Summary
Denne protokollen beskriver utarbeidelsen av horisontale hippocampal-entorhinal cortex (HEC) skiver fra mus som viser spontan skarpbølge krusning aktivitet. Skiver inkuberes i et forenklet grensesnitt holder kammer og opptak utføres under nedsenket forhold med raskt flytende kunstig cerebrospinalvæske for å fremme vev oksygenering og spontan fremveksten av nettverksnivå aktivitet.
Abstract
Akutt gnagerhjerneslicing gir en tractable eksperimentell tilnærming for å få innsikt i organiseringen og funksjonen til nevrale kretser med encelleoppløsning ved hjelp av elektrofysiologi, mikroskopi og farmakologi. Imidlertid er en viktig vurdering i utformingen av in vitro eksperimenter i hvilken grad forskjellige skivepreparater rekafulerer naturalistiske mønstre av nevrale aktivitet som observert in vivo. I den intakte hjernen genererer hippocampalnettverket svært synkronisert befolkningsaktivitet som reflekterer dyrets atferdstilstand, som eksemplifisert av skarpbølgekrustningskompleksene (SWRs) som oppstår under våkne forbrukstilstander eller ikke-REM-søvn. SWRs og andre former for nettverksaktivitet kan dukke opp spontant i isolerte hippocampal skiver under passende forhold. For å bruke den kraftige hjerneskive verktøykassen til undersøkelse av hippocampal nettverksaktivitet, er det nødvendig å bruke en tilnærming som optimaliserer vevshelse og bevaring av funksjonell tilkobling i hippocampalnettverket. Mus er transcardially perfused med kald sukrose-basert kunstig cerebrospinalvæske. Horisontale skiver som inneholder hippocampus er kuttet med en tykkelse på 450 μm for å bevare synaptisk tilkobling. Skiver gjenopprette i et grensesnitt-stil kammer og overføres til et nedsenket kammer for opptak. Opptakskammeret er designet for dobbel overflate superfusjon av kunstig cerebrospinalvæske ved høy strømningshastighet for å forbedre oksygeneringen av skiven. Denne protokollen gir sunt vev egnet for undersøkelse av komplekse og spontane nettverksaktivitet in vitro.
Introduction
Elektrofysiologiske målinger fra levende hippocampal skiver in vitro er en kraftig eksperimentell tilnærming med mange fordeler. Eksperimentereren kan bruke et mikroskop, mikromanipulatorer og et opptakssystem for å visualisere og samle målinger direkte fra individuelle nevroner i vevet. Vevskiver er også svært tilgjengelige for fotostimulering eller legemiddellevering for optogenetiske, kjemiskogenetiske eller farmakologiske eksperimenter.
Hippocampal nettverket genererer svært synkron befolkningsaktivitet in vivo, synlig som svingninger i det ekstracellulære lokale feltetpotensial 1,2,3,4,5. Brain slice metoder har blitt utnyttet for å få innsikt i cellulære og krets mekanismer underliggende disse nevronale nettverk svingninger. Grunnleggende arbeid fra Maier et al. viste at skarpe bølge-krusning komplekser (SWRs) kan dukke opp spontant i skiver av ventral hippocampus6,7. Etterfølgende studier fra flere forskere har gradvis belyst mange aspekter av SWRs, inkludert rollen som nevromodulatorer i å regulere nettverkstilstanden til hippocampus8,9,10 og de synaptiske mekanismene som driver in vitro reaktivering av nevronale ensembler som tidligere var aktive under atferd in vivo11. Hjerneskiver eksperimenter har også gitt innsikt i gamma rekkevidde oscillasjon (30-100 Hz), en distinkt hippocampal nettverkstilstand antas å støtte minne koding og tilbakekalling12,13. Til slutt, gjenkjenne den sentrale rollen hippocampus og tilhørende strukturer i patofysiologien til temporal lobe epilepsi14,15, forskere har brukt hippocampal skive preparater for å undersøke generering og forplantning av epileptiform aktivitet. Carter et al. demonstrerte at kombinerte hippocampal-entorhinal cortex skiver tilberedt av kronisk epileptiske dyr kan spontant generere epileptiform utslipp in vitro16. Deretter utforsket Karlócai et al. mekanismene underliggende epileptiform utslipp i hippocampal skiver ved hjelp av modifisert kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) med endrede isjonskonsentrasjoner (redusert Mg2 + eller forhøyet K+) eller lagt narkotika (4AP eller gabazine)17.
Etterforskere har utviklet mange hippocampal skive tilnærminger som varierer på viktige måter: (1) regionen av hippocampus som finnes i stykket (dorsal, middels, eller ventral); (2) tilstedeværelse eller fravær av ekstrahippocampal vev som entorhinal cortex; (3) orienteringen som brukes til å kutte skiver (koronar, sagittal, horisontal eller skrå); og (4) forholdene der vevet opprettholdes etter kutting (nedsenket fullt ut i ACSF eller holdt i grensesnittet til ACSF og fuktet, karbagenrik luft).
Valget av hvilken kutte tilnærming til bruk bør bestemmes av det eksperimentelle målet. For eksempel har tverrgående eller koronale skiver av den dorsale hippocampus opprettholdt under nedsenket forhold blitt brukt svært effektivt for undersøkelse av intrahippocampal kretser og synaptisk plastisitet18,19,20. Imidlertid genererer slike preparater ikke spontant nettverkssvingninger så lett som skiver fra ventral hippocampus21,22,23. Selv om en tilstand av vedvarende SWR-aktivitet kan induseres ved tetanisk stimulering i tverrgående skiver fra dorsal og ventral hippocampus24,observeres spontane SWRs lettere i ventrale skiver7,25.
Et iboende fysiologisk og anatomisk skille mellom dorsal og ventral hippocampus støttes av studier utført både in vivo og in vitro26. Opptak hos rotter avslørte sterkt sammenhengende theta rytmer gjennom dorsal og mellomliggende hippocampus, men dårlig sammenheng mellom ventral regionen og resten av hippocampus27. SwRs in vivo forplanter seg lett mellom dorsal og mellomliggende hippocampus, mens SWRs som stammer fra ventral hippocampus ofte forblir lokale28. De assosiasjonelle projeksjonene stammer fra CA3 pyramidale nevroner som bor i den dorsale og mellomliggende hippocampus prosjektet lange avstander langs den langsgående aksen av hippocampus. CA3-projeksjoner som kommer fra ventrale regioner forblir relativt lokale, og dermed er mindre sannsynlig å bli kuttet underkuttingsprosessen 29,30. Ventrale skiver kan derfor bedre bevare det tilbakevendende nettverket som er nødvendig for å generere befolkningssynkronisering. Tilbøyeligheten til ventrale skiver for å generere spontane nettverksaktiviteter in vitro kan også gjenspeile høyere iboende spenning av pyramidale nevroner eller svakere GABAergic hemming i ventral hippocampus sammenlignet med mer dorsale regioner31. Ventrale hippocampalskiver er faktisk mer utsatt for epileptiform aktivitet32,33. Dermed har mange studier av spontanefysiologiske 8,9,11,24 ellerpatologisk 16,34,35,36 nettverkssvingninger tradisjonelt brukt en horisontal kutting tilnærming, noen ganger med en liten vinkel i fronto-occipital retning, som gir vevskiver parallelt med det tverrgående planet av ventral hippocampus.
Nettverkstilkobling påvirkes uunngåelig av kuttprosedyren, da mange celler i stykket vil bli kuttet. Vinkelen og tykkelsen på skiven og vevet som beholdes i preparatet, bør vurderes for å optimalisere tilkoblingen i kretsene av interesse. Mange studier har benyttet horisontale kombinerte hippocampal-entorhinal cortex skiver (HEC) for å utforske interaksjoner mellom de to strukturene i sammenheng med fysiologiske eller patologiske nettverkssvingninger. Roth et al. utførte to opptak fra CA1-underfeltet i hippocampus og lag V av den mediale entorhinale cortex for å demonstrere forplantning av SWR-aktivitet gjennom HEC-skive37. Mange studier av epileptiform aktivitet har brukt HEC skive forberedelse til å undersøke hvordan epileptiform utslipp forplanter seg gjennom kortikohippocampal nettverk16,35,36,38. Det er viktig å merke seg at bevaring av intakt kortikohippocampal sløyfe ikke er en forutsetning for spontane SWRs, epileptiform utslipp, eller gamma svingninger; nettverkssvingninger kan genereres i tverrgående skiver av dorsal eller ventral hippocampus uten vedlagte parahippocampal vev21,22,23, 25,39,40,41. En viktigere faktor for spontan generering av nettverkssvingninger i hippocampal skiver kan være tykkelsen på hver skive, som en tykkere skive (400-550 μm) vil bevare mer tilkobling i CA2 / CA3 tilbakevendendenettverk 21,22,25.
Selv om vinklede horisontale HEC skiver (kuttet med en ca 12° vinkel i fronto-occipital retning) har blitt brukt til å studere funksjonell tilkobling av kortikohippocampal loop11,16,34,35,42, slike vinklede preparater er ikke nødvendig for spontan nettverksaktivitet43,44,45. Imidlertid tillater bruk av et vinklet skjæreplan utprøver å selektivt lage skiver som best bevarer den tverrgående orienterte lamelleren av enten ventral eller mellomliggende hippocampus, avhengig av om en nedadgående eller en oppadgående vinkel påføres (figur 1). Denne tilnærmingen er konseptuelt lik den som brukes av Papatheodoropoulos et al., 2002, som dissekerte hver hippocampus fri og deretter brukte et vevshelikopter for å lage tverrgående skiver langs hele dorsal-ventralaksen 21. I lys av de nevnte funksjonelle forskjellene mellom ventral og dorsal-intermediate hippocampus, bør etterforskerne vurdere den anatomiske opprinnelsen til skiver når de utformer eksperimenter eller tolker resultater. Ved hjelp av en agarrampe under kuttingsprosedyren er en enkel måte å fortrinnsvis produsere skiver fra enten mellomliggende eller ventral hippocampus.
Hippocampal skiver kan opprettholdes i enten et nedsenket kammer (med vevet fullt nedsenket i ACSF), eller et grensesnitt-stil kammer (f.eks Oslo eller Haas kammer, med skiver dekket bare av en tynn film av flytende medier). Grensesnittvedlikehold forbedrer oksygenering av vevet, noe som fremmer nevronal overlevelse og gir mulighet for vedvarende høye nivåer av internuronal aktivitet. Tradisjonelt bruker nedsenkede opptaksforhold en langsommere ACSF-strømningshastighet som ikke gir tilstrekkelig vevs oksygenering for stabilt uttrykk for svingninger på nettverksnivå. I nedsenket hippocampal skiver carbachol-indusert gamma svingninger er bare observertforbigående 46,47, mens de kan stabilt opprettholdes i grensesnitt opptakskamre10,48,49. Som sådan har mange studier av kompleks spontan aktivitet in vitro stolt på grensesnittopptakskamre for å undersøke skarpbølgekrustningskomplekser6,7,8,9,10,25,37,gammasvingninger10,13og epileptiform aktivitet16,38,45,47.
I et opptakskammer i nedsenket stil kan et mål om nedsenking av mikroskop brukes til å visualisere individuelle celler og selektivt målrette mot friske celler for opptak. Det nedsenkede preparatet gir også fin kontroll over det cellulære miljøet, da nedsenking letter rask diffusjon av narkotika eller andre forbindelser til vevet. Dermed representerer en modifisert metodikk der stabile nettverkssvingninger opprettholdes under nedsenkede forhold en kraftig eksperimentell tilnærming. Denne tilnærmingen er eksemplifisert av arbeidet til Hájos et al., der hippocampal skiver gjenopprette i et forenklet grensesnitt-stil holder kammer i flere timer før overføring til en modifisert nedsenket opptakskammer med en høy strømningshastighet på ACSF (~ 6 ml / min) for å forbedre oksygentilførselen tilvevet 12,48,49. Under disse forholdene kan høye nivåer av internuronaktivitet og stabile spontane nettverkssvingninger opprettholdes i et nedsenket opptakskammer. Denne modifiserte tilnærmingen gjør det mulig for etterforskerne å utføre visuelt veiledede helcellede patchklemmeopptak og karakterisere bidraget fra morfologisk identifiserte celletyper til karbachol-induserte gammasvingninger12. SwRs kan også oppstå spontant i nedsenket hippocampal skiver med en rask strømningshastighet på ACSF11,48,49. Maier et al. demonstrerte at hippocampal skiver som gjenopprettet i et grensesnittkammer før overføring til et nedsenket opptakskammer pålitelig utstilt spontane SWRs, mens skiver som gjenopprettet nedsenket i et beger før overføring til et nedsenket opptakskammer viste mindre fremkalte feltresponser, lavere nivåer av spontansynaptiske strømmer, og bare svært sjelden utstilt spontane SWRs43. Schlingloff et al. brukte denne forbedrede metodikken til å demonstrere rollen som parvalbumin-uttrykkende kurvceller i generasjonen spontane SWRs44.
Følgende protokoll presenterer en skjæremetode der spontant aktive nevroner i horisontale hippocampalskiver kan gjenopprettes under grensesnittforhold og deretter opprettholdes i et nedsenket opptakskammer egnet for farmakologiske eller optogenetiske manipulasjoner og visuelt veiledede opptak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder som er beskrevet her har blitt godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Columbia University (AC-AAAU9451).
1. Klargjør løsninger
- Forbered sukroseskjæreoppløsning for kutting som beskrevet i tabell 1.
MERK: Etter at du har klargjør 1 L sukroseoppløsning, må du fryse en liten mengde (ca. 100–200 ml) i et isbrett. Disse frosne sukroseisbitene vil bli blandet inn i en isete slurry (se trinn 4.3). - Klargjør kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) for opptak som beskrevet i tabell 2.
- Forbered 1 M NaCl for stimuleringspipetter ved å oppløse 0,05844 g NaCl i 1 ml renset vann som er filtrert for å fjerne spormetaller og andre urenheter.
MERK: Sukrose skjæreløsning og ACSF bør tilberedes friskt for hvert eksperiment.
2. Klargjør agarrampe
- Forbered 4 % agar (f.eks. 2 g agar i 50 ml vann) ved å oppløse agarpulver i renset vann som er filtrert for å fjerne spormetaller og andre urenheter. Varm blandingen i en mikrobølgeovn til den bare begynner å koke (ca. 30–60 s). Hell den smeltede agaren i en mugg og la den avkjøles og stivne ved 4 °C i kjøleskap med ca. 12 ° helling.
MERK: For en mugg kan man bruke et hvilket som helst glass eller plastbeholder satt i en vinkel, med nok smeltet agar strømmet inn for å danne en rampe på 4 cm i lengde og ca. 0, 8 cm i høyden.
3. Trinn ut kuttområdet
- Fyll et 400 ml beger som inneholder et stykke utvinningskammer med ca. 250 ml ACSF; plasser den i et vannbad oppvarmet til 32 °C og begynn å boble med karbagen (95 % oksygengass/5 % karbondioksidgass).
MERK: Fyll gjenvinningsbegeret med akkurat nok væske til å plassere nylonnettet på holdekammeret på selve overflaten av løsningen, slik at skiver vil bli holdt i grensesnittet til den varme løsningsblandingen og luften (figur 1). Legg små biter av linsepapir på nylonnettet. Skivene vil ligge oppå linsepapiret, som senere kan brukes til å overføre skiver individuelt til opptakskammeret (se trinn 6.6). - Legg en kolbe med sukroseløsningen i en isbøtte for å kjøle seg ned og begynn å boble med karbagen.
MERK: Restitusjonsbegeret og sukroseløsningen skal varmes og kjøles henholdsvis med karbagen boblende i minst 30 minutter før musen plasseres i isoflurankammeret. - Trekk ut brettet med ferdiglagde, frosne sukroseoppløsnings isbiter fra fryseren og plasser på benken for å delvis tine.
- Legg den ene halvdelen av et rent dobbeltkantet barberblad i mikrotomen og kalibrer om nødvendig. Sett til side den andre halvdelen av barberbladet for bruk under disseksjonen.
- Kjør en karbagenlinje og temperatursonde inn i kuttekammeret og omgi med is for å kjøle kammeret.
- Forbered en ren benk eller bord dekket med to engangsabsorberende pads. Legg ut alle disseksjonsverktøy og tre stykker laboratorietape på venstre pute, hvor transkardiodialperfusjonen vil bli utført.
MERK: Disseksjonsverktøy inkluderer liten Bonn-saks, dissektorsaks, stor slikkepott/skje, mikrospatula, skalpell med nytt blad, slikkepott, skarp/stump kirurgisk saks, store vevs tang og små vevst tang (se Materialtabell). - På den andre absorberende puten til høyre for perfusjonsområdet, legg et sirkulært stykke filterpapir i lokket på et 100 mm diameter glass Petriskål. Legg bunnen av petriskålen ved siden av lokket og legg en karbagenlinje i begge deler av fatet.
- Bruk et barberblad eller skalpell til å kutte en liten rampe av agar (ca. 4 cm langs den vinklede overflaten, 0,8 cm i høyde, 2 cm i bredden). Klipp av en del av rampen fra den høye enden og snu den for å skape en backing blokk av agar. Bruk cyanoacrylate lim for å feste agar rampen og backing blokk til kutte plattformen og sette til side.
MERK: Bakblokken på agar bidrar til å stabilisere hjernen under kutting og gir en overflate som å dissekere bort unødvendig vev fra hver skive (figur 1).
4. Transcardial perfusjon
- Suspender en sprøyte med kapasitet på 60 ml som et reservoar for sukroseskjæreoppløsning ca. 18 tommer over benkeplaten (f.eks. ved hjelp av en tredelt svingklemme på en vertikal stolpe). Fest slangen til bunnen av reservoaret, kjør slangen gjennom en rulleklemme, og koble den andre enden av røret til en ren 20 G nål.
- Fyll 60 ml reservoaret med ca. 30 ml kjølt sukroseløsning og rett en karbagenlinje inn i sukrosereservoaret for å kontinuerlig boble perfusatet.
MERK: Sørg for at sukroseen strømmer gjennom slangen og nålen uten fanget bobler. Strømningshastigheten skal være akkurat rask nok til å ha en jevn, kontinuerlig strøm av dryppende sukrose fra nålen. - Bruk en blender til å knuse og blande den frosne sukroseen i en isete slurry og bruk den store slikkepotten /skjeen til å fordele slammet.
- Legg en liten mengde sukrose slurry rundt kantene av glass petriskållokket. Legg til en liten mengde sukrose slurry til Petri parabolen bunnen.
- Tilsett omtrent 20–30 ml sukroseslam i perfusjonsvæskereservoaret, bland det godt med 30 ml kjølt væskesukrose til reservoaret inneholder en blanding av svært kald, overveiende flytende sukrose med en viss restfrosset oppløsning.
- Plasser musen i et kammer som er koblet til en isofluranfordamper. Med oksygen som strømmer på ca 2 L / min, vri urskiven på fordamperen for å levere isofluran ved 5% konsentrasjon og start en timer.
MERK: Hold denne tidtakeren i gang i løpet av kuttingen for å måle hvor raskt skivene oppnås. Prosedyren bør gjøres så raskt som mulig, slik at kutting er fullført, og vev er utvinne i grensesnittkammeret innen 15-20 min av dyret inn i isoflurankammeret. Se musen for å sikre at en tilstand av dypbedøvelse oppnås. Etter minst 5 min skal musen bli dypt bedøvet og ikke svarer på tåklemmene. - Umiddelbart før du fjerner musen fra isoflurankammeret, fyll petriskållokket med kjølt sukroseløsning til en dybde på ca. 3–5 mm og fyll petriskålbunnen med kjølt sukroseløsning til en dybde på ca. 1,0 cm.
- Overfør musen raskt til venstre absorberende pute og bruk de 3 stykkene tape for å sikre forbenene og halen. Utfør en hindlimb tåklem for å sikre at musen ikke svarer før noe snitt utføres. Ved hjelp av de store vevs tang og kirurgisk saks, telt huden og gjøre et på langs snitt fra bunnen av brystbenet til toppen av brystet. Bruk tangen trekke opp på brystbenet og bruke saksen til å skjære gjennom membranen.
MERK: Den første plasseringen av musen og første flere snitt for å bryte membranen skal utføres så raskt som mulig for å sikre at musen ikke gjenvinner bevisstheten. For å sikre en tilstrekkelig dybde av anestesi gjennom hele prosedyren, kan en nesekjegle plasseres på musen for å levere isofluran under perfusjonen. - Bruk saksen til å skjære gjennom brystkassen på hver side, kutte i en stor bevegelse mot det punktet hvor forbenet møter kroppen. Med tangen svinger du forsiden av brystkassen bort og opp mot hodet, og fjern det deretter helt med et horisontalt kutt ved hjelp av den store saksen. Hold hjertet på plass ved hjelp av de store tangene og sett 20 G perfusjonsnålen inn i venstre ventrikkel. Når nålen er plassert riktig, bør venstre side av hjertet raskt bleke som kjølt sukroseløsning fyller ventrikkelen.
- Bruk den lille dissektorsaksen til å skjære inn i høyre atrium og la blodet strømme ut av sirkulasjonssystemet. Hvis snittene utføres riktig, bør det være minimal skade på hjertet, og det bør fortsette å pumpe gjennom perfusjonen.
MERK: Opprullede biter av vevspapir kan brukes til å transportere bort blod og sukroseoppløsning fra hjertet og opprettholde synligheten av perfusjonsnålen under prosedyren. - Sørg for at perfusjonsnålen forblir på plass og ikke faller ut av venstre ventrikkel. Med riktig strømningshastighet og plassering vil leveren begynne å bleke til en lys brunfarge/beige farge med 20–30 s.
- Etter 30–45 s, bruk den store saksen til å halshugge musen. Hold hodet i venstre hånd, skyv eller skrell huden bort fra skallen. I et godt perfundert dyr skal skallen være veldig blek, og hjernen skal vises en veldig lys rosa farge (nærmer seg hvit) gjennom skallen uten tydelig synlige blodkar.
5. Trekk ut hjernen og kutt skiver
- Bruk den lille Bonn-saksen, gjør to laterale kutt gjennom skallen mot midtlinjen på forsiden av skallen, nær øynene. Lag to ekstra kutt på hver side av bunnen av skallen.
- Overfør hodet til bunnen av glasset Petriskål hvor den for det meste skal nedsenkes i kjølt sukroseløsning. Bruk den lille Bonn-saksen til å kutte ned midtlinjen langs skallens lengde, og trekk opp med saksen for å minimere skade på det underliggende hjernevevet. Bruk de små vevskraftene, ta godt tak i hver side av skallen og sving den opp og bort fra hjernen, som å åpne en bok.
- Bruk fingrene på venstre hånd for å holde klaffene på skallen åpen og sett mikrospatulaen under hjernen nær olfaktoriske pærer. Vend hjernen ut av skallen inn i sukrose og bruk mikrospatulaen til å bryte hjernestammen. Vask hjernen for å fjerne eventuelle gjenværende blod, pels eller annet vev.
- Bruk den store slikkepotten/skjeen til å overføre hjernen til lokket på glasset Petriskål. Med den andre halvdelen av det dobbelteggede barberbladet som tidligere er satt til side, gjør du to koronale kutt for først å fjerne lillehjernen og deretter den mest fremre delen av hjernen, inkludert olfaktoriske pærer (figur 1).
- Påfør cyanoacrylate lim til agar rampen. Plasser hjernen veldig kort på et stykke tørt filterpapir ved hjelp av de store vevstappene og overfør den umiddelbart til agarrampen, og plasser hjernens ventrale overflate på limet.
MERK: For skiver av den mellomliggende hippocampus, bør hjernen være orientert med fremre vendt opp skråningen av rampen, og bakre nærmere bladet. For skiver av ventral hippocampus, orienter hjernen med den fremre enden pekte ned skråningen av rampen, med den bakre enden på toppen av rampen, lenger unna bladet. I begge tilfeller bør hjernen plasseres på toppen av rampen, slik at den koronalkuttede overflaten av hjernen kontakter agarens bakblokk (figur 1). - Plasser kutteplattformen med agaren og hjernen i kuttekammeret på mikrotomen og senk helt ned med kjølt sukroseløsning. Bruk den store slikkepotten/skjeen til å overføre noen sukroseslam til kammeret, rør for å smelte en frossen sukrose og raskt få ned temperaturen på blandingen til ~ 1-2 ° C.
MERK: Pass på temperaturmåleren gjennom hele kuttingen. Hvis sukroseoppløsningen varmes opp over 3 °C, tilsett mer slurry og bland for å få temperaturen ned igjen. - Skjær skiver med en tykkelse på 450 μm med mikrotomhastigheten satt til 0,07 mm/s. Som hver skive er frigjort, bruk de små vev tang og en skarp skalpell for å først skille de to halvkuler, og deretter å kutte bort vev til skiven består hovedsakelig av hippocampus og parahippocampal regioner (Figur 1).
- Bruk en plastoverføringspipette til å overføre skivene individuelt til grensesnittgjenvinningskammeret, slik at de er plassert i grensesnittet til ACSF og luften med bare en tynn menisk acsf som dekker skivene. Lukk lokket på kammeret tett og la skiver komme seg ved 32 °C i 30 min.
- Etter den første utvinningen ved 32 °C, ta grensesnittets gjenopprettingskammer ut av vannbadet og plasser på et rørersett til en langsom hastighet slik at den magnetiske rørestangen fremmer sirkulasjonen av ACSF i kammeret. La det gradvis avkjøles til romtemperatur som skivene gjenopprette i ytterligere 90 min. Sørg for at gjenopprettingskammeret stadig bobles med karbagen og ikke tillater store bobler å bli fanget under skivene.
6. Utfør lokale feltpotensiale (LFP) opptak av spontan aktivitet
- Forbered deg på LFP-opptak ved å slå på alt nødvendig utstyr, inkludert datamaskinen som kjører oppkjøpsprogramvaren, skjermen som er koblet til datamaskinen, stimulatorene, mikromanipulatoren, temperaturkontrolleren, mikroskoplyskilden, det mikroskoptilkoblede kameraet, mikroelektrorodforsterkeren, digitalisatoren og den peristaltiske pumpen. Hvis du bruker et sentralvakuumsystem, åpner du veggventilen for å klargjøre vakuumledningen som fjerner ACSF fra opptakskammeret.
- Fyll det oppvarmede reservoaret med ACSF, og plasser deretter den ene enden av slangen i det 400 ml begeret som inneholder det boblende ACSF. Slå på den peristaltiske pumpen for å lede ACSF fra 400 ml beger til det oppvarmede reservoaret, og fra reservoaret og utover til registreringskammeret. Trykk eller knip slangen for å frigjøre eventuelle fanget bobler.
- Juster den peristaltiske pumpen for å sikre at ACSF-strømningshastigheten gjennom opptakskammeret er rask (~ 8–10 ml/min). Bruk en temperatursonde for å sikre at ACSF er 32 °C i midten av opptakskammeret.
MERK: Hvis ACSF leveres til registreringskammeret ved hjelp av en peristaltisk pumpe, kan en høy strømningshastighet føre til betydelige svingninger i strømningshastigheten. Konsistente strømningshastigheter kan oppnås ved hjelp av en enkel pulsasjonsdempinger bestående av en rekke tomme sprøyter integrert i slangen (figur 2). - Forbered stimulering og opptak av pipetter fra borosilikatglasskapillærer ved hjelp av en oppvarmet filamenttrekker. Avtrekkerprotokollen bør konfigureres til å gi pipetter med en motstand på 2–3 MOhm for stimulering eller lokale feltpotensiale opptakselektroder.
- Fyll stimuleringspipetter med 1 M NaCl- og LFP-pipetter med ACSF.
- Klem kort inn slangen og slå av pumpen for å stanse strømmen av ACSF på pause. Overfør et stykke til opptakskammeret ved hjelp av fine tang for å gripe et hjørne av linsepapiret stykket hviler på skiven, vil holde seg til linsepapiret. Plasser linsepapiret og skjær i opptakskammeret med skiven vendt ned, og "skrell" bort linsepapiret og la skiven være nedsenket i opptakskammeret. Fest stykket med en harpe.
MERK: Harper kan kjøpes ferdig eller gjøres i laboratoriet ved hjelp av et U-formet stykke rustfritt stål eller platina og fin nylonfilament. - Plasser en NaCl-fylt stimuleringspipette i den manuelle mikromanipulatoren og før langsomt pipettens spiss inn i overflaten av skiven (f.eks. i stratum radiatumlaget) i en vinkel på ca. 30–45°. Når tuppen av pipetten kommer inn i vevet, før pipetten sakte fremover og avstå fra store bevegelser i sideveis eller vertikal retning som unødvendig kan skade aksoner i skiven. Plasser tuppen av pipetten minst 50–100 μm dypt inn i skiven for å unngå celler nær overflaten som ble skadet under kutting.
- Plasser en ACSF-fylt LFP-pipette i pipetteholderen som er festet til den motoriserte mikromanipulatoren. Påfør et svært lett positivt trykk ved hjelp av enten munntrykk eller en 1 ml sprøyte koblet via en stoppekranventil og en kort slangelengde til pipetteholderen.
MERK: Plasser LFP-pipetter i skiven for å registrere interessesignalene: ved skarpe bølgekrusninger bør en LFP-pipette plasseres i stratumpyramidalen (SP) og en annen pipette i stratum radiatum (SR). Denne konfigurasjonen gjør det mulig for samtidige opptak av den negative skarpe bølgen i SR og høyfrekvent rippelsvingninger i SP (figur 3). - Ved hjelp av mikromanipulatoren langsomt fremme spissen av LFP pipetten inn i området av interesse (f.eks CA1 pyramidecellelag) i en vinkel på ca 30-45°. Plasser tuppen av pipetten minst 50–100 μm dypt inn i skiven for å unngå celler nær overflaten som ble skadet under kutting. Mens du fremmer LFP-pipetten, leverer du kontinuerlig en liten spenningstestpuls ved hjelp av oppkjøpsprogramvaren og ser etter en plutselig økning i elektrodemotstand. Dette kan tyde på at pipetten er tilstoppet eller presset opp mot en celle.
- Når LFP-pipetten er plassert i interesseområdet, må du forsiktig slippe det positive trykket ved å åpne ventilen på slangen som er festet til pipetteholderen.
- Hvis du vil registrere LFP-en på et annet sted samtidig, gjentar du trinn 6.8–6.10 med en ekstra pipette og mikromanipulator.
- Bruk mikroelektrorodforsterkeren i den gjeldende klemmekonfigurasjonen til å registrere spontan aktivitet i det lokale feltpotensialet etter bruk av brobalansefunksjonen i oppkjøpsprogramvaren for å korrigere for seriemotstanden til pipetten. Spontane SWRs vil vises som positive nedbøyninger i det ekstracellulære potensialet til SP-laget (figur 3).
- For å registrere fremkalte feltpotensialer, bruk stimulatorene som er koblet til digitalisatoren til å levere en kort (200 us) firkantet spenningspuls gjennom den NaCl-fylte stimuleringspipetten. Juster stimuleringsspenningshjulet for å fremkalle en rekke responsa amplituder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Presentert her er representative opptak fra HEC skiver utarbeidet som beskrevet i denne protokollen. Etter utvinning i et grensesnitt holder kammer (Figur 1C), skiver overføres individuelt til et nedsenket opptakskammer (figur 2B). Opptakskammeret leveres med karbagenmettet ACSF ved hjelp av en peristaltisk pumpe (figur 2A). Pumpen trekker først ACSF fra et begerbeger til et oppvarmet reservoar. Karbagenledninger plasseres i både holderbegeret og det oppvarmede reservoaret for å gi kontinuerlig oksygenering av media. En pulsasjonsdemper, bestående av en rekke luftfylte sprøyter, er plassert mellom den peristaltiske pumpen og opptakskammeret for å minimere svingningene i strømningshastigheten produsert av rask peristaltikk. Luftlommen i hver sprøyte absorberer trykkendringene forårsaket av hver syklus av pumpen, slik at opptakskammeret får en jevn og konsekvent strømning av ACSF52,53. En innebygd varmeapparat plassert etter pulseringsdemperen sikrer at temperaturen på ACSF holdes ved 32 °C når den kommer inn i registreringskammeret.
I dette eksemplet består det doble superfusjonsopptakskammeret av tre 3D-trykte lag (figur 2B). Det nederste laget har en rektangulær utskjæring for å passe en dekkslipp, sikret med vakuumfett. Det midterste laget inneholder den nederste halvdelen av et langstrakt ovalt kammer, med to horisontale støtter. Nylon filament er spent på tvers av disse støttene (omtrent hver 0,5 mm) og sikret med cyanoacrylat lim. Skiven vil hvile på toppen av denne spente filamentet. Det øverste laget inneholder den øvre halvdelen av det ovale kammeret sammen med små brønner der sølvkloridbakken pellets kan plasseres. Den langstrakte ovale formen på kammeret er designet for å fremme rask laminær flyt av ACSF.
Figur 3 presenterer representative opptak fra HEC-skiver utarbeidet i henhold til denne protokollen. For først å vurdere skivehelse, fremkales feltpostsynaptiske potensialer (fPSPs) i stratum radiatum (SR) ved hjelp av en pipette fylt med 1 M nacl. I sunne skiver bør elektrisk stimulering produsere en fPSP med en liten presynaptisk fibervolley og et stort postsynaptisk potensial med en rask innledende nedstigning (figur 3B, øvre venstre). I sunne skiver er spontane skarpe bølgekrusninger (SWRs) synlige som positive nedbøyninger i LFP i stratumpyramidale (figur 3B, nedre venstre). I suboptimale skiver fremkalt fPSPs viser en stor fibervolley og et relativt lite postsynaptisk potensial, og slike skiver viser ikke spontane SWRs (Figur 3B, høyre). SWRs in vitro viser egenskaper som er i samsvar med publiserte beskrivelser: et positivt feltpotensial i SP-laget med en overlaid høyfrekvent oscillasjon, sammen med et negativt feltpotensial i SR-laget (figur 3C). En enkelt SWR registrert i CA2 er indikert med en stjerne ( figur3C, høyre). SwRs i HEC skiver stammer fra CA2 / CA3 tilbakevendende kretser og forplante seg til CA1. En enkelt SWR observert i CA2- og CA1 SP-laget er angitt med en stjerne (figur 3D, høyre). I dette representative eksemplet fører CA2 SWR (grønn) som i CA1 (blå) med flere millisekunder, som vist i overlegget av SWR-konvolutten (filtrert ved 2–30 Hz) registrert i hvert område.
Figur 1: Fremstilling av horisontale vinklede hippocampal-entorhinal cortex (HEC) skiver. (A) (i)Etter å ha hentet hjernen, utfør to koronarkutt med et barberblad for å fjerne bakre og fremre deler av hjernen. (ii) Agarrampen er dannet av to vinklede deler limt til mikrotomslicing-plattformen. For å forberede skiver av den mellomliggende hippocampus, plasser hjerneblokken på agarrampen med den fremre overflaten vendt opp skråningen og ta kontakt med den høye backingdelen av rampen. For å forberede skiver av mer ventral hippocampus, plasser hjerneblokken på agarrampen med den fremre overflaten vendt nedover skråningen, slik at den bakre kuttoverflaten kommer i kontakt med den høye bakdelen av rampen. (iii) Når hver skive er frigjort, utfør flere kutt med skalpell for å skille halvkulene og fjerne unødvendig vev. (B) Representativt bilde av den resulterende skiven med cellekjerner merket av DAPI. (C) I et grensesnittgjenvinningskammer plasseres skiver på stykker linsepapir på toppen av et rustfritt stål eller nylonnett, på nivå med overflaten av ACSF. En keramisk bubbler formidler karbagen inn i kammeret og en magnetisk rørestang blander kontinuerlig væsken i kammeret. En tynn film av ACSF dekker den øverste overflaten av skiven, noe som forbedrer diffusjonen av oksygen fra den fuktige karbagenrike luften i kammeret. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Dobbelt overflatesuperfusjonsopptakskammer med pulsasjonsdemper i ACSF-leveringsslangen. (A) Diagram over superfusjonssystemet. ACSF varmes opp til 32 °C, bobler kontinuerlig med karbagengass, og leveres ved ca. 8–10 ml/min ved hjelp av en peristaltisk pumpe med pulseringsdemper bestående av en rekke luftfylte sprøyter. (B)Opptakskammeret består av tre 3D-trykte lag, hvor midten er tredd med nylonfilament. Skiven hviler på denne spente filament og ACSF flyter over og under vevet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative opptak av spontane skarpe bølgekrusninger fra HEC-skiver. (A) Et forenklet diagram av HEC-skiven som viser posisjonene til opptaks- og stimuleringselektrodene. (B) Representative opptak av LFP-aktivitet fra både en aktiv, sunn skive og en suboptimal skive. Den sunne skiven (venstre, i grønt) viser store fremkalte feltresponser og spontane skarpe bølgekrusninger (SWRs), synlig som uregelmessig forekommende positive nedbøyninger i det lokale feltpotensialet i SP-laget. I motsetning viser en usunn skive små fremkalte feltresponser og ingen spontan aktivitet (høyre, i grått). (C) Representative opptak av SWRs i CA2-regionen, bestående av en negativ nedbøyning i LFP i SR-laget og en høyfrekvent svingning med en underliggende positiv nedbøyning i LFP i SP-laget. Topper i hver kanal som er større enn tre standardavvik for signalalituden, er uthevet i rødt. Et båndpassfilter på henholdsvis 2–30 Hz isolerer den underliggende positive og negative konvolutten til den skarpe bølgen i SP- og SR-laget, mens et båndpassfilter på 80–250 Hz brukes til å isolere den høyfrekvente svingningen av krusningen i SP-laget. (D) SWRs in vitro forplanter seg fra CA2/CA3 til CA1. I disse representative opptakene går SWRs i CA2 (grønn, bunn) foran det i CA1 (blå, øverst) med flere millisekunder. Topper i hver kanal som er større enn tre standardavvik for signalalituden, er uthevet i rødt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| molekylvekt (gram / mol) | endelig konsentrasjon (mM) | gram / 1 L sukrose skjæreoppløsning | ||
| Sukrose | C12H22O11 | 342.3 | 195 | 66.749 |
| natriumklorid | Nacl | 58.44 | 10 | 0.584 |
| Glukose | C6T12O6 | 180.08 | 10 | 1.801 |
| natriumbikarbonat | NaHCO3 | 84.01 | 25 | 2.1 |
| kaliumklorid | KCl (andre | 74.55 | 2.5 | 0.186 |
| natriumfosfat monobasisk vannfri | NaH2PO4 | 137.99 | 1.25 | 0.173 |
| natrium pyruvat | C3H3NaO3 | 110.04 | 2 | 0.22 |
| lagerkonsentrasjon (M) | endelig konsentrasjon (mM) | milliliter / 1L sukrose skjæreoppløsning | ||
| kalsiumklorid | CaCl2 Leilighet | 1 | 0.5 | 0.5 |
| magnesiumklorid | MgCl2 Leilighet | 1 | 7 | 7 |
Tabell 1: Sammensetning av sukrose skjæreoppløsning. Begynn med ca. 0,75 l renset vann som er filtrert for å fjerne spormetaller og andre urenheter. Oppløs hver solid mens du blander løsningen med en magnetisk rørestang. Når alle faste stoffer er oppløst, boble karbaogengass gjennom løsningen i 10 min. Tilsett MgCl2- og CaCl2-løsningene og tilsett vann for å bringe det totale volumet til 1 L. Bland med en magnetisk rørestang i 10 min for å sikre at oppløsningen blandes jevnt. Osmolariteten skal være mellom 315 og 325 mOsm, og pH bør være ca 7,4.
| molekylvekt (gram / mol) | endelig konsentrasjon (mM) | gram / 2L ACSF | ||
| natriumklorid | Nacl | 58.44 | 125 | 14.61 |
| Glukose | C6T12O6 | 180.08 | 12.5 | 4.502 |
| natriumbikarbonat | NaHCO3 | 84.01 | 25 | 4.201 |
| kaliumklorid | KCl (andre | 74.55 | 3.5 | 0.522 |
| natriumfosfat monobasisk vannfri | NaH2PO4 | 137.99 | 1.25 | 0.345 |
| askorbinsyre | C6H8O6 | 176.12 | 1 | 0.352 |
| natrium pyruvat | C3H3NaO3 | 110.04 | 3 | 0.66 |
| lagerkonsentrasjon (M) | endelig konsentrasjon (mM) | milliliter / 2L ACSF | ||
| kalsiumklorid | CaCl2 Leilighet | 1 | 1.6 | 3.2 |
| magnesiumklorid | MgCl2 Leilighet | 1 | 1.2 | 2.4 |
Tabell 2: Sammensetning av kunstig cerebrospinalvæske. Begynn med ca. 1,5 l renset vann som er filtrert for å fjerne spormetaller og andre urenheter. Oppløs hver solid mens du blander løsningen med en magnetisk rørestang. Når alle faste stoffer er oppløst, boble karbaogengass gjennom løsningen i 10 min. Tilsett MgCl2- og CaCl2-løsningene og tilsett vann for å bringe det totale volumet til 2 L. Bland med en magnetisk rørestang i 10 min for å sikre at oppløsningen blandes jevnt. Osmolariteten skal være mellom 315 og 325 mOsm, og pH bør være ca 7,4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er flere trinn i denne kutteprotokollen designet for å fremme vevshelse og favorisere fremveksten av spontan naturalistisk nettverksaktivitet: musen er transcardially perfused med kjølt sukrose kutte løsning; horisontal-entorhinal cortex (HEC) skiver er kuttet med en tykkelse på 450 μm fra mellomliggende eller ventral hippocampus; skiver gjenopprette på grensesnittet av oppvarmet ACSF og fuktet, karbagen-rik luft; under opptak skiver er superfundert med ACSF varmet til 32 ° C og leveres med en rask strømningshastighet med dual-overflate superfusjon i et nedsenket opptakskammer.
Slice helse er av avgjørende betydning for generering av nettverkssvingninger in vitro. Unge dyr vil gi mer sunne skiver, og vanligvis med unge eller unge mus kan transcardialperfusjonstrinnet hoppes over. Etter hvert som dyrene blir eldre, blir det stadig vanskeligere å lage sunne skiver, men noen undersøkelser (som sykdomsmodeller eller langsgående studier) nødvendiggjør bruk av voksne eller aldrende dyr. Dengler et al., for eksempel, brukte transkardiode perfusjoner i deres fremstilling av HEC-skiver fra pilokarpinbehandlet kronisk epileptiske voksne mus50. Med voksne mus er det gunstig å utføre en transkardiolenfusjon med kjølt sukrosekutteløsning for å kjøle vevet, fjerne blod fra hjernen og redusere metabolsk aktivitet før du fjerner hjernen fra skallen51. Det er imidlertid viktig å merke seg at transkardiode perfusjoner krever at opplæring utføres riktig, og det må tas hensyn til at prosedyren utføres raskt og på en måte som ikke utgjør en risiko for dyrevelferd. Når det er mulig, bør eksperimenter utformes for å bruke unge dyr for å utelukke bruk av transkarbale perfusjoner. I en suboptimal skive forberedelse, vil det ikke være nok friske celler, spesielt interneurons, for å støtte pågående nettverkssvingninger. For å vurdere skivehelse under forsøket, er det nyttig å først registrere fremkalte feltpotensialer (for eksempel med en stimuleringpipette og en opptakspipett i stratum radiatum, SR). I en sunn skive vil stimulering i SR-laget fremkalle et stort felt postsynaptisk potensial (fPSP) med en relativt liten presynaptisk fibervolley (figur 3).
Skivene produsert av denne protokollen er vinklet horisontale hippocampal-entorhinal cortex (HEC) skiver. Viktigere, verken inkludering av parahippocampal vev eller vinklet kutt er nødvendig for hippocampal skiver å spontant generere nettverksaktiviteter som SWRs. Faktisk har mange studier benyttet horisontale eller tverrgående hippocampal skiver for å avhøre aspekter av fysiologiske25,40,41,44 eller patologiske nettverkssvingninger33,38. I denne protokollen gjør plasseringen av hjernen på en agarrampe at eksperimentereren selektivt kan produsere flere skiver fra enten ventral eller mellomliggende hippocampus (figur 1), som kan være gunstig for eksperimentelle mål som tar hensyn til den funksjonelle heterogeniteten som eksisterer langs hippocampus langs langsgåendeakse 26,31. Hvis den anatomiske opprinnelsen til skivene ikke er en faktor, kan agarrampen utelukkes, og et ekte horisontalt skjæreplan vil gi skiver av mellomliggende-til-ventral hippocampus. Etter hvert som hver horisontale vevsskive frigjøres, kan de fleste unødvendige deler av skiven fjernes med tre enkle kutt, slik at en omtrent rektangulær skive som inneholder hippocampus og noe omkringliggende vev, inkludert parahippocampalregionen (figur 1). Videre disseksjon kan utføres for å fjerne alle ekstrahippocampal vev, men inkludering av omkringliggende vev er gunstig, ved at skiveharpen lett kan plasseres slik at nylonfilamenter ikke hviler over hippocampus riktig. Som omtalt ovenfor, er den kombinerte HEC-skiven også et nyttig preparat for å undersøke et større kortikohippocampalnettverk i sammenheng med fysiologiske37 ellerpatologiske 16,35,36,38 nettverkssvingninger.
Den viktigste faktoren i denne protokollen er å optimalisere oksygentilførselen til vevet, både under gjenopprettingsfasen og under opptakene. Mange studier av nettverkssvingninger utføres i skiver som overføres direkte fra mikrotomen til et grensesnittopptakskammer og lov til å gjenopprette med kontinuerlig perfusjon av frisk ACSF. Etter flere timer med gjenoppretting kan opptak deretter utføres i samme grensesnittkammer. Dermed holdes skiver i grensesnittet til ACSF og fuktig karbaogenrik luft i hele eksperimentets varighet. I den alternative metodikken som presenteres i denne protokollen, gjenoppretter skiver i et grensesnitt-stil holder kammer i minst to timer før individuelle skiver overføres til en nedsenket stil opptakskammer med tilstrekkelig raske ACSF strømningshastigheter. Skiver utarbeidet under disse forholdene kan vise stabile gammasvingninger12 eller spontan SWR aktivitet43. Slice utvinning i et grensesnitt-stil holder kammer er et kritisk skritt: Maier et al. demonstrert at skiver som gjenoppretter i et beger helt nedsenket i ACSF viser mindre fremkalte felt potensialer, mindre hyppige spontane postsynaptiske strømmer, og bare sjelden produsere spontan nettverksaktivitet43. På samme måte viste Hájos et al. at raske ACSF-strømningshastigheter resulterer i en høyere frekvens av spontane hemmende postsynaptiske strømmer, noe som tyder på forbedret internuronal aktivitet49. I løpet av opptaksperioden er ikke dobbeltoverflate superfusjon strengt nødvendig, forutsatt at opptakskammeret har et relativt lite volum ACSF levert med en rask strømningshastighet (minst 6 ml/ min)43. 3D trykt opptakskammer presentert i denne protokollen (Figur 2B) er et relativt kostnadseffektivt og et enkelt alternativ, men det er også kommersielt tilgjengelige nedsenket opptakskamre designet for å holde mindre volumer, fremme laminær flyt av media, eller gi dual-surface superfusjon (i motsetning til sirkulære opptakskamre, for eksempel, som tillater overflødig dødt volum av ACSF).
Selv om denne protokollen tillater en å registrere nettverkssvingninger uten kravet om et tradisjonelt grensesnittopptakskammer, er det flere begrensninger. Selv om skiver holdes i ACSF-luftgrensesnittet i gjenopprettingsperioden, mottar de ikke kontinuerlig perfusjon av friske medier som oppstår i tradisjonelle Haas-stil grensesnittopptakskamre. Skiver må overføres individuelt (ved hjelp av fine tang) fra gjenopprettingskammeret til det nedsenkede opptakskammeret. Videre kan raske strømningshastigheter forårsake ustabilitet og bevegelsesartefakter problematisk for enkelte opptak, spesielt hvis ACSF leveres med en peristaltisk pumpe. For å opprettholde raske strømningshastigheter og minimere mekaniske forstyrrelser, kan en enkel pulsasjonsdemper integreres i perfusjonssystemet (figur 2). Denne pulsasjonsdempingen fungerer ved hjelp avWindkessel-effekten 52, der tomme sprøyter inneholder luftlommer som fungerer som elastiske reservoarer, og absorberer det varierende trykket som genereres av rullene til den peristaltiske pumpen53. Inkorporering av en pulsdemping kan imidlertid legge til lengde på slangen som leverer ACSF til opptakskammeret og påvirke oksygentilførselen til skiven. Strømningshastigheter bør bare være så raske som nødvendig for å gi stabile nettverkssvingninger, og hvis en peristaltisk pumpe brukes, bør den ideelt sett være en pumpe som bruker et stort antall ruller (> 12) for å minimere pulseringen forårsaket av peristaltikk, utelukke bruk av en pulseringsdemper, og sørg for at slangen som leverer ACSF til opptakskammeret er så kort som mulig. Opptak utført med raske strømningshastigheter krever også store mengder ACSF, noe som kan være problematisk hvis eksperimenter krever tilsetning av verdifulle eller dyre stoffer eller forbindelser til media. Selv om et superfusjonskammer med to overflater krever et spesialkonstruert opptakskammer med to væskeinntak for å levere oksygenerte medier til begge sider av skiven, kan spontane nettverkssvingninger observeres med moderate ACSF-strømningshastigheter48. Denne protokollen benytter både en rask strømningshastighet (stabilisert med en pulsasjonsdemper) og et superfusjonskammer med to overflater for å øke sannsynligheten for å observere spontan aktivitet.
Til slutt har denne protokollen et lavt utbytte med hensyn til antall skiver produsert per dyr. Horisontal kutting med en tykkelse på 450 μm gir et lite antall HEC-skiver i foretrukket retning (der skiven er effektivt parallelt med den tverrgående aksen til hippocampus). Av disse skivene viser vanligvis bare en eller to per hippocampi spontan SWR-aktivitet, færre enn det som er rapportert andre steder43. Selv om tykkere skiver antagelig inneholder en større grad av tilbakevendende tilkobling, kan kutting av litt tynnere skiver (400 μm) gi et større antall per mus av tverrgående orienterte skiver med SWR-aktivitet. I tillegg kan sannsynligheten for at flere skiver pålitelig viser spontan SWR-aktivitet være høyere i eksperimenter som benytter sanne horisontale eller nedadgående vinklede skiver av ventral hippocampus. Den nåværende protokollen inkorporerer bruken av oppadgående vinklede horisontale skiver av den mellomliggende hippocampus, som kan være mindre sannsynlig å vise spontan nettverksaktivitet i forhold til skiver fra ventral hippocampus25,26,31. Til slutt brukte denne protokollen skiver fra unge og voksne mus. Mens transcardial perfusjoner kan forbedre kvaliteten på skiver fra eldre dyr, kan sannsynligheten for å observere spontane nettverksaktiviteter forbedres ved bruk av skiver fra yngre dyr12,41,44.
Oppsummert presenterer denne protokollen en mushjerne som kutter tilnærming som gir vinklede horisontale hippocampal-entorhinale cortex skiver fra mellomliggende eller ventral hippocampal formasjon som kan vise komplekse spontane nettverksaktivitet i form av skarpe bølge-krusning komplekser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatteren vil gjerne takke Steve Siegelbaum for støtte. Det gis midler fra 5R01NS106983-02 samt 1 F31 NS113466-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Lulzbot | LulzBot TAZ 6 | |
| Acute brain slice incubation holder | NIH 3D Print Exchange | 3DPX-001623 | Designed by ChiaMing Lee, available at https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623 |
| Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma Aldrich | A9187-500MG | |
| Ag-Cl ground pellets | Warner | 64-1309, (E205) | |
| agar | Becton, Dickinson | 214530-500g | |
| ascorbic acid | Alfa Aesar | 36237 | |
| beaker (250 mL) | Kimax | 14000-250 | |
| beaker (400 mL) | Kimax | 14000-400 | |
| biocytin | Sigma Aldrich | B4261 | |
| blender | Oster | BRLY07-B00-NP0 | |
| Bonn scissors, small | becton, Dickinson | 14184-09 | |
| borosilicate glass capillaries with filament (O.D. 1.5 mm, I.D. 0.86 mm, length 10 cm) | Sutter Instruments | BF150-86-10HP | Fire polished capillaries are preferable. |
| calcium chloride solution (1 M) | G-Biosciences | R040 | |
| camera | Olympus | OLY-150 | |
| compressed carbogen gas (95% oxygen / 5% carbon dioxide) | Airgas | X02OX95C2003102 | |
| compressed oxygen | Airgas | OX 200 | |
| constant voltage isolated stimulator | Digitimer Ltd. | DS2A-Mk.II | |
| coverslips (22x50 mm) | VWR | 16004-314 | |
| cyanoacrylate adhesive | Krazy Glue | KG925 | Ideally use the brush-on form for precision |
| data acquisition software | Axograph | N/A | Any equivalent software (e.g. pClamp) would work. |
| Dell Precision T1500 Tower Workstation Desktop | Dell | N/A | Catalog number will depend on specific computer - any computer will work as long as it can run electrophysiology acquisition software. |
| Digidata 1440A | Molecular Devices | 1-2950-0367 | |
| digital timer | VWR | 62344-641 | 4-channel Traceable timer |
| disposable absorbant pads | VWR | 56616-018 | |
| dissector scissors | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| double-edge razor blades | Personna | BP9020 | |
| dual automatic temperature controller | Warner Instrument Corporation | TC-344B | |
| dual-surface or laminar-flow optimized recording chamber | N/A | N/A | The chamber presented in this protocol is custom made. A commercial equivalent would be the RC-27L from Warner Instruments. |
| equipment rack | Automate Scientific | FR-EQ70" | A rack is not strictly necessary but useful for organizing electrophysiology |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethyiether)- N,N,N',N'-teetraacetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | 324626-25GM | |
| filter paper | Whatman | 1004 070 | |
| fine scale | Mettler Toledo | XS204DR | |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| glass petri dish (100 x 15 mm) | Corning | 3160-101 | |
| glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G8877-250MG | |
| ice buckets | Sigma Aldrich | BAM168072002-1EA | |
| isoflurane vaporizer | General Anesthetic Services | Tec 3 | |
| lab tape | Fisher Scientific | 15-901-10R | |
| lens paper | Fisher Scientific | 11-996 | |
| light source | Olympus | TH4-100 | |
| magnesium chloride solution (1 M) | Quality Biological | 351-033-721EA | |
| magnetic stir bars | Fisher Scientific | 14-513-56 | Catalog number will be dependent on the size of the stir bar. |
| micromanipulator | Luigs & Neumann | SM-5 | |
| micromanipulator (manual) | Scientifica | LBM-2000-00 | |
| microscope | Olympus | BX51WI | |
| microspatula | Fine Science Tools | 10089-11 | |
| monitor | Dell | 2007FPb | |
| MultiClamp 700B Microelectrode Amplifier | Molecular Devices | MULTICLAMP 700B | The MultiClamp 700B should include headstages, pipette holders, and a model cell. |
| N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), (HEPES) | Sigma Aldrich | H3375-25G | |
| needle (20 gauge, 1.5 in length) | Becton, Dickinson | 305176 | |
| nylon filament | YLI Wonder Invisible Thread | 212-15-004 | size 0.004. This cat. # is from Amazon.com |
| nylon mesh | Warner Instruments Corporation | 64-0198 | |
| perstaltic pump | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
| Phosphocreatine di(tris) salt | Sigma Aldrich | P1937-1G | |
| pipette holders | Molecular Devices | 1-HL-U | |
| platinum wire | World Precision | PT0203 | |
| polylactic acid (PLA) filament | Ultimaker | RAL 9010 | |
| potassium chloride | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| potassium gluconate | Sigma Aldrich | 1550001-200MG | |
| potassium hydroxide | Sigma Aldrich | 60377-1KG | |
| razor blades | VWR | 55411-050 | |
| roller clamp | World Precision Instruments | 14041 | |
| scale | Mettler Toledo | PM2000 | |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| slice harp | Warner | SHD-26GH/2 | |
| sodium bicarbonate | Fisher Chemical | S233-500 | |
| sodium chloride | Sigma Aldrich | S9888-1KG | |
| sodium phosphate monobasic anhydrous | Fisher Chemical | S369-500 | |
| sodium pyruvate | Fisher Chemical | BP356-100 | |
| spatula | VWR | 82027-520 | |
| spatula/spoon, large | VWR | 470149-442 | |
| sterile scalpel blades | Feather | 72044-10 | |
| stirrer / hot plate | Corning | 6795-220 | |
| stopcock valves, 1-way | World Precision Instruments | 14054 | |
| stopcock valves, 3-way | World Precision Instruments | 14036 | |
| sucrose | Acros Organics | AC177142500 | |
| support for swivel clamps | Fisher Scientific | 14-679Q | |
| surgical scissors, sharp/blunt | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| syringe (1 mL) | Becton, Dickinson | 309659 | |
| syringe (60 mL with Luer-Lok tip) | Becton, Dickinson | 309653 | |
| three-pronged clamp | Fisher Scientific | 05-769-8Q | |
| tissue forceps, large | Fine Science Tools | 11021-15 | |
| tissue forceps, small | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| tubing | Tygon | E-3603 | ID 1/16 inch, OD 3/16 inch |
| tubing | Tygon | R-3603 | ID 1/8 inch, OD 1/4 inch |
| vacuum grease | Dow Corning | 14-635-5D | |
| vibrating blade microtome | Leica | VT 1200S | |
| vibration-dampening table with faraday cage | Micro-G / TMC-ametek | 2536-516-4-30PE | |
| volumetric flask (1 L) | Kimax | KIM-28014-1000 | |
| volumetric flask (2 L) | PYREX | 65640-2000 | |
| warm water bath | VWR | 1209 |
References
- Buzsáki, G., Lai-Wo, S., Vanderwolf, C. H. Cellular bases of hippocampal EEG in the behaving rat. Brain Research Reviews. 6, 139-171 (1983).
- Buzsáki, G. Hippocampal sharp waves: Their origin and significance. Brain Research. 398, 242-253 (1986).
- Buzsáki, G., Horváth, Z., Urioste, R., Hetke, J., Wise, K. High-frequency network oscillation in the hippocampus. Science. 256, 1025-1027 (1992).
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents — EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews Neuroscience. 13, 407-420 (2012).
- Buzsáki, G. Hippocampal sharp wave-ripple: A cognitive biomarker for episodic memory and planning. Hippocampus. 25, 1073 (2015).
- Maier, N., et al. Reduction of high-frequency network oscillations (ripples) and pathological network discharges in hippocampal slices from connexin 36-deficient mice. Journal of Physiology. 541, 521-528 (2002).
- Maier, N., Nimmrich, V., Draguhn, A. Cellular and network mechanisms underlying spontaneous sharp wave-ripple complexes in mouse hippocampal slices. Journal of Physiology. 550, 873-887 (2003).
- ul Haq, R., et al. Adrenergic modulation of sharp wave-ripple activity in rat hippocampal slices. Hippocampus. 22, 516-533 (2012).
- ul Haq, R., et al. Serotonin dependent masking of hippocampal sharp wave ripples. Neuropharmacology. 101, 188-203 (2016).
- Maier, P., Kaiser, M. E., Grinevich, V., Draguhn, A., Both, M. Differential effects of oxytocin on mouse hippocampal oscillations in vitro. European Journal of Neuroscience. 44, 2885-2898 (2016).
- Mizunuma, M., et al. Unbalanced excitability underlies offline reactivation of behaviorally activated neurons. Nature Neuroscience. 17, 503-505 (2014).
- Hájos, N., et al. Spike timing of distinct types of GABAergic interneuron during hippocampal gamma oscillations in vitro. Journal of Neuroscience. 24, 9127-9137 (2004).
- Geschwill, P., et al. Synchronicity of excitatory inputs drives hippocampal networks to distinct oscillatory patterns. Hippocampus. , (2020).
- Rutecki, P. A., Grossmann, R. G., Armstrong, D., Irish-Loewen, S. Electrophysiological connections between the hippocampus and entorhinal cortex in patients with complex partial seizures. Journal of Neurosurgery. 70, 667-675 (1989).
- Lothman, E. W., Bertram, E. H., Stringer, J. L. Functional anatomy of hippocampal seizures. Progress in Neurobiology. 37, 1-82 (1991).
- Carter, D. S., Deshpande, L. S., Rafiq, A., Sombati, S., Delorenzo, R. J. Characterization of spontaneous recurrent epileptiform discharges in hippocampal - cortical slices prepared from chronic epileptic animals. Seizure: European Journal of Epilepsy. 20, 218-224 (2011).
- Karlócai, M. R., et al. Physiological sharp wave-ripples and interictal events in vitro: What's the difference. Brain. 137, 463-485 (2014).
- Leroy, F., et al. Input-timing-dependent plasticity in the hippocampal CA2 region and its potential role in social memory. Neuron. 95, 1089-1102 (2017).
- Sun, Q., et al. Proximodistal heterogeneity of hippocampal CA3 pyramidal neuron intrinsic properties, connectivity, and reactivation during memory recall. Neuron. 95, 656-672 (2017).
- Masurkar, A. V., et al. Medial and lateral entorhinal cortex differentially excite deep versus superficial CA1 pyramidal neurons. Cell Reports. 18, 1-13 (2017).
- Papatheodoropoulos, C., Kostopoulos, G. Spontaneous, low frequency (∼2-3 Hz) field activity generated in rat ventral hippocampal slices perfused with normal medium. Brain Research Bulletin. 57, 187-193 (2002).
- Papatheodoropoulos, C., Kostopoulos, G. Spontaneous GABAA-dependent synchronous periodic activity in adult rat ventral hippocampal slices. Neuroscience Letters. 319, 17-20 (2002).
- Kubota, D., Colgin, L. L., Casale, M., Brucher, F. A., Lynch, G. Endogenous waves in hippocampal slices. Journal of Neurophysiology. 89, 81-89 (2003).
- Behrens, C. J., Van Den Boom, L. P., De Hoz, L., Friedman, A., Heinemann, U. Induction of sharp wave - complexes in vitro and reorganization of hippocampal networks. Nature Neuroscience. 8, 1560-1567 (2005).
- Kouvaros, S., Papatheodoropoulos, C. Prominent differences in sharp waves, ripples and complex spike bursts between the dorsal and the ventral rat hippocampus. Neuroscience. 352, 131-143 (2017).
- Strange, B. A., Witter, M. P., Lein, E. S., Moser, E. I. Functional organization of the hippocampal longitudinal axis. Nature Reviews Neuroscience. 15, 655-669 (2014).
- Patel, J., Fujisawa, S., Berényi, A., Royer, S., Buzsáki, G. Traveling Theta Waves along the Entire Septotemporal Axis of the Hippocampus. Neuron. 75, 410-417 (2012).
- Patel, J., Schomburg, E. W., Berényi, A., Fujisawa, S., Buzsáki, G. Local generation and propagation of ripples along the septotemporal axis of the hippocampus. Journal of Neuroscience. 33, 17029-17041 (2013).
- Fricke, R., Cowan, W. M. An autoradiographic study of the commissural and ipsilateral hippocampo-dentate projections in the adult rat. Journal of Comparative Neurology. 181, 253-269 (1978).
- Ishizuka, N. O. R., Weber, J., Amaral, D. G. Organization of intrahippocampal projections originating from CA3 pyramidal cells in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 623, 580-623 (1990).
- Papatheodoropoulos, C. Electrophysiological evidence for long-axis intrinsic diversification of the hippocampus. Frontiers in Bioscience - Landmark. 23, 109-145 (2018).
- Gilbert, M., Racine, R. J., Smith, G. K. Epileptiform burst responses in ventral vs dorsal hippocampal slices. Brain Research. 361, 389-391 (1985).
- Papatheodoropoulos, C., Moschovos, C., Kostopoulos, G. Greater contribution of N-methyl-D-aspartic acid receptors in ventral compared to dorsal hippocampal slices in the expression and long-term maintenance of epileptiform activity. Neuroscience. 135, 765-779 (2005).
- Jones, R. S. G., Heinemann, U. Synaptic and intrinsic responses of medial entorhinal cortical cells in normal and magnesium-free medium in vitro. Journal of Neurophysiology. 59, (1988).
- Rafiq, A., Delorenzo, R. J., Coulter, D. A. Generation and propagation of epileptiform discharges in a combined entorhinal cortex / hippocampal slice. Journal of Neurophysiology. 70, 1962-1974 (1993).
- Stoop, R., Pralong, E. Functional connections and epileptic spread between hippocampus, entorhinal cortex and amygdala in a modified horizontal slice preparation of the rat brain. European Journal of Neuroscience. 12, 3651-3663 (2000).
- Roth, F. C., Beyer, K. M., Both, M., Draguhn, A., Egorov, A. V. Downstream effects of hippocampal sharp wave ripple oscillations on medial entorhinal cortex layer V neurons in vitro. Hippocampus. 26, 1493-1508 (2016).
- Bertsche, A., Bruehl, C., Pietz, J., Draguhn, A. Region- and pattern-specific effects of glutamate uptake blockers on epileptiform activity in rat brain slices. Epilepsy Research. 88, 118-126 (2010).
- Wu, C., Shen, H., Luk, W. P., Zhang, L. A fundamental oscillatory state of isolated rodent hippocampus. Journal of Physiology. 540, 509-527 (2002).
- Colgin, L. L., Jia, Y., Sabatier, J. M., Lynch, G. Blockade of NMDA receptors enhances spontaneous sharp waves in rat hippocampal slices. Neuroscience Letters. 385, 46-51 (2005).
- Ellender, T. J., Nissen, W., Colgin, L. L., Mann, E. O., Paulsen, O. Priming of hippocampal population bursts by individual perisomatic-targeting interneurons. The Journal of Neuroscience. 30, 5979-5991 (2010).
- Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. A. Comparison of different slicing planes in preservation of major hippocampal pathway fibers in the mouse. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 1-17 (2017).
- Maier, N., Morris, G., Johenning, F. W., Schmitz, D. An approach for reliably investigating hippocampal sharp wave-ripples in vitro. PLoS One. 4, 6925 (2009).
- Schlingloff, D., Kali, S., Freund, T. F., Hajos, N., Gulyas, A. I. Mechanisms of sharp wave initiation and ripple generation. Journal of Neuroscience. 34, 11385-11398 (2014).
- McCloskey, D. P., Scharfman, H. E. Progressive, potassium-sensitive epileptiform activity in hippocampal area CA3 of pilocarpine-treated rats with recurrent seizures. Epilepsy Research. 97, 92-102 (2011).
- McMahon, L. L., Williams, J. H., Kauer, J. A. Functionally distinct groups of interneurons identified during rhythmic carbachol oscillations in hippocampus in vitro. Journal of Neuroscience. 18, 5640-5651 (1998).
- Pöschel, B., Heinemann, U., Draguhn, A. High frequency oscillations in the dentate gyrus of rat hippocampal slices induced by tetanic stimulation. Brain Research. 959, 320-327 (2003).
- Hájos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. European Journal of Neuroscience. 29, 319-327 (2009).
- Hájos, N., Mody, I. Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content. Journal of Neuroscience Methods. 183, 107-113 (2009).
- Dengler, C. G., Yue, C., Takano, H., Coulter, D. A. Massively augmented hippocampal dentate granule cell activation accompanies epilepsy development. Nature Publishing Group. , 1-17 (2017).
- Ting, J. T., et al. Preparation of acute brain slices using an optimized N -methyl-D-glucamine protective recovery method. Journal of Visualized Experiments. 132, 1-13 (2018).
- Westerhof, N., Lankhaar, J. W., Westerhof, B. E. The arterial windkessel. Medical and Biological Engineering and Computing. 47, 131-141 (2009).
- Shi, W. X., Bunney, B. S. A small volume chamber for electrical recording from submerged brain slices and a pulse-free medium supply system using a peristalic pump. Journal of Neuroscience Methods. 35, 235-240 (1990).
