Summary
Questo protocollo descrive la preparazione di fette orizzontali di corteccia ippocampale-entorinale (HEC) da topi che mostrano un'attività spontanea di increspatura ad onda acuta. Le fette vengono incubate in una camera di tenuta dell'interfaccia semplificata e le registrazioni vengono eseguite in condizioni sommerse con liquido cerebrospinale artificiale a flusso rapido per promuovere l'ossigenazione dei tessuti e l'emergere spontaneo di attività a livello di rete.
Abstract
L'affezione acuta del cervello dei roditori offre un approccio sperimentale trattabile per ottenere informazioni sull'organizzazione e la funzione dei circuiti neurali con risoluzione a singola cellula utilizzando elettrofisiologia, microscopia e farmacologia. Tuttavia, una considerazione importante nella progettazione di esperimenti in vitro è la misura in cui diversi preparati a fette ricapitolano modelli naturalistici di attività neurale osservati in vivo. Nel cervello intatto, la rete ippocampale genera un'attività demografica altamente sincronizzata che riflette lo stato comportamentale dell'animale, come esemplificato dai complessi a catena a onde acuti (SWR) che si verificano durante gli stati consumatori di veglia o il sonno non REM. Gli SWR e altre forme di attività di rete possono emergere spontaneamente in fette ippocampali isolate in condizioni appropriate. Al fine di applicare il potente toolkit di fette cerebrali allo studio dell'attività della rete ippocampale, è necessario utilizzare un approccio che ottimizzi la salute dei tessuti e la conservazione della connettività funzionale all'interno della rete ippocampale. I topi sono perfusi transcardialmente con liquido cerebrospinale artificiale a base di saccarosio freddo. Le fette orizzontali contenenti l'ippocampo vengono tagliate con uno spessore di 450 μm per preservare la connettività sinaptica. Le fette si riprendono in una camera in stile interfaccia e vengono trasferite in una camera sommersa per le registrazioni. La camera di registrazione è progettata per la doppia superfusione superficiale di liquido cerebrospinale artificiale ad alta portata per migliorare l'ossigenazione della fetta. Questo protocollo produce tessuti sani adatti allo studio di attività di rete complesse e spontanee in vitro.
Introduction
La misurazione elettrofisiologia da fette ippocampali viventi in vitro è un potente approccio sperimentale con numerosi vantaggi. Lo sperimentatore può usare un microscopio, micromanipolatori e un sistema di registrazione per visualizzare e raccogliere direttamente le misurazioni dai singoli neuroni nel tessuto. Le fette di tessuto sono anche molto accessibili alla fotostimolazione o alla somministrazione di farmaci per esperimenti optogenetici, chemiogenetici o farmacologici.
La rete ippocampale genera un'attività demografica altamente sincrona in vivo,visibile come oscillazioni nel potenziale di campo locale extracellulare1,2,3,4,5. I metodi delle fette cerebrali sono stati sfruttati per ottenere informazioni sui meccanismi cellulari e di circuito alla base di queste oscillazioni della rete neuronale. ha dimostrato che i complessi a catena d'onda affilati (SWR) possono emergere spontaneamente in fette dell'ippocampo ventrale6,7. Studi successivi di più ricercatori hanno gradualmente chiarito molti aspetti degli SWR, tra cui il ruolo dei neuromodulatori nella regolazione dello stato di rete dell'ippocampo8,9,10 e i meccanismi sinaptici che guidano la riattivazione in vitro di insiemi neuronali precedentemente attivi durante il comportamento in vivo11. Gli esperimenti sulle fette cerebrali hanno anche fornito informazioni sull'oscillazione dell'intervallo gamma (30-100 Hz), un distinto stato della rete ippocampale che si ritiene supporti la codifica dellamemoria e richiami 12,13. Infine, riconoscendo il ruolo centrale dell'ippocampo e delle strutture associate nella fisiopatologia dell'epilessia del lobo temporale14,15, i ricercatori hanno utilizzato preparati a fette ippocampali per indagare la generazione e la propagazione dell'attività epileptiforme. carter et al. Successivamente, Karlócai et al.
Gli investigatori hanno sviluppato numerosi approcci a fette ippocampali che differiscono in modi chiave: (1) la regione dell'ippocampo contenuta nella fetta (dorsale, intermedia o ventrale); 2) la presenza o l'assenza di tessuti extraippocampali come la corteccia entorinale; (3) l'orientamento utilizzato per tagliare le fette (coronale, sagittale, orizzontale o obliquo); e (4) le condizioni in cui il tessuto viene mantenuto dopo l'affezione (immerso completamente in ACSF o tenuto all'interfaccia dell'ACSF e dell'aria umidificata ricca di carbogeni).
La scelta dell'approccio di affezione all'uso dovrebbe essere determinata dall'obiettivo sperimentale. Ad esempio, fette trasversali o coronali dell'ippocampo dorsale mantenute in condizioni sommerse sono state utilizzate in modo molto efficace per lo studio dei circuiti intraippocampali e della plasticità sinaptica18,19,20. Tuttavia, tali preparati non generano spontaneamente oscillazioni di rete così prontamente come fette dall'ippocampo ventrale21,22,23. Sebbene uno stato di attività persistente di CFA possa essere indotto dalla stimolazione tetanica in fette trasversali dall'ippocampo dorsale e ventrale24, gli SWR spontanei sono più facilmente osservati nelle fetteventrali 7,25.
Una distinzione fisiologica e anatomica intrinseca tra l'ippocampo dorsale e ventrale è supportata da studi eseguiti sia in vivo che in vitro26. Le registrazioni nei ratti rivelarono ritmi di theta fortemente coerenti in tutto l'ippocampo dorsale e intermedio, ma scarsa coerenza tra la regione ventrale e il resto dell'ippocampo27. Gli SWR in vivo si propagano prontamente tra l'ippocampo dorsale e intermedio, mentre gli SWR che hanno origine nell'ippocampo ventrale rimangono spessolocali 28. Le proiezioni associativa provenienti dai neuroni piramidali CA3 che risiedono nell'ippocampo dorsale e intermedio proiettano lunghe distanze lungo l'asse longitudinale dell'ippocampo. Le proiezioni CA3 provenienti dalle regioni ventrali rimangono relativamente locali e quindi hanno meno probabilità di essere recise durante il processo diaffezione 29,30. Le fette ventrali possono quindi preservare meglio la rete ricorrente necessaria per generare sincronia della popolazione. La propensione delle fette ventrali a generare attività spontanee di rete in vitro può anche riflettere una maggiore eccitabilità intrinseca dei neuroni piramidali o un'inibizione GABAergica più debole nell'ippocampo ventrale rispetto alle regioni più dorsali31. Infatti, le fette ippocampali ventrali sono più suscettibili all'attività epileptiforme32,33. Così, molti studi di spontaneafisiologica 8,9,11,24 opatologica 16,34,35,36 oscillazioni di rete hanno tradizionalmente utilizzato un approccio di affettare orizzontale, a volte con un leggero angolo nella direzione fronto-occipitale, che produce fette di tessuto parallele al piano trasversale dell'ippocampo ventrale.
La connettività di rete è inevitabilmente influenzata dalla procedura di affettare il numero di celle nella sezione che verrà recisa. L'angolo e lo spessore della fetta e del tessuto trattenuti nella preparazione devono essere considerati per ottimizzare la connettività nei circuiti di interesse. Molti studi hanno utilizzato fette orizzontali combinate di corteccia ippocampale-entorinale (HEC) per esplorare le interazioni tra le due strutture nel contesto di oscillazioni fisiologiche o patologiche della rete. ha eseguito due registrazioni dal sottocampo CA1 dell'ippocampo e dallo strato V della corteccia entorinale mediale per dimostrare la propagazione dell'attività SWR attraverso la fettaHEC 37. Molti studi sull'attività epileptiforme hanno utilizzato la preparazione della fetta HEC per indagare come le scariche epileptiformi si propagano attraverso la rete corticoippocampale16,35,36,38. È importante notare che la conservazione dell'anello corticoippocampale intatto non è un prerequisito per gli SWR spontanei, le scariche epileptiformi o le oscillazioni gamma; le oscillazioni di rete possono essere generate in fette trasversali dell'ippocampo dorsale o ventrale senza tessuti paraippocampaliattaccati 21,22,23, 25,39,40,41. Un fattore più importante per la generazione spontanea di oscillazioni di rete nelle fette ippocampali può essere lo spessore di ogni fetta, poiché una fetta più spessa (400-550 μm) conserverà una maggiore connettività nella rete ricorrente CA2/ CA321,22,25.
Sebbene siano state utilizzate fette orizzontali angolate di HEC (tagliate con un angolo di circa 12° nella direzione fronto-occipitale) per studiare la connettività funzionale dell'anello corticoippocampale11,16,34,35,42,tali preparati angolati non sono necessari per l'attività spontanea della rete43,44,45. Tuttavia, l'uso di un piano di affettare angolato consente allo sperimentatore di creare selettivamente fette che preservano al meglio le lamelle orientate trasversalmente dell'ippocampo ventrale o intermedio, a seconda che si applica un angolo verso il basso o verso l'alto (Figura 1). Questo approccio è concettualmente simile a quello usato da Papatheodoropoulos et al., 2002, che ha sezionato ogni ippocampo libero e poi ha usato un elicottero tissutale per creare fette trasversali lungo l'intero asse dorsale-ventrale21. Alla luce delle suddette distinzioni funzionali tra l'ippocampo ventrale e dorsale-intermedio, gli investigatori dovrebbero considerare l'origine anatomica delle fette quando progettano esperimenti o interpretano i risultati. L'uso di una rampa di agar durante la procedura di affettare è un modo semplice per produrre preferenzialmente fette dall'ippocampo intermedio o ventrale.
Le fette ippocampali possono essere mantenute in una camera sommersa (con il tessuto completamente immerso in ACSF), o in una camera in stile interfaccia (ad esempio, camera Oslo o Haas, con fette coperte solo da una sottile pellicola di mezzi fluenti). La manutenzione dell'interfaccia migliora l'ossigenazione del tessuto, che promuove la sopravvivenza neuronale e consente alti livelli sostenuti di attività internauronale. Tradizionalmente, le condizioni di registrazione sommerse utilizzano una portata ACSF più lenta che non fornisce un'adeguata ossigenazione dei tessuti per l'espressione stabile delle oscillazioni a livello di rete. Nelle fette ippocampali sommerse le oscillazioni gamma indotte da carbacholo si osservano transitoriamentesolo 46,47, mentre possono essere mantenute stabilmente nelle camere di registrazionedell'interfaccia 10,48,49. Come tale, molti studi di attività spontanea complessa in vitro si sono affidati a camere di registrazione dell'interfaccia per indagarei complessi di increspature a onde acuti6,7,8,9,10,25,37, oscillazioni gamma10,13e attività epileptiforme16,38,45,47.
In una camera di registrazione in stile sommerso, un obiettivo di microscopio ad immersione può essere utilizzato per visualizzare singole cellule e indirizzare selettivamente cellule dall'aspetto sano per le registrazioni. La preparazione sommersa consente anche un controllo fine sull'ambiente cellulare, poiché l'immersione facilita la rapida diffusione di farmaci o altri composti nel tessuto. Pertanto, una metodologia modificata in cui le oscillazioni di rete stabili vengono mantenute in condizioni sommerse rappresenta un potente approccio sperimentale. Questo approccio è esemplificato dal lavoro di Hájos et al., in cui le fette ippocampali si riprendono in una camera di tenuta semplificata in stile interfaccia per diverse ore prima del trasferimento in una camera di registrazione sommersa modificata con un'elevata portata di ACSF (~ 6 mL / min) per migliorare l'apportodi ossigeno al tessuto 12,48,49. In queste condizioni, alti livelli di attività internauron e oscillazioni spontanee stabili della rete possono essere mantenuti in una camera di registrazione sommersa. Questo approccio modificato consente agli investigatori di eseguire registrazioni di patch clamp a celle intere guidate visivamente e caratterizzare il contributo dei tipi di cellule morfologicamente identificati alle oscillazioni gamma indotte da carbacholo12. Gli SWR possono anche verificarsi spontaneamente in fette ippocampali sommerse con una portata veloce di ACSF11,48,49. ha dimostrato che le fette ippocampali che si sono riprese in una camera di interfaccia prima del trasferimento in una camera di registrazione sommersa mostravano in modo affidabile SWR spontanei, mentre le fette che si riprendevano immerse in un becher prima del trasferimento in una camera di registrazione sommersa mostravano risposte di campo evocate più piccole, livelli inferiori di correnti sinaptiche spontanee e solo molto raramente mostravano SWRspontanei 43. ha utilizzato questa metodologia migliorata per dimostrare il ruolo delle cellule del cesto che esprimono parvalbumina nella generazione di SWR spontanei44.
Il seguente protocollo presenta un metodo di affettare attraverso il quale i neuroni spontaneamente attivi nelle fette ippocampali orizzontali possono essere recuperati in condizioni di interfaccia e successivamente mantenuti in una camera di registrazione sommersa adatta a manipolazioni farmacologiche o optogenetiche e registrazioni visivamente guidate.
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Protocol
Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Columbia University (AC-AAAU9451).
1. Preparare soluzioni
- Preparare la soluzione di taglio del saccarosio per l'affezione, come descritto nella tabella 1.
NOTA: Dopo aver preparato 1 L di soluzione di saccarosio, congelare una piccola quantità (circa 100-200 mL) in un vassoio di ghiaccio. Questi cubetti di ghiaccio di saccarosio congelati saranno miscelati in un liquame ghiacciato (vedere fase 4.3). - Preparare il liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) per la registrazione come descritto nella tabella 2.
- Preparare 1 M di NaCl per le pipette di stimolazione sciogliendo 0,05844 g di NaCl in 1 mL di acqua purificata che è stata filtrata per rimuovere metalli traccia e altre impurità.
NOTA: La soluzione di taglio del saccarosio e l'ACSF devono essere preparati freschi per ogni esperimento.
2. Preparare la rampa di agar
- Preparare il 4% di agar (ad esempio, 2 g di agar in 50 mL di acqua) sciogliendo la polvere di agar in acqua purificata che è stata filtrata per rimuovere metalli traccia e altre impurità. Scaldare la miscela in un forno a microonde fino a quando non inizia a bollire (circa 30-60 s). Versare l'agar fuso in uno stampo e lasciare raffreddare e solidificare a 4 °C in frigorifero a una pendenza di circa 12°.
NOTA: Per uno stampo, è possibile utilizzare qualsiasi contenitore di vetro o plastica impostato ad angolo, con abbastanza agar fuso versato per formare una rampa di 4 cm di lunghezza e circa 0,8 cm di altezza.
3. Palcoe l'area di affezione
- Riempire un becher da 400 mL contenente una camera di recupero a fette con circa 250 mL di ACSF; posizionare in un bagno d'acqua riscaldato a 32 °C e iniziare a gorgogliare con carbogeno (95% gas ossigeno/ 5% gas di anidride carbonica).
NOTA: Riempire il becher di recupero con un fluido sufficiente per posizionare la rete di nylon della camera di tenuta sulla superficie stessa della soluzione, in modo che le fette siano tenute all'interfaccia della miscela di soluzione calda e dell'aria(Figura 1). Posizionare piccoli pezzi di carta per lenti sulla rete di nylon. Le fette giaceranno sopra la carta dell'obiettivo, che può essere successivamente utilizzata per trasferire le fette singolarmente nella camera di registrazione (vedere il passaggio 6.6). - Mettere un pallone con la soluzione di saccarosio in un secchio di ghiaccio per raffreddare e iniziare a gorgogliare con carbogeno.
NOTA: Il becher di recupero e la soluzione di saccarosio devono essere riscaldati e refrigerati, rispettivamente, con gorgogliamento di carbogeno per almeno 30 minuti prima che il topo venga posto nella camera dell'isoflurane. - Estrarre il vassoio dei cubetti di ghiaccio di soluzione di saccarosio prefabbroti e congelati dal congelatore e posizionare sulla panchina per scongelare parzialmente.
- Posizionare metà di una lama di rasoio pulita a doppio taglio nel microtomo e calibrare se necessario. Mettere da parte l'altra metà della lama del rasoio per l'uso durante la dissezione.
- Eseguire una linea di carbogeno e una sonda di temperatura nella camera di affezione e circondare di ghiaccio per raffreddare la camera.
- Preparare una panca o un tavolo pulito coperto da due cuscinetti assorbenti usa e getta. Disporre tutti gli strumenti di dissezione e tre pezzi di nastro da laboratorio sul pad sinistro, dove verrà eseguita la perfusione trascardica.
NOTA: Gli strumenti di dissezione includono piccole forbici Bonn, forbici dissector, spatola / cucchiaio di grandi dimensioni, microspapla, bisturi con nuova lama, spatola, forbici chirurgiche affilate / smussate, grandi forcelle tissutali e piccoli fasci di tessuto (vedi Tabella dei materiali). - Sull'altro cuscinetto assorbente a destra dell'area di perfusione, posizionare un pezzo circolare di carta da filtro nel coperchio di una piastra di Petri in vetro di 100 mm di diametro. Posizionare il fondo della piastra di Petri accanto al coperchio e posizionare una linea di carbogeno in entrambi i pezzi del piatto.
- Utilizzare una lama di rasoio o bisturi per tagliare una piccola rampa di agar (circa 4 cm lungo la superficie angolata, 0,8 cm di altezza, 2 cm di larghezza). Tagliare un pezzo della rampa dall'estremità alta e invertire per creare un blocco di supporto di agar. Utilizzare l'adesivo cianoacrilato per apporre la rampa dell'agar e il blocco di supporto sulla piattaforma di affettamento e mettere da parte.
NOTA: Il blocco di supporto dell'agar aiuta a stabilizzare il cervello durante l'affettare e fornisce una superficie su cui sezionare i tessuti non necessari da ogni fetta (Figura 1).
4. Perfusione transcardica
- Sospendere una siringa di capacità di 60 ml come serbatoio per la soluzione di taglio del saccarosio a circa 18 pollici sopra il banco (ad esempio, utilizzando un morsetto girevole su tre assi su un palo verticale). Attaccare i tubi sul fondo del serbatoio, far scorrere il tubo attraverso un morsetto a rulli e collegare l'altra estremità del tubo a un ago pulito da 20 G.
- Riempire il serbatoio da 60 mL con circa 30 mL di soluzione di saccarosio refrigerato e dirigere una linea di carbogeno nel serbatoio del saccarosio per far bollire continuamente il perfusato.
NOTA: Assicurarsi che il saccarosio flui attraverso il tubo e l'ago senza bolle intrappolate. La portata dovrebbe essere abbastanza veloce da avere un flusso costante e continuo di saccarosio gocciolante dall'ago. - Utilizzando un frullatore, schiacciare e frullare il saccarosio congelato in un liquame ghiacciato e utilizzare la grande spatola / cucchiaio per distribuire il liquame.
- Posizionare una piccola quantità di liquame di saccarosio intorno ai bordi del coperchio della piastra di Petri di vetro. Aggiungere una piccola quantità di liquame di saccarosio sul fondo della piastra di Petri.
- Aggiungere circa 20-30 mL di liquame di saccarosio al serbatoio del fluido perfusione, mescolandolo bene con i 30 mL di saccarosio liquido refrigerato fino a quando il serbatoio non contiene una miscela di saccarosio molto freddo, prevalentemente liquido, con qualche soluzione congelata residuata.
- Posizionare il mouse in una camera collegata a un vaporizzatore di isoflurane. Con l'ossigeno che scorre a circa 2 L/min, ruotare il quadrante del vaporizzatore per fornire isoflurane a una concentrazione del 5% e avviare un timer.
NOTA: Mantenere questo timer in corso per tutto il corso dell'affettare per valutare la velocità con cui vengono ottenute le fette. La procedura deve essere eseguita il più rapidamente possibile, in modo che l'affezione sia completa e che il tessuto si stia riprendendo nella camera di interfaccia entro 15-20 minuti dall'ingresso dell'animale nella camera isoflurana. Guarda il mouse per assicurarti che si ottiene uno stato di anestesia profonda. Dopo un minimo di 5 minuti, il mouse deve essere profondamente anestetizzato e non risponde ai dita dei piedi. - Immediatamente prima di rimuovere il topo dalla camera dell'isoflurane, riempire il coperchio della piastra di Petri con soluzione di saccarosio refrigerato a una profondità di circa 3-5 mm e riempire il fondo della piastra di Petri con soluzione di saccarosio refrigerato a una profondità di circa 1,0 cm.
- Trasferire rapidamente il mouse sul pad assorbente sinistro e utilizzare i 3 pezzi di nastro per fissare gli arti anteriori e la coda. Eseguire un dito posteriore per assicurarsi che il mouse non risponde prima che vengano eseguite eventuali incisioni. Usando le grandi forcelle tissutali e le forbici chirurgiche, tende la pelle e fai un'incisione longitudinale dal fondo dello sterno alla parte superiore del torace. Usando le forcep tirare su sullo sterno e utilizzare le forbici per tagliare attraverso il diaframma.
NOTA: Il posizionamento iniziale del mouse e le prime incisioni per severare il diaframma devono essere eseguiti il più rapidamente possibile per garantire che il mouse non riprenda conoscenza. Per garantire un'adeguata profondità di anestesia durante tutta la procedura, un cono del naso può essere posizionato sul mouse per fornire isoflurane durante la perfusione. - Utilizzare le forbici per tagliare la gabbia toracica su ciascun lato, tagliando in un grande movimento verso il punto in cui l'avaro incontra il corpo. Con le forcep, oscillare la parte anteriore della gabbia toracica via e verso la testa, quindi rimuoverla completamente con un taglio orizzontale usando le grandi forbici. Tenere il cuore in posizione utilizzando le pini grandi e inserire l'ago da perfusione da 20 G nel ventricolo sinistro. Una volta posizionato correttamente l'ago, il lato sinistro del cuore dovrebbe rapidamente impallidire poiché la soluzione di saccarosio refrigerato riempie il ventricolo.
- Utilizzare le piccole forbici sezionarie per tagliare nell'atrio destro e consentire al sangue di fluire fuori dal sistema circolatorio. Se le incisioni vengono eseguite correttamente, ci dovrebbero essere danni minimi al cuore e dovrebbe continuare a pompare durante la perfusione.
NOTA: I pezzi arrotolati di carta velina possono essere utilizzati per eliminare sangue e soluzione di saccarosio dal cuore e mantenere la visibilità dell'ago perfusione durante la procedura. - Assicurarsi che l'ago perfusione rimanga in posizione e non cada dal ventricolo sinistro. Con una corretta portata e posizionamento, il fegato inizierà a impallidire a un colore chiaro tan / beige con 20-30 s.
- Dopo 30-45 s, usa le grandi forbici per decapitare il topo. Tenendo la testa nella mano sinistra, spingere o sbucciare la pelle dal cranio. In un animale ben perfuso, il cranio dovrebbe essere molto pallido e il cervello dovrebbe apparire di un colore rosa molto chiaro (avvicinandosi al bianco) attraverso il cranio senza vasi sanguigni chiaramente visibili.
5. Estrarre il cervello e tagliare le fette
- Usando le piccole forbici Bonn, fai due tagli laterale attraverso il cranio verso la linea mediana nella parte anteriore del cranio, vicino agli occhi. Fai due tagli aggiuntivi su entrambi i lati della base del cranio.
- Trasferire la testa sul fondo della piastra di Petri di vetro dove dovrebbe essere per lo più immersa in una soluzione di saccarosio refrigerato. Usa le piccole forbici Bonn per ridurre la linea mediana lungo la lunghezza del cranio, tirando su con le forbici per ridurre al minimo i danni al tessuto cerebrale sottostante. Usando le piccole fase tissutali, afferra saldamente ogni lato del cranio e oscillalo su e lontano dal cervello, come aprire un libro.
- Usa le dita della mano sinistra per tenere aperte le alette del cranio e inserire la microspapla sotto il cervello vicino ai bulbi olfattivi. Capovolgere il cervello dal cranio nel saccarosio e usare la microspatola per severare il tronco encefalico. Lavare il cervello per rimuovere sangue residuo, pelliccia o altri tessuti.
- Utilizzare la grande spatola / cucchiaio per trasferire il cervello sul coperchio della piastra di Petri di vetro. Con l'altra metà della lama del rasoio a doppio taglio precedentemente messa da parte, fare due tagli coronali per rimuovere prima il cervelletto e poi la porzione più anteriore del cervello, compresi i bulbi olfattivi (Figura 1).
- Applicare l'adesivo cianoacrilato sulla rampa dell'agar. Posizionare molto brevemente il cervello su un pezzo di carta da filtro asciutta utilizzando le grandi forcelle tissutali e quindi trasferirlo immediatamente sulla rampa dell'agar, posizionando la superficie ventrale del cervello sull'adesivo.
NOTA: Per le fette dell'ippocampo intermedio, il cervello dovrebbe essere orientato con il anteriore rivolto verso l'alto la pendenza della rampa e il posteriore più vicino alla lama. Per fette dell'ippocampo ventrale, orientare il cervello con l'estremità anteriore puntata lungo la pendenza della rampa, con l'estremità posteriore nella parte superiore della rampa, più lontano dalla lama. In entrambi i casi, il cervello deve essere posizionato nella parte superiore della rampa, in modo che la superficie coronally-cut del cervello contatti il blocco di supporto dell'agar (Figura 1). - Posizionare la piattaforma di affettamento con l'agar e il cervello nella camera di affezione del microtomo e immergersi completamente con la soluzione di saccarosio refrigerato. Utilizzare la grande spatola/cucchiaio per trasferire alcuni liquami di saccarosio alla camera, mescolando per sciogliere qualsiasi saccarosio congelato e far scendere rapidamente la temperatura della miscela a ~1-2 °C.
NOTA: Guarda l'indicatore di temperatura durante l'affezione. Se la soluzione di saccarosio si riscalda sopra i 3 °C, aggiungere più liquami e mescolare per riportare la temperatura verso il basso. - Tagliare le fette con uno spessore di 450 μm con la velocità del microtomo impostata su 0,07 mm/s. Man mano che ogni fetta viene liberata, utilizzare le piccole forze tissutali e un bisturi affilato per separare prima i due emisferi, quindi per tagliare il tessuto fino a quando la fetta non è costituita principalmente dalle regioni ippocampo e paraippocampale (Figura 1).
- Utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per trasferire le fette singolarmente nella camera di recupero dell'interfaccia, assicurando che siano posizionate all'interfaccia dell'ACSF e dell'aria con solo un menisco sottile di ACSF che copre le fette. Chiudere saldamente il coperchio della camera e lasciare che le fette si riprendano a 32 °C per 30 minuti.
- Dopo il recupero iniziale a 32 °C, portare la camera di recupero dell'interfaccia fuori dal bagno d'acqua e posizionare su un agitatore impostato a una velocità lenta in modo che la barra di agitazione magnetica promuova la circolazione dell'ACSF all'interno della camera. Lasciare raffreddare gradualmente a temperatura ambiente mentre le fette si riprendono per altri 90 minuti. Assicurarsi che la camera di recupero sia continuamente bollata con carbogeno e non permettere che grandi bolle vengano intrappolate sotto le fette.
6. Eseguire registrazioni del potenziale sul campo locale (LFP) dell'attività spontanea
- Prepararsi per le registrazioni LFP accendendo tutte le apparecchiature necessarie, tra cui il computer che esegue il software di acquisizione, il monitor collegato al computer, gli stimolatori, il micromanipolatore, il regolatore di temperatura, la sorgente luminosa del microscopio, la fotocamera collegata al microscopio, l'amplificatore al microelettrode, il digitalizzatore e la pompa peristaltica. Se si utilizza un sistema di vuoto centrale, aprire la valvola a parete per preparare la linea del vuoto che rimuoverà ACSF dalla camera di registrazione.
- Riempire il serbatoio riscaldato con ACSF, quindi posizionare un'estremità del tubo nel becher da 400 mL contenente l'ACSF gorgogliante. Accendere la pompa peristaltica per dirigere L'ACSF dal becher da 400 mL al serbatoio riscaldato e dal serbatoio in poi alla camera di registrazione. Toccare o pizzicare il tubo per rilasciare eventuali bolle intrappolate.
- Regolare la pompa peristaltica per assicurarsi che la portata ACSF attraverso la camera di registrazione sia veloce (~ 8-10 mL/min). Utilizzare una sonda di temperatura per assicurarsi che l'ACSF sia a 32 °C al centro della camera di registrazione.
NOTA: Se L'ACSF viene consegnato alla camera di registrazione utilizzando una pompa peristaltica, un'elevata portata può comportare una fluttuazione significativa della portata. Le portate costanti possono essere ottenute utilizzando un semplice smorzatore di pulsazione costituito da una serie di siringhe vuote integrate nei tubi (Figura 2). - Preparare la stimolazione e la registrazione delle pipette dai capillari di vetro borosilicato utilizzando un estrattore di filamento riscaldato. Il protocollo estrattore deve essere configurato per produrre pipette con una resistenza di 2-3 MOhm per la stimolazione o potenziali elettrodi di registrazione del campo locale.
- Riempire le pipette di stimolazione con pipette 1 M NaCl e LFP con ACSF.
- Bloccare brevemente il tubo e spegnere la pompa per sospendere il flusso di ACSF. Trasferire una fetta nella camera di registrazione utilizzando forcep fini per afferrare un angolo della carta dell'obiettivo su cui si appoggia la fetta- la fetta si attacca alla carta dell'obiettivo. Posizionare la carta dell'obiettivo e affettare nella camera di registrazione con la fetta rivolta verso il basso, quindi "sbucciare" la carta dell'obiettivo lasciando la fetta immersa nella camera di registrazione. Fissare la fetta con un'arpa.
NOTA: Le arpe possono essere acquistate prefatti o realizzati in laboratorio utilizzando un pezzo di acciaio inossidabile a forma di U o filamento di platino e nylon fine. - Posizionare una pipetta di stimolazione riempita di NaCl nel micromanipolatore manuale e avanzare lentamente la punta della pipetta nella superficie della fetta (ad esempio, nello strato di radiorato dello strato) con un angolo di circa 30-45°. Una volta che la punta della pipetta entra nel tessuto, avanzare lentamente la pipetta in avanti e astenersi da grandi movimenti nella direzione laterale o verticale che potrebbero danneggiare inutilmente gli assoni all'interno della fetta. Posizionare la punta della pipetta ad almeno 50-100 μm di profondità nella fetta per evitare cellule vicino alla superficie danneggiate durante l'affettare.
- Posizionare una pipetta LFP riempita con ACSF nel supporto della pipetta attaccato al micromanipolatore motorizzato. Applicare una pressione positiva molto leggera utilizzando la pressione della bocca o una siringa da 1 ml collegata tramite una valvola di arresto e una breve lunghezza di tubi sul supporto della pipetta.
NOTA: Posizionare le pipette LFP all'interno della fetta per registrare i segnali di interesse: in caso di increspature d'onda affilate, una pipetta LFP deve essere posizionata nello strato pyramidale (SP) e una seconda pipetta nel radiatum dello strato (SR). Questa configurazione consente registrazioni simultanee dell'onda acuta negativa nella SR e dell'oscillazione a increspatura ad alta frequenza nell'SP (Figura 3). - L'uso del micromanipolatore avanza lentamente la punta della pipetta LFP nella regione di interesse (ad esempio, lo strato cellulare piramidale CA1) con un angolo di circa 30-45°. Posizionare la punta della pipetta ad almeno 50-100 μm di profondità nella fetta per evitare cellule vicino alla superficie danneggiate durante l'affettare. Durante l'avanzamento della pipetta LFP, fornire continuamente un piccolo impulso di prova di tensione utilizzando il software di acquisizione e guardare per un improvviso aumento della resistenza agli elettrodi. Ciò può indicare che la pipetta è stata ostruito o premuto contro una cella.
- Una volta posizionata la pipetta LFP nella regione di interesse, rilasciare con cura la pressione positiva aprendo la valvola sul tubo attaccato al supporto della pipetta.
- Per registrare l'LFP in una seconda posizione contemporaneamente, ripetere i passaggi 6.8–6.10 con una seconda pipetta e micromanipolatore.
- Utilizzare l'amplificatore a microelettrodi nella configurazione del morsetto di corrente per registrare l'attività spontanea nel potenziale di campo locale dopo aver utilizzato la funzione di bilanciamento del ponte nel software di acquisizione per correggere la resistenza in serie della pipetta. Gli SWR spontanei appariranno come deviazioni positive nel potenziale extracellulare dello strato SP (Figura 3).
- Per registrare i potenziali di campo evocati, utilizzare gli stimolatori collegati al digitalizzatore per fornire un breve impulso di tensione quadrata (200 us) attraverso la pipetta di stimolazione riempita di NaCl. Regolare il quadrante della tensione di stimolazione per evocare una gamma di ampiezze di risposta.
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Representative Results
Qui sono presentate registrazioni rappresentative da fette HEC preparate come descritto in questo protocollo. Dopo il recupero in una camera di tenuta dell'interfaccia (Figura 1C), le fette vengono trasferite singolarmente in una camera di registrazione sommersa (Figura 2B). La camera di registrazione viene fornita con ACSF saturo di carbogen utilizzando una pompa peristaltica (Figura 2A). La pompa estrae prima L'ACSF da un becher di tenuta in un serbatoio riscaldato. Le linee di carbogeno vengono posizionate sia nel becher di tenuta che nel serbatoio riscaldato per fornire un'ossigenazione continua del supporto. Uno smorzatore di pulsazione, costituito da una serie di siringhe riempite d'aria, è posizionato tra la pompa peristaltica e la camera di registrazione per ridurre al minimo le fluttuazioni della portata prodotte dalla rapida peristalisi. La tasca dell'aria in ogni siringa assorbe i cambiamenti di pressione causati da ogni ciclo della pompa, in modo che la camera di registrazione riceva un flusso fluido e coerente di ACSF52,53. Un riscaldatore in linea posizionato dopo lo smorzatore di pulsazione assicura che la temperatura dell'ACSF sia elevata a 32 °C quando entra nella camera di registrazione.
In questo esempio, la camera di registrazione a superfusione a doppia superficie è costituita da tre strati stampati in 3D (Figura 2B). Lo strato inferiore ha un ritaglio rettangolare per adattarsi a un coverslip, fissato con grasso sottovuoto. Lo strato intermedio contiene la metà inferiore di una camera ovale allungata, con due supporti orizzontali. Il filamento di nylon è infilato su questi supporti (all'incirca ogni 0,5 mm) e fissato con adesivo cianoacrilato. La fetta poggia su questo filamento infilato. Lo strato superiore contiene la metà superiore della camera ovale insieme a piccoli pozzi in cui è possibile posizionare i pellet macinati al cloruro d'argento. La forma ovale allungata della camera è progettata per promuovere un rapido flusso laminare di ACSF.
La figura 3 presenta le registrazioni rappresentative delle fette HEC preparate secondo questo protocollo. Per valutare inizialmente lo stato di salute delle fette, i potenziali postinaptici sul campo (fPSPs) vengono evocati nello strato radiatum (SR) usando una pipetta riempita con 1 M di NaCl. Nelle fette sane, la stimolazione elettrica dovrebbe produrre un fPSP con una piccola raffica di fibre presnaptiche e un grande potenziale postssinattico con una rapida discesa iniziale(Figura 3B, in altoa sinistra). Nelle fette sane, le increspature spontanee ad onda acuta (SWR) sono visibili come deformazioni positive nella LFP nello strato pyramidale (Figura 3B, inbasso a sinistra). Nelle fette non ottili evocate gli FPSP mostrano una grande raffica di fibre e un potenziale postssinattico relativamente piccolo, e tali fette non mostrano SWR spontanei(Figura 3B, adestra). Gli SWR in vitro mostrano caratteristiche coerenti con le descrizioni pubblicate: un potenziale di campo positivo nello strato SP con un'oscillazione ad alta frequenza sovrapposta, abbinato a un potenziale di campo negativo nello strato SR (Figura 3C). Un singolo CFA registrato in CA2 è indicato con un asterisco (Figura 3C, destra). Gli SWR nelle sezioni HEC hanno origine all'interno di circuiti ricorrenti CA2/CA3 e si propagano a CA1. Un singolo CFA osservato nello strato CA2 e CA1 SP è indicato con un asterisco (Figura 3D, destra). In questo esempio rappresentativo, il CA2 SWR (verde) lo porta in CA1 (blu) di diversi millisecondi, come mostrato nella sovrapposizione dell'inviluppo SWR (filtrato a 2-30 Hz) registrato in ogni regione.
Figura 1: Preparazione di fette orizzontali di corteccia ippocampale-entorinale angolata (HEC). ( A )La commissione per l'agricoltura, la (i) Dopo aver estratto il cervello, eseguire due tagli coronali con una lama di rasoio per rimuovere le porzioni posteriori e anteriori del cervello. (ii) La rampa di agar è formata da due porzioni angolate incollate alla piattaforma di affettamento dei microtomi. Per preparare fette dell'ippocampo intermedio, posizionare il blocco cerebrale sulla rampa dell'agar con la superficie anteriore rivolta verso l'alto del pendio e prendere contatto con l'alta porzione di supporto della rampa. Per preparare fette di ippocampo più ventrale, posizionare il blocco cerebrale sulla rampa dell'agar con la superficie anteriore rivolta verso il basso lungo il pendio, in modo che la superficie di taglio posteriore faccia contatto con l'alta porzione di supporto della rampa. (iii) Man mano che ogni fetta viene liberata, eseguire molti altri tagli con il bisturi per separare gli emisferi e rimuovere i tessuti non necessari. (B) Immagine rappresentativa della fetta risultante con nuclei cellulari etichettati da DAPI. (C) In una camera di recupero dell'interfaccia, le fette sono posizionate su pezzi di carta per lenti sopra una rete in acciaio inossidabile o nylon, livellate con la superficie dell'ACSF. Un bubbler in ceramica trasmette carbogeno nella camera e una barra di agitazione magnetica mescola continuamente il fluido nella camera. Una sottile pellicola di ACSF copre la superficie superiore della fetta, migliorando la diffusione dell'ossigeno dall'aria umida ricca di carbogeni della camera. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Camera di registrazione a doppia superfusione superficiale con smorzatore di pulsazione nei tubi di erogazione ACSF. (A) Diagramma del sistema di superfusione. L'ACSF viene riscaldato a 32 °C, costantemente bollito con gas carbogeno e consegnato a circa 8-10 mL/min utilizzando una pompa peristaltica con uno smorzatore di pulsazione costituito da una serie di siringhe riempite d'aria. (B) La camera di registrazione è costituita da tre strati stampati in 3D, il cui centro è infilato con filamento di nylon. La fetta poggia su questo filamento infilato e L'ACSF scorre sopra e sotto il tessuto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Registrazioni rappresentative di increspature spontanee ad onda acuta da fette HEC. (A) Diagramma semplificato della fetta di HEC che mostra le posizioni degli elettrodi di registrazione e stimolazione. (B) Registrazioni rappresentative dell'attività LFP sia da una fetta attiva e sana che da una fetta non ottimale. La fetta sana (a sinistra, in verde) mostra grandi risposte di campo evocate e increspature spontanee di onde affilate (SWR), visibili come deviazioni positive che si verificano irregolarmente nel potenziale di campo locale dello strato SP. Al contrario, una fetta malsana mostra piccole risposte di campo evocate e nessuna attività spontanea (a destra, in grigio). (C) Registrazioni rappresentative degli SWR nella regione CA2, costituite da una deflessione negativa nella LFP nello strato SR e da un'oscillazione ad alta frequenza con una deflessione positiva sottostante nella LFP nello strato SP. I picchi in ogni canale superiori a tre deviazioni standard dell'ampiezza del segnale sono evidenziati in rosso. Un filtro passa banda di 2-30 Hz isola l'inviluppo positivo e negativo sottostante dell'onda acuta nello strato SP e SR, rispettivamente, mentre un filtro passa banda di 80-250 Hz viene utilizzato per isolare l'oscillazione ad alta frequenza dell'increspatura nello strato SP. (D) Gli SWR si propagano in vitro da CA2/CA3 a CA1. In queste registrazioni rappresentative, gli SWR in CA2 (verde, inferiore) lo precedono in CA1 (blu, superiore) di diversi millisecondi. I picchi in ogni canale superiori a tre deviazioni standard dell'ampiezza del segnale sono evidenziati in rosso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| peso molecolare (grammi / mol) | concentrazione finale (mM) | grammi / soluzione di taglio del saccarosio da 1 L | ||
| Saccarosio | C12H22O11 | 342.3 | 195 | 66.749 |
| cloruro di sodio | Nacl | 58.44 | 10 | 0.584 |
| Glucosio | C6H12O6 | 180.08 | 10 | 1.801 |
| bicarbonato di sodio | NaHCO3 | 84.01 | 25 | 2.1 |
| cloruro di potassio | Kcl | 74.55 | 2.5 | 0.186 |
| fosfato di sodio monobasico anidro | NaH2PO4 | 137.99 | 1.25 | 0.173 |
| piruvato di sodio | C3H3NaO3 | 110.04 | 2 | 0.22 |
| concentrazione delle scorte (M) | concentrazione finale (mM) | millilitri / soluzione di taglio del saccarosio 1L | ||
| cloruro di calcio | CaCl2 | 1 | 0.5 | 0.5 |
| cloruro di magnesio | MgCl2 | 1 | 7 | 7 |
Tabella 1: Composizione della soluzione di taglio del saccarosio. Iniziare con circa 0,75 L di acqua purificata che è stata filtrata per rimuovere metalli traccia e altre impurità. Sciogliere ogni solido mescolando la soluzione con una barra di agitazione magnetica. Una volta sciolti tutti i solidi, il gas carbogeno a bolle attraverso la soluzione per 10 minuti. Aggiungere le soluzioni MgCl2 e CaCl2 e aggiungere acqua per portare il volume totale a 1 L. Mescolare con una barra di agitazione magnetica per 10 minuti per assicurarsi che la soluzione sia miscelata uniformemente. L'osmolarità dovrebbe essere compresa tra 315 e 325 mOsm e il pH dovrebbe essere di circa 7,4.
| peso molecolare (grammi / mol) | concentrazione finale (mM) | grammi / 2L ACSF | ||
| cloruro di sodio | Nacl | 58.44 | 125 | 14.61 |
| Glucosio | C6H12O6 | 180.08 | 12.5 | 4.502 |
| bicarbonato di sodio | NaHCO3 | 84.01 | 25 | 4.201 |
| cloruro di potassio | Kcl | 74.55 | 3.5 | 0.522 |
| fosfato di sodio monobasico anidro | NaH2PO4 | 137.99 | 1.25 | 0.345 |
| acido ascorbico | C6H8O6 | 176.12 | 1 | 0.352 |
| piruvato di sodio | C3H3NaO3 | 110.04 | 3 | 0.66 |
| concentrazione delle scorte (M) | concentrazione finale (mM) | millilitri / 2L ACSF | ||
| cloruro di calcio | CaCl2 | 1 | 1.6 | 3.2 |
| cloruro di magnesio | MgCl2 | 1 | 1.2 | 2.4 |
Tabella 2: Composizione del liquido cerebrospinale artificiale. Iniziare con circa 1,5 L di acqua purificata che è stata filtrata per rimuovere metalli traccia e altre impurità. Sciogliere ogni solido mescolando la soluzione con una barra di agitazione magnetica. Una volta sciolti tutti i solidi, il gas carbogeno a bolle attraverso la soluzione per 10 minuti. Aggiungere le soluzioni MgCl2 e CaCl2 e aggiungere acqua per portare il volume totale a 2 L. Mescolare con una barra di agitazione magnetica per 10 minuti per assicurarsi che la soluzione sia miscelata uniformemente. L'osmolarità dovrebbe essere compresa tra 315 e 325 mOsm e il pH dovrebbe essere di circa 7,4.
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Discussion
Ci sono diversi passaggi in questo protocollo di affettamento progettato per promuovere la salute dei tessuti e favorire l'emergere di attività spontanea della rete naturalistica: il topo viene transcardially perfuso con soluzione di taglio del saccarosio refrigerato; le fette di corteccia orizzontale-entorinale (HEC) sono tagliate ad uno spessore di 450 μm dall'ippocampo intermedio o ventrale; le fette si riprendono all'interfaccia dell'ACSF riscaldato e dell'aria umidificata ricca di carbogeni; durante le registrazioni le fette vengono sovrafuse con ACSF riscaldate a 32 °C e consegnate a una portata rapida con superfusione a doppia superficie in una camera di registrazione sommersa.
Slice health è di fondamentale importanza per la generazione di oscillazioni di rete in vitro. Gli animali giovani produrranno fette più sane e, generalmente, con topi giovani o adolescenti la fase di perfusione trascardica può essere saltata. Con l'invecchiamento degli animali, diventa sempre più difficile fare fette sane, ma alcune indagini (come modelli di malattia o studi longitudinali) richiedono l'uso di animali adulti o invecchiati. Dengler et al., ad esempio, hanno usato perfusioni trascardiali nella loro preparazione di fette di HEC da topi adulti cronicamente epilettici trattati con pilocarpina50. Con topi adulti, è utile eseguire una perfusione trascardica con soluzione di taglio del saccarosio refrigerato per raffreddare il tessuto, liberare il sangue dal cervello e ridurre l'attività metabolica prima di rimuovere il cervello dalcranio 51. È importante notare, tuttavia, che le perfusioni trascardiali richiedono una formazione corretta e occorre fare attenzione a garantire che la procedura venga eseguita rapidamente e in modo da non rappresentare un rischio per il benessere degli animali. Quando possibile, gli esperimenti dovrebbero essere concepiti in modo da utilizzare animali giovani in modo da impedire l'uso di perfusioni trascardiali. In una preparazione a fette non ottimale, non ci saranno abbastanza cellule sane, in particolare internanti, per supportare le oscillazioni di rete in corso. Per valutare la salute delle fette durante l'esperimento, è utile registrare prima i potenziali di campo evocati (ad esempio, con una pipetta di stimolazione e una pipetta di registrazione nello strato radiatum, SR). In una fetta sana, la stimolazione nello strato SR evocherà un grande potenziale postsinattico di campo (fPSP) con una raffica di fibre presnaptiche relativamente piccola (Figura 3).
Le fette prodotte da questo protocollo sono fette orizzontali orizzontali di corteccia ippocampale-entorinale (HEC). È importante sottolineare che né l'inclusione del tessuto paraippocampale né il taglio angolato sono necessari affinché le fette ippocampali generino spontaneamente attività di rete come gli SWR. Infatti, molti studi hanno utilizzato fette ippocampali orizzontali o trasversali per interrogare aspetti fisiologici25,40,41,44 o oscillazioni patologiche della rete33,38. In questo protocollo il posizionamento del cervello su una rampa di agar consente allo sperimentatore di produrre selettivamente più fette dall'ippocampo ventrale o intermedio (Figura 1), che può essere utile per obiettivi sperimentali che tengono conto dell'eterogeneità funzionale che esiste lungo l'asse longitudinale dell'ippocampo26,31. Se l'origine anatomica delle fette non è un fattore, allora la rampa dell'agar può essere esclusa e un vero piano di taglio orizzontale produrrà fette dell'ippocampo intermedio-ventrale. Man mano che ogni fetta di tessuto orizzontale viene liberata, la maggior parte delle parti estranee della fetta può essere rimossa con tre semplici tagli, lasciando una fetta approssimativamente rettangolare che contiene l'ippocampo e alcuni tessuti circostanti, compresa la regione paraippocampale (Figura 1). Un'ulteriore dissezione può essere eseguita per rimuovere tutti i tessuti extraippocampali, ma l'inclusione del tessuto circostante è benefica, in quanto l'arpa a fette può essere facilmente posizionata in modo tale che i filamenti di nylon non si riposino sull'ippocampo vero e proprio. Come discusso sopra, la fetta combinata hec è anche una preparazione utile con cui indagare una rete corticoippocampale più ampia nel contestofisiologico 37 opatologico 16,35,36,38 oscillazioni di rete.
Il fattore chiave di questo protocollo è ottimizzare l'apporto di ossigeno al tessuto, sia durante la fase di recupero che durante le registrazioni. Molti studi sulle oscillazioni di rete vengono eseguiti in fette che vengono trasferite direttamente dal microtomo a una camera di registrazione dell'interfaccia e permesso di recuperare con perfusione continua di ACSF fresco. Dopo diverse ore di recupero, le registrazioni possono quindi essere eseguite nella stessa camera di interfaccia. Pertanto, le fette sono tenute all'interfaccia dell'ACSF e dell'aria umida ricca di carbogeni per l'intera durata dell'esperimento. Nella metodologia alternativa presentata in questo protocollo, le fette si riprendono in una camera di tenuta in stile interfaccia per almeno due ore prima che le singole fette siano trasferite in una camera di registrazione in stile sommerso con portate ACSF sufficientemente veloci. Le fette preparate in queste condizioni possono presentare oscillazioni gamma stabili12 o attività spontanea di CFA43. Il recupero delle fette in una camera di tenuta in stile interfaccia è un passo critico: Maier et al. Allo stesso modo, Hájos et al. Durante il periodo di registrazione, la superfusione a doppia superficie non è strettamente necessaria, a condizione che la camera di registrazione consecchi un volume relativamente piccolo di ACSF erogato a una portata rapida (almeno 6 mL/min)43. La camera di registrazione stampata in 3D presentata in questo protocollo (Figura 2B) è un'opzione relativamente economica e semplice, ma ci sono anche camere di registrazione sommerse disponibili in commercio progettate per contenere volumi più piccoli, promuovere il flusso laminare dei supporti o fornire una superfusione a doppia superficie (a differenza delle camere di registrazione circolari, ad esempio, che consentono un volume morto in eccesso di ACSF).
Mentre questo protocollo consente di registrare oscillazioni di rete senza il requisito di una camera di registrazione dell'interfaccia tradizionale, ci sono diverse limitazioni. Sebbene le fette siano tenute nell'interfaccia ACSF-air durante il periodo di recupero, non ricevono una perfusione continua di supporti freschi come avviene nelle tradizionali camere di registrazione dell'interfaccia in stile Haas. Le fette devono essere trasferite singolarmente (utilizzando forcep sottili) dalla camera di recupero alla camera di registrazione sommersa. Inoltre, le portate veloci possono causare instabilità e artefatti di movimento problematici per alcune registrazioni, in particolare se ACSF viene fornito con una pompa peristaltica. Al fine di mantenere portate elevate e ridurre al minimo i disturbi meccanici, è possibile integrare nel sistema di perfusione un semplice smorzatore dipulsazione (Figura 2). Questo smorzatore di pulsazione funziona utilizzando l'effetto Windkessel52, in cui le siringhe vuote contengono sacche d'aria che fungono da serbatoi elastici, assorbendo la pressione fluttuante generata dai rulli della pompa peristaltica53. Tuttavia, l'incorporazione di uno smorzatore di impulsi può aggiungere lunghezza al tubo che fornisce ACSF alla camera di registrazione e influire sull'alimentazione dell'ossigeno alla fetta. Le portate devono essere solo il più velocemente possibile per produrre oscillazioni di rete stabili e, se viene utilizzata una pompa peristaltica, dovrebbe idealmente essere una pompa che utilizza un gran numero di rulli (> 12) per ridurre al minimo la pulsazione causata dalla peristalisi, impedire l'uso di uno smorzatore di pulsazione e assicurarsi che il tubo che fornisce ACSF alla camera di registrazione sia il più breve possibile. Le registrazioni eseguite con portate elevate richiedono anche grandi volumi di ACSF, il che può essere problematico se gli esperimenti richiedono l'aggiunta di farmaci o composti preziosi o costosi ai media. Sebbene una camera di superfusione a doppia superficie richieda una camera di registrazione appositamente costruita con due insenature di fluido per fornire mezzi ossigenati su entrambi i lati della fetta, si possono osservare oscillazioni spontanee della rete con portate ACSF moderate48. Questo protocollo utilizza sia una portata rapida (stabilizzata con uno smorzatore di pulsazione) che una camera di superfusione a doppia superficie per migliorare la probabilità di osservare l'attività spontanea.
Infine, questo protocollo ha una bassa resa per quanto riguarda il numero di fette prodotte per animale. L'affettare orizzontalmente con uno spessore di 450 μm produce un piccolo numero di fette di HEC all'orientamento preferito (in cui la fetta è effettivamente parallela all'asse trasversale dell'ippocampo). Di queste fette, tipicamente, solo una o due per ippocampi mostrano attività spontanea di CFA, meno di quanto riportato altrove43. Sebbene le fette più spesse contengano presumibilmente un maggior grado di connettività ricorrente, il taglio di fette leggermente più sottili (400 μm) può produrre un numero maggiore per mouse di fette orientate trasversalmente con attività SWR. Inoltre, la probabilità che più fette mostrino in modo affidabile un'attività spontanea di CFA può essere più alta negli esperimenti che utilizzano vere fette angolate orizzontali o verso il basso dell'ippocampo ventrale. L'attuale protocollo incorpora l'uso di fette orizzontali angolate verso l'alto dell'ippocampo intermedio, che potrebbero avere meno probabilità di mostrare attività spontanea di rete rispetto alle fette dell'ippocampo ventrale25,26,31. Infine, questo protocollo ha usato fette di topi adolescenti e adulti. Mentre le perfusioni trascardiali possono migliorare la qualità delle fette di animali più anziani, la probabilità di osservare attività spontanee di rete può essere miglioratadall'uso di fette di animali più giovani 12,41,44.
In sintesi, questo protocollo presenta un approccio di affettare il cervello del topo che produce fette orizzontali angolate di corteccia ippocampale-entorinale dalla formazione ippocampale intermedia o ventrale che può mostrare una complessa attività spontanea di rete sotto forma di complessi acuti di ondate-increspature.
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Disclosures
L'autore non ha nulla da rivelare.
Acknowledgments
L'autore desidera ringraziare Steve Siegelbaum per il supporto. I finanziamenti sono forniti da 5R01NS106983-02 e 1 F31 NS113466-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Lulzbot | LulzBot TAZ 6 | |
| Acute brain slice incubation holder | NIH 3D Print Exchange | 3DPX-001623 | Designed by ChiaMing Lee, available at https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623 |
| Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma Aldrich | A9187-500MG | |
| Ag-Cl ground pellets | Warner | 64-1309, (E205) | |
| agar | Becton, Dickinson | 214530-500g | |
| ascorbic acid | Alfa Aesar | 36237 | |
| beaker (250 mL) | Kimax | 14000-250 | |
| beaker (400 mL) | Kimax | 14000-400 | |
| biocytin | Sigma Aldrich | B4261 | |
| blender | Oster | BRLY07-B00-NP0 | |
| Bonn scissors, small | becton, Dickinson | 14184-09 | |
| borosilicate glass capillaries with filament (O.D. 1.5 mm, I.D. 0.86 mm, length 10 cm) | Sutter Instruments | BF150-86-10HP | Fire polished capillaries are preferable. |
| calcium chloride solution (1 M) | G-Biosciences | R040 | |
| camera | Olympus | OLY-150 | |
| compressed carbogen gas (95% oxygen / 5% carbon dioxide) | Airgas | X02OX95C2003102 | |
| compressed oxygen | Airgas | OX 200 | |
| constant voltage isolated stimulator | Digitimer Ltd. | DS2A-Mk.II | |
| coverslips (22x50 mm) | VWR | 16004-314 | |
| cyanoacrylate adhesive | Krazy Glue | KG925 | Ideally use the brush-on form for precision |
| data acquisition software | Axograph | N/A | Any equivalent software (e.g. pClamp) would work. |
| Dell Precision T1500 Tower Workstation Desktop | Dell | N/A | Catalog number will depend on specific computer - any computer will work as long as it can run electrophysiology acquisition software. |
| Digidata 1440A | Molecular Devices | 1-2950-0367 | |
| digital timer | VWR | 62344-641 | 4-channel Traceable timer |
| disposable absorbant pads | VWR | 56616-018 | |
| dissector scissors | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| double-edge razor blades | Personna | BP9020 | |
| dual automatic temperature controller | Warner Instrument Corporation | TC-344B | |
| dual-surface or laminar-flow optimized recording chamber | N/A | N/A | The chamber presented in this protocol is custom made. A commercial equivalent would be the RC-27L from Warner Instruments. |
| equipment rack | Automate Scientific | FR-EQ70" | A rack is not strictly necessary but useful for organizing electrophysiology |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethyiether)- N,N,N',N'-teetraacetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | 324626-25GM | |
| filter paper | Whatman | 1004 070 | |
| fine scale | Mettler Toledo | XS204DR | |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| glass petri dish (100 x 15 mm) | Corning | 3160-101 | |
| glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G8877-250MG | |
| ice buckets | Sigma Aldrich | BAM168072002-1EA | |
| isoflurane vaporizer | General Anesthetic Services | Tec 3 | |
| lab tape | Fisher Scientific | 15-901-10R | |
| lens paper | Fisher Scientific | 11-996 | |
| light source | Olympus | TH4-100 | |
| magnesium chloride solution (1 M) | Quality Biological | 351-033-721EA | |
| magnetic stir bars | Fisher Scientific | 14-513-56 | Catalog number will be dependent on the size of the stir bar. |
| micromanipulator | Luigs & Neumann | SM-5 | |
| micromanipulator (manual) | Scientifica | LBM-2000-00 | |
| microscope | Olympus | BX51WI | |
| microspatula | Fine Science Tools | 10089-11 | |
| monitor | Dell | 2007FPb | |
| MultiClamp 700B Microelectrode Amplifier | Molecular Devices | MULTICLAMP 700B | The MultiClamp 700B should include headstages, pipette holders, and a model cell. |
| N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), (HEPES) | Sigma Aldrich | H3375-25G | |
| needle (20 gauge, 1.5 in length) | Becton, Dickinson | 305176 | |
| nylon filament | YLI Wonder Invisible Thread | 212-15-004 | size 0.004. This cat. # is from Amazon.com |
| nylon mesh | Warner Instruments Corporation | 64-0198 | |
| perstaltic pump | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
| Phosphocreatine di(tris) salt | Sigma Aldrich | P1937-1G | |
| pipette holders | Molecular Devices | 1-HL-U | |
| platinum wire | World Precision | PT0203 | |
| polylactic acid (PLA) filament | Ultimaker | RAL 9010 | |
| potassium chloride | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| potassium gluconate | Sigma Aldrich | 1550001-200MG | |
| potassium hydroxide | Sigma Aldrich | 60377-1KG | |
| razor blades | VWR | 55411-050 | |
| roller clamp | World Precision Instruments | 14041 | |
| scale | Mettler Toledo | PM2000 | |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| slice harp | Warner | SHD-26GH/2 | |
| sodium bicarbonate | Fisher Chemical | S233-500 | |
| sodium chloride | Sigma Aldrich | S9888-1KG | |
| sodium phosphate monobasic anhydrous | Fisher Chemical | S369-500 | |
| sodium pyruvate | Fisher Chemical | BP356-100 | |
| spatula | VWR | 82027-520 | |
| spatula/spoon, large | VWR | 470149-442 | |
| sterile scalpel blades | Feather | 72044-10 | |
| stirrer / hot plate | Corning | 6795-220 | |
| stopcock valves, 1-way | World Precision Instruments | 14054 | |
| stopcock valves, 3-way | World Precision Instruments | 14036 | |
| sucrose | Acros Organics | AC177142500 | |
| support for swivel clamps | Fisher Scientific | 14-679Q | |
| surgical scissors, sharp/blunt | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| syringe (1 mL) | Becton, Dickinson | 309659 | |
| syringe (60 mL with Luer-Lok tip) | Becton, Dickinson | 309653 | |
| three-pronged clamp | Fisher Scientific | 05-769-8Q | |
| tissue forceps, large | Fine Science Tools | 11021-15 | |
| tissue forceps, small | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| tubing | Tygon | E-3603 | ID 1/16 inch, OD 3/16 inch |
| tubing | Tygon | R-3603 | ID 1/8 inch, OD 1/4 inch |
| vacuum grease | Dow Corning | 14-635-5D | |
| vibrating blade microtome | Leica | VT 1200S | |
| vibration-dampening table with faraday cage | Micro-G / TMC-ametek | 2536-516-4-30PE | |
| volumetric flask (1 L) | Kimax | KIM-28014-1000 | |
| volumetric flask (2 L) | PYREX | 65640-2000 | |
| warm water bath | VWR | 1209 |
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