Summary
이 프로토콜은 자발적인 날카로운 파도 잔물결 활동을 나타내는 마우스에서 수평 해마 내톨리날 피질 (HEC) 슬라이스의 준비를 설명합니다. 슬라이스는 단순화 된 인터페이스 보유 챔버에서 배양되고 기록은 조직의 산소화와 네트워크 수준의 활동의 자발적출현을 촉진하기 위해 빠르게 흐르는 인공 뇌척수액과 침수 된 조건에서 수행됩니다.
Abstract
급성 설치류 뇌 슬라이스는 전기 생리학, 현미경 검사법 및 약리학을 사용하여 단일 세포 해상도로 신경 회로의 조직과 기능에 대한 통찰력을 얻기 위한 견통 가능한 실험 적 접근법을 제공합니다. 그러나, 시험관 내 실험의 설계에 대한 주요 고려 사항은 생체 내에서 관찰되는 바와 같이 다른 슬라이스 제제가 신경 활동의 자연주의 적 패턴을 재구성하는 정도이다. 그대로 뇌에서, 해마 네트워크는 침엽수 상태 또는 비 REM 수면 중에 발생하는 날카로운 파도 잔물결 복합체(SWRs)에 의해 예시된 바와 같이 동물의 행동 상태를 반영하는 고도로 동기화된 인구 활성을 생성한다. SWRs 및 기타 형태의 네트워크 활동은 적절한 조건하에서 격리된 해마 조각에서 자발적으로 나타날 수 있습니다. 강력한 뇌 슬라이스 툴킷을 해마 네트워크 활성 조사에 적용하기 위해서는 해마 네트워크 내의 조직 건강과 기능적 연결의 보존을 최적화하는 접근 방식을 활용할 필요가 있다. 마우스는 감기 자당 기반의 인공 뇌척수액으로 트랜스카디에 퍼집니다. 해마를 포함하는 수평 조각은 시냅스 연결을 유지하기 위해 450 μm의 두께로 절단됩니다. 슬라이스는 인터페이스 스타일 챔버에서 복구되고 기록용 침수 챔버로 전송됩니다. 기록 챔버는 슬라이스의 산소를 개선하기 위해 높은 유량으로 인공 뇌척수액의 이중 표면 슈퍼퓨전을 위해 설계되었습니다. 이 프로토콜은 시험관 내 복잡하고 자발적인 네트워크 활동의 조사에 적합한 건강한 조직을 산출한다.
Introduction
체외에서 살아있는 해마 슬라이스에서 전기 생리학적 측정은 수많은 장점을 가진 강력한 실험 적 접근 방식입니다. 실험자는 현미경, 미세 조작기 및 기록 시스템을 사용하여 조직의 개별 뉴런에서 측정을 직접 시각화하고 수집할 수 있습니다. 조직 조각은 또한 광유전학, 화학유전학, 또는 약리학 실험을 위한 사진 자극 또는 약 전달에 아주 접근합니다.
해마 네트워크는 생체 내에서매우 동기적인 인구 활성을 생성하며, 세포외 지역 필드 전위1,2,3,4,5에서 진동으로 볼 수있다. 뇌 슬라이스 방법은 이러한 신경 네트워크 진동의 기초 세포 및 회로 메커니즘에 대한 통찰력을 얻기 위해 활용되었습니다. 마이어 외(Maier) 등의 기초 작업은 날카로운 파리플 복합체(SWRs)가 복부 해마6,7의슬라이스에서 자발적으로 나타날 수 있음을 입증하였다. 여러조사자로부터의 후속 연구는 점차 해마8,9,10의 네트워크 상태를 조절하는 신경 조절기의 역할을 포함하여 SRS의 많은 측면을 점진적으로 해명하고 생체 내에서 동작 중에 이전에 활성화된 신경 앙상블의 체외 재활성화를 유도하는 시냅스메커니즘을 유도한다. 뇌 슬라이스 실험은 또한 감마 범위 진동 (30-100 Hz)에 대한 통찰력을 제공했으며, 메모리 인코딩을 지원하고12,13을리콜하는 것으로 추정되는 독특한 해마 네트워크 상태. 마지막으로, 측두엽 간질의 병리생리학에서 해마및 관련 구조물의 중심적인 역할을 인식하여14,15,연구원은 간질 활성의 생성 및 전파를 조사하기 위하여 해마 슬라이스 준비를 이용했습니다. 카터 외는 만성 간질 동물로부터 제조된 결합된 해마-내측 피질 슬라이스가 시험관 외16에서간질 방출을 자발적으로 생성할 수 있음을 입증하였다. 그 후, Karlócai 등은 변형된 인공 뇌척수액(ACSF)을 변경된 이온 농도(Mg2+ 또는 상승K+)또는 추가약물(4AP 또는 가바진)17을사용하여 해마 슬라이스에서 간질 배전의 기전을 탐구하였다.
조사자들은 주요 방법으로 다른 수많은 해마 슬라이스 접근법을 개발했습니다: (1) 슬라이스에 포함된 해마 의 영역(등쪽, 중간 또는 복부); (2) 내측 피질과 같은 외격 조직의 존재 또는 부재; (3) 슬라이스를 자르는 데 사용되는 방향(관상, 처진, 수평 또는 경사); (4) 조직이 슬라이스 후 유지되는 조건(ACSF에 완전히 침수되거나 ACSF 및 가습, 환원이 풍부한 공기의 인터페이스에서 유지).
어떤 슬라이싱 접근 방식을 사용하는지는 실험목표에 의해 결정되어야 합니다. 예를 들어, 침수된 조건하에서 유지되는 등쪽 해마의 횡방향 또는 관상 슬라이스는 내격 회로 및 시냅스가소성(18,19,20)의조사를 위해 매우 효과적으로 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 제제는 자발적으로 복부 해마(21),22,23로부터의슬라이스로서 용이하게 네트워크 진동을 생성하지 않는다. 지속적인 SWR 활성상태는 등쪽 및 복부해마(24)로부터의횡방향 슬라이스에서 파탄성 자극에 의해 유도될 수 있지만, 자발적인 SW는 복부 슬라이스7,25에서보다 쉽게 관찰된다.
등쪽과 복부 해마 사이의 내재된 생리학적 및 해부학적 구별은 생체 내 및 체외26모두에서 수행된 연구에 의해 지원된다. 쥐의 기록은 등대와 중간 해마 를 통해 강하게 일관된 테타 리듬을 드러냈지만, 복부 지역과 나머지 해마(27)의 일관성이 좋지않았다. 생체 내 의 SW는 등쪽과 중간 해마 사이에 쉽게 전파되며, 복부 해마에서 발생하는 SW는 종종 지역28로남아 있습니다. 회생 투영은 등쪽 및 중간 해마 프로젝트에 상주하는 CA3 피라미드 뉴런에서 유래하여 해마의 세로 축을 따라 먼 거리를 투영합니다. 복부 영역에서 유래한 CA3 프로젝션은 비교적 로컬로 유지되므로 슬라이스 공정29,30중에 절단될 가능성이 적습니다. 따라서 복부 조각은 인구 동기화를 생성하는 데 필요한 반복 네트워크를 더 잘 보존할 수 있습니다. 체외에서 자발적인 네트워크 활동을 생성하는 복부 슬라이스의 성향은 또한 더 많은 등쪽 지역에 비해 복부 해마에서 피라미드 뉴런 또는 약한 GABAergic 억제의 높은 본질적인 흥분성을 반영할 수 있습니다31. 실제로, 복부 해마 슬라이스는 간질 활성32,33에더 취약하다. 따라서, 자발적인생리학적8, 9,11,24 또는병리학적 16,34,35,36네트워크 진동에 대한 많은 연구는 전통적으로 수평 슬라이스 접근법을 사용했으며, 때로는 프론토-후수 방향에 약간의 각도를 가지며, 이는 복부 해마의 횡측 평면과 평행한 조직 조각을 산출한다.
슬라이스의 많은 셀이 절단될 때 네트워크 연결은 슬라이싱 절차에 의해 불가피하게 영향을 미칩니다. 준비에 유지된 슬라이스와 조직의 각도와 두께는 관심 회로에서 연결을 최적화하는 것으로 간주되어야 합니다. 많은 연구는 생리학적 또는 병리학 적 네트워크 진동의 맥락에서 두 구조 사이의 상호 작용을 탐구하기 위해 수평 결합 해마 - 내측 피질 조각 (HEC)을 이용했다. Roth et al.은 HEC슬라이스(37)를통해 SWR 활성의 전파를 입증하기 위해 내측 내측 피질의 해마 및 층 V의 CA1 서브필드에서 이중 레코딩을 수행하였다. 간질 활성의 많은 연구는 간질 방출이 코르티코모캄망(16,35,36,38)을통해 전파되는 방법을 조사하기 위해 HEC 슬라이스제제를사용했다. 손상되지 않은 코르티코히마막 루프의 보존은 자발적인 SW, 간질 방전 또는 감마 진동을 위한 전제 조건이 아니라는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 네트워크 진동은 부착된 파라하마조직(21,22,23, 25,39,40,41)이없는 등 또는 복부 해마의 횡방향 조각에서 생성될 수 있다. 해마 슬라이스에서의 네트워크 진동의 자발적인 생성을 위한 더 중요한 요소는 두꺼운 슬라이스(400-550 μm)가 CA2/CA3 재발네트워크(21,22,25)에서더 많은 연결을 보존하기 때문에 각 슬라이스의 두께일 수 있다.
각진 수평 HEC 슬라이스(정면-후두 방향으로 약 12° 각도로 절단)가 코르티코히마항루프(11),16,34,35,42의기능적 연결을 연구하는 데 사용되었지만, 이러한 각진 제제는 자발적인 네트워크활동(43,44,45)에필요하지 않다. 그러나, 각진 슬라이싱 평면의 사용은 조사관이 하향 또는 위쪽 각도가 적용되는지 여부에 따라 복부 또는 중간 해마의 횡방향 방향 라멜라를 가장 잘 보존하는 슬라이스를 선택적으로 만들 수 있게한다(그림 1). 이 접근법은 개념적으로 파파테오도로풀로스 외, 2002년, 각 해마를 무료로 해부한 다음 조직 헬기를 사용하여 전체 등쪽-복부축(21)을따라 횡방향 슬라이스를 만드는 것과 개념적으로 유사하다. 전술한 작용기와 등간 중간 해마 사이의 기능적 구별에 비추어, 조사관은 실험을 설계하거나 결과를 해석할 때 슬라이스의 해부학적 기원을 고려해야 한다. 슬라이스 시술 중에 한천 경사로를 사용하는 것은 중간 또는 복부 해마에서 슬라이스를 우선적으로 생산하는 간단한 방법입니다.
해마 슬라이스는 침수 된 챔버 (조직이 ACSF에 완전히 침지됨) 또는 인터페이스 스타일의 챔버 (예 : 오슬로 또는 하스 챔버,흐르는 미디어의 얇은 필름으로만 덮여 있는 슬라이스)에서 유지 될 수 있습니다. 인터페이스 유지 보수는 조직의 산소를 향상, 이는 신경 생존을 촉진하고 간 간 활동의 지속적인 높은 수준을 허용. 전통적으로 침수된 기록 조건은 네트워크 수준의 진동의 안정적인 발현을 위해 적절한 조직 산소화를 제공하지 않는 느린 ACSF 유량을 사용합니다. 침수 된 해마 슬라이스에서 carbachol 유도 감마 진동은 일시적으로 관찰된다46,47,그들은 안정적으로 인터페이스 기록 챔버에서 유지 될 수있는 동안10,48,49. 이와 같이, 시험관내 복잡한 자발적 활성에 대한 많은 연구는 급격한 파플리플 단지6,7,8,9,10,25,37,감마 진동10,13,및 간질 편성 활동16,38,45,47을 조사하기 위해 인터페이스 기록챔버에 의존했다.
침수식 기록실에서, 침지 현미경 목표는 개별 세포를 시각화하고 기록에 대한 건강한 세포를 선택적으로 표적으로 하는 데 사용될 수 있다. 침수 된 준비는 또한 세포 milieu에 미세 한 제어를 허용, 침수 조직에 약물 또는 다른 화합물의 급속 한 확산을 용이 하 게. 따라서 침수 된 조건에서 안정적인 네트워크 진동을 유지하는 수정 된 방법론은 강력한 실험 적 접근 방식을 나타냅니다. 이러한 접근법은 하호스 등의 작업에 의해 예시되며, 해마 슬라이스는 ACSF(~6mL/min)의 높은 유량으로 수정된 침수된 기록실로 이송하기 전에 몇 시간 동안 단순화된 인터페이스 스타일의 지주 챔버에서 회수하여조직(12,48,49)에산소 공급을 향상시키는 데 서술된다. 이러한 조건하에서, 높은 수준의 인터뉴런 활동과 안정적인 자발적네트워크 진동은 침수된 기록실에서 유지될 수 있다. 이러한 수정된 접근법을 통해 조사관은 시각적으로 유도된 전세포 패치 클램프 레코딩을 수행하고 카바콜 유도 감마진동(12)에형태학적으로 확인된 세포 유형의 기여를 특성화할 수 있다. SW는 또한 ACSF11,48,49의빠른 유량으로 침수 된 해마 슬라이스에서 자발적으로 발생할 수 있습니다. Maier 등. 잠긴 기록 챔버로 옮겨지기 전에 인터페이스 챔버에서 회수된 해마 슬라이스가 자발적인 SW를 안정적으로 전시한 반면, 침수된 기록실로 옮겨지기 전에 비커에 잠긴 슬라이스는 더 작은 필드 응답, 낮은 수준의 자발적인 시냅스 전류, 그리고 자발적인 SWRs43을거의 전시하지 않는 것을 보여주었습니다. 슐링로프 외.는 자발적인 SWRs44의생성에서 파르팔알린 발현 바구니 세포의 역할을 입증하기 위해 이 향상된 방법론을 사용했다.
다음 프로토콜은 수평 해마 슬라이스에서 자발적으로 활성 뉴런을 인터페이스 조건하에서 회수하고 약리학적 또는 광유전학 적 조작 및 시각적으로 유도된 기록에 적합한 침수된 기록 챔버에서 유지될 수 있는 슬라이스 방법을 제시한다.
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Protocol
여기에 설명된 모든 방법은 컬럼비아 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (AC-AAAU9451)에 의해 승인되었습니다.
1. 솔루션 준비
- 표 1에설명된 대로 슬라이스용 자당 절단 용액을 준비한다.
참고: 1L의 자당 용액을 준비한 후, 얼음 트레이에 소량(약 100~200mL)을 동결하십시오. 이 냉동 자당 얼음 큐브는 얼음 슬러리에 혼합됩니다 (4.3 단계 참조). - 표 2에설명된 대로 기록용 인공 뇌척수액(ACSF)을 준비한다.
- 미량 금속 및 기타 불순물을 제거하기 위해 여과된 정제수 1mL에서 NaCl0.05844 g의 NaCl을 용해시켜 자극 파이펫을 위한 NaCl 1M을 준비합니다.
참고: 자당 절단 용액과 ACSF는 각 실험에 대해 신선하게 준비해야 합니다.
2. 한천 경사로 준비
- 미량 금속 및 기타 불순물을 제거하기 위해 여과된 정제수로 한천 분말을 용해시켜 4% 한천(예: 50mL의 물 속 의 한천 2g)을 준비하십시오. 혼합물을 전자레인지에 가열하여 끓이기 시작할 때까지 가열합니다(약 30-60s). 용융 된 한천을 금형에 붓고 약 12 ° 경사의 냉장고에서 4 °C에서 냉각되고 고체되도록합니다.
참고: 금형의 경우, 한 쪽의 유리 또는 플라스틱 용기를 비스듬히 사용할 수 있으며, 충분한 용융 된 한천을 부어 길이 4cm, 높이약 0.8cm의 경사로를 형성할 수 있습니다.
3. 슬라이스 영역을 무대
- ACSF의 약 250mL와 슬라이스 복구 챔버를 포함하는 400 mL 비커를 채우십시오; 32°C로 데운 수조에 놓고 카보겐(산소 가스/이산화탄소 가스 95%)으로 거품을 내기 시작합니다.
참고: 회수 비커를 충분한 유체로 채우면 용액의 표면에 홀딩 챔버의 나일론 메쉬를 배치하여 따뜻한 용액 혼합물과 공기의 인터페이스에서 슬라이스를 유지하도록한다(도 1). 나일론 메쉬에 렌즈 용지의 작은 조각을 배치합니다. 슬라이스는 렌즈 용지 위에 놓여 있으며, 나중에 조각을 녹음 챔버로 개별적으로 전달하는 데 사용할 수 있습니다(6.6단계 참조). - 자당 용액을 얼음 양동이에 넣고 차가운 카보겐으로 거품을 시작합니다.
참고: 회수 비커와 자당 용액은 마우스가 이소플루란 챔버에 놓이기 전에 카보겐이 적어도 30 분 동안 버블링하여 각각 따뜻하게 하고 냉각되어야합니다. - 냉동고에서 미리 만들어진 냉동 자당 용액 얼음 큐브의 트레이를 꺼내 벤치에 놓고 부분적으로 해동하십시오.
- 깨끗한 양날 면도날의 절반을 마이크로톤에 넣고 필요한 경우 교정합니다. 해부 동안 사용할 면도날의 나머지 절반을 따로 둡니다.
- 카보겐 라인과 온도 프로브를 슬라이스 챔버로 실행하고 얼음으로 둘러싸여 챔버를 식힙니다.
- 두 개의 일회용 흡수 패드로 덮인 깨끗한 벤치 또는 테이블을 준비하십시오. 모든 해부 도구와 왼쪽 패드에 실험실 테이프 세 개를 배치하여 경질 관류가 수행됩니다.
참고: 해부 도구에는 작은 본 가위, 해부 가위, 큰 주걱 / 숟가락, 미세 주걱, 새로운 블레이드, 주걱, 날카로운 / 무딘 수술 가위, 큰 조직 집게 및 작은 조직 집게 (재료의 표참조)가 포함됩니다. - 관류 영역의 오른쪽에 있는 다른 흡수 패드에 100mm 직경의 유리 페트리 접시뚜껑에 원형 필터 용지를 놓습니다. 페트리 접시의 바닥을 뚜껑 옆에 놓고 카보겐 라인을 접시의 두 조각에 넣습니다.
- 면도날이나 메스를 사용하여 작은 천 경사로(각진 표면을 따라 약 4cm, 높이 0.8cm, 너비 2cm)를 자른다. 높은 끝에서 경사로의 조각을 잘라 한천의 백업 블록을 만들기 위해 그것을 반전. 시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 한천 램프와 백킹 블록을 슬라이스 플랫폼에 부착하고 따로 둡니다.
참고: 한천의 백업 블록은 슬라이스 하는 동안 뇌를 안정 시키는 데 도움이 하 고 각 조각에서 불필요 한 조직을 해부 하는 표면을 제공(그림 1).
4. 경내 관류
- 벤치탑 위의 약 18인치 자당 절단 용액을 위한 저수지로서 60mL 용량 주사기를 일시 중단합니다(예: 수직 기둥에 세 갈래의 회전 클램프를 사용). 저수지 바닥에 튜브를 부착하고 롤러 클램프를 통해 튜브를 실행하고 튜브의 다른 쪽 끝을 깨끗한 20 G 바늘에 연결합니다.
- 60mL 저수지에 약 30mL의 차가운 자당 용액을 채우고 카보겐 라인을 자당 저수지로 지시하여 지속적으로 퍼퓸을 포부합니다.
참고 : 자당이 갇힌 거품없이 튜브와 바늘을 통해 흐르는지 확인하십시오. 유량은 바늘에서 떨어지는 자당의 꾸준하고 지속적인 스트림을 가질 만큼 충분히 빠야합니다. - 블렌더를 사용하여 냉동 자당을 얼음 슬러리에 넣고 큰 주걱/숟가락을 사용하여 슬러리를 분배합니다.
- 유리 페트리 접시 뚜껑의 가장자리에 소량의 자당 슬러리를 놓습니다. 페트리 접시 바닥에 소량의 자당 슬러리를 넣습니다.
- 약 20-30mL의 자당 슬러리를 관류 유체 저장소에 추가하여 저수지가 매우 차갑고 주로 액체 자당의 혼합물을 포함 할 때까지 30 mL의 냉장 액체 자당과 잘 혼합하여 일부 잔류 냉동 용액과 혼합하십시오.
- 이소플루란 기화기에 연결된 챔버에 마우스를 놓습니다. 약 2 L/min에서 흐르는 산소로 기화기의 다이얼을 돌려 5% 농도로 이소플루란을 전달하고 타이머를 시작합니다.
참고: 슬라이스를 얼마나 빨리 얻을 수 있는지 측정하기 위해 슬라이스 과정을 거치는 동안 이 타이머를 유지합니다. 절차는 가능한 한 빨리 수행되어야하며, 슬라이스가 완료되고, 조직은 이소플루란 챔버를 입력동물의 15-20 분 이내에 인터페이스 챔버에서 회복된다. 깊은 마취의 상태를 보장하기 위해 마우스를 보십시오. 최소 5분 후에 마우스는 발가락 핀치에 깊이 마취되고 반응하지 않아야 합니다. - 이소플루란 챔버에서 마우스를 제거하기 직전에 페트리 접시 뚜껑을 약 3-5mm 깊이로 차가운 자당 용액으로 채우고 페트리 접시 바닥을 약 1.0cm 깊이로 채웁니다.
- 마우스를 왼쪽 흡수 패드로 빠르게 옮기고 3개의 테이프를 사용하여 앞다리와 꼬리를 고정합니다. 절개가 수행되기 전에 마우스가 응답하지 않도록 뒷다리 발가락 핀치를 수행합니다. 큰 조직 집게와 외과 가위를 사용하여 피부를 텐트화하고 흉골 바닥에서 가슴 의 상단까지 길게 절개를합니다. 포셉을 사용하여 흉골에 당겨 와 격막을 통해 잘라 가위를 사용합니다.
참고: 마우스의 초기 위치와 다이어프램을 절착하기 위한 첫 번째 여러 절개는 마우스가 의식을 되찾지 못하도록 가능한 한 빨리 수행해야 합니다. 절차 전반에 걸쳐 마취의 적절한 깊이를 보장하기 위해, 코 콘은 관류 동안 이소플루란을 제공하기 위해 마우스에 배치 할 수 있습니다. - 가위를 사용하여 양쪽의 늑골 케이지를 잘라 내어 앞다리가 신체와 만나는 지점을 향해 하나의 큰 움직임으로 절단합니다. 집게를 사용하면 리브 케이지 의 앞쪽을 머리 쪽으로 스윙한 다음 큰 가위를 사용하여 수평 절단으로 완전히 제거합니다. 큰 집게를 사용하여 심장을 제자리에 잡고 20 G 관류 바늘을 왼쪽 심실에 삽입하십시오. 바늘이 올바르게 배치되면 차가운 자당 용액이 심실을 채우면서 심장의 왼쪽이 빠르게 창백해야합니다.
- 작은 분산 가위를 사용하여 오른쪽 아트리움으로 자르고 혈액이 순환 시스템에서 흘러 나올 수 있도록 하십시오. 절개가 올바르게 수행되면 심장에 최소한의 손상이 있어야하며 관류 전반에 걸쳐 계속 펌핑해야합니다.
참고: 티슈 페이퍼의 롤업 조각은 심장에서 혈액과 자당 액액을 심고 시술 중에 관류 바늘의 가시성을 유지하는 데 사용할 수 있습니다. - 관류 바늘이 제자리에 머무르고 왼쪽 심실에서 떨어지지 않도록하십시오. 적절한 유량과 배치로 간은 20-30 초와 밝은 황갈색 / 베이지 색으로 창백하기 시작합니다.
- 30-45s 후 큰 가위를 사용하여 마우스를 참수합니다. 왼손에 머리를 잡고 두개골에서 피부를 밀거나 벗깁니다. 잘 퍼진 동물에서 두개골은 매우 창백해야하며 뇌는 명확하게 보이는 혈관없이 두개골을 통해 매우 밝은 분홍색 색상 (흰색접근)을 표시해야합니다.
5. 뇌를 추출하고 슬라이스를 잘라
- 작은 본 가위를 사용하여 두개골을 통해 두 개의 측면 컷을 두개골 앞의 중간선으로, 눈 근처에 만듭니다. 두개골 의 기지의 양쪽에 두 개의 추가 컷을 확인합니다.
- 머리를 유리 페트리 접시 의 바닥으로 옮기면 대부분 차가운 자당 용액에 담가두어야합니다. 작은 본 가위를 사용하여 두개골 의 길이를 따라 미드 라인을 자르고 기본 뇌 조직의 손상을 최소화하기 위해 가위로 당깁니다. 작은 조직 집게를 사용하여 두개골의 각 면을 단단히 잡고 책을 여는 것처럼 뇌에서 위아래로 스윙합니다.
- 왼손의 손가락을 사용하여 두개골 플랩을 열고 후각 전구 근처의 뇌 밑에 미세 주걱을 삽입하십시오. 두개골에서 뇌를 자당으로 뒤집어 서 뇌줄기를 끊습니다. 어떤 잔류 혈액, 모피, 또는 다른 조직을 제거하기 위해 뇌를 씻어.
- 큰 주걱 / 숟가락을 사용하여 유리 페트리 접시의 뚜껑에 뇌를 전송합니다. 양날면도날의 나머지 절반은 이전에 따로 설정, 먼저 소뇌를 제거하고 후각 전구를 포함하여 뇌의 가장 전방 부분을 제거하기 위해 두 개의 관상 절단을(그림 1).
- 천 경사로에 시아노아크릴레이트 접착제를 적용합니다. 매우 간단하게 큰 조직 집게를 사용하여 건조 필터 종이의 조각에 뇌를 배치 한 다음 즉시 천 경사로로 전송, 접착제에 뇌의 복부 표면을 배치.
참고: 중간 해마의 조각의 경우 뇌는 경사로의 경사면을 향한 전방과 블레이드에 가까운 후방을 지향해야 합니다. 복부 해마의 조각을 위해, 전방 끝과 뇌를 방향은 경사로의 경사를 가리키며, 뒤쪽 끝이 경사로 의 상단에, 블레이드에서 더 멀리. 두 경우 모두, 뇌는 경사로의 상단에 위치해야하며, 뇌의 관상 절단 표면이 천백 블록(도 1)에접촉하는 것과 같은. - 미천과 두뇌가 있는 슬라이스 플랫폼을 마이크로토메의 슬라이스 챔버에 넣고 차가운 자당 용액에 완전히 몰입하십시오. 큰 주걱 /숟가락을 사용하여 일부 자당 슬러리를 챔버로 옮기고, 냉동 자당을 녹이고 혼합물의 온도를 ~ 1-2 °C로 빠르게 끌어 내리십시오.
참고: 슬라이스 전체의 온도 게이지를 시청합니다. 자당 용액이 3 °C 이상으로 따뜻해지면 슬러리를 더 넣고 혼합하여 온도를 다시 내려 보세요. - 마이크로토메 속도가 0.07mm/s로 설정되어 450 μm 두께로 슬라이스를 잘라냅니다. 각 슬라이스가 풀려나면, 작은 조직 집게와 날카로운 메스를 사용하여 먼저 두 반구를 분리한 다음, 슬라이스가 주로 해마와 파라하마영역(도 1)으로구성될 때까지 조직을 잘라낸다.
- 플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 슬라이스를 인터페이스 복구 챔버로 개별적으로 전송하여 ACSF 의 인터페이스와 슬라이스를 덮는 ACSF의 얇은 반월상연수만으로 공기를 배치하도록 합니다. 챔버의 뚜껑을 단단히 닫고 슬라이스가 32 °C에서 30 분 동안 회복 되도록 합니다.
- 32°C에서 초기 복구 후, 교반기세트의 수조에서 인터페이스 회수 챔버를 꺼내서 심실 내ACSF의 순환을 촉진하도록 느린 속도로 설정한다. 슬라이스가 90분 동안 회복되면 서서히 실온까지 식힙니다. 복구 챔버가 지속적으로 카보겐으로 거품이 있는지 확인하고 큰 거품이 조각 아래에 갇히지 않도록하십시오.
6. 자발적인 활동의 로컬 필드 잠재력 (LFP) 녹음 수행
- 인수 소프트웨어를 실행하는 컴퓨터, 컴퓨터에 연결된 모니터, 자극기, 미세 조작기, 온도 컨트롤러, 현미경 광원, 현미경 부착 카메라, 마이크로 전기 전하 증폭기, 디지털화기 및 동시 펌프를 포함한 모든 필요한 장비를 켜서 LFP 기록을 준비합니다. 중앙 진공 시스템을 사용하는 경우 벽 밸브를 열어 기록 챔버에서 ACSF를 제거하는 진공 라인을 준비합니다.
- 가열된 저수지를 ACSF로 채운 다음 튜브의 한쪽 끝을 버블링 ACSF가 들어있는 400 mL 비커에 넣습니다. 연동 펌프를 켜서 ACSF를 400mL 비커에서 가열된 저수지로, 그리고 저수지에서 녹음실로 지시한다. 튜브를 탭하거나 꼬집어 갇힌 거품을 놓습니다.
- 연동 펌프를 조정하여 기록 챔버를 통한 ACSF 유량이 빠르도록 합니다(~ 8-10mL/min). 온도 프로브를 사용하여 ACSF가 기록 챔버의 중앙에 32°C인지 확인합니다.
참고: ACSF가 연동 펌프를 사용하여 기록 챔버로 전달되면 유량이 높을 수록 유량이 크게 변동될 수 있습니다. 일관된 유량은 튜브에 통합된 일련의 빈 주사기로 구성된 간단한 맥동 댐퍼(도2)를사용하여 달성될 수 있다. - 가열 된 필라멘트 풀러를 사용하여 보로실리케이트 유리 모세 혈관에서 자극과 녹음 파이펫을 준비합니다. 풀러 프로토콜은 자극 또는 로컬 필드 잠재적 기록 전극에 대한 2-3 MOhm의 저항과 파이펫을 산출하도록 구성되어야한다.
- ACSF를 통해 자극 파이펫을 1M NaCl 및 LFP 파이펫으로 채웁니다.
- 튜브를 잠깐 고정하고 펌프를 끄고 ACSF의 흐름을 일시 중지합니다. 슬라이스를 미세 한 집게를 사용하여 레코딩 챔버로 슬라이스를 옮기면 슬라이스가 렌즈 용지에 달라붙는 렌즈 용지의 모서리를 파악합니다. 렌즈 용지를 놓고 슬라이스를 아래로 향하게 하여 녹음실에 슬라이스한 다음 렌즈 용지를 "벗겨"하여 조각이 기록실에 잠긴 채로 나섭됩니다. 하프를 사용하여 슬라이스를 고정합니다.
참고: 하프스는 U자형 스테인리스 스틸 또는 플래티넘 및 고급 나일론 필라멘트를 사용하여 실험실에서 미리 구입하거나 제작할 수 있습니다. - NaCl 채워진 자극 파이펫을 수동 미세 조작기에 넣고 파이펫 끝을 슬라이스 표면(예: 층 라디툼 층)의 각도로 천천히 전진시약 30-45°의 각도로 진행합니다. 파이펫 끝이 조직에 들어가면 파이펫을 천천히 앞으로 나아가고 슬라이스 내의 축삭을 불필요하게 손상시킬 수 있는 측면 또는 수직 방향의 큰 움직임을 삼가하십시오. 파이펫 의 끝을 적어도 50-100 μm 깊이슬라이스에 배치하여 슬라이스 중에 손상된 표면 근처의 세포를 피하십시오.
- ACSF가 채워진 LFP 파이펫을 전동 마이크로 조작기에 부착된 파이펫 홀더에 넣습니다. 입 압력 또는 스톱콕 밸브를 통해 연결된 1mL 주사기를 사용하여 매우 가벼운 양압과 파이펫 홀더에 짧은 튜브를 적용합니다.
참고: 관심 있는 신호를 기록하기 위해 슬라이스 내의 LFP 파이펫 위치: 날카로운 파문의 경우, 하나의 LFP 파이펫은 지층 피라미드(SP)와 지층 라디툼(SR)의 두 번째 파이펫에 배치되어야 합니다. 이 구성을 통해 SR 및 SP(도3)에서음수 선동과 고주파 리플 진동의 동시 레코딩을 가능하게 한다. - 마이크로 조작기는 LFP 파이펫의 끝을 약 30-45°의 각도로 관심 영역(예: CA1 피라미드 세포 층)으로 천천히 전진시다. 파이펫 의 끝을 적어도 50-100 μm 깊이슬라이스에 배치하여 슬라이스 중에 손상된 표면 근처의 세포를 피하십시오. LFP 파이펫을 진행하는 동안, 지속적으로 획득 소프트웨어를 사용하여 작은 전압 테스트 펄스를 제공하고 전극 저항의 급격한 증가를 감시한다. 이것은 파이펫이 막히거나 셀에 대해 눌린 것을 나타낼 수 있습니다.
- LFP 파이펫이 관심 지역에 배치되면 파이펫 홀더에 부착된 튜브의 밸브를 열어 양압을 조심스럽게 방출합니다.
- 두 번째 위치에서 LFP를 동시에 기록하려면 두 번째 파이펫 및 마이크로 조작기로 6.8-6.10 단계를 반복합니다.
- 현재 클램프 구성의 마이크로 전하 증폭기를 사용하여 획득 소프트웨어에서 브리지 밸런스 기능을 사용한 후 로컬 필드 잠재력에서 자발적인 활성을 기록하여 파이펫의 계열 저항을 보정합니다. 자발적인 SW는 SP 층의 세포외 전위(도3)에서양성 편향으로 나타납니다.
- 불러일으킨 필드 잠재력을 기록하려면 디지털화기에 연결된 자극기를 사용하여 NaCl 채워진 자극 파이펫을 통해 짧은(200us) 제곱 전압 펄스를 제공합니다. 자극 전압 다이얼을 조정하여 다양한 반응 진폭을 연상시킵니다.
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Representative Results
여기에 이 프로토콜에 설명된 대로 준비된 HEC 슬라이스의 대표 녹음이 있습니다. 인터페이스 유지 챔버(도1C)에서회수한 후, 슬라이스는 침수된 기록 챔버(도2B)로개별적으로 전달된다. 레코딩 챔버는 연동펌프(도 2A)를사용하여 카보겐 포화 ACSF로 공급된다. 펌프는 먼저 ACSF를 홀딩 비커에서 가열된 저수지로 끌어들입니다. 카보겐 라인은 미디어의 지속적인 산소화를 제공하기 위해 보유 비커와 가열 된 저수지 모두에 배치됩니다. 일련의 공기 채워진 주사기로 구성된 맥동 댐퍼는 연동 펌프와 레코딩 챔버 사이에 위치하여 급속한 연동에 의해 생성되는 유속의 변동을 최소화합니다. 각 주사기의 에어 포켓은 펌프의 각 사이클에 의한 압력의 변화를 흡수하여 레코딩 챔버가 ACSF52,53의부드럽고 일관된 흐름을 수신하도록 합니다. 맥동 댐퍼 후 위치한 인라인 히터는 ACSF의 온도가 레코딩 챔버에 들어갈 때 32°C로 유지되도록 합니다.
이 예에서, 이중 표면 슈퍼퓨전 기록 챔버는 3개의 3D 인쇄층(도 2B)으로구성된다. 하단 층에는 진공 그리스로 고정된 커버슬립에 맞는 직사각형 컷아웃이 있습니다. 중간 레이어에는 길쭉한 타원형 챔버의 아래쪽 절반이 포함되어 있으며 두 개의 수평 지지대가 있습니다. 나일론 필라멘트는 이러한 지지대(대략 0.5mm마다)에 매달려 있으며 시아노아크라일레이트 접착제로 고정됩니다. 슬라이스는이 매달려 필라멘트의 상단에 휴식됩니다. 상단 층에는 타원형 챔버의 상반부에는 실버 염화물 접지 펠릿을 배치 할 수있는 작은 우물이 포함되어 있습니다. 챔버의 길쭉한 타원형 모양은 ACSF의 빠른 라미나르 흐름을 촉진하도록 설계되었습니다.
그림 3은 이 프로토콜에 따라 준비된 HEC 슬라이스의 대표 기록을 제시합니다. 처음에 슬라이스 상태를 평가하기 위해 NaCl의 1M로 채워진 파이펫을 사용하여 지층 라디툼(SR)에서 필드 포스트냅스 전위(fPSPs)가 생명합니다. 건강한 슬라이스에서, 전기 자극은 작은 사전 시냅스 섬유 발리와 빠른 초기 하강(그림 3B, 왼쪽 위)와큰 포스트 냅틱 잠재력을 가진 fPSP를 생성해야합니다. 건강한 슬라이스에서, 자발적인 날카로운 파도 잔물결(SW)은 지층 피라미드(그림 3B, 왼쪽 아래)에서LFP에서 긍정적인 편향으로 볼 수 있다. fPSPs를 불러낸 최적 슬라이스에서 큰 섬유 발리와 상대적으로 작은 포스트냅스 전위를 나타내며, 이러한 슬라이스는 자발적인 SW(그림3B, 오른쪽)를나타내지 않는다. 시험관 내의 SW는 게시된 설명과 일치하는 특성을 나타내습니다: SR 층(그림3C)의음수 필드 전위와 짝을 이루는 오버레이 고주파 진동을 가진 SP 층의 양양성 필드 전위.. CA2에 기록된 단일 SWR은 별표(그림3C, 오른쪽)로표시됩니다. HEC 슬라이스의 SW는 CA2/CA3 재발 회로 내에서 시작하여 CA1로 전파됩니다. CA2 및 CA1 SP 계층에서 관찰된 단일 SWR은별표(그림3D, 오른쪽)로표시됩니다. 이 대표적인 예에서 CA2 SWR(녹색)은 각 리전에서 기록된 SWR 봉투(2-30Hz에서 필터링)의 오버레이에 도시된 바와 같이 CA1(파란색)에서 몇 밀리초 씩 리드한다.
그림 1: 수평 각진 해마-내측 피질(HEC) 슬라이스의 준비. (A) (i)뇌를 추출한 후 면도날로 두 개의 관상 절단을 수행하여 뇌의 후방 및 전방 부분을 제거합니다. (ii)한천 램프는 마이크로토메 슬라이싱 플랫폼에 접착된 두 개의 각진 부분으로 형성된다. 중간 해마의 조각을 준비하려면 전방 표면이 경사면을 향하고 경사로의 높은 백부분과 접촉하여 천 경사로에 뇌 블록을 놓습니다. 더 많은 복부 해마의 조각을 준비하려면, 후방 절단 표면이 경사로의 높은 백업 부분과 접촉할 수 있도록 전방 표면이 경사면을 향한 천 경사로에 뇌 블록을 배치합니다. (iii)각 슬라이스가 풀려나면, 메스로 몇 가지 컷을 더 수행하여 반구를 분리하고 불필요한 조직을 제거한다. (B)DAPI에 의해 표지된 세포 핵을 가진 결과 슬라이스의 대표적인 이미지. (C)인터페이스 복구 챔버에서, 슬라이스는 ACSF의 표면과 수평, 스테인레스 스틸 또는 나일론 메쉬 의 상단에 렌즈 종이의 조각에 배치됩니다. 세라믹 버블러는 카보겐을 챔버로 전달하고 마그네틱 스터드 바는 챔버의 유체를 지속적으로 혼합합니다. ACSF의 박막은 슬라이스의 상단 표면을 덮어 챔버의 습한 환원이 풍부한 공기에서 산소의 확산을 향상시킵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: ACSF 전달 튜브에서 맥동 댐퍼가 있는 이중 표면 슈퍼퓨전 기록 챔버. (A)과류 시스템의 다이어그램. ACSF는 32°C로 따뜻하게 되어 카보겐 가스로 지속적으로 버블링되며, 공기가 채워진 일련의 주사기로 구성된 맥동 댐퍼가 있는 연동 펌프를 사용하여 약 8-10mL/min으로 전달됩니다. (B)녹음 챔버는 3개의 3D 인쇄 층으로 구성되어 있으며, 그 중 하나는 나일론 필라멘트로 매달려 있습니다. 슬라이스는 이 매달린 필라멘트 위에 놓여 있고 ACSF는 조직 위와 아래에 흐릅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: HEC 슬라이스의 자발적인 날카로운 파도 잔물결의 대표적인 기록. (A)레코딩 및 자극 전극의 위치를 보여주는 HEC 슬라이스의 단순화된 다이어그램. (B)활성, 건강한 슬라이스 및 최적이 아닌 슬라이스 모두에서 LFP 활동의 대표 기록. 건강한 슬라이스(왼쪽, 녹색)는 SP 층의 로컬 필드 잠재력에서 불규칙하게 발생하는 긍정적인 편향으로 보이는 큰 발생 필드 응답및 자발적인 날카로운 파문(SW)을 보여줍니다. 반면, 건강에 해로운 슬라이스는 작은 불러필드 응답과 자발적인 활동(오른쪽, 회색)을 보여줍니다. (C)SR 층내의 LFP내의 음수 편향및 SP 층의 LFP내의 기본 양성 편향을 통한 고주파 진동으로 구성된 CA2 영역에서 SWRs의 대표적인 레코딩. 신호 진폭의 세 가지 표준 편차를 초과하는 각 채널의 피크가 빨간색으로 강조 표시됩니다. 2-30Hz의 밴드패스 필터는 각각 SP 및 SR 층에서 날카로운 파의 기본 양수 및 음수 봉투를 분리하고, 80~250Hz의 밴드패스 필터는 SP 층의 잔물결의 고주파 진동을 격리하는 데 사용된다. (D) 시험관내 SW가 CA2/CA3에서 CA1로 전파됩니다. 이러한 대표적인 레코딩에서 CA2(녹색, 아래쪽)의 SWRs는 CA1(파란색, 위쪽)에서 몇 밀리초 앞을 내다보겠습니다. 신호 진폭의 세 가지 표준 편차를 초과하는 각 채널의 피크가 빨간색으로 강조 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 분자량(그램/몰) | 최종 농도(mM) | 그램 / 1 L 자당 절단 용액 | ||
| 자당 | C12H22O11 | 342.3 | 195 | 66.749 |
| 염화나트륨 | Nacl | 58.44 | 10 | 0.584 |
| 포도 당 | C6H12O6 | 180.08 | 10 | 1.801 |
| 중탄산나트륨 | 나에코3 | 84.01 | 25 | 2.1 |
| 염화칼륨 | KCl | 74.55 | 2.5 | 0.186 |
| 나트륨 인산염 단수 성분 | NaH2PO4 | 137.99 | 1.25 | 0.173 |
| 피루바테 나트륨 | C3H3NaO3 | 110.04 | 2 | 0.22 |
| 재고 농도 (M) | 최종 농도(mM) | 밀리리터/1L 자당 절단 용액 | ||
| 염화칼슘 | CaCl2 | 1 | 0.5 | 0.5 |
| 염화 마그네슘 | MgCl2 | 1 | 7 | 7 |
표 1: 자당 절단 용액의 구성. 약 0.75 L의 정제된 물로 시작하여 미량 금속 및 기타 불순물을 제거합니다. 용액을 마그네틱 스터드 바와 혼합하면서 각 고체를 녹입니다. 모든 고형체가 용해되면 용액을 통해 기포 카보겐 가스가 10분 동안 용액을 통과합니다. MgCl2 및 CaCl2 솔루션을 추가하고 물을 추가하여 총 부피를 1L. 믹스에 10분 동안 마그네틱 스터드 바에 추가하여 용액이 균일하게 혼합되도록 합니다. 삼투석은 315~325m 사이여야 하며, pH는 약 7.4여야 한다.
| 분자량(그램/몰) | 최종 농도(mM) | 그램 / 2L ACSF | ||
| 염화나트륨 | Nacl | 58.44 | 125 | 14.61 |
| 포도 당 | C6H12O6 | 180.08 | 12.5 | 4.502 |
| 중탄산나트륨 | 나에코3 | 84.01 | 25 | 4.201 |
| 염화칼륨 | KCl | 74.55 | 3.5 | 0.522 |
| 나트륨 인산염 단수 성분 | NaH2PO4 | 137.99 | 1.25 | 0.345 |
| 아스코르브 산 | C6H8O6 | 176.12 | 1 | 0.352 |
| 피루바테 나트륨 | C3H3NaO3 | 110.04 | 3 | 0.66 |
| 재고 농도 (M) | 최종 농도(mM) | 밀리리터 / 2L ACSF | ||
| 염화칼슘 | CaCl2 | 1 | 1.6 | 3.2 |
| 염화 마그네슘 | MgCl2 | 1 | 1.2 | 2.4 |
표 2: 인공 뇌척수액의 구성. 미량 금속 및 기타 불순물을 제거하기 위해 여과된 약 1.5 L의 정제된 물로 시작합니다. 용액을 마그네틱 스터드 바와 혼합하면서 각 고체를 녹입니다. 모든 고형체가 용해되면 용액을 통해 기포 카보겐 가스가 10분 동안 용액을 통과합니다. MgCl2 및 CaCl2 솔루션을 추가하고 물을 추가하여 총 부피를 10분 동안 마그네틱 스터드 바와 함께 2L. 믹스에 추가하여 용액이 균일하게 혼합되도록 합니다. 삼투석은 315~325m 사이여야 하며, pH는 약 7.4여야 한다.
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Discussion
조직 건강을 촉진하고 자발적인 자연주의 네트워크 활동의 출현을 선호하도록 설계된이 슬라이싱 프로토콜에는 몇 가지 단계가 있습니다 : 마우스는 차가운 자당 절단 용액으로 전사적으로 퍼집니다. 수평 내측 피질 (HEC) 슬라이스는 중간 또는 복부 해마에서 450 μm의 두께로 절단됩니다. 슬라이스는 따뜻한 ACSF와 가습, 환생이 풍부한 공기의 인터페이스에서 복구; 기록 중 슬라이스는 ACSF를 32°C로 따뜻하게 하고 침수된 레코딩 챔버에서 이중 표면 슈퍼퓨전으로 빠른 유량으로 전달됩니다.
슬라이스 건강은 시험관 내 네트워크 진동의 생성에가장 중요합니다. 젊은 동물은 더 건강한 조각을 산출하고, 일반적으로 청소년 또는 사춘기 마우스와 함께 경각관류 단계를 건너 뛸 수 있습니다. 동물이 나이가 들어감에 따라 건강한 조각을 만드는 것이 점점 더 어려워지지만, 일부 조사(예: 질병 모델 또는 경도 연구)는 성인 또는 노화 동물의 사용을 필요로 합니다. Dengler 등은 예를 들어 필로카르핀 처리 만성 간질 성인마우스(50)로부터HEC 슬라이스를 제조하는 데 경외 심혈을 사용했다. 성인 마우스를 사용하면 조직을 냉각시키고 뇌에서 혈액을 맑게하며 두개골51에서뇌를 제거하기 전에 대사 활동을 줄이는 차가운 자당 절단 용액으로 경내 관류를 수행하는 것이 유익합니다. 그러나, 경외 관류는 제대로 수행될 수 있도록 훈련을 필요로 하고 절차가 동물 복지에 위험을 초래하지 않는 방식으로 신속하고 수행되도록주의를 기울여야한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 가능하면, 실험은 경동맥 관류의 사용을 배제하기 위해 젊은 동물을 사용하도록 설계되어야한다. 최적이 아닌 슬라이스 준비에서는 지속적인 네트워크 진동을 지원하기에 충분한 건강한 세포, 특히 인터뉴런이 없을 것입니다. 실험 중 슬라이스 상태를 평가하기 위해 먼저 호출된 필드 전위(예: 자극 파이펫 및 지층 라디툼,SR의 기록 파이펫)를 기록하는 것이 유용합니다. 건강한 슬라이스에서, SR 층의 자극은 상대적으로 작은 전시냅스 섬유 배구(그림3)를가진 큰 필드 포스트냅스 전위(fPSP)를 연상시킵니다.
이 프로토콜에 의해 생성된 슬라이스는 각진 수평 해마-내톨리날 피질(HEC) 슬라이스입니다. 중요한 것은, 파라하모막 조직의 포함이나 각진 절단은 해마 조각이 SW와 같은 네트워크 활동을 자발적으로 생성하는 데 필요하지 않습니다. 실제로, 많은 연구는생리적 25,40,41,44 또는 병리학 네트워크 진동33,38의양상을 심문하기 위해 수평 또는 횡해마 조각을이용했다. 이 프로토콜에서 천경사로에 뇌를 배치하면 실험자가 복부 또는 중간 해마(도1)로부터더 많은 조각을 선택적으로 생성할 수 있으며, 이는해마(26)및31의세로축을 따라 존재하는 기능성 이질성을 고려하는 실험 적 목표에 도움이 될 수 있다. 슬라이스의 해부학적 기원이 요인이 아닌 경우, 한천 경사로를 배제할 수 있으며 진정한 수평 절단 평면은 중간에서 복부까지의 해마의 조각을 산출합니다. 각 수평 조직 슬라이스가 풀려나면, 슬라이스의 대부분의 외부 부분은 세 개의 간단한 절단으로 제거될 수 있으며, 해마와 파라하마 영역을 포함한 일부 주변 조직을 포함하는 대략 직사각형 슬라이스를 남깁니다(그림1). 추가 해부는 모든 외마 조직을 제거하기 위해 수행 될 수 있지만, 주변 조직의 포함은 도움이된다, 슬라이스 하프쉽게 배치 할 수 있다는 점에서 나일론 필라멘트가 적절한 해마를 가로 질러 휴식하지 않도록. 위에서 설명한 바와 같이, 결합된 HEC 슬라이스는 또한 생리학적37 또는병리학적 16,35,36,38네트워크 진동의 맥락에서 더 큰 코르티코모하마항 망을 조사하는 유용한 제제이다.
이 프로토콜의 핵심 요소는 회복 단계 와 기록 중에 조직에 산소 공급을 최적화하는 것입니다. 네트워크 진동에 대한 많은 연구는 마이크로토메에서 인터페이스 기록 챔버로 직접 전송되고 신선한 ACSF의 지속적인 관류로 복구 할 수있는 슬라이스에서 수행됩니다. 몇 시간 동안 복구한 후 동일한 인터페이스 챔버에서 레코딩을 수행할 수 있습니다. 따라서, 슬라이스는 ACSF 및 습한 환원이 풍부한 공기의 인터페이스에서 실험의 전체 기간 동안 유지된다. 이 프로토콜에 제시된 대체 방법론에서, 슬라이스는 개별 조각이 충분히 빠른 ACSF 유량으로 침수된 스타일의 기록 챔버로 전송되기 전에 적어도 2 시간 동안 인터페이스 스타일의 유지 챔버에서 복구됩니다. 이러한 조건하에서 제조된 슬라이스는 안정적인 감마진동(12) 또는 자발적인 SWR활동(43)을나타낼 수 있다. 인터페이스 스타일의 홀딩 챔버에서 슬라이스 복구는 중요한 단계입니다 : Maier 등. ACSF에 완전히 잠긴 비커에서 회복 되는 슬라이스는 작은 불러 필드 잠재력을 나타내고, 덜 빈번한 자발적인 포스트 냅틱 전류를 나타내며, 자발적인 네트워크활동(43)만거의 생성하지 않는 것을 입증하였다. 유사하게, Hájos 등. 빠른 ACSF 유량은 자발적 억제 포스트 냅틱 전류의 더 높은 주파수귀착된다는 것을 입증, 향상 된 신경 간 활성을 제안(49). 기록 기간 동안, 이중 표면 초융합은 엄격하게 필요하지 않습니다, 기록 챔버는 빠른 유량 (적어도 6mL / 분)에 전달 ACSF의 상대적으로 작은 볼륨을 보유하는 경우43. 이프로토콜(도 2B)에제시된 3D 프린팅 레코딩 챔버는 비교적 비용 효율적이고 간단한 옵션이지만, 소량의 볼륨을 보유하거나, 미디어의 라미나르 흐름을 촉진하거나, 이중 표면 슈퍼퓨전을 제공하도록 설계된 상업적으로 이용 가능한 침수 된 기록 챔버도 있습니다(예를 들어, ACSF의 과도한 사수 량을 허용하는 원형 기록 챔버와 는 대조적).
이 프로토콜은 기존의 인터페이스 기록 챔버의 요구 없이 네트워크 진동을 기록할 수 있지만 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 슬라이스는 복구 기간 동안 ACSF-air 인터페이스에서 유지되지만 기존의 Haas 스타일의 인터페이스 녹음 챔버에서 발생하는 것처럼 신선한 미디어의 지속적인 관류를 받지 못합니다. 슬라이스는 복구 챔버에서 침수 된 기록 챔버로 개별적으로 전송해야합니다 (미세 집게를 사용하여). 또한 빠른 유량은 특히 ACSF가 연동 펌프로 전달되는 경우 일부 레코딩에 불안정하고 모션 아티팩트가 문제가 발생할 수 있습니다. 빠른 유량을 유지하고 기계적 장애를 최소화하기 위해 간단한 맥동 댐퍼를 관류 시스템에 통합할 수있습니다(그림 2). 이 맥동 댐퍼는 윈드케셀효과(52)를사용하여 작동하며, 빈 주사기에는 탄성 저수지 역할을 하는 에어 포켓이 들어 있어 연동펌프(53)의롤러에 의해 발생하는 변동 압력을 흡수한다. 그러나, 펄스 댐퍼의 편입은 ACSF를 기록 챔버에 전달하고 슬라이스에 산소 공급에 영향을 미치는 튜브에 길이를 추가할 수 있다. 유량은 안정적인 네트워크 진동을 산출하는 데 필요한 만큼빠야 하며, 연동 펌프를 사용하는 경우 이상적으로 많은 수의 롤러(> 12)를 사용하는 펌프가 되어야 연동에 의한 맥동을 최소화하고, 펄스 댐퍼의 사용을 배제하고, ACSF를 가능한 한 짧은 실내챔버에 전달하는 튜빙을 보장해야 한다. 빠른 유량으로 수행된 기록은 또한 대량의 ACSF가 필요하며, 실험이 미디어에 귀중하거나 값비싼 약물 또는 화합물을 첨가해야 하는 경우 문제가 될 수 있습니다. 이중 표면 슈퍼퓨전 챔버는 슬라이스의 양쪽에 산소를 공급하기 위해 두 개의 유체 입구가 있는 특별히 구성된 녹음 챔버가 필요하지만, 적당한 ACSF유량(48)으로자발적인 네트워크 진동을 관찰할 수 있다. 이 프로토콜은 빠른 유량(맥동 댐퍼로 안정화)과 이중 표면 슈퍼퓨전 챔버를 모두 활용하여 자발적인 활성을 관찰할 가능성을 향상시킵니다.
마지막으로 이 프로토콜은 동물당 생성된 슬라이스 수와 관련하여 수율이 낮습니다. 450 μm의 두께로 수평 슬라이스는 선호하는 방향으로 소수의 HEC 슬라이스를 생성합니다(슬라이스가 해마의 횡축과 효과적으로 평행합니다). 이러한 슬라이스 중, 일반적으로 해마당 하나 또는 두 개만 자발적인 SWR 활성을 나타내며, 다른 곳에서 보고된 것보다 적은43. 두꺼운 슬라이스는 아마도 재발 연결의 더 큰 정도를 포함하지만, 약간 얇은 슬라이스 (400 μm)를 절단SWR 활성과 횡 방향 슬라이스의 마우스 당 더 많은 수를 얻을 수 있습니다. 또한, 여러 조각이 자발적인 SWR 활성을 안정적으로 나타낼 가능성은 복부 해마의 진정한 수평 또는 하향 각진 슬라이스를 활용하는 실험에서 더 높을 수 있다. 현재 프로토콜은 중간 해마의 상향 각진 수평 슬라이스의 사용을 통합하며, 이는 복부해마(25,26,31)의슬라이스와 비교하여 자발적인 네트워크 활성을 나타낼 가능성이 적다. 마지막으로,이 프로토콜은 청소년과 성인 마우스에서 조각을 사용했다. 경외 관류는 오래된 동물의 슬라이스 품질을 향상시킬 수 있지만, 젊은 동물의 슬라이스를 사용하여 자발적인 네트워크 활동을 관찰 할 가능성이 향상 될 수있다12,41,44.
요약하자면, 이 프로토콜은 급격한 파파 리플 복합체의 형태로 복잡한 자발적인 네트워크 활동을 나타낼 수 있는 중간 또는 복부 해마 형성에서 각진 수평 해마-내톨리날 피질 조각을 산출하는 마우스 두뇌 슬라이스 접근법을 제시한다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 스티브 시겔바움의 지원에 감사드립니다. 자금 조달은 5R01NS106983-02뿐만 아니라 1 F31 NS113466-01에 의해 제공됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Lulzbot | LulzBot TAZ 6 | |
| Acute brain slice incubation holder | NIH 3D Print Exchange | 3DPX-001623 | Designed by ChiaMing Lee, available at https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623 |
| Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma Aldrich | A9187-500MG | |
| Ag-Cl ground pellets | Warner | 64-1309, (E205) | |
| agar | Becton, Dickinson | 214530-500g | |
| ascorbic acid | Alfa Aesar | 36237 | |
| beaker (250 mL) | Kimax | 14000-250 | |
| beaker (400 mL) | Kimax | 14000-400 | |
| biocytin | Sigma Aldrich | B4261 | |
| blender | Oster | BRLY07-B00-NP0 | |
| Bonn scissors, small | becton, Dickinson | 14184-09 | |
| borosilicate glass capillaries with filament (O.D. 1.5 mm, I.D. 0.86 mm, length 10 cm) | Sutter Instruments | BF150-86-10HP | Fire polished capillaries are preferable. |
| calcium chloride solution (1 M) | G-Biosciences | R040 | |
| camera | Olympus | OLY-150 | |
| compressed carbogen gas (95% oxygen / 5% carbon dioxide) | Airgas | X02OX95C2003102 | |
| compressed oxygen | Airgas | OX 200 | |
| constant voltage isolated stimulator | Digitimer Ltd. | DS2A-Mk.II | |
| coverslips (22x50 mm) | VWR | 16004-314 | |
| cyanoacrylate adhesive | Krazy Glue | KG925 | Ideally use the brush-on form for precision |
| data acquisition software | Axograph | N/A | Any equivalent software (e.g. pClamp) would work. |
| Dell Precision T1500 Tower Workstation Desktop | Dell | N/A | Catalog number will depend on specific computer - any computer will work as long as it can run electrophysiology acquisition software. |
| Digidata 1440A | Molecular Devices | 1-2950-0367 | |
| digital timer | VWR | 62344-641 | 4-channel Traceable timer |
| disposable absorbant pads | VWR | 56616-018 | |
| dissector scissors | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| double-edge razor blades | Personna | BP9020 | |
| dual automatic temperature controller | Warner Instrument Corporation | TC-344B | |
| dual-surface or laminar-flow optimized recording chamber | N/A | N/A | The chamber presented in this protocol is custom made. A commercial equivalent would be the RC-27L from Warner Instruments. |
| equipment rack | Automate Scientific | FR-EQ70" | A rack is not strictly necessary but useful for organizing electrophysiology |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethyiether)- N,N,N',N'-teetraacetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | 324626-25GM | |
| filter paper | Whatman | 1004 070 | |
| fine scale | Mettler Toledo | XS204DR | |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| glass petri dish (100 x 15 mm) | Corning | 3160-101 | |
| glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G8877-250MG | |
| ice buckets | Sigma Aldrich | BAM168072002-1EA | |
| isoflurane vaporizer | General Anesthetic Services | Tec 3 | |
| lab tape | Fisher Scientific | 15-901-10R | |
| lens paper | Fisher Scientific | 11-996 | |
| light source | Olympus | TH4-100 | |
| magnesium chloride solution (1 M) | Quality Biological | 351-033-721EA | |
| magnetic stir bars | Fisher Scientific | 14-513-56 | Catalog number will be dependent on the size of the stir bar. |
| micromanipulator | Luigs & Neumann | SM-5 | |
| micromanipulator (manual) | Scientifica | LBM-2000-00 | |
| microscope | Olympus | BX51WI | |
| microspatula | Fine Science Tools | 10089-11 | |
| monitor | Dell | 2007FPb | |
| MultiClamp 700B Microelectrode Amplifier | Molecular Devices | MULTICLAMP 700B | The MultiClamp 700B should include headstages, pipette holders, and a model cell. |
| N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), (HEPES) | Sigma Aldrich | H3375-25G | |
| needle (20 gauge, 1.5 in length) | Becton, Dickinson | 305176 | |
| nylon filament | YLI Wonder Invisible Thread | 212-15-004 | size 0.004. This cat. # is from Amazon.com |
| nylon mesh | Warner Instruments Corporation | 64-0198 | |
| perstaltic pump | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
| Phosphocreatine di(tris) salt | Sigma Aldrich | P1937-1G | |
| pipette holders | Molecular Devices | 1-HL-U | |
| platinum wire | World Precision | PT0203 | |
| polylactic acid (PLA) filament | Ultimaker | RAL 9010 | |
| potassium chloride | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| potassium gluconate | Sigma Aldrich | 1550001-200MG | |
| potassium hydroxide | Sigma Aldrich | 60377-1KG | |
| razor blades | VWR | 55411-050 | |
| roller clamp | World Precision Instruments | 14041 | |
| scale | Mettler Toledo | PM2000 | |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| slice harp | Warner | SHD-26GH/2 | |
| sodium bicarbonate | Fisher Chemical | S233-500 | |
| sodium chloride | Sigma Aldrich | S9888-1KG | |
| sodium phosphate monobasic anhydrous | Fisher Chemical | S369-500 | |
| sodium pyruvate | Fisher Chemical | BP356-100 | |
| spatula | VWR | 82027-520 | |
| spatula/spoon, large | VWR | 470149-442 | |
| sterile scalpel blades | Feather | 72044-10 | |
| stirrer / hot plate | Corning | 6795-220 | |
| stopcock valves, 1-way | World Precision Instruments | 14054 | |
| stopcock valves, 3-way | World Precision Instruments | 14036 | |
| sucrose | Acros Organics | AC177142500 | |
| support for swivel clamps | Fisher Scientific | 14-679Q | |
| surgical scissors, sharp/blunt | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| syringe (1 mL) | Becton, Dickinson | 309659 | |
| syringe (60 mL with Luer-Lok tip) | Becton, Dickinson | 309653 | |
| three-pronged clamp | Fisher Scientific | 05-769-8Q | |
| tissue forceps, large | Fine Science Tools | 11021-15 | |
| tissue forceps, small | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| tubing | Tygon | E-3603 | ID 1/16 inch, OD 3/16 inch |
| tubing | Tygon | R-3603 | ID 1/8 inch, OD 1/4 inch |
| vacuum grease | Dow Corning | 14-635-5D | |
| vibrating blade microtome | Leica | VT 1200S | |
| vibration-dampening table with faraday cage | Micro-G / TMC-ametek | 2536-516-4-30PE | |
| volumetric flask (1 L) | Kimax | KIM-28014-1000 | |
| volumetric flask (2 L) | PYREX | 65640-2000 | |
| warm water bath | VWR | 1209 |
References
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