは、信号振幅の標準偏差が3つよりも大きい場合は赤色でハイライト表示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 分子量 (グラム / モル) | 最終濃度 (mM) | グラム / 1 L スクロース切断溶液 | ||
| ショ糖 | C12H22O11 | 342.3 | 195 | 66.749 |
| 塩化ナトリウム | 塩化 ナトリウム | 58.44 | 10 | 0.584 |
| グルコース | C6H12O6 | 180.08 | 10 | 1.801 |
| 炭酸水素ナトリウム | ナフコ3 | 84.01 | 25 | 2.1 |
| 塩化カリウム | Kcl | 74.55 | 2.5 | 0.186 |
| リン酸ナトリウム単塩基無水 | NaH2PO4 | 137.99 | 1.25 | 0.173 |
| ピルビン酸ナトリウム | C3H3NaO3 | 110.04 | 2 | 0.22 |
| 在庫集中(M) | 最終濃度 (mM) | ミリリットル/ 1Lスクロース切断液 | ||
| 塩化カルシウム | CaCl2 | 1 | 0.5 | 0.5 |
| 塩化マグネシウム | MgCl2 | 1 | 7 | 7 |
表1:スクロース切断液の組成。 微量金属やその他の不純物を除去するために濾過された精製水の約0.75 Lから始めます。各固体を溶解しながら、溶液を磁気攪拌棒で混合します。すべての固形物が溶解したら、10分間溶液を通して気泡カルボーゲンガス。MgCl2 とCaCl2 溶液を加え、水を加えて総体積を1 Lにし、10分間磁気攪拌棒と混ぜて溶液が均一に混合されるようにします。オスモルの大きさは315~325mOsmで、pHは約7.4です。
| 分子量 (グラム / モル) | 最終濃度 (mM) | グラム / 2L ACSF | ||
| 塩化ナトリウム | 塩化 ナトリウム | 58.44 | 125 | 14.61 |
| グルコース | C6H12O6 | 180.08 | 12.5 | 4.502 |
| 炭酸水素ナトリウム | ナフコ3 | 84.01 | 25 | 4.201 |
| 塩化カリウム | Kcl | 74.55 | 3.5 | 0.522 |
| リン酸ナトリウム単塩基無水 | NaH2PO4 | 137.99 | 1.25 | 0.345 |
| アスコルビン酸 | C6H8O6 | 176.12 | 1 | 0.352 |
| ピルビン酸ナトリウム | C3H3NaO3 | 110.04 | 3 | 0.66 |
| 在庫集中(M) | 最終濃度 (mM) | ミリリットル / 2L ACSF | ||
| 塩化カルシウム | CaCl2 | 1 | 1.6 | 3.2 |
| 塩化マグネシウム | MgCl2 | 1 | 1.2 | 2.4 |
表2:人工脳脊髄液の組成 微量金属やその他の不純物を除去するために濾過された精製水の約1.5 Lから始めます。各固体を溶解しながら、溶液を磁気攪拌棒で混合します。すべての固形物が溶解したら、10分間溶液を通して気泡カルボーゲンガス。MgCl2 とCaCl2 溶液を加え、水を加えて総容積を2 Lにし、10分間磁気攪拌棒と混ぜて溶液が均一に混合されるようにします。オスモルの大きさは315~325mOsmで、pHは約7.4です。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
組織の健康を促進し、自発的な自然主義的なネットワーク活動の出現を支持するように設計されたこのスライスプロトコルにはいくつかのステップがあります:マウスは、チルドショ糖切断溶液で経皮的に浸透しています。水平内膜皮質(HEC)スライスは、中間または腹側海馬から450μmの厚さで切断されます。スライスは、温めたACSFのインターフェースで回復し、加湿された、カルボゲンが豊富な空気。録音中にスライスは32 °Cに温められたACSFと過重され、水没した記録室の二重表面のスーパーフュージョンとの速い流量で提供される。
スライスの健康は、インビトロでのネットワーク振動の生成にとって最も重要です。若い動物はより健康的なスライスを生み出し、一般的に若年性マウスまたは思春期のマウスでは、心筋灌流ステップをスキップすることができる。動物が老化するにつれて、健康的なスライスを作ることはますます困難になりますが、一部の調査(疾患モデルや縦断研究など)は、成人または老化した動物の使用を必要とします。例えば、ピロカルピン処理慢性てんかん成体マウス50からのHECスライスの調製に経心面灌流を用いた。成体マウスでは、冷やされたスクロース切断液を用いた経心的灌流を行って組織を冷却し、脳から血液をクリアし、頭蓋骨51から脳を除去する前に代謝活性を低下させるのが有益である。しかし、心筋灌流は訓練を正しく行う必要があり、動物の福祉にリスクを及ぼすものではない方法で迅速かつ確実に処置が行われないように注意する必要があることに注意することが重要です。可能な場合、実験は、心筋灌流の使用を妨げるために若い動物を使用するように設計されるべきです。最適でないスライスの準備では、進行中のネットワーク振動をサポートするのに十分な健康な細胞、特にインターニューロンはありません。実験中にスライスの健全性を評価するには、最初に誘発された電位を記録することが有用です(例えば、刺激ピペットと、地層ラジタム、SRの記録ピペットを使用)。健全なスライスでは、SR層の刺激は、比較的小さなシナプス前繊維ボレーを有する大きな電界のポストナプティック電位(fPSP)を呼び起こすだろう(図3)。
このプロトコルによって作り出されるスライスは斜めの海馬内皮質(HEC)スライスである。重要なことに、海馬のスライスがSDRなどのネットワーク活動を自発的に生成するためには、海馬組織を含めることも斜めの切り傷も必要ではない。実際、多くの研究は、生理学的25、40、41、44または病理学的ネットワーク振動33、38の側面を尋問するために水平または横海馬スライスを利用している。このプロトコルでは、寒天ランプへの脳の配置は、実験者が選択的に腹側または中間海馬(図1)のいずれかからより多くのスライスを生成することを可能にするが、これは海馬26,31の縦軸に沿って存在する機能的異質性を考慮に入れる実験目的にとって有益である可能性がある。スライスの解剖学的起源が因子でない場合、寒天ランプを除外することができ、真の水平切断面は中対腹管海馬のスライスを生み出す。各水平組織スライスが解放されると、スライスのほとんどの余分な部分は、海馬と海馬部を含むいくつかの周囲の組織を含む大まかに長方形のスライスを残して、3つの簡単なカットで除去することができます(図1)。さらに解剖を行ってすべての海馬外組織を除去することができるが、周囲の組織を含めることは有益であり、スライスハープはナイロンフィラメントが海馬全体に適切に残らないように容易に配置することができるという点で有益である。上で説明したように、結合されたHECスライスはまた、生理学的37、35、36、38ネットワーク振動の文脈でより大きなコルチコヒッポカンスネットワークを調査するための有用な調製物である。
このプロトコルの重要な要因は、回復段階と記録中の両方で、組織への酸素供給を最適化することです。ネットワーク振動の多くの研究は、マイクロトームからインターフェイス記録チャンバに直接転送され、新鮮なACSFの継続的な灌流で回復することを可能にするスライスで行われます。数時間の回復の後、録音は同じインターフェイスの部屋で行うことができる。したがって、実験の全期間、ACSFと湿気の多いカルボーゲン豊富な空気の界面でスライスが保持されます。このプロトコルで提示される代替方法論では、スライスは、個々のスライスが十分に速いACSF流量の水没した様式の記録室に移される前に、少なくとも2時間、インターフェイススタイルの保持室で回復する。これらの条件下で調製されたスライスは、安定したガンマ振動12または自発的なSWR活性43を示すことができる。インターフェーススタイルの保持室におけるスライス回復は重要なステップである:Maierら.は、ACSFに完全に沈んだビーカーで回復するスライスは、より小さな呼び起動フィールド電位を示し、より頻繁に自発的なポストナプティック電流を示し、自発的なネットワーク活動43を生成することはめったにありません。同様に、Hájosら. 速い ACSF 流速が自然抑制性のポストナプティック電流のより高い頻度をもたらすことを実証し、改善されたニューロン間活動を示唆する49.記録期間中、二重表面の重ね合いは厳密に必要ではなく、記録チャンバーが高速流速(少なくとも6mL/min)43で送達される比較的少量のACSFを保持する場合。このプロトコルで提示された3Dプリント記録室(図2B)は、比較的費用対効果が高く、簡単なオプションですが、より小さなボリュームを保持したり、メディアの層流を促進したり、二面面の重ね合わせ(例えば、ACSFの余分なデッドボリュームを可能にする)を提供するように設計された市販の水没記録室もあります。
このプロトコルは、従来のインターフェイス記録室の要件なしにネットワークの振動を記録することができますが、いくつかの制限があります。スライスは回復期間中にACSF-airインターフェイスに保持されますが、従来のハース様式のインターフェース記録室で発生する新鮮なメディアの継続的な灌流を受け取りません。スライスは、回復チャンバーから水没記録室に個別に(ファイン鉗子を使用して)移送する必要があります。さらに、高速流速は、ACSFが蠕動ポンプで提供される場合は特に、一部の記録で不安定性および動きのアーティファクトを問題にする可能性があります。速い流動速度を維持し、機械の乱れを最小にするために、単純な脈動の湿器は潅流システムに統合することができる(図2)。この拍動減衰器は、Windkesselエフェクト52を用いて動作し、空のシリンジが弾性リザーバとして機能するエアポケットを含み、蠕動ポンプ53のローラーによって発生する変動圧力を吸収する。しかし、パルスダンパーを組み込むことで、ACSFを記録チャンバーに送り込むチューブに長さを加え、スライスへの酸素供給に影響を与えることができます。流量は安定したネットワーク振動を生み出すために必要なだけ速くするべきであり、蠕動ポンプが使用されるならば、それは理想的には蠕動性によって引き起こされる脈動を最小にし、脈動ダンパーの使用を妨げ、そしてACSFを引き出す管が可能な限り短い記録場に確実にする多数のローラー(>12)を使用するポンプであるべきである。高速流速で行われる記録はまた、大量のACSFを必要とし、実験が貴重な薬物または化合物をメディアに添加する必要がある場合に問題となる可能性があります。二重表面のスーパーフュージョンチャンバーは、スライスの両側に酸素化された媒体を送達するために2つの流体入口を備えた特別に構築された記録室を必要とするが、自発的なネットワーク振動は、適度なACSF流量48で観察することができる。このプロトコルは、高速流量(脈動ダンパーで安定化)と二面重表面の重ね合わチャンバーの両方を利用して、自発的な活動を観察する可能性を向上させます。
最後に、このプロトコルは、動物ごとのスライスの数に関して低収率を有する。450 μm の厚さの水平スライスは、好ましい方向で少数の HEC スライスを生成します (スライスは海馬の横軸に効果的に平行です)。これらのスライスのうち、通常、海馬1つにつき1つまたは2つだけが自発的なSWR活性を示し、他の43よりも少ない。厚いスライスは、おそらく再発接続の大きな程度を含んでいるが、わずかに薄いスライス(400 μm)を切断すると、SWR活性を有する横方向のスライスのマウス当たりの数が多くなる可能性があります。さらに、複数のスライスが確実に自発的なSWR活性を示す可能性は、腹側海馬の真の水平または下向きの斜めのスライスを利用する実験において高い可能性がある。現在のプロトコルは、中間海馬の上向きの斜めの水平スライスの使用を組み込み、腹側海馬25、26、31からのスライスと比較して自発的なネットワーク活動を示す可能性が低いかもしれない。最後に、このプロトコルは、思春期および成人マウスからのスライスを使用しました。心筋透析は古い動物からのスライスの質を向上させることができるが、若い動物12、41、44からのスライスを使用することによって自発的なネットワーク活動を観察する可能性が向上する可能性がある。
要約すると、このプロトコルは、鋭波波波動複合体の形で複雑な自発的なネットワーク活動を示すことができる中間または腹側海馬形成から斜めの海馬内皮質スライスを生み出すマウス脳スライスアプローチを提示する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者はスティーブ・ジーゲルバウムのサポートに感謝したいと思います。資金は5R01NS106983-02と1 F31 NS113466-01によって提供されます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Lulzbot | LulzBot TAZ 6 | |
| Acute brain slice incubation holder | NIH 3D Print Exchange | 3DPX-001623 | Designed by ChiaMing Lee, available at https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623 |
| Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma Aldrich | A9187-500MG | |
| Ag-Cl ground pellets | Warner | 64-1309, (E205) | |
| agar | Becton, Dickinson | 214530-500g | |
| ascorbic acid | Alfa Aesar | 36237 | |
| beaker (250 mL) | Kimax | 14000-250 | |
| beaker (400 mL) | Kimax | 14000-400 | |
| biocytin | Sigma Aldrich | B4261 | |
| blender | Oster | BRLY07-B00-NP0 | |
| Bonn scissors, small | becton, Dickinson | 14184-09 | |
| borosilicate glass capillaries with filament (O.D. 1.5 mm, I.D. 0.86 mm, length 10 cm) | Sutter Instruments | BF150-86-10HP | Fire polished capillaries are preferable. |
| calcium chloride solution (1 M) | G-Biosciences | R040 | |
| camera | Olympus | OLY-150 | |
| compressed carbogen gas (95% oxygen / 5% carbon dioxide) | Airgas | X02OX95C2003102 | |
| compressed oxygen | Airgas | OX 200 | |
| constant voltage isolated stimulator | Digitimer Ltd. | DS2A-Mk.II | |
| coverslips (22x50 mm) | VWR | 16004-314 | |
| cyanoacrylate adhesive | Krazy Glue | KG925 | Ideally use the brush-on form for precision |
| data acquisition software | Axograph | N/A | Any equivalent software (e.g. pClamp) would work. |
| Dell Precision T1500 Tower Workstation Desktop | Dell | N/A | Catalog number will depend on specific computer - any computer will work as long as it can run electrophysiology acquisition software. |
| Digidata 1440A | Molecular Devices | 1-2950-0367 | |
| digital timer | VWR | 62344-641 | 4-channel Traceable timer |
| disposable absorbant pads | VWR | 56616-018 | |
| dissector scissors | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| double-edge razor blades | Personna | BP9020 | |
| dual automatic temperature controller | Warner Instrument Corporation | TC-344B | |
| dual-surface or laminar-flow optimized recording chamber | N/A | N/A | The chamber presented in this protocol is custom made. A commercial equivalent would be the RC-27L from Warner Instruments. |
| equipment rack | Automate Scientific | FR-EQ70" | A rack is not strictly necessary but useful for organizing electrophysiology |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethyiether)- N,N,N',N'-teetraacetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | 324626-25GM | |
| filter paper | Whatman | 1004 070 | |
| fine scale | Mettler Toledo | XS204DR | |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| glass petri dish (100 x 15 mm) | Corning | 3160-101 | |
| glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G8877-250MG | |
| ice buckets | Sigma Aldrich | BAM168072002-1EA | |
| isoflurane vaporizer | General Anesthetic Services | Tec 3 | |
| lab tape | Fisher Scientific | 15-901-10R | |
| lens paper | Fisher Scientific | 11-996 | |
| light source | Olympus | TH4-100 | |
| magnesium chloride solution (1 M) | Quality Biological | 351-033-721EA | |
| magnetic stir bars | Fisher Scientific | 14-513-56 | Catalog number will be dependent on the size of the stir bar. |
| micromanipulator | Luigs & Neumann | SM-5 | |
| micromanipulator (manual) | Scientifica | LBM-2000-00 | |
| microscope | Olympus | BX51WI | |
| microspatula | Fine Science Tools | 10089-11 | |
| monitor | Dell | 2007FPb | |
| MultiClamp 700B Microelectrode Amplifier | Molecular Devices | MULTICLAMP 700B | The MultiClamp 700B should include headstages, pipette holders, and a model cell. |
| N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), (HEPES) | Sigma Aldrich | H3375-25G | |
| needle (20 gauge, 1.5 in length) | Becton, Dickinson | 305176 | |
| nylon filament | YLI Wonder Invisible Thread | 212-15-004 | size 0.004. This cat. # is from Amazon.com |
| nylon mesh | Warner Instruments Corporation | 64-0198 | |
| perstaltic pump | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
| Phosphocreatine di(tris) salt | Sigma Aldrich | P1937-1G | |
| pipette holders | Molecular Devices | 1-HL-U | |
| platinum wire | World Precision | PT0203 | |
| polylactic acid (PLA) filament | Ultimaker | RAL 9010 | |
| potassium chloride | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| potassium gluconate | Sigma Aldrich | 1550001-200MG | |
| potassium hydroxide | Sigma Aldrich | 60377-1KG | |
| razor blades | VWR | 55411-050 | |
| roller clamp | World Precision Instruments | 14041 | |
| scale | Mettler Toledo | PM2000 | |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| slice harp | Warner | SHD-26GH/2 | |
| sodium bicarbonate | Fisher Chemical | S233-500 | |
| sodium chloride | Sigma Aldrich | S9888-1KG | |
| sodium phosphate monobasic anhydrous | Fisher Chemical | S369-500 | |
| sodium pyruvate | Fisher Chemical | BP356-100 | |
| spatula | VWR | 82027-520 | |
| spatula/spoon, large | VWR | 470149-442 | |
| sterile scalpel blades | Feather | 72044-10 | |
| stirrer / hot plate | Corning | 6795-220 | |
| stopcock valves, 1-way | World Precision Instruments | 14054 | |
| stopcock valves, 3-way | World Precision Instruments | 14036 | |
| sucrose | Acros Organics | AC177142500 | |
| support for swivel clamps | Fisher Scientific | 14-679Q | |
| surgical scissors, sharp/blunt | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| syringe (1 mL) | Becton, Dickinson | 309659 | |
| syringe (60 mL with Luer-Lok tip) | Becton, Dickinson | 309653 | |
| three-pronged clamp | Fisher Scientific | 05-769-8Q | |
| tissue forceps, large | Fine Science Tools | 11021-15 | |
| tissue forceps, small | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| tubing | Tygon | E-3603 | ID 1/16 inch, OD 3/16 inch |
| tubing | Tygon | R-3603 | ID 1/8 inch, OD 1/4 inch |
| vacuum grease | Dow Corning | 14-635-5D | |
| vibrating blade microtome | Leica | VT 1200S | |
| vibration-dampening table with faraday cage | Micro-G / TMC-ametek | 2536-516-4-30PE | |
| volumetric flask (1 L) | Kimax | KIM-28014-1000 | |
| volumetric flask (2 L) | PYREX | 65640-2000 | |
| warm water bath | VWR | 1209 |
References
- Buzsáki, G., Lai-Wo, S., Vanderwolf, C. H. Cellular bases of hippocampal EEG in the behaving rat. Brain Research Reviews. 6, 139-171 (1983).
- Buzsáki, G. Hippocampal sharp waves: Their origin and significance. Brain Research. 398, 242-253 (1986).
- Buzsáki, G., Horváth, Z., Urioste, R., Hetke, J., Wise, K.
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents — EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews Neuroscience. 13, 407-420 (2012).
- Buzsáki, G. Hippocampal sharp wave-ripple: A cognitive biomarker for episodic memory and planning. Hippocampus. 25, 1073 (2015).
- Maier, N., et al. Reduction of high-frequency network oscillations (ripples) and pathological network discharges in hippocampal slices from connexin 36-deficient mice. Journal of Physiology. 541, 521-528 (2002).
- Maier, N., Nimmrich, V., Draguhn, A. Cellular and network mechanisms underlying spontaneous sharp wave-ripple complexes in mouse hippocampal slices. Journal of Physiology. 550, 873-887 (2003).
- ul Haq, R., et al. Adrenergic modulation of sharp wave-ripple activity in rat hippocampal slices. Hippocampus. 22, 516-533 (2012).
- ul Haq, R., et al. Serotonin dependent masking of hippocampal sharp wave ripples. Neuropharmacology. 101, 188-203 (2016).
- Maier, P., Kaiser, M. E., Grinevich, V., Draguhn, A., Both, M. Differential effects of oxytocin on mouse hippocampal oscillations in vitro. European Journal of Neuroscience. 44, 2885-2898 (2016).
- Mizunuma, M., et al. Unbalanced excitability underlies offline reactivation of behaviorally activated neurons. Nature Neuroscience. 17, 503-505 (2014).
- Hájos, N., et al. Spike timing of distinct types of GABAergic interneuron during hippocampal gamma oscillations in vitro. Journal of Neuroscience. 24, 9127-9137 (2004).
- Geschwill, P., et al. Synchronicity of excitatory inputs drives hippocampal networks to distinct oscillatory patterns. Hippocampus. , (2020).
- Rutecki, P. A., Grossmann, R. G., Armstrong, D., Irish-Loewen, S. Electrophysiological connections between the hippocampus and entorhinal cortex in patients with complex partial seizures. Journal of Neurosurgery. 70, 667-675 (1989).
- Lothman, E. W., Bertram, E. H., Stringer, J. L.
- Carter, D. S., Deshpande, L. S., Rafiq, A., Sombati, S., Delorenzo, R. J. Characterization of spontaneous recurrent epileptiform discharges in hippocampal - cortical slices prepared from chronic epileptic animals. Seizure: European Journal of Epilepsy. 20, 218-224 (2011).
- Karlócai, M. R., et al. Physiological sharp wave-ripples and interictal events in vitro: What's the difference. Brain. 137, 463-485 (2014).
- Leroy, F., et al. Input-timing-dependent plasticity in the hippocampal CA2 region and its potential role in social memory. Neuron. 95, 1089-1102 (2017).
- Sun, Q., et al. Proximodistal heterogeneity of hippocampal CA3 pyramidal neuron intrinsic properties, connectivity, and reactivation during memory recall. Neuron. 95, 656-672 (2017).
- Masurkar, A. V., et al. Medial and lateral entorhinal cortex differentially excite deep versus superficial CA1 pyramidal neurons. Cell Reports. 18, 1-13 (2017).
- Papatheodoropoulos, C., Kostopoulos, G. Spontaneous, low frequency (∼2-3 Hz) field activity generated in rat ventral hippocampal slices perfused with normal medium. Brain Research Bulletin. 57, 187-193 (2002).
- Papatheodoropoulos, C., Kostopoulos, G. Spontaneous GABAA-dependent synchronous periodic activity in adult rat ventral hippocampal slices. Neuroscience Letters. 319, 17-20 (2002).
- Kubota, D., Colgin, L. L., Casale, M., Brucher, F. A., Lynch, G.
- Behrens, C. J., Van Den Boom, L. P., De Hoz, L., Friedman, A., Heinemann, U. Induction of sharp wave - complexes in vitro and reorganization of hippocampal networks. Nature Neuroscience. 8, 1560-1567 (2005).
- Kouvaros, S., Papatheodoropoulos, C. Prominent differences in sharp waves, ripples and complex spike bursts between the dorsal and the ventral rat hippocampus. Neuroscience. 352, 131-143 (2017).
- Strange, B. A., Witter, M. P., Lein, E. S., Moser, E. I. Functional organization of the hippocampal longitudinal axis. Nature Reviews Neuroscience. 15, 655-669 (2014).
- Patel, J., Fujisawa, S., Berényi, A., Royer, S., Buzsáki, G. Traveling Theta Waves along the Entire Septotemporal Axis of the Hippocampus. Neuron. 75, 410-417 (2012).
- Patel, J., Schomburg, E. W., Berényi, A., Fujisawa, S., Buzsáki, G. Local generation and propagation of ripples along the septotemporal axis of the hippocampus. Journal of Neuroscience. 33, 17029-17041 (2013).
- Fricke, R., Cowan, W. M. An autoradiographic study of the commissural and ipsilateral hippocampo-dentate projections in the adult rat. Journal of Comparative Neurology. 181, 253-269 (1978).
- Ishizuka, N. O. R., Weber, J., Amaral, D. G. Organization of intrahippocampal projections originating from CA3 pyramidal cells in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 623, 580-623 (1990).
- Papatheodoropoulos, C. Electrophysiological evidence for long-axis intrinsic diversification of the hippocampus. Frontiers in Bioscience - Landmark. 23, 109-145 (2018).
- Gilbert, M., Racine, R. J., Smith, G. K. Epileptiform burst responses in ventral vs dorsal hippocampal slices. Brain Research. 361, 389-391 (1985).
- Papatheodoropoulos, C., Moschovos, C., Kostopoulos, G. Greater contribution of N-methyl-D-aspartic acid receptors in ventral compared to dorsal hippocampal slices in the expression and long-term maintenance of epileptiform activity. Neuroscience. 135, 765-779 (2005).
- Jones, R. S. G., Heinemann, U. Synaptic and intrinsic responses of medial entorhinal cortical cells in normal and magnesium-free medium in vitro. Journal of Neurophysiology. 59, (1988).
- Rafiq, A., Delorenzo, R. J., Coulter, D. A. Generation and propagation of epileptiform discharges in a combined entorhinal cortex / hippocampal slice. Journal of Neurophysiology. 70, 1962-1974 (1993).
- Stoop, R., Pralong, E. Functional connections and epileptic spread between hippocampus, entorhinal cortex and amygdala in a modified horizontal slice preparation of the rat brain. European Journal of Neuroscience. 12, 3651-3663 (2000).
- Roth, F. C., Beyer, K. M., Both, M., Draguhn, A., Egorov, A. V. Downstream effects of hippocampal sharp wave ripple oscillations on medial entorhinal cortex layer V neurons in vitro. Hippocampus. 26, 1493-1508 (2016).
- Bertsche, A., Bruehl, C., Pietz, J., Draguhn, A. Region- and pattern-specific effects of glutamate uptake blockers on epileptiform activity in rat brain slices. Epilepsy Research. 88, 118-126 (2010).
- Wu, C., Shen, H., Luk, W. P., Zhang, L. A fundamental oscillatory state of isolated rodent hippocampus. Journal of Physiology. 540, 509-527 (2002).
- Colgin, L. L., Jia, Y., Sabatier, J. M., Lynch, G. Blockade of NMDA receptors enhances spontaneous sharp waves in rat hippocampal slices. Neuroscience Letters. 385, 46-51 (2005).
- Ellender, T. J., Nissen, W., Colgin, L. L., Mann, E. O., Paulsen, O. Priming of hippocampal population bursts by individual perisomatic-targeting interneurons. The Journal of Neuroscience. 30, 5979-5991 (2010).
- Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. A. Comparison of different slicing planes in preservation of major hippocampal pathway fibers in the mouse. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 1-17 (2017).
- Maier, N., Morris, G., Johenning, F. W., Schmitz, D. An approach for reliably investigating hippocampal sharp wave-ripples in vitro. PLoS One. 4, 6925 (2009).
- Schlingloff, D., Kali, S., Freund, T. F., Hajos, N., Gulyas, A. I. Mechanisms of sharp wave initiation and ripple generation. Journal of Neuroscience. 34, 11385-11398 (2014).
- McCloskey, D. P., Scharfman, H. E. Progressive, potassium-sensitive epileptiform activity in hippocampal area CA3 of pilocarpine-treated rats with recurrent seizures. Epilepsy Research. 97, 92-102 (2011).
- McMahon, L. L., Williams, J. H., Kauer, J. A. Functionally distinct groups of interneurons identified during rhythmic carbachol oscillations in hippocampus in vitro. Journal of Neuroscience. 18, 5640-5651 (1998).
- Pöschel, B., Heinemann, U., Draguhn, A. High frequency oscillations in the dentate gyrus of rat hippocampal slices induced by tetanic stimulation. Brain Research. 959, 320-327 (2003).
- Hájos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. European Journal of Neuroscience. 29, 319-327 (2009).
- Hájos, N., Mody, I. Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content. Journal of Neuroscience Methods. 183, 107-113 (2009).
- Dengler, C. G., Yue, C., Takano, H., Coulter, D. A. Massively augmented hippocampal dentate granule cell activation accompanies epilepsy development. Nature Publishing Group. , 1-17 (2017).
- Ting, J. T., et al. Preparation of acute brain slices using an optimized N -methyl-D-glucamine protective recovery method. Journal of Visualized Experiments. 132, 1-13 (2018).
- Westerhof, N., Lankhaar, J. W., Westerhof, B. E.
- Shi, W. X., Bunney, B. S. A small volume chamber for electrical recording from submerged brain slices and a pulse-free medium supply system using a peristalic pump. Journal of Neuroscience Methods. 35, 235-240 (1990).
