Summary
Denne protokol beskriver forberedelsen af vandrette hippocampal-entorhinal cortex (HEC) skiver fra mus, der udviser spontan skarpbølge krusningsaktivitet. Skiver inkuberes i et forenklet grænsefladeholderkammer, og optagelser udføres under neddykkede forhold med hurtigtflydende kunstig cerebrospinalvæske for at fremme iltning af væv og spontan fremkomst af aktivitet på netværksniveau.
Abstract
Akut gnaver hjerne udskæring tilbyder en tractable eksperimentel tilgang til at få indsigt i organiseringen og funktionen af neurale kredsløb med enkelt-celle opløsning ved hjælp af elektrofysiologi, mikroskopi, og farmakologi. En vigtig overvejelse i udformningen af in vitro-eksperimenter er imidlertid, i hvilket omfang forskellige skivepræparater sammenfatter naturalistiske mønstre af neural aktivitet som observeret in vivo. I den intakte hjerne genererer hippocampalnetværket stærkt synkroniseret befolkningsaktivitet, der afspejler dyrets adfærdsmæssige tilstand, som eksemplificeret ved de skarpe bølge krusningskomplekser (SWR'er), der opstår under vågne fuldbyrdelsestilstande eller ikke-REM-søvn. Stålwirer og andre former for netværksaktivitet kan opstå spontant i isolerede hippocampale skiver under passende forhold. For at anvende den kraftfulde hjerneskiveværktøjssæt til undersøgelse af hippocampal netværksaktivitet er det nødvendigt at bruge en tilgang, der optimerer vævssundheden og bevarelsen af funktionel forbindelse inden for hippocampalnetværket. Mus er transcardially perfunderes med kold saccharose-baserede kunstige cerebrospinalvæske. Vandrette skiver, der indeholder hippocampus, skæres i en tykkelse på 450 μm for at bevare synaptisk forbindelse. Skiver inddrive i en grænseflade-stil kammer og overføres til en nedsænket kammer til optagelser. Optagelseskammeret er designet til dobbelt overflade superfusion af kunstig cerebrospinalvæske ved en høj strømningshastighed for at forbedre iltningen af skiven. Denne protokol giver sundt væv egnet til undersøgelse af komplekse og spontane netværk aktivitet in vitro.
Introduction
Elektrofysiologiske målinger fra levende hippocampale skiver in vitro er en kraftfuld eksperimentel tilgang med mange fordele. Eksperimentatoren kan bruge et mikroskop, mikromanipulatorer og et optagelsessystem til direkte at visualisere og indsamle målinger fra individuelle neuroner i vævet. Vævsskiver er også meget tilgængelige for fototimulation eller lægemiddellevering til optogenetiske, kemogenetiske eller farmakologiske eksperimenter.
Hippocampal-netværket genererer meget synkron befolkningsaktivitet in vivo, synlig som svingninger i det ekstracellulære lokale feltpotentiale1,2,3,4,5. Brain slice metoder er blevet udnyttet til at få indsigt i de cellulære og kredsløb mekanismer, der ligger til grund for disse neuronale netværk svingninger. Foundational arbejde fra Maier et al. viste, at skarpe bølge-krusning komplekser (SWRs) kan opstå spontant i skiver af ventral hippocampus6,7. Efterfølgende undersøgelser fra flere efterforskere har gradvist belyst mange aspekter af stålwirer, herunder neuromodulatorernes rolle i reguleringen af hippocampus 8 ,9,10 og de synaptiske mekanismer, der driver in vitro-reaktivering af neuronale ensembler, der tidligere var aktive under adfærd in vivo11. Brain slice eksperimenter har også givet indsigt i gamma rækkevidde svingning (30-100 Hz), en særskilt hippocampal netværk tilstand menes at støtte hukommelse kodning og huske12,13. Endelig anerkender den centrale rolle hippocampus og tilknyttede strukturer i patofysiologien af temporal lobe epilepsi14,15, forskere har brugt hippocampale skivepræparater til at undersøge generering og formering af epileptiform aktivitet. Carter et al. påviste, at kombinerede hippocampal-entorhinal cortex skiver fremstillet af kronisk epileptiske dyr spontant kan generere epileptiform udledninger in vitro16. Efterfølgende undersøgte Karlócai et al. de mekanismer, der ligger til grund for epileptiformudladninger i hippocampale skiver ved hjælp af modificeret kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) med ændrede ionkoncentrationer (reduceret Mg2+ eller forhøjet K+) eller tilsat stoffer (4AP eller gabazin)17.
Efterforskere har udviklet adskillige hippocampale skive tilgange, der adskiller sig på centrale måder: (1) regionen hippocampus indeholdt i skiven (dorsal, mellemliggende eller ventral); 2) tilstedeværelsen eller fraværet af ekstrahippocampal væv såsom entorhinal cortex; (3) den orientering, der anvendes til at skære skiver (koronar, sagittal, vandret eller skrå) og (4) de forhold, hvorunder vævet holdes efter udskæring (nedsænket fuldt ud i ACSF eller holdes ved grænsefladen mellem ACSF og befugtet, carbogen-rig luft).
Valget af, hvilken udskæringsmetode der skal anvendes, bør bestemmes af forsøgsmålsætningen. For eksempel, tværgående eller koronar skiver af dorsale hippocampus opretholdes under neddykkede forhold er blevet brugt meget effektivt til undersøgelse af intrahippocampal kredsløb og synaptisk plasticitet18,19,20. Sådanne præparater genererer dog ikke spontant netværkssvingninger så let som skiver fra ventral hippocampus21,22,23. Selv om en tilstand af vedvarende SWR-aktivitet kan fremkaldes ved stivkrampe stimulation i tværgående skiver fra den dorsale og ventrale hippocampus24, observeres spontane stålwirer lettere i ventralskiver7,25.
En iboende fysiologisk og anatomisk skelnen mellem den dorsale og ventral hippocampus understøttes af undersøgelser udført både in vivo og in vitro26. Optagelser i rotter afslørede stærkt sammenhængende theta rytmer i hele dorsale og mellemliggende hippocampus, men dårlig sammenhæng mellem ventral regionen og resten af hippocampus27. Stålwirer in vivo formerer sig let mellem den dorsale og mellemliggende hippocampus, mens stålwirer, der stammer fra den ventrale hippocampus, ofte forbliver lokale28. De foreningsmæssige fremskrivninger stammer fra CA3 pyramide neuroner, der bor i den dorsale og mellemliggende hippocampus projekt lange afstande langs langs langsgående akse hippocampus. CA3-fremskrivninger fra ventrale regioner er fortsat relativt lokale og er derfor mindre tilbøjelige til at blive afbrudt under udskæringsprocessen29,30. Ventralskiver kan derfor bedre bevare det tilbagevendende netværk, der er nødvendigt for at generere befolkningssynkronisering. Tilbøjeligheden af ventrale skiver til at generere spontane netværksaktiviteter in vitro kan også afspejle højere iboende excitabilitet af pyramide neuroner eller svagere GABAergic hæmning i ventral hippocampus i forhold til mere dorsale regioner31. Faktisk ventral hippocampal skiver er mere modtagelige for epileptiform aktivitet32,33. Således har mange undersøgelser af spontane fysiologiske8,9,11,24 eller patologiske16,34,35,36 netværkssvingninger traditionelt brugt en vandret udskæringsmetode, nogle gange med en lille vinkel i fronto-occipital retning, som giver vævsskiver parallelt med det tværgående plan af ventral hippocampus.
Netværksforbindelsen påvirkes uundgåeligt af udskæringsproceduren, da mange celler i skiven vil blive afbrudt. Vinklen og tykkelsen af skiven og vævet, der tilbageholdes i præparatet, bør overvejes for at optimere forbindelsen i de kredsløb, der er af interesse. Mange undersøgelser har udnyttet horisontale kombinerede hippocampal-entorhinal cortex skiver (HEC) til at udforske interaktioner mellem de to strukturer i forbindelse med fysiologiske eller patologiske netværk svingninger. Roth et al. udførte dobbelte optagelser fra CA1-underfeltet i hippocampus og lag V i den mediale entorhinale cortex for at demonstrere udbredelse af SWR-aktivitet gennem HEC-skiven37. Mange undersøgelser af epileptiform aktivitet har brugt HEC skive forberedelse til at undersøge, hvordan epileptiform udledninger formere sig gennem corticohippocampal netværk16,35,36,38. Det er vigtigt at bemærke, at bevarelse af den intakte kortikohippocampal sløjfe ikke er en forudsætning for spontane stålwirer, epileptiformudladninger eller gammasvingninger; netværk svingninger kan genereres i tværgående skiver af dorsale eller ventral hippocampus uden vedlagte parahippocampal væv21,22,23, 25,39,40,41. En vigtigere faktor for den spontane generering af netværkssvingninger i hippocampale skiver kan være tykkelsen af hver skive, da en tykkere skive (400-550 μm) vil bevare mere forbindelse i CA2/CA3 tilbagevendende netværk21,22,25.
Selv om vinklede vandrette HEC-skiver (skåret med en ca. 12° vinkel i fronto-occipital retning) er blevet brugt til at studere den funktionelle forbindelse mellem kortikohippocampal loop11,16,34,35,42, er sådanne vinklede præparater ikke nødvendige for spontan netværksaktivitet43,44,45. Brugen af et vinklet udskæringsplan gør det dog muligt for investigator selektivt at lave skiver, der bedst bevarer den tværgående orienterede lameller af enten ventral eller mellemliggende hippocampus, afhængigt af om der anvendes en nedadgående eller en opadgående vinkel (Figur 1). Denne tilgang er begrebsmæssigt svarer til den, der anvendes af Papatheodoropoulos et al., 2002, der dissekeret hver hippocampus fri og derefter brugt en væv chopper til at skabe tværgående skiver langs hele dorsal-ventral akse21. I lyset af ovennævnte funktionelle sondringer mellem den ventrale og dorsale mellemliggende hippocampus bør efterforskerne overveje skivernes anatomiske oprindelse, når de udformer eksperimenter eller fortolker resultater. Brug af en agar rampe under udskæringsproceduren er en enkel måde at fortrinsvis producere skiver fra enten den mellemliggende eller ventral hippocampus.
Hippocampal skiver kan opretholdes i enten en nedsænket kammer (med vævet fuldt nedsænket i ACSF), eller en grænseflade-stil kammer (f.eks Oslo eller Haas kammer, med skiver, der kun er omfattet af en tynd film af flydende medier). Interface vedligeholdelse øger iltning af vævet, som fremmer neuronal overlevelse og giver mulighed for vedvarende høje niveauer af internuronal aktivitet. Traditionelt bruger neddykkede optagelsesforhold en langsommere ACSF-strømningshastighed, der ikke giver tilstrækkelig iltning af væv til stabilt udtryk for svingninger på netværksniveau. I neddykkede hippocampale skiver observeres carbachol-inducerede gammasvingninger kun forbigående46,47, mens de kan holdes stabilt i grænsefladeregistreringskamre10,48,49. Som sådan har mange undersøgelser af komplekse spontane aktivitet in vitro påberåbt grænseflade registrering kamre til at undersøge skarpe bølge krusning komplekser6,7,8,9,10,25,37, gamma svingninger10,13, og epileptiform aktivitet16,38,45,47.
I et indspilningskammer i neddykket stil kan et mål for nedsænkningsmikroskop bruges til at visualisere individuelle celler og selektivt målrette sunde celler mod optagelser. Det nedsænkede præparat giver også fin kontrol over det cellulære miljø, da nedsænkning letter hurtig spredning af stoffer eller andre forbindelser til vævet. En ændret metode, hvor stabile netsvingninger opretholdes under neddykkede forhold, repræsenterer således en stærk eksperimentel tilgang. Denne fremgangsmåde er eksemplificeret ved arbejdet i Hájos et al., hvor hippocampal skiver inddrive i en forenklet interface-stil bedrift kammer i flere timer før overførsel til en modificeret nedsænket optagelse kammer med en høj strømningshastighed af ACSF (~ 6 mL/ min) for at øge iltforsyningen til vævet12,48,49. Under disse omstændigheder kan høje niveauer af internuronaktivitet og stabile spontane netværkssvingninger opretholdes i et neddykket optagelseskammer. Denne ændrede tilgang gør det muligt for efterforskerne at udføre visuelt styrede helcelleplasterklemmeoptagelser og karakterisere bidraget fra morfologisk identificerede celletyper til carbachol-inducerede gammasvingninger12. Stålwirer kan også forekomme spontant i neddykkede hippocampale skiver med en hurtig strømningshastighed på ACSF11,48,49. Maier et al. påviste, at hippocampale skiver, der kom sig i et grænsefladekammer før overførsel til et nedsænket optagelseskammer pålideligt, udstillede spontane stålwirer, mens skiver, der kom sig nedsænket i et bægerglas før overførsel til et nedsænket optagelseskammer, viste mindre fremkaldte feltresponser, lavere niveauer af spontane synaptiske strømme og kun meget sjældent udstillede spontaneSWR'er 43. Schlingloff et al. anvendte denne forbedrede metode til at demonstrere parvalbumin-udtrykkende kurvcellers rolle i generering af spontane stålwirer44.
Følgende protokol præsenterer en udskæringsmetode, hvorigennem spontant aktive neuroner i vandrette hippocampale skiver kan genvindes under grænsefladeforhold og efterfølgende opretholdes i et nedsænket optagelseskammer, der er egnet til farmakologiske eller optogenetiske manipulationer og visuelt styrede optagelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Columbia University (AC-AAAU9451).
1. Forbered løsninger
- Der fremstilles en saccharoseskæreopløsning til udskæring som beskrevet i tabel 1.
BEMÆRK: Efter tilberedning af 1 L saccharoseopløsning fryses en lille mængde (ca. 100-200 ml) i en isbakke. Disse frosne saccharoseisninger vil blive blandet ind i en iskold gylle (se trin 4.3). - Forbered kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) til optagelse som beskrevet i tabel 2.
- Forbered 1 M NaCl til stimuleringspipetter ved at opløse 0,05844 g NaCl i 1 mL renset vand, der er filtreret for at fjerne spormetaller og andre urenheder.
BEMÆRK: Saccharoseskæreopløsning og ACSF skal tilberedes frisk til hvert forsøg.
2. Forbered agar rampe
- Forbered 4% agar (f.eks. 2 g agar i 50 mL vand) ved at opløse agarpulver i renset vand, der er filtreret for at fjerne spormetaller og andre urenheder. Blandingen opvarmes i en mikrobølgeovn, indtil den begynder at koge (ca. 30-60 s). Den smeltede agar hældes i en form og afkøles og størkner ved 4 °C i køleskab ved en hældning på ca. 12°.
BEMÆRK: For en form kan man bruge enhver glas- eller plastbeholder, der er indstillet i en vinkel, med nok smeltet agar hældt i til at danne en rampe på 4 cm i længden og ca. 0,8 cm i højden.
3. Indspil udskæringsområdet
- Fyld et 400 mL bægerglas, der indeholder et skivegenvindingskammer med ca. 250 mL ACSF det i et vandbad opvarmet til 32 °C og begynde at boble med carbogen (95% iltgas/5% kuldioxidgas).
BEMÆRK: Fyld genvindingsbægeret med lige nok væske til at placere nylonmasken i holdekammeret på selve overfladen af opløsningen, således at skiverne holdes ved grænsefladen mellem blandingen af varm opløsning og luften (Figur 1). Placer små stykker linsepapir på nylonmasken. Skiverne vil ligge oven på linsepapiret, som senere kan bruges til at overføre skiver individuelt til optagekammeret (se trin 6.6). - Placer en kolbe med saccharoseopløsningen i en isspand for at køle af og begynde at boble med carbogen.
BEMÆRK: Genvindingsbægeret og saccharoseopløsningen skal opvarmes og køles, og carbogen bobler i mindst 30 minutter, før musen anbringes i isoflurankammeret. - Træk bakken af premade, frosne saccharoseopløsning isterninger fra fryseren og sted på bænken til delvis optøning.
- Placer den ene halvdel af et rent tveægget barberblad i mikrotomen og kalibrer om nødvendigt. Sæt den anden halvdel af barberbladet til side til brug under dissektionen.
- Kør en carbogen linje og temperatur sonde ind i udskæring kammer og surround med is til at køle kammeret.
- Forbered en ren bænk eller bord dækket med to engangsabsorberende puder. Læg alle dissektionsværktøjer og tre stykker laboratoriebånd på venstre pad, hvor transcardial perfusion vil blive udført.
BEMÆRK: Dissektionsværktøjer omfatter lille Bonn saks, dissektor saks, stor spatel / ske, mikrospatel, skalpel med nyt blad, spatel, skarpe / stump kirurgisk saks, store væv pincet, og små væv pincet (se Tabel over materialer). - På den anden absorberende pude til højre for perfusionsområdet skal du placere et cirkulært stykke filterpapir i låget på en 100 mm diameter glas petriskål. Placer bunden af petriskålen ved siden af låget og læg en carbogen-linje i begge stykker af skålen.
- Brug et barberblad eller skalpel til at skære en lille rampe agar (ca. 4 cm langs den vinklede overflade, 0,8 cm i højden, 2 cm i bredden). Afskær et stykke af rampen fra den høje ende og vend den for at skabe en bagblok af agar. Brug cyanoacrylatklæbemiddel til at fastgøre agarrampen og bagblokken på udskæringsplatformen og sætte den til side.
BEMÆRK: Agars bagblok hjælper med at stabilisere hjernen under udskæringen og giver en overflade, hvor man kan dissekere unødvendige væv fra hver skive (Figur 1).
4. Transcardial perfusion
- Ophæng en sprøjte med en kapacitet på 60 mL som reservoir for saccharoseskæringsopløsning ca. 18 tommer over bordpladen (f.eks. ved hjælp af en trestrenget drejeklemme på en lodret stolpe). Fastgør slangen til bunden af reservoiret, kør slangen gennem en rulleklemme, og tilslut den anden ende af røret til en ren 20 G nål.
- Fyld 60 ml reservoiret med ca. 30 ml kølet saccharoseopløsning, og ret en carbogen-linje ind i saccharosebeholderen for løbende at boble perfusatet.
BEMÆRK: Sørg for, at saccharosemet strømmer gennem slangen og nålen uden nogen fanget bobler. Strømningshastigheden skal være lige hurtig nok til at have en stabil, kontinuerlig strøm af dryppende saccharose fra nålen. - Ved hjælp af en blender knuses og blandes den frosne saccharose i en iskold gylle, og den store spatel/ske bruges til at fordele gyllen.
- Placer en lille mængde saccharose gylle omkring kanterne af glasset Petri parabol låg. Tilsæt en lille mængde saccharose gylle til petriskålbunden.
- Der tilsættes ca. 20-30 ml saccharoseslam til perfusionsvæskebeholderen, og den blandes godt med 30 ml kølet flydende saccharose, indtil reservoiret indeholder en blanding af meget kold, overvejende flydende saccharose med en eller anden restfrosset opløsning.
- Placer musen i et kammer forbundet til en isoflurane vaporizer. Med ilt flyder på ca 2 L / min, drej skiven af fordamperen til at levere isoflurane ved 5% koncentration og starte en timer.
BEMÆRK: Hold denne timer i gang i løbet af udskæringen for at måle, hvor hurtigt skiverne opnås. Proceduren skal udføres så hurtigt som muligt, således at udskæringen er afsluttet, og væv genvindes i grænsefladekammeret inden for 15-20 minutter fra dyret, der kommer ind i isoflurankammeret. Hold øje med musen for at sikre, at der opnås en tilstand af dyb anæstesi. Efter mindst 5 minutter skal musen bedøves dybt og ikke reagere på tåklemøer. - Umiddelbart før du fjerner musen fra isoflurankammeret, fyldes petriskålslåget med kølet saccharoseopløsning til en dybde på ca. 3-5 mm og fylde petriskålbunden med kølet saccharoseopløsning i en dybde på ca. 1,0 cm.
- Overfør hurtigt musen til venstre absorberende pude og brug de 3 stykker tape til at sikre forbenene og halen. Udfør en hindlimb tåklem for at sikre, at musen ikke reagerer, før der udføres et snit. Ved hjælp af de store vævs pincet og kirurgisk saks, telt huden og gøre en langsgående snit fra bunden af brystbenet til toppen af brystet. Brug tang trække op på brystbenet og bruge saks til at skære gennem mellemgulvet.
BEMÆRK: Den første placering af musen og de første flere snit til at bryde mellemgulvet skal udføres så hurtigt som muligt for at sikre, at musen ikke genvinder bevidstheden. For at sikre en tilstrækkelig dybde af anæstesi under hele proceduren, en næse kegle kan placeres på musen for at levere isoflurane under perfusion. - Brug saksen til at skære gennem brystkassen på hver side og skær i en stor bevægelse mod det punkt, hvor forbenene møder kroppen. Med pincet, svinge forsiden af brystkassen væk og op mod hovedet, og derefter helt fjerne det med et vandret snit ved hjælp af den store saks. Hold hjertet på plads ved hjælp af de store pincet og indsæt 20 G perfusion nål i venstre hjertekammer. Når nålen er placeret korrekt, skal venstre side af hjertet hurtigt blegne, da kølet saccharoseopløsning fylder hjertekammeret.
- Brug den lille dissektor saks til at skære i højre atrium og lad blodet til at flyde ud af kredsløbet. Hvis snittene udføres korrekt, skal der være minimal skade på hjertet, og det skal fortsætte med at pumpe i hele perfusionen.
BEMÆRK: Sammenrullede stykker silkepapir kan bruges til at transportere blod og saccharoseopløsning væk fra hjertet og bevare synligheden af perfusionsnålen under proceduren. - Sørg for, at perfusionsnålen forbliver på plads og ikke falder ud af venstre hjertekammer. Med en korrekt strømningshastighed og placering, vil leveren begynde at blegne til en lys tan / beige farve med 20-30 s.
- Efter 30-45 s skal du bruge den store saks til at halshugge musen. Hold hovedet i venstre hånd, skub eller skræl huden væk fra kraniet. I et godt perfunderet dyr skal kraniet være meget blegt, og hjernen skal fremstå som en meget lyserød farve (nærmer sig hvid) gennem kraniet uden klart synlige blodkar.
5. Udtræk hjernen og skær skiver
- Brug den lille Bonn saks, gøre to laterale nedskæringer gennem kraniet mod midterlinjen på forsiden af kraniet, nær øjnene. Lav yderligere to snit på hver side af kraniets bund.
- Overfør hovedet til bunden af glasset Petri parabol, hvor det skal være for det meste nedsænket i kølet saccharose opløsning. Brug den lille Bonn saks til at skære ned midterlinjen langs længden af kraniet, trække op med saks for at minimere skader på det underliggende hjernevæv. Brug den lille væv pincet, fast greb hver side af kraniet og svinge den op og væk fra hjernen, som at åbne en bog.
- Brug fingrene på venstre hånd til at holde flaps af kraniet åbne og indsætte mikrospatula under hjernen i nærheden af olfaktoriske pærer. Vend hjernen ud af kraniet ind i saccharose og bruge mikrospatula at afskære hjernestammen. Vask hjernen for at fjerne resterende blod, pels eller andet væv.
- Brug den store spatel/ ske til at overføre hjernen til låget af glasset Petri parabol. Med den anden halvdel af det tveæggede barberblad, der tidligere var afsat, skal du foretage to koronarskæringer for først at fjerne lillehjernen og derefter den mest forreste del af hjernen, herunder de olfaktoriske pærer (Figur 1).
- Påfør cyanoacrylatklæbemiddel på agarrampen. Placer meget kort hjernen på et stykke tørt filterpapir ved hjælp af de store vævsplymp og overfør det straks til agarrampen og placerer hjernens ventrale overflade på klæbemidlet.
BEMÆRK: For skiver af den mellemliggende hippocampus skal hjernen være orienteret med den forreste vender op ad rampens skråning og den bageste tættere på bladet. For skiver af ventral hippocampus, orientere hjernen med den forreste ende pegede ned ad skråningen af rampen, med den bageste ende på toppen af rampen, længere væk fra bladet. I begge tilfælde skal hjernen placeres øverst på rampen, således at hjernens koronarskårne overflade kontakter agar-bagblokken (Figur 1). - Placer udskæringsplatformen med agaren og hjernen i mikrotomets udskæringskammer og nedsænk helt med kølet saccharoseopløsning. Brug den store spatel/ske til at overføre noget saccharoseslam til kammeret under omrøring for at smelte frossen saccharose og hurtigt bringe blandingens temperatur ned til ~1-2 °C.
BEMÆRK: Hold øje med temperaturmåleren under udskæringen. Hvis saccharoseopløsningen opvarmes over 3 °C, tilsættes mere gylle og blandes for at bringe temperaturen ned igen. - Skær skiver i en tykkelse på 450 μm med mikrotomhastigheden indstillet til 0,07 mm/s. Da hver skive er befriet, skal du bruge de små væv pincet og en skarp skalpel til først at adskille de to halvkugler, og derefter at skære væk væv, indtil skiven består primært af hippocampus og parahippocampal regioner (Figur 1).
- Brug en plastoverførselspipette til at overføre skiverne individuelt til interfacegenvindingskammeret, hvilket sikrer, at de er placeret ved ACSF'ens grænseflade og luften med kun en tynd menisk af ACSF, der dækker skiverne. Luk låget af kammeret tæt, og lad skiverne komme sig ved 32 °C i 30 minutter.
- Efter den første genopretning ved 32 °C bringes grænsefladegenvindingskammeret ud af vandbadet og anbringes på en omrører, der er indstillet til en langsom hastighed, således at den magnetiske rørestang fremmer cirkulationen af ACSF i kammeret. Lad det gradvist afkøle til stuetemperatur, da skiverne genvindes i yderligere 90 minutter. Sørg for, at opvågningskammeret hele tiden bobles med carbogen og ikke tillader store bobler at blive fanget under skiverne.
6. Udfør lokale feltpotentialeoptagelser af spontan aktivitet
- Forbered dig på LFP-optagelser ved at tænde for alt nødvendigt udstyr, herunder den computer, der kører anskaffelsessoftwaren, skærmen, der er tilsluttet computeren, stimulatorerne, mikromanipulatoren, temperaturregulatoren, mikroskoplyskilden, det mikroskopforbundne kamera, mikroelektrotrodforstærkeren, digitalisatoren og den peristaltiske pumpe. Hvis du bruger et centralt vakuumsystem, skal du åbne vægventilen for at forberede den vakuumlinje, der fjerner ACSF fra optagekammeret.
- Fyld det opvarmede reservoir med ACSF, og placer derefter den ene ende af slangen i det 400 mL bægerglas, der indeholder den boblende ACSF. Tænd den peristaltiske pumpe for at dirigere ACSF fra 400 mL bægerglasset til det opvarmede reservoir og fra reservoiret videre til optagekammeret. Tryk eller knib slangen for at frigøre eventuelle fanget bobler.
- Juster den peristaltiske pumpe for at sikre, at ACSF-strømningshastigheden gennem optagekammeret er hurtig (~ 8-10 mL/min). Brug en temperatursonde til at sikre, at ACSF er 32 °C i midten af optagekammeret.
BEMÆRK: Hvis ACSF leveres til optagekammeret ved hjælp af en peristaltisk pumpe, kan en høj strømningshastighed resultere i betydelige udsving i strømningshastigheden. Konsekvente strømningshastigheder kan opnås ved hjælp af en simpel pulseringsdæmper bestående af en række tomme sprøjter integreret i slangen (Figur 2). - Forbered stimulering og optagelse pipetter fra borosilicate glas kapillærer ved hjælp af en opvarmet glødetråd aftrækker. Pullerprotokollen skal konfigureres til at give pipetter med en modstand på 2-3 MOhm til stimulering eller lokale feltpotentiale registreringselektroder.
- Fyld stimuleringspipetter med 1 M NaCl- og LFP-pipetter med ACSF.
- Fastgør slangen kort, og sluk for pumpen for at standse strømmen af ACSF. Overfør en skive til optagelsen kammer ved hjælp af fine pincet til at forstå et hjørne af linsen papir skiven hviler på-skiven vil holde sig til linsen papir. Placer linsepapiret og skær det ind i optagekammeret med skiven nedad, og "skræl" derefter linsepapiret væk, så skiven er nedsænket i optagekammeret. Fastgør skiven ved hjælp af en harpe.
BEMÆRK: Harper kan købes pre-made eller made in-lab ved hjælp af en U-formet stykke rustfrit stål eller platin og fine nylon filament. - Placer en NaCl-fyldt stimuleringspipette i den manuelle mikromanipulator, og fremryk langsomt spidsen af pipetten ind i skivens overflade (f.eks. i stratum radiatumlaget) i en vinkel på ca. 30-45°. Når spidsen af pipetten kommer ind i vævet, skal du langsomt rykke pipetten langsomt frem og afstå fra store bevægelser i den laterale eller lodrette retning, der unødigt kan beskadige axoner i skiven. Spidsen af pipetten anbringes mindst 50-100 μm dybt inde i skiven for at undgå celler nær overfladen, der blev beskadiget under udskæringen.
- Placer en ACSF-fyldt LFP-pipette i pipetteholderen, der er fastgjort til den motoriserede mikromanipulator. Påfør et meget let positivt tryk ved hjælp af enten mundtryk eller en 1 mL sprøjte tilsluttet via en stophaneventil og en kort slangelængde til pipetteholderen.
BEMÆRK: Placer LFP-pipetter i skiven for at registrere de pågældende signaler: I tilfælde af skarpe bølgebølger skal der placeres en LFP-pipette i stratumpyramiden (SP) og en anden pipette i stratum radiatum (SR). Denne konfiguration giver mulighed for samtidige optagelser af den negative skarpe bølge i SR og højfrekvente krusning svingninger i SP (Figur 3). - Ved hjælp af mikromanipulatoren skal du langsomt føre spidsen af LFP-pipetten ind i interesseområdet (f.eks. CA1-pyramidecellelaget) i en vinkel på ca. 30-45°. Spidsen af pipetten anbringes mindst 50-100 μm dybt inde i skiven for at undgå celler nær overfladen, der blev beskadiget under udskæringen. Mens du fremmer LFP-pipetten, skal du løbende levere en lille spændingstestpuls ved hjælp af anskaffelsessoftwaren og se efter en pludselig stigning i elektrodemodstanden. Dette kan indikere, at pipetten er tilstoppet eller presset op mod en celle.
- Når LFP-pipetten er placeret i det pågældende område, skal du forsigtigt slippe det positive tryk ved at åbne ventilen på slangen, der er fastgjort til pipetteholderen.
- Gentag trin 6.8-6.10 med en anden pipette og mikromanipulator for at registrere LFP'en på en anden placering samtidigt.
- Brug mikroelektronidforstærkeren i den aktuelle klemmekonfiguration til at registrere spontan aktivitet i det lokale feltpotentiale efter brug af brobalancefunktionen i anskaffelsessoftwaren til at korrigere for pipettens seriemodstand. Spontane stålwirer fremstår som positive afbøjninger i SP-lagets ekstracellulære potentiale (Figur 3).
- For at registrere fremkaldte feltpotentialer skal du bruge de stimulatorer, der er forbundet til digitalisatoren, til at levere en kort (200 os) kvadratspændingspuls gennem den NaCl-fyldte stimuleringspipette. Juster stimuleringsspændingsknappen for at fremkalde en række responsforstærkninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Præsenteret her er repræsentative optagelser fra HEC skiver udarbejdet som beskrevet i denne protokol. Efter genvinding i et grænsefladeholdekammer (figur 1C) overføres skiver individuelt til et neddykket optagelseskammer (Figur 2B). Optagelseskammeret forsynes med carbogenmættet ACSF ved hjælp af en peristaltisk pumpe (Figur 2A). Pumpen trækker først ACSF fra et holdeglas ind i et opvarmet reservoir. Carbogen linjer er placeret i både bedriften bægerglas og den opvarmede reservoir til at give kontinuerlig iltning af medierne. En pulseringsdæmper, der består af en række luftfyldte sprøjter, placeres mellem den peristaltiske pumpe og registreringskammeret for at minimere udsvingene i strømningshastigheden produceret af hurtig peristalsis. Luftlommen i hver sprøjte absorberer de trykændringer, der forårsages af hver cyklus af pumpen, således at optagekammeret modtager en jævn og ensartet strøm af ACSF52,53. En indbygget varmelegeme, der er placeret efter pulseringsdæmperen, sikrer, at ACSF'ens temperatur holdes ved 32 °C, når den kommer ind i optagekammeret.
I dette eksempel består superfusionsoptagelseskammeret med to overflader af tre 3D-printede lag (Figur 2B). Det nederste lag har en rektangulær udskæring, der passer til en coverlip, fastgjort med vakuumfedt. Det midterste lag indeholder den nederste halvdel af et langstrakt ovalt kammer med to vandrette understøtninger. Nylon filament er trukket over disse understøtninger (ca. hver 0,5 mm) og sikret med cyanoacrylat lim. Skiven vil hvile oven på denne spændte glødetråd. Det øverste lag indeholder den øverste halvdel af det ovale kammer sammen med små brønde, hvor sølvchlorid jorden pellets kan placeres. Kammerets aflange ovale form er designet til at fremme hurtig laminarstrøm af ACSF.
Figur 3 viser repræsentative optagelser fra HEC-skiver, der er udarbejdet i henhold til denne protokol. For i første omgang at vurdere skive sundhed, felt postsynaptic potentialer (fPSP'er) er fremkaldt i stratum radiatum (SR) ved hjælp af en pipette fyldt med 1 M NaCl. I sunde skiver, bør elektrisk stimulation producere en fPSP med en lille presynaptic fiber volley og et stort postsynaptisk potentiale med en hurtig indledende afstamning(Figur 3B, øverst til venstre). I sunde skiver er spontane bølger med skarp bølge synlige som positive afbøjninger i LFP i stratumpyramiden (Figur 3B, nederst til venstre). I suboptimale skiver fremkaldte fPSP'er viser en stor fibervolley og et relativt lille postsynaptisk potentiale, og sådanne skiver viser ikke spontane stålwirer(figur 3B, højre). Stålwirer in vitro udviser egenskaber, der er i overensstemmelse med offentliggjorte beskrivelser: et positivt feltpotentiale i SP-laget med en overlejret højfrekvent svingning, parret med et negativt feltpotentiale i SR-laget ( Figur3C). En enkelt stålwire registreret i CA2 er angivet med en stjerne (figur 3C, højre). Stålwirer i HEC-skiver har oprindelse i tilbagevendende CA2/CA3-kredsløb og overføres til CA1. En enkelt stålwire observeret i CA2- og CA1 SP-laget er angivet med en stjerne (figur 3D, højre). I dette repræsentative eksempel fører CA2 SWR (grøn) til, at der i CA1 (blå) med flere millisekunder, som vist i overlejringen af swr-konvolutten (filtreret ved 2-30 Hz), der registreres i hvert område.
Figur 1: Forberedelse af vandrette vinklede hippocampal-entorhinal cortex (HEC) skiver. (A) (i) Efter udvinding af hjernen, udføre to koronar nedskæringer med et barberblad for at fjerne den bageste og forreste dele af hjernen. (ii) Agarrampen er dannet af to vinklede portioner limet til mikrotome-udskæringsplatformen. For at forberede skiver af den mellemliggende hippocampus skal du placere hjerneblokken på agarrampen med den forreste overflade vendt op ad skråningen og komme i kontakt med den høje bagside af rampen. For at forberede skiver af mere ventral hippocampus skal du placere hjerneblokken på agarrampen med den forreste overflade vendt ned ad skråningen, så den bageste afskårne overflade kommer i kontakt med den høje bagside af rampen. (iii) Som hver skive er befriet, udføre flere flere nedskæringer med skalpel til at adskille halvkugler og fjerne unødvendige væv. (B) Repræsentativt billede af det resulterende udsnit med cellekerner mærket af DAPI. (C) I en grænseflade opsving kammer, er skiver placeret på stykker linse papir på toppen af en rustfrit stål eller nylon mesh, niveau med overfladen af ACSF. En keramisk bubbler formidler carbogen ind i kammeret og en magnetisk rørestang blander løbende væsken i kammeret. En tynd film af ACSF dækker den øverste overflade af skiven, hvilket øger diffusion af ilt fra den fugtige carbogen-rige luft i kammeret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Dobbelt overflade superfusionsoptagelseskammer med pulseringsdæmper i ACSF-leveringsrøret. (A) Diagram over superfusionssystemet. ACSF opvarmes til 32 °C, bobles konstant med carbogengas og leveres ved ca. 8-10 mL/min ved hjælp af en peristaltisk pumpe med en pulsationsdæmper bestående af en række luftfyldte sprøjter. (B) Optagelseskammeret består af tre 3D-printede lag, hvor midten er trukket med nylonglødetråd. Skiven hviler på denne spændte glødetråd og ACSF strømmer over og under vævet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentative optagelser af spontane bølger af skarp bølge fra HEC-skiver. (a) Etforenklet diagram over HEC-skiven, der viser registrerings- og stimuleringselektrodernes positioner. (B) Repræsentative registreringer af LFP-aktivitet fra både en aktiv, sund skive og en suboptimal skive. Den sunde skive (venstre, i grøn) viser store fremkaldte feltresponser og spontane skarpbølge krusninger (SWRs), synlig som uregelmæssigt forekommende positive afbøjninger i det lokale feltpotentiale i SP-laget. I modsætning hertil viser en usund skive små fremkaldte feltresponser og ingen spontan aktivitet (højre, i grå). (C) Repræsentative registreringer af stålwirer i CA2-regionen, bestående af en negativ bøjning i arbejdsstyrkeundersøgelsen i SR-laget og en højfrekvent svingning med en underliggende positiv bøjning i arbejdsstyrkeundersøgelsen i SP-laget. Toppe i hver kanal, der er større end tre standardafvigelser for signalforstærkeren, fremhæves med rødt. Et båndkortfilter på 2-30 Hz isolerer den underliggende positive og negative kuvert af den skarpe bølge i henholdsvis SP- og SR-laget, mens et båndkortfilter på 80-250 Hz bruges til at isolere højfrekvente svingninger af krusningen i SP-laget. D) Stålwirer in vitro formerer sig fra CA2/CA3 til CA1. I disse repræsentative optagelser går stålwirer i CA2 (grøn, nederst) forud for den i CA1 (blå, øverst) med flere millisekunder. Toppe i hver kanal, der er større end tre standardafvigelser for signalforstærkeren, fremhæves med rødt. Klik her for at se en større version af dette tal.
| molekylvægt (gram / mol) | endelig koncentration (mM) | gram / 1 L saccharose skæreopløsning | ||
| Saccharose | C12H22O11 | 342.3 | 195 | 66.749 |
| Natriumchlorid | Nacl | 58.44 | 10 | 0.584 |
| Glukose | C6H12O6 | 180.08 | 10 | 1.801 |
| Natriumbicarbonat | NaHCO3 | 84.01 | 25 | 2.1 |
| kaliumchlorid | KCl | 74.55 | 2.5 | 0.186 |
| natriumphosphat monobasisk vandfri | NaH2PO4 | 137.99 | 1.25 | 0.173 |
| natrium pyruvat | C3H3NaO3 | 110.04 | 2 | 0.22 |
| koncentration af bestanden (M) | endelig koncentration (mM) | milliliter / 1L saccharose skæreopløsning | ||
| calciumchlorid | CaCl2 | 1 | 0.5 | 0.5 |
| magnesiumchlorid | MgCl2 | 1 | 7 | 7 |
Tabel 1: Sammensætning af saccharosebearbejdningsopløsning. Begynd med ca. 0,75 L renset vand, der er filtreret for at fjerne spormetaller og andre urenheder. Opløs hvert fast stof, mens opløsningen blandes med en magnetisk rørestang. Når alle faste stoffer er opløst, boble carbogen gas gennem opløsningen i 10 min. Tilsæt MgCl2- og CaCl2-opløsningerne, og tilsæt vand for at bringe det samlede volumen til 1 L. Bland med en magnetisk rørestang i 10 minutter for at sikre, at opløsningen blandes ensartet. Osmolariteten skal være mellem 315 og 325 mOsm, og pH-vinduet skal være ca. 7,4.
| molekylvægt (gram / mol) | endelig koncentration (mM) | gram / 2L ACSF | ||
| Natriumchlorid | Nacl | 58.44 | 125 | 14.61 |
| Glukose | C6H12O6 | 180.08 | 12.5 | 4.502 |
| Natriumbicarbonat | NaHCO3 | 84.01 | 25 | 4.201 |
| kaliumchlorid | KCl | 74.55 | 3.5 | 0.522 |
| natriumphosphat monobasisk vandfri | NaH2PO4 | 137.99 | 1.25 | 0.345 |
| Ascorbinsyre | C6H8O6 | 176.12 | 1 | 0.352 |
| natrium pyruvat | C3H3NaO3 | 110.04 | 3 | 0.66 |
| koncentration af bestanden (M) | endelig koncentration (mM) | milliliter / 2L ACSF | ||
| calciumchlorid | CaCl2 | 1 | 1.6 | 3.2 |
| magnesiumchlorid | MgCl2 | 1 | 1.2 | 2.4 |
Tabel 2: Sammensætning af kunstigt cerebrospinalvæske. Begynd med ca. 1,5 L renset vand, der er filtreret for at fjerne spormetaller og andre urenheder. Opløs hvert fast stof, mens opløsningen blandes med en magnetisk rørestang. Når alle faste stoffer er opløst, boble carbogen gas gennem opløsningen i 10 min. Tilsæt MgCl2- og CaCl2-opløsningerne, og tilsæt vand for at bringe det samlede volumen til 2 L. Bland med en magnetisk rørestang i 10 minutter for at sikre, at opløsningen blandes ensartet. Osmolariteten skal være mellem 315 og 325 mOsm, og pH-vinduet skal være ca. 7,4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er flere trin i denne udskæringsprotokol designet til at fremme vævssundheden og favorisere fremkomsten af spontan naturalistisk netværksaktivitet: musen er transcardialt perfunderet med kølet saccharoseskæringsopløsning; vandret-entorhinal cortex (HEC) skiver skæres i en tykkelse på 450 μm fra den mellemliggende eller ventral hippocampus; skiver inddrive på grænsefladen af opvarmet ACSF og befugtet, carbogen-rige luft; under optagelser superfunderes skiver med ACSF opvarmet til 32 °C og leveres med en hurtig strømningshastighed med superfusion med dobbelt overflade i et neddykket optagelseskammer.
Skive sundhed er af afgørende betydning for generering af nettet svingninger in vitro. Unge dyr vil give mere sunde skiver, og generelt med unge eller unge mus kan transcardial perfusionstrin springes over. Efterhånden som dyrene bliver ældre, bliver det stadig vanskeligere at lave sunde skiver, men nogle undersøgelser (såsom sygdomsmodeller eller langsgående undersøgelser) kræver brug af voksne eller aldrende dyr. Dengler et al., for eksempel, brugte transcardial perfusioner i deres fremstilling af HEC skiver fra pilocarpine-behandlede kronisk epileptiske voksne mus50. Med voksne mus er det gavnligt at udføre en transcardial perfusion med kølet saccharoseskæringsopløsning for at afkøle vævet, klart blod fra hjernen og reducere metabolisk aktivitet, før du fjerner hjernen fra kraniet51. Det er imidlertid vigtigt at bemærke, at transcardiale perfusioner kræver, at uddannelsen udføres korrekt, og der skal sørges for, at proceduren udføres hurtigt og på en måde, der ikke udgør en risiko for dyrevelfærden. Når det er muligt, bør forsøg udformes med henblik på anvendelse af unge dyr, således at det udelukkes, at der anvendes transcardiale perfusioner. I en suboptimal skive forberedelse, vil der ikke være nok raske celler, især interneurons, til at støtte igangværende netværk svingninger. For at vurdere skive sundhed under eksperimentet, er det nyttigt først at optage fremkaldte felt potentialer (for eksempel med en stimulation pipette og en optagelse pipette i stratum radiatum, SR). I en sund skive vil stimulering i SR-laget fremkalde et stort felt postsynaptisk potentiale (fPSP) med en relativt lille præsynaptisk fibervolley(Figur 3).
Skiverne produceret af denne protokol er vinklet vandret hippocampal-entorhinal cortex (HEC) skiver. Det er vigtigt, at hverken inddragelsen af parahippocampal væv eller det vinklede snit er nødvendige for hippocampale skiver for spontant at generere netværksaktiviteter såsom stålwirer. Faktisk har mange undersøgelser udnyttet vandrette eller tværgående hippocampal skiver til at afhøre aspekter af fysiologiske25,40,41,44 eller patologiske netværk svingninger33,38. I denne protokol gør placeringen af hjernen på en agarrampe det muligt for eksperimentatoren selektivt at producere flere skiver fra enten den ventrale eller mellemliggende hippocampus (Figur 1), hvilket kan være gavnligt for eksperimentelle mål, der tager højde for den funktionelle heterogenitet, der findes langs hippocampusens længdeakse26,31. Hvis skivernes anatomiske oprindelse ikke er en faktor, kan agarrampen udelukkes, og et ægte vandret skæreplan vil give skiver af den mellemliggende til ventral hippocampus. Da hver vandret vævsskive frigøres, kan de fleste fremmede dele af skiven fjernes med tre enkle udskæringer, hvilket efterlader en omtrent rektangulær skive, der indeholder hippocampus og noget omgivende væv, herunder parahippocampal-regionen (Figur 1). Yderligere dissektion kan udføres for at fjerne alle ekstrahippocampal væv, men inddragelsen af det omgivende væv er gavnligt, idet skiveharpen let kan placeres således, at nylon filamenter ikke hviler over hippocampus korrekt. Som nævnt ovenfor er den kombinerede HEC-skive også et nyttigt præparat til at undersøge et større korticohippocampalnetværk i forbindelse med fysiologiske37 eller patologiske16,35,36,38 netværkssvingninger.
Den vigtigste faktor i denne protokol er at optimere ilttilførslen til vævet, både i genopretningsfasen og under optagelserne. Mange undersøgelser af netværkssvingninger udføres i skiver, der overføres direkte fra mikrotomet til et grænsefladeregistreringskammer og får lov til at komme sig med kontinuerlig perfusion af frisk ACSF. Efter flere timers opsving kan optagelser derefter udføres i samme grænsefladekammer. Således holdes skiver på grænsefladen mellem ACSF og fugtig bilbogen-rig luft i hele eksperimentets varighed. I den alternative metode, der præsenteres i denne protokol, genvindes skiver i et holdekammer i grænsefladestil i mindst to timer, før individuelle skiver overføres til et optagelseskammer i neddykket stil med tilstrækkeligt hurtige ACSF-strømningshastigheder. Skiver, der tilberedes under disse forhold, kan udvise stabile gammasvingninger12 eller spontan SWR-aktivitet43. Skive opsving i en grænseflade-stil bedrift kammer er et kritisk skridt: Maier et al. vist, at skiver, der inddrives i et bægerglas helt nedsænket i ACSF udviser mindre fremkaldte felt potentialer, mindre hyppige spontane postsynaptiske strømme, og kun sjældent producere spontan netværksaktivitet43. På samme måde påviste Hájos et al., at hurtige ACSF-strømningshastigheder resulterer i en højere frekvens af spontane hæmmende postsynaptiske strømme, hvilket tyder på forbedret internuronal aktivitet49. I registreringsperioden er superfusion med dobbelt overflade ikke strengt nødvendig, forudsat at registreringskammeret har et relativt lille volumen ACSF leveret med en hurtig strømningshastighed (mindst 6 mL/min)43. Det 3D-printede optagelseskammer, der præsenteres i denne protokol (figur 2B), er et relativt omkostningseffektivt og en enkel mulighed, men der er også kommercielt tilgængelige neddykkede optagelseskamre designet til at holde mindre mængder, fremme laminarstrømmen af medierne eller give superfusion med dobbelt overflade (i modsætning til cirkulære optagelseskamre, for eksempel som tillader overskydende dødt volumen af ACSF).
Mens denne protokol giver en mulighed for at optage netværkssvingninger uden krav om et traditionelt grænsefladeoptagelseskammer, er der flere begrænsninger. Selvom skiver opbevares i ACSF-luft-grænsefladen i restitutionsperioden, modtager de ikke kontinuerlig perfusion af friske medier, som det sker i traditionelle Haas-stil interface-registreringskamre. Skiver skal overføres individuelt (ved hjælp af fine pincet) fra opvågningskammeret til det nedsænkede optagekammer. Desuden kan hurtige strømningshastigheder forårsage ustabilitet og bevægelsesartefakter problematiske for nogle optagelser, især hvis ACSF leveres med en peristaltisk pumpe. For at opretholde hurtige strømningshastigheder og minimere mekaniske forstyrrelser kan en simpel pulseringsdæmper integreres i perfusionssystemet (Figur 2). Denne pulseringsdæmper fungerer ved hjælp af Windkessel-effekten52, hvor tomme sprøjter indeholder luftlommer, der fungerer som elastiske reservoirer, der absorberer det svingende tryk, der genereres af peristaltisk pumpes ruller53. Inkorporering af en pulsdæmper kan dog tilføje længde til slangen, der leverer ACSF til optagekammeret og påvirker iltforsyningen til skiven. Strømningshastigheder bør kun være så hurtige, som det er nødvendigt for at give stabile netværkssvingninger, og hvis der anvendes en peristaltisk pumpe, bør det ideelt set være en pumpe, der bruger et stort antal ruller (> 12) for at minimere pulseringen forårsaget af peristalsis, udelukke brugen af en pulseringsdæmper og sikre, at slangen, der leverer ACSF til optagelseskammeret, er så kort som muligt. Optagelser udført med hurtige strømningshastigheder kræver også store mængder ACSF, hvilket kan være problematisk, hvis eksperimenter kræver tilsætning af værdifulde eller dyre stoffer eller forbindelser til medierne. Selvom et superfusionskammer med dobbelt overflade kræver et specielt konstrueret optagelseskammer med to væskeindtag for at levere iltede medier til begge sider af skiven, kan spontane netværkssvingninger observeres med moderate ACSF-strømningshastigheder48. Denne protokol anvender både en hurtig strømningshastighed (stabiliseret med en pulsationsdæmper) og et superfusionskammer med dobbelt overflade for at forbedre sandsynligheden for at observere spontan aktivitet.
Endelig har denne protokol et lavt udbytte med hensyn til antallet af producerede skiver pr. dyr. Vandret udskæring med en tykkelse på 450 μm giver et lille antal HEC-skiver ved den foretrukne orientering (hvor skiven er effektivt parallel med hippocampus' tværgående akse). Af disse skiver, typisk, kun en eller to pr hippocampi udviser spontan SWR aktivitet, færre end der er blevet rapporteret andre steder43. Selv om tykkere skiver formentlig indeholder en større grad af tilbagevendende konnektivitet, kan skæring af lidt tyndere skiver (400 μm) give et større antal pr. mus af tværgående orienterede skiver med stålwireaktivitet. Derudover kan sandsynligheden for, at flere skiver pålideligt udviser spontan SWR-aktivitet, være højere i eksperimenter, der bruger ægte vandrette eller nedadvinklede skiver af ventral hippocampus. Den nuværende protokol inkorporerer brugen af opadvinklede vandrette skiver af den mellemliggende hippocampus, som kan være mindre tilbøjelige til at udvise spontan netværksaktivitet i forhold til skiver fra ventral hippocampus25,26,31. Endelig brugte denne protokol skiver fra unge og voksne mus. Mens transcardial perfusioner kan forbedre kvaliteten af skiver fra ældre dyr, kan sandsynligheden for at observere spontane netværksaktiviteter forbedres ved brug af skiver fra yngre dyr12,41,44.
Sammenfattende præsenterer denne protokol en musehjerneudsætningsmetode, der giver vinklede vandrette hippocampal-entorhinale cortexskiver fra den mellemliggende eller ventral hippocampale formation, der kan udvise kompleks spontan netværksaktivitet i form af skarpe bølge-ripple-komplekser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatteren vil gerne takke Steve Siegelbaum for støtte. Finansieringen ydes af 5R01NS106983-02 samt 1 F31 NS113466-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Lulzbot | LulzBot TAZ 6 | |
| Acute brain slice incubation holder | NIH 3D Print Exchange | 3DPX-001623 | Designed by ChiaMing Lee, available at https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623 |
| Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma Aldrich | A9187-500MG | |
| Ag-Cl ground pellets | Warner | 64-1309, (E205) | |
| agar | Becton, Dickinson | 214530-500g | |
| ascorbic acid | Alfa Aesar | 36237 | |
| beaker (250 mL) | Kimax | 14000-250 | |
| beaker (400 mL) | Kimax | 14000-400 | |
| biocytin | Sigma Aldrich | B4261 | |
| blender | Oster | BRLY07-B00-NP0 | |
| Bonn scissors, small | becton, Dickinson | 14184-09 | |
| borosilicate glass capillaries with filament (O.D. 1.5 mm, I.D. 0.86 mm, length 10 cm) | Sutter Instruments | BF150-86-10HP | Fire polished capillaries are preferable. |
| calcium chloride solution (1 M) | G-Biosciences | R040 | |
| camera | Olympus | OLY-150 | |
| compressed carbogen gas (95% oxygen / 5% carbon dioxide) | Airgas | X02OX95C2003102 | |
| compressed oxygen | Airgas | OX 200 | |
| constant voltage isolated stimulator | Digitimer Ltd. | DS2A-Mk.II | |
| coverslips (22x50 mm) | VWR | 16004-314 | |
| cyanoacrylate adhesive | Krazy Glue | KG925 | Ideally use the brush-on form for precision |
| data acquisition software | Axograph | N/A | Any equivalent software (e.g. pClamp) would work. |
| Dell Precision T1500 Tower Workstation Desktop | Dell | N/A | Catalog number will depend on specific computer - any computer will work as long as it can run electrophysiology acquisition software. |
| Digidata 1440A | Molecular Devices | 1-2950-0367 | |
| digital timer | VWR | 62344-641 | 4-channel Traceable timer |
| disposable absorbant pads | VWR | 56616-018 | |
| dissector scissors | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| double-edge razor blades | Personna | BP9020 | |
| dual automatic temperature controller | Warner Instrument Corporation | TC-344B | |
| dual-surface or laminar-flow optimized recording chamber | N/A | N/A | The chamber presented in this protocol is custom made. A commercial equivalent would be the RC-27L from Warner Instruments. |
| equipment rack | Automate Scientific | FR-EQ70" | A rack is not strictly necessary but useful for organizing electrophysiology |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethyiether)- N,N,N',N'-teetraacetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | 324626-25GM | |
| filter paper | Whatman | 1004 070 | |
| fine scale | Mettler Toledo | XS204DR | |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| glass petri dish (100 x 15 mm) | Corning | 3160-101 | |
| glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G8877-250MG | |
| ice buckets | Sigma Aldrich | BAM168072002-1EA | |
| isoflurane vaporizer | General Anesthetic Services | Tec 3 | |
| lab tape | Fisher Scientific | 15-901-10R | |
| lens paper | Fisher Scientific | 11-996 | |
| light source | Olympus | TH4-100 | |
| magnesium chloride solution (1 M) | Quality Biological | 351-033-721EA | |
| magnetic stir bars | Fisher Scientific | 14-513-56 | Catalog number will be dependent on the size of the stir bar. |
| micromanipulator | Luigs & Neumann | SM-5 | |
| micromanipulator (manual) | Scientifica | LBM-2000-00 | |
| microscope | Olympus | BX51WI | |
| microspatula | Fine Science Tools | 10089-11 | |
| monitor | Dell | 2007FPb | |
| MultiClamp 700B Microelectrode Amplifier | Molecular Devices | MULTICLAMP 700B | The MultiClamp 700B should include headstages, pipette holders, and a model cell. |
| N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), (HEPES) | Sigma Aldrich | H3375-25G | |
| needle (20 gauge, 1.5 in length) | Becton, Dickinson | 305176 | |
| nylon filament | YLI Wonder Invisible Thread | 212-15-004 | size 0.004. This cat. # is from Amazon.com |
| nylon mesh | Warner Instruments Corporation | 64-0198 | |
| perstaltic pump | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
| Phosphocreatine di(tris) salt | Sigma Aldrich | P1937-1G | |
| pipette holders | Molecular Devices | 1-HL-U | |
| platinum wire | World Precision | PT0203 | |
| polylactic acid (PLA) filament | Ultimaker | RAL 9010 | |
| potassium chloride | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| potassium gluconate | Sigma Aldrich | 1550001-200MG | |
| potassium hydroxide | Sigma Aldrich | 60377-1KG | |
| razor blades | VWR | 55411-050 | |
| roller clamp | World Precision Instruments | 14041 | |
| scale | Mettler Toledo | PM2000 | |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| slice harp | Warner | SHD-26GH/2 | |
| sodium bicarbonate | Fisher Chemical | S233-500 | |
| sodium chloride | Sigma Aldrich | S9888-1KG | |
| sodium phosphate monobasic anhydrous | Fisher Chemical | S369-500 | |
| sodium pyruvate | Fisher Chemical | BP356-100 | |
| spatula | VWR | 82027-520 | |
| spatula/spoon, large | VWR | 470149-442 | |
| sterile scalpel blades | Feather | 72044-10 | |
| stirrer / hot plate | Corning | 6795-220 | |
| stopcock valves, 1-way | World Precision Instruments | 14054 | |
| stopcock valves, 3-way | World Precision Instruments | 14036 | |
| sucrose | Acros Organics | AC177142500 | |
| support for swivel clamps | Fisher Scientific | 14-679Q | |
| surgical scissors, sharp/blunt | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| syringe (1 mL) | Becton, Dickinson | 309659 | |
| syringe (60 mL with Luer-Lok tip) | Becton, Dickinson | 309653 | |
| three-pronged clamp | Fisher Scientific | 05-769-8Q | |
| tissue forceps, large | Fine Science Tools | 11021-15 | |
| tissue forceps, small | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| tubing | Tygon | E-3603 | ID 1/16 inch, OD 3/16 inch |
| tubing | Tygon | R-3603 | ID 1/8 inch, OD 1/4 inch |
| vacuum grease | Dow Corning | 14-635-5D | |
| vibrating blade microtome | Leica | VT 1200S | |
| vibration-dampening table with faraday cage | Micro-G / TMC-ametek | 2536-516-4-30PE | |
| volumetric flask (1 L) | Kimax | KIM-28014-1000 | |
| volumetric flask (2 L) | PYREX | 65640-2000 | |
| warm water bath | VWR | 1209 |
References
- Buzsáki, G., Lai-Wo, S., Vanderwolf, C. H. Cellular bases of hippocampal EEG in the behaving rat. Brain Research Reviews. 6, 139-171 (1983).
- Buzsáki, G. Hippocampal sharp waves: Their origin and significance. Brain Research. 398, 242-253 (1986).
- Buzsáki, G., Horváth, Z., Urioste, R., Hetke, J., Wise, K.
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents — EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews Neuroscience. 13, 407-420 (2012).
- Buzsáki, G. Hippocampal sharp wave-ripple: A cognitive biomarker for episodic memory and planning. Hippocampus. 25, 1073 (2015).
- Maier, N., et al. Reduction of high-frequency network oscillations (ripples) and pathological network discharges in hippocampal slices from connexin 36-deficient mice. Journal of Physiology. 541, 521-528 (2002).
- Maier, N., Nimmrich, V., Draguhn, A. Cellular and network mechanisms underlying spontaneous sharp wave-ripple complexes in mouse hippocampal slices. Journal of Physiology. 550, 873-887 (2003).
- ul Haq, R., et al. Adrenergic modulation of sharp wave-ripple activity in rat hippocampal slices. Hippocampus. 22, 516-533 (2012).
- ul Haq, R., et al. Serotonin dependent masking of hippocampal sharp wave ripples. Neuropharmacology. 101, 188-203 (2016).
- Maier, P., Kaiser, M. E., Grinevich, V., Draguhn, A., Both, M. Differential effects of oxytocin on mouse hippocampal oscillations in vitro. European Journal of Neuroscience. 44, 2885-2898 (2016).
- Mizunuma, M., et al. Unbalanced excitability underlies offline reactivation of behaviorally activated neurons. Nature Neuroscience. 17, 503-505 (2014).
- Hájos, N., et al. Spike timing of distinct types of GABAergic interneuron during hippocampal gamma oscillations in vitro. Journal of Neuroscience. 24, 9127-9137 (2004).
- Geschwill, P., et al. Synchronicity of excitatory inputs drives hippocampal networks to distinct oscillatory patterns. Hippocampus. , (2020).
- Rutecki, P. A., Grossmann, R. G., Armstrong, D., Irish-Loewen, S. Electrophysiological connections between the hippocampus and entorhinal cortex in patients with complex partial seizures. Journal of Neurosurgery. 70, 667-675 (1989).
- Lothman, E. W., Bertram, E. H., Stringer, J. L.
- Carter, D. S., Deshpande, L. S., Rafiq, A., Sombati, S., Delorenzo, R. J. Characterization of spontaneous recurrent epileptiform discharges in hippocampal - cortical slices prepared from chronic epileptic animals. Seizure: European Journal of Epilepsy. 20, 218-224 (2011).
- Karlócai, M. R., et al. Physiological sharp wave-ripples and interictal events in vitro: What's the difference. Brain. 137, 463-485 (2014).
- Leroy, F., et al. Input-timing-dependent plasticity in the hippocampal CA2 region and its potential role in social memory. Neuron. 95, 1089-1102 (2017).
- Sun, Q., et al. Proximodistal heterogeneity of hippocampal CA3 pyramidal neuron intrinsic properties, connectivity, and reactivation during memory recall. Neuron. 95, 656-672 (2017).
- Masurkar, A. V., et al. Medial and lateral entorhinal cortex differentially excite deep versus superficial CA1 pyramidal neurons. Cell Reports. 18, 1-13 (2017).
- Papatheodoropoulos, C., Kostopoulos, G. Spontaneous, low frequency (∼2-3 Hz) field activity generated in rat ventral hippocampal slices perfused with normal medium. Brain Research Bulletin. 57, 187-193 (2002).
- Papatheodoropoulos, C., Kostopoulos, G. Spontaneous GABAA-dependent synchronous periodic activity in adult rat ventral hippocampal slices. Neuroscience Letters. 319, 17-20 (2002).
- Kubota, D., Colgin, L. L., Casale, M., Brucher, F. A., Lynch, G.
- Behrens, C. J., Van Den Boom, L. P., De Hoz, L., Friedman, A., Heinemann, U. Induction of sharp wave - complexes in vitro and reorganization of hippocampal networks. Nature Neuroscience. 8, 1560-1567 (2005).
- Kouvaros, S., Papatheodoropoulos, C. Prominent differences in sharp waves, ripples and complex spike bursts between the dorsal and the ventral rat hippocampus. Neuroscience. 352, 131-143 (2017).
- Strange, B. A., Witter, M. P., Lein, E. S., Moser, E. I. Functional organization of the hippocampal longitudinal axis. Nature Reviews Neuroscience. 15, 655-669 (2014).
- Patel, J., Fujisawa, S., Berényi, A., Royer, S., Buzsáki, G. Traveling Theta Waves along the Entire Septotemporal Axis of the Hippocampus. Neuron. 75, 410-417 (2012).
- Patel, J., Schomburg, E. W., Berényi, A., Fujisawa, S., Buzsáki, G. Local generation and propagation of ripples along the septotemporal axis of the hippocampus. Journal of Neuroscience. 33, 17029-17041 (2013).
- Fricke, R., Cowan, W. M. An autoradiographic study of the commissural and ipsilateral hippocampo-dentate projections in the adult rat. Journal of Comparative Neurology. 181, 253-269 (1978).
- Ishizuka, N. O. R., Weber, J., Amaral, D. G. Organization of intrahippocampal projections originating from CA3 pyramidal cells in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 623, 580-623 (1990).
- Papatheodoropoulos, C. Electrophysiological evidence for long-axis intrinsic diversification of the hippocampus. Frontiers in Bioscience - Landmark. 23, 109-145 (2018).
- Gilbert, M., Racine, R. J., Smith, G. K. Epileptiform burst responses in ventral vs dorsal hippocampal slices. Brain Research. 361, 389-391 (1985).
- Papatheodoropoulos, C., Moschovos, C., Kostopoulos, G. Greater contribution of N-methyl-D-aspartic acid receptors in ventral compared to dorsal hippocampal slices in the expression and long-term maintenance of epileptiform activity. Neuroscience. 135, 765-779 (2005).
- Jones, R. S. G., Heinemann, U. Synaptic and intrinsic responses of medial entorhinal cortical cells in normal and magnesium-free medium in vitro. Journal of Neurophysiology. 59, (1988).
- Rafiq, A., Delorenzo, R. J., Coulter, D. A. Generation and propagation of epileptiform discharges in a combined entorhinal cortex / hippocampal slice. Journal of Neurophysiology. 70, 1962-1974 (1993).
- Stoop, R., Pralong, E. Functional connections and epileptic spread between hippocampus, entorhinal cortex and amygdala in a modified horizontal slice preparation of the rat brain. European Journal of Neuroscience. 12, 3651-3663 (2000).
- Roth, F. C., Beyer, K. M., Both, M., Draguhn, A., Egorov, A. V. Downstream effects of hippocampal sharp wave ripple oscillations on medial entorhinal cortex layer V neurons in vitro. Hippocampus. 26, 1493-1508 (2016).
- Bertsche, A., Bruehl, C., Pietz, J., Draguhn, A. Region- and pattern-specific effects of glutamate uptake blockers on epileptiform activity in rat brain slices. Epilepsy Research. 88, 118-126 (2010).
- Wu, C., Shen, H., Luk, W. P., Zhang, L. A fundamental oscillatory state of isolated rodent hippocampus. Journal of Physiology. 540, 509-527 (2002).
- Colgin, L. L., Jia, Y., Sabatier, J. M., Lynch, G. Blockade of NMDA receptors enhances spontaneous sharp waves in rat hippocampal slices. Neuroscience Letters. 385, 46-51 (2005).
- Ellender, T. J., Nissen, W., Colgin, L. L., Mann, E. O., Paulsen, O. Priming of hippocampal population bursts by individual perisomatic-targeting interneurons. The Journal of Neuroscience. 30, 5979-5991 (2010).
- Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. A. Comparison of different slicing planes in preservation of major hippocampal pathway fibers in the mouse. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 1-17 (2017).
- Maier, N., Morris, G., Johenning, F. W., Schmitz, D. An approach for reliably investigating hippocampal sharp wave-ripples in vitro. PLoS One. 4, 6925 (2009).
- Schlingloff, D., Kali, S., Freund, T. F., Hajos, N., Gulyas, A. I. Mechanisms of sharp wave initiation and ripple generation. Journal of Neuroscience. 34, 11385-11398 (2014).
- McCloskey, D. P., Scharfman, H. E. Progressive, potassium-sensitive epileptiform activity in hippocampal area CA3 of pilocarpine-treated rats with recurrent seizures. Epilepsy Research. 97, 92-102 (2011).
- McMahon, L. L., Williams, J. H., Kauer, J. A. Functionally distinct groups of interneurons identified during rhythmic carbachol oscillations in hippocampus in vitro. Journal of Neuroscience. 18, 5640-5651 (1998).
- Pöschel, B., Heinemann, U., Draguhn, A. High frequency oscillations in the dentate gyrus of rat hippocampal slices induced by tetanic stimulation. Brain Research. 959, 320-327 (2003).
- Hájos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. European Journal of Neuroscience. 29, 319-327 (2009).
- Hájos, N., Mody, I. Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content. Journal of Neuroscience Methods. 183, 107-113 (2009).
- Dengler, C. G., Yue, C., Takano, H., Coulter, D. A. Massively augmented hippocampal dentate granule cell activation accompanies epilepsy development. Nature Publishing Group. , 1-17 (2017).
- Ting, J. T., et al. Preparation of acute brain slices using an optimized N -methyl-D-glucamine protective recovery method. Journal of Visualized Experiments. 132, 1-13 (2018).
- Westerhof, N., Lankhaar, J. W., Westerhof, B. E.
- Shi, W. X., Bunney, B. S. A small volume chamber for electrical recording from submerged brain slices and a pulse-free medium supply system using a peristalic pump. Journal of Neuroscience Methods. 35, 235-240 (1990).
