Denne protokollen beskriver utarbeidelsen av horisontale hippocampal-entorhinal cortex (HEC) skiver fra mus som viser spontan skarpbølge krusning aktivitet. Skiver inkuberes i et forenklet grensesnitt holder kammer og opptak utføres under nedsenket forhold med raskt flytende kunstig cerebrospinalvæske for å fremme vev oksygenering og spontan fremveksten av nettverksnivå aktivitet.
Akutt gnagerhjerneslicing gir en tractable eksperimentell tilnærming for å få innsikt i organiseringen og funksjonen til nevrale kretser med encelleoppløsning ved hjelp av elektrofysiologi, mikroskopi og farmakologi. Imidlertid er en viktig vurdering i utformingen av in vitro eksperimenter i hvilken grad forskjellige skivepreparater rekafulerer naturalistiske mønstre av nevrale aktivitet som observert in vivo. I den intakte hjernen genererer hippocampalnettverket svært synkronisert befolkningsaktivitet som reflekterer dyrets atferdstilstand, som eksemplifisert av skarpbølgekrustningskompleksene (SWRs) som oppstår under våkne forbrukstilstander eller ikke-REM-søvn. SWRs og andre former for nettverksaktivitet kan dukke opp spontant i isolerte hippocampal skiver under passende forhold. For å bruke den kraftige hjerneskive verktøykassen til undersøkelse av hippocampal nettverksaktivitet, er det nødvendig å bruke en tilnærming som optimaliserer vevshelse og bevaring av funksjonell tilkobling i hippocampalnettverket. Mus er transcardially perfused med kald sukrose-basert kunstig cerebrospinalvæske. Horisontale skiver som inneholder hippocampus er kuttet med en tykkelse på 450 μm for å bevare synaptisk tilkobling. Skiver gjenopprette i et grensesnitt-stil kammer og overføres til et nedsenket kammer for opptak. Opptakskammeret er designet for dobbel overflate superfusjon av kunstig cerebrospinalvæske ved høy strømningshastighet for å forbedre oksygeneringen av skiven. Denne protokollen gir sunt vev egnet for undersøkelse av komplekse og spontane nettverksaktivitet in vitro.
Elektrofysiologiske målinger fra levende hippocampal skiver in vitro er en kraftig eksperimentell tilnærming med mange fordeler. Eksperimentereren kan bruke et mikroskop, mikromanipulatorer og et opptakssystem for å visualisere og samle målinger direkte fra individuelle nevroner i vevet. Vevskiver er også svært tilgjengelige for fotostimulering eller legemiddellevering for optogenetiske, kjemiskogenetiske eller farmakologiske eksperimenter.
Hippocampal nettverket genererer svært synkron befolkningsaktivitet in vivo, synlig som svingninger i det ekstracellulære lokale feltetpotensial 1,2,3,4,5. Brain slice metoder har blitt utnyttet for å få innsikt i cellulære og krets mekanismer underliggende disse nevronale nettverk svingninger. Grunnleggende arbeid fra Maier et al. viste at skarpe bølge-krusning komplekser (SWRs) kan dukke opp spontant i skiver av ventral hippocampus6,7. Etterfølgende studier fra flere forskere har gradvis belyst mange aspekter av SWRs, inkludert rollen som nevromodulatorer i å regulere nettverkstilstanden til hippocampus8,9,10 og de synaptiske mekanismene som driver in vitro reaktivering av nevronale ensembler som tidligere var aktive under atferd in vivo11. Hjerneskiver eksperimenter har også gitt innsikt i gamma rekkevidde oscillasjon (30-100 Hz), en distinkt hippocampal nettverkstilstand antas å støtte minne koding og tilbakekalling12,13. Til slutt, gjenkjenne den sentrale rollen hippocampus og tilhørende strukturer i patofysiologien til temporal lobe epilepsi14,15, forskere har brukt hippocampal skive preparater for å undersøke generering og forplantning av epileptiform aktivitet. Carter et al. demonstrerte at kombinerte hippocampal-entorhinal cortex skiver tilberedt av kronisk epileptiske dyr kan spontant generere epileptiform utslipp in vitro16. Deretter utforsket Karlócai et al. mekanismene underliggende epileptiform utslipp i hippocampal skiver ved hjelp av modifisert kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) med endrede isjonskonsentrasjoner (redusert Mg2 + eller forhøyet K+) eller lagt narkotika (4AP eller gabazine)17.
Etterforskere har utviklet mange hippocampal skive tilnærminger som varierer på viktige måter: (1) regionen av hippocampus som finnes i stykket (dorsal, middels, eller ventral); (2) tilstedeværelse eller fravær av ekstrahippocampal vev som entorhinal cortex; (3) orienteringen som brukes til å kutte skiver (koronar, sagittal, horisontal eller skrå); og (4) forholdene der vevet opprettholdes etter kutting (nedsenket fullt ut i ACSF eller holdt i grensesnittet til ACSF og fuktet, karbagenrik luft).
Valget av hvilken kutte tilnærming til bruk bør bestemmes av det eksperimentelle målet. For eksempel har tverrgående eller koronale skiver av den dorsale hippocampus opprettholdt under nedsenket forhold blitt brukt svært effektivt for undersøkelse av intrahippocampal kretser og synaptisk plastisitet18,19,20. Imidlertid genererer slike preparater ikke spontant nettverkssvingninger så lett som skiver fra ventral hippocampus21,22,23. Selv om en tilstand av vedvarende SWR-aktivitet kan induseres ved tetanisk stimulering i tverrgående skiver fra dorsal og ventral hippocampus24,observeres spontane SWRs lettere i ventrale skiver7,25.
Et iboende fysiologisk og anatomisk skille mellom dorsal og ventral hippocampus støttes av studier utført både in vivo og in vitro26. Opptak hos rotter avslørte sterkt sammenhengende theta rytmer gjennom dorsal og mellomliggende hippocampus, men dårlig sammenheng mellom ventral regionen og resten av hippocampus27. SwRs in vivo forplanter seg lett mellom dorsal og mellomliggende hippocampus, mens SWRs som stammer fra ventral hippocampus ofte forblir lokale28. De assosiasjonelle projeksjonene stammer fra CA3 pyramidale nevroner som bor i den dorsale og mellomliggende hippocampus prosjektet lange avstander langs den langsgående aksen av hippocampus. CA3-projeksjoner som kommer fra ventrale regioner forblir relativt lokale, og dermed er mindre sannsynlig å bli kuttet underkuttingsprosessen 29,30. Ventrale skiver kan derfor bedre bevare det tilbakevendende nettverket som er nødvendig for å generere befolkningssynkronisering. Tilbøyeligheten til ventrale skiver for å generere spontane nettverksaktiviteter in vitro kan også gjenspeile høyere iboende spenning av pyramidale nevroner eller svakere GABAergic hemming i ventral hippocampus sammenlignet med mer dorsale regioner31. Ventrale hippocampalskiver er faktisk mer utsatt for epileptiform aktivitet32,33. Dermed har mange studier av spontanefysiologiske 8,9,11,24 ellerpatologisk 16,34,35,36 nettverkssvingninger tradisjonelt brukt en horisontal kutting tilnærming, noen ganger med en liten vinkel i fronto-occipital retning, som gir vevskiver parallelt med det tverrgående planet av ventral hippocampus.
Nettverkstilkobling påvirkes uunngåelig av kuttprosedyren, da mange celler i stykket vil bli kuttet. Vinkelen og tykkelsen på skiven og vevet som beholdes i preparatet, bør vurderes for å optimalisere tilkoblingen i kretsene av interesse. Mange studier har benyttet horisontale kombinerte hippocampal-entorhinal cortex skiver (HEC) for å utforske interaksjoner mellom de to strukturene i sammenheng med fysiologiske eller patologiske nettverkssvingninger. Roth et al. utførte to opptak fra CA1-underfeltet i hippocampus og lag V av den mediale entorhinale cortex for å demonstrere forplantning av SWR-aktivitet gjennom HEC-skive37. Mange studier av epileptiform aktivitet har brukt HEC skive forberedelse til å undersøke hvordan epileptiform utslipp forplanter seg gjennom kortikohippocampal nettverk16,35,36,38. Det er viktig å merke seg at bevaring av intakt kortikohippocampal sløyfe ikke er en forutsetning for spontane SWRs, epileptiform utslipp, eller gamma svingninger; nettverkssvingninger kan genereres i tverrgående skiver av dorsal eller ventral hippocampus uten vedlagte parahippocampal vev21,22,23, 25,39,40,41. En viktigere faktor for spontan generering av nettverkssvingninger i hippocampal skiver kan være tykkelsen på hver skive, som en tykkere skive (400-550 μm) vil bevare mer tilkobling i CA2 / CA3 tilbakevendendenettverk 21,22,25.
Selv om vinklede horisontale HEC skiver (kuttet med en ca 12° vinkel i fronto-occipital retning) har blitt brukt til å studere funksjonell tilkobling av kortikohippocampal loop11,16,34,35,42, slike vinklede preparater er ikke nødvendig for spontan nettverksaktivitet43,44,45. Imidlertid tillater bruk av et vinklet skjæreplan utprøver å selektivt lage skiver som best bevarer den tverrgående orienterte lamelleren av enten ventral eller mellomliggende hippocampus, avhengig av om en nedadgående eller en oppadgående vinkel påføres (figur 1). Denne tilnærmingen er konseptuelt lik den som brukes av Papatheodoropoulos et al., 2002, som dissekerte hver hippocampus fri og deretter brukte et vevshelikopter for å lage tverrgående skiver langs hele dorsal-ventralaksen 21. I lys av de nevnte funksjonelle forskjellene mellom ventral og dorsal-intermediate hippocampus, bør etterforskerne vurdere den anatomiske opprinnelsen til skiver når de utformer eksperimenter eller tolker resultater. Ved hjelp av en agarrampe under kuttingsprosedyren er en enkel måte å fortrinnsvis produsere skiver fra enten mellomliggende eller ventral hippocampus.
Hippocampal skiver kan opprettholdes i enten et nedsenket kammer (med vevet fullt nedsenket i ACSF), eller et grensesnitt-stil kammer (f.eks Oslo eller Haas kammer, med skiver dekket bare av en tynn film av flytende medier). Grensesnittvedlikehold forbedrer oksygenering av vevet, noe som fremmer nevronal overlevelse og gir mulighet for vedvarende høye nivåer av internuronal aktivitet. Tradisjonelt bruker nedsenkede opptaksforhold en langsommere ACSF-strømningshastighet som ikke gir tilstrekkelig vevs oksygenering for stabilt uttrykk for svingninger på nettverksnivå. I nedsenket hippocampal skiver carbachol-indusert gamma svingninger er bare observertforbigående 46,47, mens de kan stabilt opprettholdes i grensesnitt opptakskamre10,48,49. Som sådan har mange studier av kompleks spontan aktivitet in vitro stolt på grensesnittopptakskamre for å undersøke skarpbølgekrustningskomplekser6,7,8,9,10,25,37,gammasvingninger10,13og epileptiform aktivitet16,38,45,47.
I et opptakskammer i nedsenket stil kan et mål om nedsenking av mikroskop brukes til å visualisere individuelle celler og selektivt målrette mot friske celler for opptak. Det nedsenkede preparatet gir også fin kontroll over det cellulære miljøet, da nedsenking letter rask diffusjon av narkotika eller andre forbindelser til vevet. Dermed representerer en modifisert metodikk der stabile nettverkssvingninger opprettholdes under nedsenkede forhold en kraftig eksperimentell tilnærming. Denne tilnærmingen er eksemplifisert av arbeidet til Hájos et al., der hippocampal skiver gjenopprette i et forenklet grensesnitt-stil holder kammer i flere timer før overføring til en modifisert nedsenket opptakskammer med en høy strømningshastighet på ACSF (~ 6 ml / min) for å forbedre oksygentilførselen tilvevet 12,48,49. Under disse forholdene kan høye nivåer av internuronaktivitet og stabile spontane nettverkssvingninger opprettholdes i et nedsenket opptakskammer. Denne modifiserte tilnærmingen gjør det mulig for etterforskerne å utføre visuelt veiledede helcellede patchklemmeopptak og karakterisere bidraget fra morfologisk identifiserte celletyper til karbachol-induserte gammasvingninger12. SwRs kan også oppstå spontant i nedsenket hippocampal skiver med en rask strømningshastighet på ACSF11,48,49. Maier et al. demonstrerte at hippocampal skiver som gjenopprettet i et grensesnittkammer før overføring til et nedsenket opptakskammer pålitelig utstilt spontane SWRs, mens skiver som gjenopprettet nedsenket i et beger før overføring til et nedsenket opptakskammer viste mindre fremkalte feltresponser, lavere nivåer av spontansynaptiske strømmer, og bare svært sjelden utstilt spontane SWRs43. Schlingloff et al. brukte denne forbedrede metodikken til å demonstrere rollen som parvalbumin-uttrykkende kurvceller i generasjonen spontane SWRs44.
Følgende protokoll presenterer en skjæremetode der spontant aktive nevroner i horisontale hippocampalskiver kan gjenopprettes under grensesnittforhold og deretter opprettholdes i et nedsenket opptakskammer egnet for farmakologiske eller optogenetiske manipulasjoner og visuelt veiledede opptak.
Det er flere trinn i denne kutteprotokollen designet for å fremme vevshelse og favorisere fremveksten av spontan naturalistisk nettverksaktivitet: musen er transcardially perfused med kjølt sukrose kutte løsning; horisontal-entorhinal cortex (HEC) skiver er kuttet med en tykkelse på 450 μm fra mellomliggende eller ventral hippocampus; skiver gjenopprette på grensesnittet av oppvarmet ACSF og fuktet, karbagen-rik luft; under opptak skiver er superfundert med ACSF varmet til 32 ° C og leveres med en rask strømnings…
The authors have nothing to disclose.
Forfatteren vil gjerne takke Steve Siegelbaum for støtte. Det gis midler fra 5R01NS106983-02 samt 1 F31 NS113466-01.
3D printer | Lulzbot | LulzBot TAZ 6 | |
Acute brain slice incubation holder | NIH 3D Print Exchange | 3DPX-001623 | Designed by ChiaMing Lee, available at https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623 |
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma Aldrich | A9187-500MG | |
Ag-Cl ground pellets | Warner | 64-1309, (E205) | |
agar | Becton, Dickinson | 214530-500g | |
ascorbic acid | Alfa Aesar | 36237 | |
beaker (250 mL) | Kimax | 14000-250 | |
beaker (400 mL) | Kimax | 14000-400 | |
biocytin | Sigma Aldrich | B4261 | |
blender | Oster | BRLY07-B00-NP0 | |
Bonn scissors, small | becton, Dickinson | 14184-09 | |
borosilicate glass capillaries with filament (O.D. 1.5 mm, I.D. 0.86 mm, length 10 cm) | Sutter Instruments | BF150-86-10HP | Fire polished capillaries are preferable. |
calcium chloride solution (1 M) | G-Biosciences | R040 | |
camera | Olympus | OLY-150 | |
compressed carbogen gas (95% oxygen / 5% carbon dioxide) | Airgas | X02OX95C2003102 | |
compressed oxygen | Airgas | OX 200 | |
constant voltage isolated stimulator | Digitimer Ltd. | DS2A-Mk.II | |
coverslips (22×50 mm) | VWR | 16004-314 | |
cyanoacrylate adhesive | Krazy Glue | KG925 | Ideally use the brush-on form for precision |
data acquisition software | Axograph | N/A | Any equivalent software (e.g. pClamp) would work. |
Dell Precision T1500 Tower Workstation Desktop | Dell | N/A | Catalog number will depend on specific computer – any computer will work as long as it can run electrophysiology acquisition software. |
Digidata 1440A | Molecular Devices | 1-2950-0367 | |
digital timer | VWR | 62344-641 | 4-channel Traceable timer |
disposable absorbant pads | VWR | 56616-018 | |
dissector scissors | Fine Science Tools | 14082-09 | |
double-edge razor blades | Personna | BP9020 | |
dual automatic temperature controller | Warner Instrument Corporation | TC-344B | |
dual-surface or laminar-flow optimized recording chamber | N/A | N/A | The chamber presented in this protocol is custom made. A commercial equivalent would be the RC-27L from Warner Instruments. |
equipment rack | Automate Scientific | FR-EQ70" | A rack is not strictly necessary but useful for organizing electrophysiology |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethyiether)- N,N,N',N'-teetraacetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | 324626-25GM | |
filter paper | Whatman | 1004 070 | |
fine scale | Mettler Toledo | XS204DR | |
Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
glass petri dish (100 x 15 mm) | Corning | 3160-101 | |
glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G8877-250MG | |
ice buckets | Sigma Aldrich | BAM168072002-1EA | |
isoflurane vaporizer | General Anesthetic Services | Tec 3 | |
lab tape | Fisher Scientific | 15-901-10R | |
lens paper | Fisher Scientific | 11-996 | |
light source | Olympus | TH4-100 | |
magnesium chloride solution (1 M) | Quality Biological | 351-033-721EA | |
magnetic stir bars | Fisher Scientific | 14-513-56 | Catalog number will be dependent on the size of the stir bar. |
micromanipulator | Luigs & Neumann | SM-5 | |
micromanipulator (manual) | Scientifica | LBM-2000-00 | |
microscope | Olympus | BX51WI | |
microspatula | Fine Science Tools | 10089-11 | |
monitor | Dell | 2007FPb | |
MultiClamp 700B Microelectrode Amplifier | Molecular Devices | MULTICLAMP 700B | The MultiClamp 700B should include headstages, pipette holders, and a model cell. |
N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), (HEPES) | Sigma Aldrich | H3375-25G | |
needle (20 gauge, 1.5 in length) | Becton, Dickinson | 305176 | |
nylon filament | YLI Wonder Invisible Thread | 212-15-004 | size 0.004. This cat. # is from Amazon.com |
nylon mesh | Warner Instruments Corporation | 64-0198 | |
perstaltic pump | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
Phosphocreatine di(tris) salt | Sigma Aldrich | P1937-1G | |
pipette holders | Molecular Devices | 1-HL-U | |
platinum wire | World Precision | PT0203 | |
polylactic acid (PLA) filament | Ultimaker | RAL 9010 | |
potassium chloride | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
potassium gluconate | Sigma Aldrich | 1550001-200MG | |
potassium hydroxide | Sigma Aldrich | 60377-1KG | |
razor blades | VWR | 55411-050 | |
roller clamp | World Precision Instruments | 14041 | |
scale | Mettler Toledo | PM2000 | |
scalpel handle | Fine Science Tools | 10004-13 | |
slice harp | Warner | SHD-26GH/2 | |
sodium bicarbonate | Fisher Chemical | S233-500 | |
sodium chloride | Sigma Aldrich | S9888-1KG | |
sodium phosphate monobasic anhydrous | Fisher Chemical | S369-500 | |
sodium pyruvate | Fisher Chemical | BP356-100 | |
spatula | VWR | 82027-520 | |
spatula/spoon, large | VWR | 470149-442 | |
sterile scalpel blades | Feather | 72044-10 | |
stirrer / hot plate | Corning | 6795-220 | |
stopcock valves, 1-way | World Precision Instruments | 14054 | |
stopcock valves, 3-way | World Precision Instruments | 14036 | |
sucrose | Acros Organics | AC177142500 | |
support for swivel clamps | Fisher Scientific | 14-679Q | |
surgical scissors, sharp/blunt | Fine Science Tools | 14001-12 | |
syringe (1 mL) | Becton, Dickinson | 309659 | |
syringe (60 mL with Luer-Lok tip) | Becton, Dickinson | 309653 | |
three-pronged clamp | Fisher Scientific | 05-769-8Q | |
tissue forceps, large | Fine Science Tools | 11021-15 | |
tissue forceps, small | Fine Science Tools | 11023-10 | |
transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
tubing | Tygon | E-3603 | ID 1/16 inch, OD 3/16 inch |
tubing | Tygon | R-3603 | ID 1/8 inch, OD 1/4 inch |
vacuum grease | Dow Corning | 14-635-5D | |
vibrating blade microtome | Leica | VT 1200S | |
vibration-dampening table with faraday cage | Micro-G / TMC-ametek | 2536-516-4-30PE | |
volumetric flask (1 L) | Kimax | KIM-28014-1000 | |
volumetric flask (2 L) | PYREX | 65640-2000 | |
warm water bath | VWR | 1209 |