Summary
Detta protokoll beskriver beredningen av horisontella hippocampal-entorhinal cortex (HEC) skivor från möss uppvisar spontana skarpa våg krusning verksamhet. Skivor inkuberas i en förenklad gränssnittskammare och inspelningar utförs under nedsänkta förhållanden med snabbt strömmande konstgjord cerebrospinalvätska för att främja vävnad syresättning och spontana uppkomsten av nätverksaktivitet.
Abstract
Akut gnagarhjärnslicing erbjuder ett dragbart experimentellt tillvägagångssätt för att få insikt i organisationen och funktionen hos neurala kretsar med encellsupplösning med hjälp av elektrofysiologi, mikroskopi och farmakologi. En viktig faktor i utformningen av in vitro-experiment är dock i vilken utsträckning olika segmentpreparat rekapitulerar naturalistiska mönster av neural aktivitet som observerats in vivo. I den intakta hjärnan genererar hippocampal-nätverket mycket synkroniserad populationsaktivitet som återspeglar djurets beteendetillstånd, vilket exemplifieras av de skarpa våg kruskomplexen (SWR) som uppstår under vakna fullbordanstillstånd eller icke-REM-sömn. Stållinor och andra former av nätverksaktivitet kan dyka upp spontant i isolerade hippocampalskivor under lämpliga förhållanden. För att tillämpa den kraftfulla verktygslådan för hjärnskivor på undersökningen av hippocampal nätverksaktivitet är det nödvändigt att använda ett tillvägagångssätt som optimerar vävnadshälsan och bevarandet av funktionell anslutning inom hippocampal-nätverket. Möss är transcardially perfused med kall sackaros-baserade konstgjorda cerebrospinal vätska. Horisontella skivor som innehåller hippocampus skärs med en tjocklek av 450 μm för att bevara synaptisk anslutning. Segment återställs i en kammare i gränssnittsstil och överförs till en nedsänkt kammare för inspelningar. Inspelningskammaren är utformad för dubbel ytsmfusion av konstgjord cerebrospinalvätska med hög flödeshastighet för att förbättra syresättningen av skivan. Detta protokoll ger frisk vävnad som är lämplig för undersökning av komplexa och spontana nätverksaktivitet in vitro.
Introduction
Elektrofysiologisk mätning från levande hippocampala skivor in vitro är ett kraftfullt experimentellt tillvägagångssätt med många fördelar. Experimenteraren kan använda ett mikroskop, mikromanipulatorer och ett inspelningssystem för att direkt visualisera och samla mätningar från enskilda nervceller i vävnaden. Vävnadsskivor är också mycket tillgängliga för fotostimulering eller läkemedelsleverans för optogenetiska, chemogenetiska eller farmakologiska experiment.
Hippocampal nätverket genererar mycket synkron befolkning aktivitet in vivo, synlig som svängningar i det extracellulära lokala fältet potential1,2,3,4,5. Brain slice metoder har utnyttjats för att få insikt i cellulära och krets mekanismer som ligger till grund för dessa neuronala nätverk svängningar. Grundläggande arbete från Maier et al. visade att skarpa våg-ripple komplex (SWRs) kan dyka upp spontant i skivor av ventral hippocampus6,7. Efterföljande studier från flera utredare har gradvis klarlagt många aspekter av SWR, inklusive neuromodulatorernas roll i att reglera nätverkstillståndet för hippocampus8,9,10 och de synaptiska mekanismerna som driver in vitro-återaktivering av neuronala ensembler som tidigare var aktiva under beteende in vivo11. Hjärnsegmentexperiment har också gett insikt i gammaområdets svängning (30–100 Hz), ett distinkt hippocampalt nätverkstillstånd som tros stödja minneskodning ochåterkalla 12,13. Slutligen, erkänner hippocampus centrala roll och associerade strukturer i patofysiologin för temporal lob epilepsi14,15, forskare har använt hippocampal slice preparat för att undersöka generering och spridning av epileptiform aktivitet. Carter et al. visat att kombinerade hippocampal-entorhinal cortex skivor beredda från kroniskt epileptiska djur kan spontant generera epileptiform utsläpp in vitro16. Därefter undersökte Karlócai et al. mekanismerna bakom epileptiforma utsläpp i hippocampal skivor med hjälp av modifierad konstgjord cerebrospinalvätska (ACSF) med ändrade jonkoncentrationer (minskad Mg2 + eller förhöjd K+) eller tillsatta läkemedel (4AP eller gabazin)17.
Utredare har utvecklat många hippocampal slice metoder som skiljer sig åt på viktiga sätt: (1) regionen hippocampus som finns i skivan (dorsala, mellanliggande eller ventrala); (2) Förekomst eller frånvaro av extrahippocampala vävnader såsom entorhinal cortex. (3) Den orientering som används för att skära skivor (koronal, sagittal, horisontell eller sned); och (4) de förhållanden under vilka vävnaden bibehålls efter skivning (helt nedsänkt i ACSF eller hålls i gränslandet mellan ACSF och fuktad, karbinrik luft).
Valet av vilken skivningsstrategi som ska användas bör bestämmas av försöksmålet. Till exempel har tvärgående eller koronala skivor av dorsala hippocampus som upprätthålls under nedsänkta förhållanden använts mycket effektivt för undersökning av intrahippocampalkretsar och synaptisk plasticitet18,19,20. Sådana preparat genererar dock inte spontant nätverksoscillationer lika lätt som skivor från ventral hippocampus21,22,23. Även om ett tillstånd av ihållande SWR-aktivitet kan induceras av ttanisk stimulering i tvärgående skivor från dorsala och ventrala hippocampus24, observeras spontana SWR lättare i ventralaskivor 7,25.
En inneboende fysiologisk och anatomisk skillnad mellan dorsala och ventrala hippocampus stöds av studier som utförs både in vivo och in vitro26. Inspelningar hos råttor visade starkt sammanhängande theta rytmer i hela dorsala och mellanliggande hippocampus, men dålig sammanhållning mellan ventral regionen och resten av hippocampus27. STÅL in vivo förökar sig lätt mellan dorsala och mellanliggande hippocampus, medan SWR som har sitt ursprung i ventral hippocampus ofta förblir lokala28. De associationsprojektioner som härrör från CA3 pyramidala nervceller som bor i dorsala och mellanliggande hippocampus projektet långa avstånd längs hippocampus längs längsgående axeln. CA3-prognoser från ventrala regioner är fortfarande relativt lokala och är därför mindre benägna att skäras av under skivningsprocessen29,30. Ventrala skivor kan därför bättre bevara det återkommande nätverk som krävs för att generera befolkningssynkronisering. Benägenheten hos ventrala skivor att generera spontana nätverksaktiviteter in vitro kan också återspegla högre inneboende excitabilitet av pyramidala nervceller eller svagare GABAergic hämning i ventrala hippocampus jämfört med mer dorsala regioner31. Faktum är att ventrala hippocampal skivor är mer mottagliga för epileptiform aktivitet32,33. Således har många studier av spontanafysiologiska 8,9,11,24 eller patologiska16,34,35,36 nätverkssvängningar traditionellt använt en horisontell skivning, ibland med en liten vinkel i fronto-occipital riktningen, vilket ger vävnadsskivor parallellt med ventrala hippocampus tvärplan.
Nätverksanslutningen påverkas oundvikligen av skivningsproceduren eftersom många celler i segmentet kommer att skäras av. Vinkeln och tjockleken på skivan och vävnaden som behålls i preparatet bör övervägas för att optimera anslutningen i kretsarna av intresse. Många studier har använt horisontella kombinerade hippocampal-entorhinal cortex skivor (HEC) för att utforska interaktioner mellan de två strukturerna i samband med fysiologiska eller patologiska nätverk svängningar. Roth et al. utförde dubbla inspelningar från CA1-delfältet i hippocampus och lager V av den mediala entorhinala cortex för att demonstrera spridning av SWR-aktivitet genom HEC-skivan37. Många studier av epileptiform aktivitet har använt HEC skiva förberedelse för att undersöka hur epileptiform utsläpp sprider sig genom corticohippocampal nätverk16,35,36,38. Det är viktigt att notera att bevarandet av den intakta corticohippocampal slingan inte är en förutsättning för spontana SWRs, epileptiform urladdningar eller gamma svängningar. nätverkssvängningar kan genereras i tvärgående skivor av dorsala eller ventrala hippocampus utan bifogade parahippocampalvävnader 21,22,23, 25,39,40,41. En viktigare faktor för den spontana generationen av nätverkssvängningar i hippocampal skivor kan vara tjockleken på varje skiva, eftersom en tjockare skiva (400-550 μm) kommer att bevara mer anslutning i CA2 / CA3 återkommande nätverk21,22,25.
Även om vinklade horisontella HEC-skivor (skurna med en cirka 12° vinkel i fronto-occipital riktning) har använts för att studera den funktionella anslutningen av corticohippocampalslingan 11,16,34,35,42, krävs sådana vinklade preparat inte för spontannätverksaktivitet 43,44,45. Användningen av ett vinklat skivplan gör det dock möjligt för prövaren att selektivt göra skivor som bäst bevarar de tvärgående orienterade lamellerna i antingen ventrala eller mellanliggande hippocampus, beroende på om en nedåt- eller uppåtriktad vinkel appliceras (figur 1). Detta tillvägagångssätt är konceptuellt likt det som används av Papatheodoropoulos et al., 2002, som dissekerade varje hippocampusfri och sedan använde en vävnadshacker för att skapa tvärgående skivor längs hela dorsala-ventrala axeln21. Mot bakgrund av de ovannämnda funktionella skillnaderna mellan ventrala och dorsala-mellanliggande hippocampus, bör utredare överväga anatomiska ursprunget för skivor när man utformar experiment eller tolkar resultat. Att använda en agarramp under skivningsproceduren är ett enkelt sätt att företrädesvis producera skivor från antingen mellanliggande eller ventral hippocampus.
Hippocampalskivor kan bibehållas i antingen en nedsänkt kammare (med vävnaden helt nedsänkt i ACSF) eller en kammare i gränssnittsstil (t.ex. Oslo eller Haas kammare, med skivor som endast täcks av en tunn film av flödande media). Gränssnittsunderhåll förbättrar syresättningen av vävnaden, vilket främjar neuronal överlevnad och möjliggör ihållande höga nivåer av interneuronal aktivitet. Traditionellt använder nedsänkta inspelningsförhållanden ett långsammare ACSF-flöde som inte ger tillräcklig vävnadssyresättning för stabilt uttryck av svängningar på nätverksnivå. I nedsänkta hippocampal skivor observeras carbachol-inducerad gamma oscillations endastövergående 46,47, medan de kan hållas stabilt i gränssnitt inspelningskammare10,48,49. Som sådan har många studier av komplex spontan aktivitet in vitro förlitat sig på gränssnitt inspelningskammare för att undersöka skarpa våg krusning komplex6,7,8,9,10,25,37, gamma svängningar10,13, och epileptiform aktivitet16,38,45,47.
I en inspelningskammare i nedsänkt stil kan ett nedsänkningsmikroskopmål användas för att visualisera enskilda celler och selektivt rikta in sig på friska celler för inspelningar. Den nedsänkta beredningen möjliggör också fin kontroll över cellmiljön, eftersom nedsänkning underlättar snabb diffusion av droger eller andra föreningar till vävnaden. Således utgör en modifierad metod där stabila nätverkssvängningar upprätthålls under nedsänkta förhållanden ett kraftfullt experimentellt tillvägagångssätt. Detta tillvägagångssätt exemplifieras av arbetet i Hájos et al., där hippocampal skivor återhämtar sig i en förenklad gränssnittsliknande hållkammare i flera timmar innan de överförs till en modifierad nedsänkt inspelningskammare med ett högt flöde av ACSF (~ 6 ml / min) för att förbättra syretillförselntill vävnaden 12,48,49. Under dessa förhållanden kan höga nivåer av interneuron aktivitet och stabila spontana nätverk svängningar upprätthållas i en nedsänkt inspelningskammare. Detta modifierade tillvägagångssätt gör det möjligt för utredarna att utföra visuellt guidade hela cell patch clamp inspelningar och karakterisera bidraget från morfologiskt identifierade celltyper till carbachol-inducerad gamma svängningar12. SWR kan också uppstå spontant i nedsänkta hippocampal skivor med en snabb flödeshastighet av ACSF11,48,49. Maier et al. visade att hippocampala skivor som återhämtade sig i en gränssnittskammare innan de överfördes till en nedsänkt inspelningskammare på ett tillförlitligt sätt uppvisade spontana SWR, medan skivor som återhämtade sig nedsänkta i en bägare före överföring till en nedsänkt inspelningskammare visade mindre framkallade fältsvar, lägre nivåer av spontana synaptiska strömmar och endast mycket sällan uppvisade spontana SWRs43. Schlingloff et al. använde denna förbättrade metodik för att demonstrera rollen av parvalbumin-uttrycka korgceller i genereringen av spontana SWRs44.
Följande protokoll presenterar en skivningsmetod genom vilken spontant aktiva nervceller i horisontella hippocampal skivor kan återvinnas under gränssnittsförhållanden och därefter upprätthållas i en nedsänkt inspelningskammare lämplig för farmakologiska eller optogenetiska manipuleringar och visuellt guidade inspelningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee vid Columbia University (AC-AAAU9451).
1. Förbered lösningar
- Bered sackarosskärningslösning för skivning enligt tabell 1.
OBS: Efter att ha förberett 1 L sackaroslösning, frys in en liten mängd (ca 100–200 ml) i en isbricka. Dessa frusna sackarosisbitar blandas i ett isigt slam (se steg 4.3). - Förbered konstgjord cerebrospinalvätska (ACSF) för registrering enligt beskrivningen i tabell 2.
- Förbered 1 M NaCl för stimuleringspipetter genom att lösa upp 0,05844 g NaCl i 1 ml renat vatten som har filtrerats för att avlägsna spårmetaller och andra föroreningar.
OBS: Sackaros skärlösning och ACSF bör beredas fräscht för varje experiment.
2. Förbered agarramp
- Förbered 4% agar (t.ex. 2 g agar i 50 ml vatten) genom att lösa upp agarpulver i renat vatten som har filtrerats för att avlägsna spårmetaller och andra föroreningar. Värm blandningen i en mikrovågsugn tills den bara börjar koka (ca 30-60 s). Häll den smälta agaren i en form och låt den svalna och stelna vid 4 °C i ett kylskåp med en cirka 12° lutning.
OBS: För en form kan man använda alla glas- eller plastbehållare som är inställda i en vinkel, med tillräckligt med smält agar hälld i för att bilda en ramp på 4 cm lång och cirka 0,8 cm i höjd.
3. Iscensätta skivningsområdet
- Fyll en 400 ml bägare som innehåller en skäråtervinningskammare med cirka 250 ml ACSF; placera den i ett vattenbad värms upp till 32 °C och börja bubbla med karbonogen (95% syregas/5% koldioxidgas).
OBS: Fyll återhämtningsbeakern med precis tillräckligt med vätska för att placera nylonnätet på hållkammarens yta på lösningens yta, så att skivorna hålls i gränssnittet mellan den varma lösningsblandningen och luften (figur 1). Placera små bitar linspapper på nylonnätet. Skivorna ligger ovanpå linspapperet, som senare kan användas för att överföra skivor individuellt till inspelningskammaren (se steg 6.6). - Placera en kolv med sackaroslösningen i en ishink för att kyla och börja bubbla med karbagen.
OBS: Återhämtningsbeaker- och sackaroslösningen ska värmas respektive kylas med karbagen som bubblar i minst 30 minuter innan musen placeras i isoflurankammaren. - Dra ut brickan med färdiga, frysta sackaroslösningsisbitar från frysen och placera på bänken för att delvis tina.
- Placera hälften av ett rent dubbelkantat rakblad i mikrotomen och kalibrera vid behov. Ställ åt sidan den andra halvan av rakbladet för användning under dissekeringen.
- Kör en karbagenlinje och temperatursond in i skivkammaren och omge med is för att kyla kammaren.
- Förbered en ren bänk eller ett bord täckt med två engångsabsorberande kuddar. Lägg ut alla dissektionsverktyg och tre labbband på vänster platta, där transkardiell perfusion kommer att utföras.
OBS: Dissektionsverktyg inkluderar liten Bonn-sax, dissekerarsax, stor spatel/sked, mikrospatula, skalpell med nytt blad, spatel, vass/trubbig kirurgisk sax, stora vävnadstångar och små vävnadstångar (se Materialförteckning). - Placera på den andra absorberande dynan till höger om perfusionsområdet ett cirkulärt filterpapper i locket på en petriskål med diametern 100 mm. Placera botten av Petri-skålen bredvid locket och placera en karbagenlinje i båda bitarna av skålen.
- Använd ett rakblad eller skalpell för att skära en liten ramp av agar (ca 4 cm längs den vinklade ytan, 0,8 cm i höjd, 2 cm bred). Skär av en bit av rampen från den höga änden och vänd den för att skapa ett stödblock av agar. Använd cyanoakrylatlim för att fästa agarrampen och stödblocket på skivningsplattformen och ställ åt sidan.
OBS: Agars underlag hjälper till att stabilisera hjärnan under skivning och ger en yta där onödiga vävnader kan dissekeras från varje skiva (figur 1).
4. Transkardiell perfusion
- Häng upp en spruta med 60 ml kapacitet som reservoar för sackarosskärningslösning cirka 18 tum ovanför bänkskivan (t.ex. med hjälp av en tredelad svängbar klämma på en vertikal stolpe). Fäst slangen i botten av behållaren, kör slangen genom en rullklämma och anslut den andra änden av röret till en ren 20 G-nål.
- Fyll 60 ml-behållaren med cirka 30 ml kyld sackaroslösning och rikta en karbonlinje i sackarosbehållaren för att kontinuerligt bubbla perfusatet.
OBS: Se till att sackarosen flödar genom slangen och nålen utan några instängda bubblor. Flödeshastigheten bör vara tillräckligt snabb för att ha en stadig, kontinuerlig ström av droppande sackaros från nålen. - Använd en mixer, krossa och blanda den frusna sackarosen i ett isigt slam och använd den stora spateln/skeden för att fördela slammet.
- Placera en liten mängd sackarosslam runt kanterna på petriskållocket i glas. Tillsätt en liten mängd sackarosslam till petriskålens botten.
- Tillsätt ungefär 20-30 ml sackarosslam till perfusionsvätskans reservoar och blanda det väl med 30 ml kylda flytande sackaros tills behållaren innehåller en blandning av mycket kall, övervägande flytande sackaros med viss restfryst lösning.
- Placera musen i en kammare ansluten till en isofluranförångare. Med syre som flödar vid cirka 2 L/min vrider du förångarens urtavla för att leverera isofluran vid 5% koncentration och starta en timer.
OBS: Håll denna timer igång under hela skivningen för att mäta hur snabbt skivorna erhålls. Förfarandet bör göras så snabbt som möjligt, så att skivningen är klar och vävnaden återhämtar sig i gränssnittskammaren inom 15-20 minuter från djuret som kommer in i isoflurankammaren. Titta på musen för att säkerställa att ett tillstånd av djupbedövning uppnås. Efter minst 5 minuter ska musen vara djupt sövd och svarar inte på tånypor. - Fyll omedelbart innan du tar bort musen från isoflurankammaren petriskållocket med kyld sackaroslösning till ett djup av ca 3–5 mm och fyll petriskålens botten med kyld sackaroslösning till ett djup av cirka 1,0 cm.
- Överför snabbt musen till den vänstra absorberande dynan och använd de 3 tejpbitarna för att säkra frambenen och svansen. Utför en bakbensnypa för att säkerställa att musen inte svarar innan något snitt utförs. Använd de stora vävnadstångarna och kirurgiska saxarna, tälta huden och gör ett på längden snitt från bröstbenets botten till toppen av bröstet. Använd tången dra upp på bröstbenet och använd saxen för att skära igenom membranet.
OBS: Musens ursprungliga positionering och de första flera snitten för att bryta membranet bör utföras så snabbt som möjligt för att säkerställa att musen inte återfår medvetandet. För att säkerställa ett tillräckligt djup av anestesi under hela proceduren kan en noskon placeras på musen för att leverera isofluran under perfusionen. - Använd saxen för att skära genom bröstkorgen på varje sida och skär i en stor rörelse mot den punkt där frambenet möter kroppen. Med tången, sväng framsidan av bröstkorgen bort och upp mot huvudet och ta sedan bort den helt med ett horisontellt snitt med den stora saxen. Håll hjärtat på plats med hjälp av de stora tångarna och sätt in 20 G perfusionsnålen i vänster ventrikel. När nålen är rätt placerad ska hjärtats vänstra sida snabbt blekna när kyld sackaroslösning fyller ventrikeln.
- Använd den lilla dissekatorsaxen för att skära i rätt atrium och låta blodet flöda ut ur cirkulationssystemet. Om snitten utförs korrekt bör det finnas minimala skador på hjärtat, och det bör fortsätta pumpa under hela perfusionen.
OBS: Upprullade bitar av mjukpapper kan användas för att transportera bort blod och sackaroslösning från hjärtat och upprätthålla perfusionsnålens synlighet under proceduren. - Se till att perfusionsnålen förblir på plats och inte faller ut ur den vänstra ventrikeln. Med rätt flöde och placering börjar levern blekna till en ljus solbränna / beige färg med 20-30 s.
- Efter 30–45 s, använd den stora saxen för att halshugga musen. Håll huvudet i vänster hand, tryck eller skala bort huden från skallen. I ett välperfuserat djur ska skallen vara mycket blek, och hjärnan ska se ut som en mycket ljusrosa färg (närmar sig vit) genom skallen utan tydligt synliga blodkärl.
5. Extrahera hjärnan och skär skivor
- Använd den lilla Bonn-saxen och gör två sidoskärningar genom skallen mot mittlinjen på framsidan av skallen, nära ögonen. Gör ytterligare två skärsår på vardera sidan av skallens botten.
- Överför huvudet till botten av glas petriskålen där den mestadels ska nedsänkas i kyld sackaroslösning. Använd den lilla Bonn-saxen för att skära ner mittlinjen längs skallens längd och dra upp med saxen för att minimera skador på den underliggande hjärnvävnaden. Med hjälp av de små vävnadstångarna, fatta tag i varje sida av skallen och sväng den upp och bort från hjärnan, som att öppna en bok.
- Använd fingrarna på vänster hand för att hålla skallklaffarna öppna och för in mikrospatulan under hjärnan nära luktlökarna. Vänd hjärnan ur skallen i sackarosen och använd mikrospatulan för att skära av hjärnstammen. Tvätta hjärnan för att ta bort eventuellt kvarvarande blod, päls eller andra vävnader.
- Använd den stora spateln/skeden för att överföra hjärnan till locket på glas petriskålen. Med den andra halvan av det dubbelkantade rakbladet tidigare åt sidan, gör två koronalsnitt för att först ta bort lillhjärnan och sedan den mest främre delen av hjärnan, inklusive luktlökarna (Figur 1).
- Applicera cyanoakrylatlim på agarrampen. Placera hjärnan mycket kort på ett torrt filterpapper med hjälp av de stora vävnadstångarna och överför det sedan omedelbart till agarrampen och placera hjärnans ventrala yta på limet.
OBS: För skivor av den mellanliggande hippocampusen bör hjärnan vara orienterad med den främre vända upp rampens sluttning och den bakre närmare bladet. För skivor av ventral hippocampus, orientera hjärnan med den främre änden pekade ner rampens sluttning, med den bakre änden högst upp på rampen, längre bort från bladet. I båda fallen ska hjärnan placeras högst upp på rampen, så att hjärnans koronat skurna yta kommer i kontakt med agarstödblocket (Figur 1). - Placera skivningsplattformen med agar och hjärna i skivningskammaren på mikrotomen och fördjupa helt med kyld sackaroslösning. Använd den stora spateln/skeden för att överföra lite sackarosslam till kammaren, rör om för att smälta eventuella frusna sackaros och snabbt sänka temperaturen på blandningen till ~ 1-2 °C.
OBS: Titta på temperaturmätaren under hela skivningen. Om sackaroslösningen värms upp över 3 °C, tillsätt mer uppslamning och blanda för att få ner temperaturen igen. - Skär skivor med en tjocklek av 450 μm med mikrotomhastigheten inställd på 0,07 mm/s. När varje skiva frigörs, använd de små vävnadstången och en skarp skalpell för att först separera de två halvkloten och sedan skära bort vävnad tills skivan huvudsakligen består av hippocampus- och parahippocampalregionerna (Figur 1).
- Använd en plastöverföringspipett för att överföra skivorna individuellt till gränssnittsåtervinningskammaren, så att de placeras vid ACSF:s och luftens gränssnitt med endast en tunn menisk av ACSF som täcker skivorna. Stäng kammarens lock ordentligt och låt skivorna återhämta sig vid 32 °C i 30 minuter.
- Efter den första återhämtningen vid 32 °C, ta ut gränssnittsåtervinningskammaren ur vattenbadet och placera på en omrörare inställd på en långsam hastighet så att den magnetiska omrörningsstången främjar cirkulationen av ACSF i kammaren. Låt det gradvis svalna till rumstemperatur när skivorna återhämtar sig i ytterligare 90 minuter. Se till att återhämtningskammaren ständigt bubblar med karbagen och låt inte stora bubblor fastna under skivorna.
6. Utföra lokala fältpotentialinspelningar av spontan aktivitet
- Förbered dig för LFP-inspelningar genom att slå på all nödvändig utrustning, inklusive datorn som kör förvärvsprogramvaran, bildskärmen som är ansluten till datorn, stimulatorerna, mikromanipulatorn, temperaturregulatorn, mikroskopljuskällan, den mikroskopanslutna kameran, mikroelektrodförstärkaren, digitizern och den peristaltiska pumpen. Om du använder ett centralt vakuumsystem, öppna väggventilen för att förbereda vakuumledningen som tar bort ACSF från inspelningskammaren.
- Fyll den uppvärmda behållaren med ACSF och placera sedan ena änden av slangen i den 400 ml bägare som innehåller den bubblande ACSF. Slå på peristaltic pumpen för att rikta ACSF från 400 ml bägare till den uppvärmda behållaren och från behållaren och framåt till inspelningskammaren. Knacka eller nyp ihop slangen för att frigöra eventuella instängda bubblor.
- Justera den peristaltiska pumpen för att säkerställa att ACSF-flödet genom inspelningskammaren är snabbt (~ 8–10 ml/min). Använd en temperatursond för att säkerställa att ACSF är 32 °C i mitten av inspelningskammaren.
OBS: Om ACSF levereras till inspelningskammaren med hjälp av en peristaltisk pump kan ett högt flöde resultera i en betydande flödesfluktuation. Konsekventa flödeshastigheter kan uppnås med hjälp av ett enkelt pulseringsdämpare bestående av en serie tomma sprutor integrerade i slangen (figur 2). - Förbered stimulering och inspelning av pipetter från borosilikatglaskapillärer med hjälp av en uppvärmd filamentdragare. Pullerprotokollet bör konfigureras för att ge pipetter med ett motstånd på 2–3 MOhm för stimulering eller lokala fältpotentialregistreringselektroder.
- Fyll stimuleringspipetter med 1 M NaCl- och LFP-pipetter med ACSF.
- Spänn kort slangen och stäng av pumpen för att pausa flödet av ACSF. Överför en skiva till inspelningskammaren med fina tångar för att greppa ett hörn av linspapperet som skivan vilar på- skivan kommer att fastna på linspapperet. Placera linspapperet och skär i inspelningskammaren med skivan vänd nedåt och "skala" bort linspapperet och lämna skivan nedsänkt i inspelningskammaren. Säkra skivan med en harpa.
OBS: Harpa kan köpas förgjorda eller tillverkade i labbet med en U-formad bit rostfritt stål eller platina och fin nylonglödtråd. - Placera en NaCl-fylld stimuleringspipett i den manuella mikromanipulatorn och för långsamt pipettspetsen in i skivans yta (t.ex. i stratum radiatumskiktet) i en vinkel på cirka 30–45°. När pipettspetsen kommer in i vävnaden, för pipetten långsamt framåt och avstå från stora rörelser i sidled eller vertikal riktning som i onödan kan skada axoner i skivan. Placera pipettspetsen minst 50–100 μm djupt in i skivan för att undvika celler nära ytan som skadades under skivningen.
- Placera en ACSF-fylld LFP-pipett i pipetthållaren som är fäst vid den motoriserade mikromanipulatorn. Applicera ett mycket lätt positivt tryck med antingen muntryck eller en 1 ml spruta ansluten via en kranventil och en kort rörlängd på pipetthållaren.
OBS: Placera LFP-pipetter i skivan för att registrera signaler av intresse: vid skarpa våg krusningar ska en LFP-pipett placeras i stratumpyramidale (SP) och en andra pipett i stratum radiatum (SR). Denna konfiguration möjliggör samtidiga inspelningar av den negativa skarpa vågen i SR och den högfrekventa krusningsoscillationen i SP (figur 3). - Genom att använda mikromanipulatorn för du långsamt fram spetsen på LFP-pipetten till intresseområdet (t.ex. CA1-pyramidcellsskiktet) i en vinkel på cirka 30–45°. Placera pipettspetsen minst 50–100 μm djupt in i skivan för att undvika celler nära ytan som skadades under skivningen. Samtidigt som du flyttar fram LFP-pipetten, leverera kontinuerligt en liten spänningstestpuls med hjälp av förvärvsprogramvaran och se upp för en plötslig ökning av elektrodmotståndet. Detta kan tyda på att pipetten har täppts till eller tryckts upp mot en cell.
- När LFP-pipetten är placerad i intresseområdet släpper du försiktigt det positiva trycket genom att öppna ventilen på slangen som är fäst vid pipetthållaren.
- Upprepa steg 6,8–6,10 med en andra pipett och mikromanipulator för att spela in LFP på en andra plats samtidigt.
- Använd mikroelektrodförstärkaren i den aktuella klämkonfigurationen för att registrera spontan aktivitet i den lokala fältpotentialen efter att ha använt brobalansfunktionen i förvärvsprogramvaran för att korrigera för pipettens seriemotstånd. Spontana stållinor visas som positiva avböjningar i SP-skiktens extracellulära potential (figur 3).
- För att registrera framkallade fältpotentialer, använd stimulatorerna som är anslutna till digitizern för att leverera en kort (200 us) kvadratisk spänningspuls genom den NaCl-fyllda stimuleringspipetten. Justera stimuleringsspänningsratten för att framkalla en rad svarsamlituder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Presenteras här är representativa inspelningar från HEC-segment som utarbetats enligt beskrivningen i detta protokoll. Efter återvinning i en gränssnittskammare(figur 1C)överförs skivorna individuellt till en nedsänkt inspelningskammare(figur 2B). Inspelningskammaren levereras med karbagenmättad ACSF med hjälp av en peristaltisk pump (figur 2A). Pumpen drar först ACSF från en håll bägare i en uppvärmd reservoar. Carbogen linjer placeras i både håll bägaren och den uppvärmda behållaren för att ge kontinuerlig syresättning av media. Ett pulseringsdämpare, bestående av en serie luftfyllda sprutor, placeras mellan den peristaltiska pumpen och inspelningskammaren för att minimera fluktuationerna i flödeshastigheten som produceras genom snabb peristals. Luftfickan i varje spruta absorberar de tryckförändringar som orsakas av varje pumpcykel, så att inspelningskammaren får ett jämnt och konsekvent flöde av ACSF52,53. En inline-värmare placerad efter pulseringsdämparen säkerställer att ACSF:s temperatur hålls vid 32 °C när den kommer in i inspelningskammaren.
I det här exemplet består inspelningskammaren med dubbla ytor av tre 3D-utskrivna lager (figur 2B). Bottenskiktet har en rektangulär utskärning för att passa en täcklip, säkrad med vakuumfett. Mellanskiktet innehåller den nedre halvan av en långsträckt oval kammare, med två horisontella stöd. Nylonfilament hänger över dessa stöd (ungefär var 0,5 mm) och säkras med cyanoakrylatlim. Skivan vilar ovanpå denna upphängda glödtråd. Det övre lagret innehåller den övre halvan av den ovala kammaren tillsammans med små brunnar i vilka silverklorid marken pellets kan placeras. Kammarens långsträckta ovala form är utformad för att främja snabbt laminärt flöde av ACSF.
Figur 3 presenterar representativa inspelningar från HEC-skivor som utarbetats enligt detta protokoll. För att initialt bedöma segment hälsa, fält postsynaptic potentialer (fPSPs) framkallas i stratum radiatum (SR) med hjälp av en pipett fylld med 1 M av NaCl. I friska skivor bör elektrisk stimulering producera en fPSP med en liten presynaptisk fibervolley och en stor postsynaptisk potential med en snabb initial nedstigning (Figur 3B, övre vänstra). I friska skivor syns spontana krusningar med skarp våg (SWR) som positiva avböjningar i LFP i stratumpyramidaleen (figur 3B, nedre vänstra). I suboptimala skivor framkallade fPSPs visar en stor fiber volley och en relativt liten postsynaptic potential, och sådana skivor visar inte spontana SWRs (Figur 3B, höger). Stållinor in vitro visar egenskaper som överensstämmer med publicerade beskrivningar: en positiv fältpotential i SP-skiktet med en överlagrad högfrekvent svängning, parat med en negativ fältpotential i SR-skiktet (figur 3C). Ett enda stållinor som registrerats i CA2 anges med en asterisk (figur 3C, höger). SWR i HEC-segment har sitt ursprung i CA2/CA3 återkommande kretsar och sprids till CA1. Ett enda stållinor som observerats i CA2- och CA1 SP-skiktet anges med en asterisk (figur 3D, höger). I det här representativa exemplet leder CA2 SWR (grön) att i CA1 (blå) med flera millisekunder, som visas i överlägget för SWR-kuvertet (filtrerat vid 2–30 Hz) som registrerats i varje region.
Figur 1: Beredning av horisontella vinklade hippocampal-entorhinal cortex (HEC) skivor. a )I artikel 3.1 skall (i) Efter att ha extraherat hjärnan, utför två koronarsnitt med ett rakblad för att ta bort de bakre och främre delarna av hjärnan. ii)Agarrampen består av två vinklade portioner limmade på mikrotom skivningsplattformen. För att förbereda skivor av den mellanliggande hippocampusen, placera hjärnblocket på agarrampen med den främre ytan vänd uppåt i sluttningen och ta kontakt med rampens höga bakgrundsdel. För att förbereda skivor av mer ventral hippocampus, placera hjärnblocket på agarrampen med den främre ytan vänd nedåt i sluttningen, så att den bakre klippta ytan kommer i kontakt med rampens höga bakgrundsdel. iii)När varje skiva frigörs, utför flera fler snitt med skalpellen för att separera halvkloten och ta bort onödig vävnad. (B) Representativ bild av det resulterande segmentet med cellkärnor märkta med DAPI. c)I en gränssnittsåtervinningskammare placeras skivor på bitar av linspapper ovanpå ett rostfritt stål eller nylonnät, i nivå med ACSF:s yta. En keramisk bubblare transporterar karbagen in i kammaren och en magnetisk omrörningsstång blandar kontinuerligt vätskan i kammaren. En tunn film av ACSF täcker skivans övre yta, vilket förbättrar diffusionen av syre från den fuktiga karbinrika luften i kammaren. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Inspelningskammare med dubbla ytspjäll med pulseringsdämpare i ACSF-leveransslangen. A)Diagram över superfusionssystemet. ACSF värms upp till 32 °C, bubblar ständigt med karbagengas och levereras vid cirka 8–10 ml/min med hjälp av en peristaltisk pump med pulseringsdämpare bestående av en serie luftfyllda sprutor. (B) Inspelningskammaren består av tre 3D-printade skikt, vars mitt hänger med nylonglödtråd. Skivan vilar på denna upphängda glödtråd och ACSF flyter över och under vävnaden. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Representativa inspelningar av spontana krusningar med skarp våg från HEC-skivor. a)Ett förenklat diagram över HEC-skivan som visar ställningar för inspelnings- och stimuleringselektroder. B)Representativa inspelningar av LFP-aktivitet från både en aktiv, hälsosam sektor och en suboptimal sektor. Den friska segmentet (vänster, i grönt) visar stora framkallade fältsvar och spontana krusningar med skarp våg (SWR), synliga som oregelbundet förekommande positiva avböjningar i SP-skiktens lokala fältpotential. Däremot visar en ohälsosam sektor små framkallade fältsvar och ingen spontan aktivitet (höger, i grått). C)Representativa registreringar av stållinor i CA2-regionen, bestående av en negativ avböjning i LFP i SR-skiktet och en högfrekvent svängning med en underliggande positiv avböjning i LFP i SP-skiktet. Toppar i varje kanal som är större än tre standardavvikelser för signalampituden markeras i rött. Ett bandpassfilter på 2–30 Hz isolerar det underliggande positiva och negativa kuvertet för den skarpa vågen i SP- respektive SR-skiktet, medan ett bandpassfilter på 80–250 Hz används för att isolera den högfrekventa svängningen av krusningen i SP-skiktet. D) SWR-in vitro-förökning från CA2/CA3 till CA1. I dessa representativa inspelningar föregår SWR i CA2 (grön, nederkant) att i CA1 (blå, överst) med flera millisekunder. Toppar i varje kanal som är större än tre standardavvikelser för signalampituden markeras i rött. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| molekylvikt (gram / mol) | slutlig koncentration (mM) | gram / 1 L sackaros skärlösning | ||
| Sackaros | C12H22O11 | 342.3 | 195 | 66.749 |
| Natriumklorid | Nacl | 58.44 | 10 | 0.584 |
| Glukos | C6H12O6 | 180.08 | 10 | 1.801 |
| Natriumbikarbonat | NaHCO3 (på NaHCO) | 84.01 | 25 | 2.1 |
| kaliumklorid | KCl (kcl) | 74.55 | 2.5 | 0.186 |
| natriumfosfat monobasiskt vattenfritt | NaH2PO4 | 137.99 | 1.25 | 0.173 |
| natrium pyruvat | C3H3NaO3 | 110.04 | 2 | 0.22 |
| Lagerkoncentration (M) | slutlig koncentration (mM) | milliliter / 1L sackaros skärlösning | ||
| kalciumklorid | CaCl2 | 1 | 0.5 | 0.5 |
| magnesiumklorid | MgCl2 | 1 | 7 | 7 |
Tabell 1: Sammansättning av sackarosskärningslösning. Börja med cirka 0,75 L renat vatten som har filtrerats för att avlägsna spårmetaller och andra föroreningar. Lös upp varje fast ämne samtidigt som lösningen blandas med en magnetisk omrörningsstång. När alla fasta ämnen är upplösta, bubbla karbagengas genom lösningen i 10 min. Tillsätt lösningarna MgCl2 och CaCl2 och tillsätt vatten för att få den totala volymen till 1 L. Blanda med en magnetisk omrörningsstång i 10 minuter för att säkerställa att lösningen blandas jämnt. Osmolariteten bör vara mellan 315 och 325 mOsm, och pH bör vara cirka 7,4.
| molekylvikt (gram / mol) | slutlig koncentration (mM) | gram / 2L ACSF | ||
| Natriumklorid | Nacl | 58.44 | 125 | 14.61 |
| Glukos | C6H12O6 | 180.08 | 12.5 | 4.502 |
| Natriumbikarbonat | NaHCO3 (på NaHCO) | 84.01 | 25 | 4.201 |
| kaliumklorid | KCl (kcl) | 74.55 | 3.5 | 0.522 |
| natriumfosfat monobasiskt vattenfritt | NaH2PO4 | 137.99 | 1.25 | 0.345 |
| Askorbinsyra | C6H8O6 | 176.12 | 1 | 0.352 |
| natrium pyruvat | C3H3NaO3 | 110.04 | 3 | 0.66 |
| Lagerkoncentration (M) | slutlig koncentration (mM) | milliliter / 2L ACSF | ||
| kalciumklorid | CaCl2 | 1 | 1.6 | 3.2 |
| magnesiumklorid | MgCl2 | 1 | 1.2 | 2.4 |
Tabell 2: Sammansättning av konstgjord cerebrospinalvätska. Börja med cirka 1,5 L renat vatten som har filtrerats för att avlägsna spårmetaller och andra föroreningar. Lös upp varje fast ämne samtidigt som lösningen blandas med en magnetisk omrörningsstång. När alla fasta ämnen är upplösta, bubbla karbagengas genom lösningen i 10 min. Tillsätt lösningarna MgCl2 och CaCl2 och tillsätt vatten för att få den totala volymen till 2 L. Blanda med en magnetisk omrörningsstång i 10 minuter för att säkerställa att lösningen blandas jämnt. Osmolariteten bör vara mellan 315 och 325 mOsm, och pH bör vara cirka 7,4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns flera steg i detta skivningsprotokoll som är utformat för att främja vävnadshälsa och gynna uppkomsten av spontan naturalistisk nätverksaktivitet: musen är transcardially perfused med kyld sackaros skärlösning; Horisontella entorhinal cortex (HEC) skivor skärs med en tjocklek av 450 μm från mellanliggande eller ventrala hippocampus; skivor återhämtar sig vid gränssnittet mellan uppvärmd ACSF och fuktad, karbinrik luft; Under inspelningarna överfuseras skivorna med ACSF som värms upp till 32 °C och levereras med ett snabbt flöde med superfusion med dubbla ytor i en nedsänkt inspelningskammare.
Slice hälsa är av största vikt för generering av nätverk svängningar in vitro. Unga djur kommer att ge mer friska skivor, och i allmänhet med juvenila eller unga möss kan det transcardial perfusionssteget hoppas över. När djur åldras blir det allt svårare att göra friska skivor, men vissa undersökningar (såsom sjukdomsmodeller eller longitudinella studier) kräver användning av vuxna eller åldrande djur. Dengler et al., till exempel, använde transcardial perfusioner i sin beredning av HEC skivor från pilocarpine-behandlade kroniskt epileptiska vuxna möss50. Med vuxna möss är det fördelaktigt att utföra en transkardiell perfusion med kyld sackarosskärningslösning för att kyla vävnaden, rensa blod från hjärnan och minska metabolisk aktivitet innan du tar bort hjärnan frånskallen 51. Det är dock viktigt att notera att transkardiella perfusioner kräver att utbildningen utförs korrekt och att man måste se till att förfarandet genomförs snabbt och på ett sätt som inte utgör någon risk för djurens välbefinnande. När så är möjligt bör försök utformas så att unga djur används så att transkardiella perfusioner inte kan användas. I en suboptimal skiva förberedelse, Det kommer inte att finnas tillräckligt med friska celler, särskilt interneurons, för att stödja pågående nätverk svängningar. För att bedöma segmenthälsa under experimentet är det användbart att först registrera framkallade fältpotentialer (till exempel med en stimuleringspipett och en inspelningspipett i stratumradiiatum, SR). I en hälsosam skiva kommer stimulering i SR-skiktet att framkalla en stor fält postsynaptisk potential (fPSP) med en relativt liten presynaptisk fibervolley(figur 3).
Skivorna som produceras av detta protokoll är vinklade horisontella hippocampal-entorhinal cortex (HEC) skivor. Viktigt är att varken införandet av parahippocampal vävnad eller det vinklade snittet är nödvändigt för hippocampal skivor att spontant generera nätverksaktiviteter som SWR. Faktum är att många studier har använt horisontella eller tvärgående hippocampala skivor för att förhöra aspekter avfysiologiska 25,40,41,44 eller patologiska nätverkssvängningar33,38. I detta protokoll gör placeringen av hjärnan på en agarramp det möjligt för experimenteraren att selektivt producera fler skivor från antingen ventral eller mellanliggande hippocampus (figur 1), vilket kan vara fördelaktigt för experimentella mål som tar hänsyn till den funktionella heterogenitet som finns längs hippocampus longitudinella axel26,31. Om skivornas anatomiska ursprung inte är en faktor, kan agarrampen uteslutas och ett riktigt horisontellt skärplan kommer att ge skivor av mellanliggande till ventral hippocampus. Eftersom varje horisontell vävnadsskiva frigörs kan de flesta främmande delar av skivan avlägsnas med tre enkla snitt, vilket lämnar en ungefär rektangulär skiva som innehåller hippocampus och viss omgivande vävnad, inklusive parahippocampal-regionen (Figur 1). Ytterligare dissekering kan utföras för att ta bort alla extrahippocampal vävnader, men införandet av omgivande vävnad är fördelaktigt, genom att skiva harpa lätt kan placeras så att nylonfilamenten inte vilar över hippocampus korrekt. Som diskuterats ovan är den kombinerade HEC-skivan också en användbar förberedelse för att undersöka ett större corticohippocampal nätverk i samband medfysiologiska 37 eller patologiska16,35,36,38 nätverk svängningar.
Nyckelfaktorn i detta protokoll är att optimera syretillförseln till vävnaden, både under återhämtningsfasen och under inspelningarna. Många studier av nätverkssvängningar utförs i skivor som överförs direkt från mikrotomen till en gränssnittsinspelningskammare och får återhämta sig med kontinuerlig perfusion av färsk ACSF. Efter flera timmars återhämtning kan inspelningar sedan utföras i samma gränssnittskammare. Således hålls skivor vid gränssnittet för ACSF och fuktig karbinrik luft under hela experimentets varaktighet. I den alternativa metod som presenteras i detta protokoll återställs skivorna i en gränssnittsliknande kammare i minst två timmar innan enskilda skivor överförs till en inspelningskammare i nedsänkt stil med tillräckligt snabba ACSF-flöden. Skivor som bereds under dessa förhållanden kan uppvisa stabila gammasvängningar12 eller spontan SWR-aktivitet43. Slice recovery i en gränssnittsliknande hållkammare är ett kritiskt steg: Maier et al. visade att skivor som återhämtar sig i en bägare helt nedsänkt i ACSF uppvisar mindre framkallade fältpotentialer, mindre frekventa spontana postsynaptiska strömmar och sällan producerar spontan nätverksaktivitet43. På samma sätt visade Hájos et al. att snabba ACSF-flöden resulterar i en högre frekvens av spontana hämmande postsynaptiska strömmar, vilket tyder på förbättrad interneuronalaktivitet 49. Under registreringsperioden är superfusion med dubbla ytor inte absolut nödvändig, förutsatt att inspelningskammaren rymmer en relativt liten volym ACSF som levereras med en snabb flödeshastighet (minst 6 ml/min)43. Den 3D-tryckta inspelningskammare som presenteras i detta protokoll (figur 2B) är ett relativt kostnadseffektivt och enkelt alternativ, men det finns också kommersiellt tillgängliga nedsänkta inspelningskammare som är utformade för att rymma mindre volymer, främja laminärt flöde av media eller tillhandahålla superfusion med dubbla ytor (i motsats till cirkulära inspelningskammare, till exempel, som tillåter överskott av död volym av ACSF).
Även om detta protokoll tillåter en att spela in nätverkssvängningar utan kravet på en traditionell gränssnittsinspelningskammare, finns det flera begränsningar. Även om skivor hålls i ACSF-luftgränssnittet under återhämtningsperioden, får de inte kontinuerlig perfusion av färska medier som förekommer i traditionella gränssnittsinspelningskammare i Haas-stil. Skivor måste överföras individuellt (med hjälp av fina tångar) från återvinningskammaren till den nedsänkta inspelningskammaren. Dessutom kan snabba flödeshastigheter orsaka instabilitet och rörelseartefakter problematiska för vissa inspelningar, särskilt om ACSF levereras med en peristaltisk pump. För att bibehålla snabba flödeshastigheter och minimera mekaniska störningar kan ett enkelt pulseringsdämpare integreras i perfusionssystemet (figur 2). Detta pulseringsdämpare fungerar med Windkessel-effekten52, där tomma sprutor innehåller luftfickor som fungerar som elastiska reservoarer och absorberar det fluktuerande trycket som genereras av rullarna på den peristaltiska pumpen53. Inkorporering av ett pulsdämpare kan dock ge längd till slangen som levererar ACSF till inspelningskammaren och påverkar syretillförseln till skivan. Flödeshastigheterna bör endast vara så snabba som behövs för att ge stabila nätverkssvängningar, och om en peristaltisk pump används bör den helst vara en pump som använder ett stort antal rullar (> 12) för att minimera den pulsering som orsakas av peristals, förhindra användning av ett pulseringsdämpare och se till att slangarna som levererar ACSF till inspelningskammaren är så kort som möjligt. Inspelningar som utförs med snabba flödeshastigheter kräver också stora volymer ACSF, vilket kan vara problematiskt om experiment kräver tillsats av värdefulla eller dyra droger eller föreningar till media. Även om en superfusionskammare med dubbla ytor kräver en speciellt konstruerad inspelningskammare med två vätskeintag för att leverera syresatt media till båda sidor av skivan, kan spontana nätverkssvängningar observeras med måttligaACSF-flödeshastigheter 48. Detta protokoll använder både ett snabbt flöde (stabiliserat med ett pulseringsdämpare) och en dubbel yta superfusionskammare för att förbättra sannolikheten för observera spontan aktivitet.
Slutligen har detta protokoll ett lågt utbyte när det gäller antalet skivor som produceras per djur. Horisontell skivning med en tjocklek av 450 μm ger ett litet antal HEC-skivor i önskad riktning (där skivan effektivt är parallell med hippocampus tvärgående axel). Av dessa skivor uppvisar vanligtvis endast en eller två per hippocampi spontan SWR-aktivitet, färre än vad som har rapporterats någon annanstans43. Även om tjockare skivor förmodligen innehåller en högre grad av återkommande anslutning, kan skärning av något tunnare skivor (400 μm) ge ett större antal per mus av tvärgående orienterade skivor med SWR-aktivitet. Dessutom kan sannolikheten för att flera skivor på ett tillförlitligt sätt uppvisar spontan SWR-aktivitet vara högre i experiment som använder sanna horisontella eller nedåtvinklad skivor av ventral hippocampus. Det nuvarande protokollet innehåller användningen av uppåt vinklade horisontella skivor av mellanliggande hippocampus, som kan vara mindre benägna att uppvisa spontan nätverksaktivitet i jämförelse med skivor från ventral hippocampus25,26,31. Slutligen använde detta protokoll skivor från ungdomar och vuxna möss. Medan transkardiella perfusioner kan förbättra kvaliteten på skivor från äldre djur, kan sannolikheten för att observera spontana nätverksaktiviteter förbättras genom användning av skivor från yngre djur12,41,44.
Sammanfattningsvis presenterar detta protokoll en mus hjärnan skivning strategi som ger vinklad horisontell hippocampal-entorhinal cortex skivor från mellanliggande eller ventral hippocampal bildas som kan uppvisa komplexa spontana nätverk verksamhet i form av skarpa våg-ripple komplex.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författaren vill tacka Steve Siegelbaum för stödet. Finansieringen tillhandahålls av 5R01NS106983-02 samt 1 F31 NS113466-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Lulzbot | LulzBot TAZ 6 | |
| Acute brain slice incubation holder | NIH 3D Print Exchange | 3DPX-001623 | Designed by ChiaMing Lee, available at https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623 |
| Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma Aldrich | A9187-500MG | |
| Ag-Cl ground pellets | Warner | 64-1309, (E205) | |
| agar | Becton, Dickinson | 214530-500g | |
| ascorbic acid | Alfa Aesar | 36237 | |
| beaker (250 mL) | Kimax | 14000-250 | |
| beaker (400 mL) | Kimax | 14000-400 | |
| biocytin | Sigma Aldrich | B4261 | |
| blender | Oster | BRLY07-B00-NP0 | |
| Bonn scissors, small | becton, Dickinson | 14184-09 | |
| borosilicate glass capillaries with filament (O.D. 1.5 mm, I.D. 0.86 mm, length 10 cm) | Sutter Instruments | BF150-86-10HP | Fire polished capillaries are preferable. |
| calcium chloride solution (1 M) | G-Biosciences | R040 | |
| camera | Olympus | OLY-150 | |
| compressed carbogen gas (95% oxygen / 5% carbon dioxide) | Airgas | X02OX95C2003102 | |
| compressed oxygen | Airgas | OX 200 | |
| constant voltage isolated stimulator | Digitimer Ltd. | DS2A-Mk.II | |
| coverslips (22x50 mm) | VWR | 16004-314 | |
| cyanoacrylate adhesive | Krazy Glue | KG925 | Ideally use the brush-on form for precision |
| data acquisition software | Axograph | N/A | Any equivalent software (e.g. pClamp) would work. |
| Dell Precision T1500 Tower Workstation Desktop | Dell | N/A | Catalog number will depend on specific computer - any computer will work as long as it can run electrophysiology acquisition software. |
| Digidata 1440A | Molecular Devices | 1-2950-0367 | |
| digital timer | VWR | 62344-641 | 4-channel Traceable timer |
| disposable absorbant pads | VWR | 56616-018 | |
| dissector scissors | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| double-edge razor blades | Personna | BP9020 | |
| dual automatic temperature controller | Warner Instrument Corporation | TC-344B | |
| dual-surface or laminar-flow optimized recording chamber | N/A | N/A | The chamber presented in this protocol is custom made. A commercial equivalent would be the RC-27L from Warner Instruments. |
| equipment rack | Automate Scientific | FR-EQ70" | A rack is not strictly necessary but useful for organizing electrophysiology |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethyiether)- N,N,N',N'-teetraacetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | 324626-25GM | |
| filter paper | Whatman | 1004 070 | |
| fine scale | Mettler Toledo | XS204DR | |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| glass petri dish (100 x 15 mm) | Corning | 3160-101 | |
| glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G8877-250MG | |
| ice buckets | Sigma Aldrich | BAM168072002-1EA | |
| isoflurane vaporizer | General Anesthetic Services | Tec 3 | |
| lab tape | Fisher Scientific | 15-901-10R | |
| lens paper | Fisher Scientific | 11-996 | |
| light source | Olympus | TH4-100 | |
| magnesium chloride solution (1 M) | Quality Biological | 351-033-721EA | |
| magnetic stir bars | Fisher Scientific | 14-513-56 | Catalog number will be dependent on the size of the stir bar. |
| micromanipulator | Luigs & Neumann | SM-5 | |
| micromanipulator (manual) | Scientifica | LBM-2000-00 | |
| microscope | Olympus | BX51WI | |
| microspatula | Fine Science Tools | 10089-11 | |
| monitor | Dell | 2007FPb | |
| MultiClamp 700B Microelectrode Amplifier | Molecular Devices | MULTICLAMP 700B | The MultiClamp 700B should include headstages, pipette holders, and a model cell. |
| N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), (HEPES) | Sigma Aldrich | H3375-25G | |
| needle (20 gauge, 1.5 in length) | Becton, Dickinson | 305176 | |
| nylon filament | YLI Wonder Invisible Thread | 212-15-004 | size 0.004. This cat. # is from Amazon.com |
| nylon mesh | Warner Instruments Corporation | 64-0198 | |
| perstaltic pump | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
| Phosphocreatine di(tris) salt | Sigma Aldrich | P1937-1G | |
| pipette holders | Molecular Devices | 1-HL-U | |
| platinum wire | World Precision | PT0203 | |
| polylactic acid (PLA) filament | Ultimaker | RAL 9010 | |
| potassium chloride | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| potassium gluconate | Sigma Aldrich | 1550001-200MG | |
| potassium hydroxide | Sigma Aldrich | 60377-1KG | |
| razor blades | VWR | 55411-050 | |
| roller clamp | World Precision Instruments | 14041 | |
| scale | Mettler Toledo | PM2000 | |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| slice harp | Warner | SHD-26GH/2 | |
| sodium bicarbonate | Fisher Chemical | S233-500 | |
| sodium chloride | Sigma Aldrich | S9888-1KG | |
| sodium phosphate monobasic anhydrous | Fisher Chemical | S369-500 | |
| sodium pyruvate | Fisher Chemical | BP356-100 | |
| spatula | VWR | 82027-520 | |
| spatula/spoon, large | VWR | 470149-442 | |
| sterile scalpel blades | Feather | 72044-10 | |
| stirrer / hot plate | Corning | 6795-220 | |
| stopcock valves, 1-way | World Precision Instruments | 14054 | |
| stopcock valves, 3-way | World Precision Instruments | 14036 | |
| sucrose | Acros Organics | AC177142500 | |
| support for swivel clamps | Fisher Scientific | 14-679Q | |
| surgical scissors, sharp/blunt | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| syringe (1 mL) | Becton, Dickinson | 309659 | |
| syringe (60 mL with Luer-Lok tip) | Becton, Dickinson | 309653 | |
| three-pronged clamp | Fisher Scientific | 05-769-8Q | |
| tissue forceps, large | Fine Science Tools | 11021-15 | |
| tissue forceps, small | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| tubing | Tygon | E-3603 | ID 1/16 inch, OD 3/16 inch |
| tubing | Tygon | R-3603 | ID 1/8 inch, OD 1/4 inch |
| vacuum grease | Dow Corning | 14-635-5D | |
| vibrating blade microtome | Leica | VT 1200S | |
| vibration-dampening table with faraday cage | Micro-G / TMC-ametek | 2536-516-4-30PE | |
| volumetric flask (1 L) | Kimax | KIM-28014-1000 | |
| volumetric flask (2 L) | PYREX | 65640-2000 | |
| warm water bath | VWR | 1209 |
References
- Buzsáki, G., Lai-Wo, S., Vanderwolf, C. H. Cellular bases of hippocampal EEG in the behaving rat. Brain Research Reviews. 6, 139-171 (1983).
- Buzsáki, G. Hippocampal sharp waves: Their origin and significance. Brain Research. 398, 242-253 (1986).
- Buzsáki, G., Horváth, Z., Urioste, R., Hetke, J., Wise, K. High-frequency network oscillation in the hippocampus. Science. 256, 1025-1027 (1992).
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents — EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews Neuroscience. 13, 407-420 (2012).
- Buzsáki, G. Hippocampal sharp wave-ripple: A cognitive biomarker for episodic memory and planning. Hippocampus. 25, 1073 (2015).
- Maier, N., et al. Reduction of high-frequency network oscillations (ripples) and pathological network discharges in hippocampal slices from connexin 36-deficient mice. Journal of Physiology. 541, 521-528 (2002).
- Maier, N., Nimmrich, V., Draguhn, A. Cellular and network mechanisms underlying spontaneous sharp wave-ripple complexes in mouse hippocampal slices. Journal of Physiology. 550, 873-887 (2003).
- ul Haq, R., et al. Adrenergic modulation of sharp wave-ripple activity in rat hippocampal slices. Hippocampus. 22, 516-533 (2012).
- ul Haq, R., et al. Serotonin dependent masking of hippocampal sharp wave ripples. Neuropharmacology. 101, 188-203 (2016).
- Maier, P., Kaiser, M. E., Grinevich, V., Draguhn, A., Both, M. Differential effects of oxytocin on mouse hippocampal oscillations in vitro. European Journal of Neuroscience. 44, 2885-2898 (2016).
- Mizunuma, M., et al. Unbalanced excitability underlies offline reactivation of behaviorally activated neurons. Nature Neuroscience. 17, 503-505 (2014).
- Hájos, N., et al. Spike timing of distinct types of GABAergic interneuron during hippocampal gamma oscillations in vitro. Journal of Neuroscience. 24, 9127-9137 (2004).
- Geschwill, P., et al. Synchronicity of excitatory inputs drives hippocampal networks to distinct oscillatory patterns. Hippocampus. , (2020).
- Rutecki, P. A., Grossmann, R. G., Armstrong, D., Irish-Loewen, S. Electrophysiological connections between the hippocampus and entorhinal cortex in patients with complex partial seizures. Journal of Neurosurgery. 70, 667-675 (1989).
- Lothman, E. W., Bertram, E. H., Stringer, J. L. Functional anatomy of hippocampal seizures. Progress in Neurobiology. 37, 1-82 (1991).
- Carter, D. S., Deshpande, L. S., Rafiq, A., Sombati, S., Delorenzo, R. J. Characterization of spontaneous recurrent epileptiform discharges in hippocampal - cortical slices prepared from chronic epileptic animals. Seizure: European Journal of Epilepsy. 20, 218-224 (2011).
- Karlócai, M. R., et al. Physiological sharp wave-ripples and interictal events in vitro: What's the difference. Brain. 137, 463-485 (2014).
- Leroy, F., et al. Input-timing-dependent plasticity in the hippocampal CA2 region and its potential role in social memory. Neuron. 95, 1089-1102 (2017).
- Sun, Q., et al. Proximodistal heterogeneity of hippocampal CA3 pyramidal neuron intrinsic properties, connectivity, and reactivation during memory recall. Neuron. 95, 656-672 (2017).
- Masurkar, A. V., et al. Medial and lateral entorhinal cortex differentially excite deep versus superficial CA1 pyramidal neurons. Cell Reports. 18, 1-13 (2017).
- Papatheodoropoulos, C., Kostopoulos, G. Spontaneous, low frequency (∼2-3 Hz) field activity generated in rat ventral hippocampal slices perfused with normal medium. Brain Research Bulletin. 57, 187-193 (2002).
- Papatheodoropoulos, C., Kostopoulos, G. Spontaneous GABAA-dependent synchronous periodic activity in adult rat ventral hippocampal slices. Neuroscience Letters. 319, 17-20 (2002).
- Kubota, D., Colgin, L. L., Casale, M., Brucher, F. A., Lynch, G. Endogenous waves in hippocampal slices. Journal of Neurophysiology. 89, 81-89 (2003).
- Behrens, C. J., Van Den Boom, L. P., De Hoz, L., Friedman, A., Heinemann, U. Induction of sharp wave - complexes in vitro and reorganization of hippocampal networks. Nature Neuroscience. 8, 1560-1567 (2005).
- Kouvaros, S., Papatheodoropoulos, C. Prominent differences in sharp waves, ripples and complex spike bursts between the dorsal and the ventral rat hippocampus. Neuroscience. 352, 131-143 (2017).
- Strange, B. A., Witter, M. P., Lein, E. S., Moser, E. I. Functional organization of the hippocampal longitudinal axis. Nature Reviews Neuroscience. 15, 655-669 (2014).
- Patel, J., Fujisawa, S., Berényi, A., Royer, S., Buzsáki, G. Traveling Theta Waves along the Entire Septotemporal Axis of the Hippocampus. Neuron. 75, 410-417 (2012).
- Patel, J., Schomburg, E. W., Berényi, A., Fujisawa, S., Buzsáki, G. Local generation and propagation of ripples along the septotemporal axis of the hippocampus. Journal of Neuroscience. 33, 17029-17041 (2013).
- Fricke, R., Cowan, W. M. An autoradiographic study of the commissural and ipsilateral hippocampo-dentate projections in the adult rat. Journal of Comparative Neurology. 181, 253-269 (1978).
- Ishizuka, N. O. R., Weber, J., Amaral, D. G. Organization of intrahippocampal projections originating from CA3 pyramidal cells in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 623, 580-623 (1990).
- Papatheodoropoulos, C. Electrophysiological evidence for long-axis intrinsic diversification of the hippocampus. Frontiers in Bioscience - Landmark. 23, 109-145 (2018).
- Gilbert, M., Racine, R. J., Smith, G. K. Epileptiform burst responses in ventral vs dorsal hippocampal slices. Brain Research. 361, 389-391 (1985).
- Papatheodoropoulos, C., Moschovos, C., Kostopoulos, G. Greater contribution of N-methyl-D-aspartic acid receptors in ventral compared to dorsal hippocampal slices in the expression and long-term maintenance of epileptiform activity. Neuroscience. 135, 765-779 (2005).
- Jones, R. S. G., Heinemann, U. Synaptic and intrinsic responses of medial entorhinal cortical cells in normal and magnesium-free medium in vitro. Journal of Neurophysiology. 59, (1988).
- Rafiq, A., Delorenzo, R. J., Coulter, D. A. Generation and propagation of epileptiform discharges in a combined entorhinal cortex / hippocampal slice. Journal of Neurophysiology. 70, 1962-1974 (1993).
- Stoop, R., Pralong, E. Functional connections and epileptic spread between hippocampus, entorhinal cortex and amygdala in a modified horizontal slice preparation of the rat brain. European Journal of Neuroscience. 12, 3651-3663 (2000).
- Roth, F. C., Beyer, K. M., Both, M., Draguhn, A., Egorov, A. V. Downstream effects of hippocampal sharp wave ripple oscillations on medial entorhinal cortex layer V neurons in vitro. Hippocampus. 26, 1493-1508 (2016).
- Bertsche, A., Bruehl, C., Pietz, J., Draguhn, A. Region- and pattern-specific effects of glutamate uptake blockers on epileptiform activity in rat brain slices. Epilepsy Research. 88, 118-126 (2010).
- Wu, C., Shen, H., Luk, W. P., Zhang, L. A fundamental oscillatory state of isolated rodent hippocampus. Journal of Physiology. 540, 509-527 (2002).
- Colgin, L. L., Jia, Y., Sabatier, J. M., Lynch, G. Blockade of NMDA receptors enhances spontaneous sharp waves in rat hippocampal slices. Neuroscience Letters. 385, 46-51 (2005).
- Ellender, T. J., Nissen, W., Colgin, L. L., Mann, E. O., Paulsen, O. Priming of hippocampal population bursts by individual perisomatic-targeting interneurons. The Journal of Neuroscience. 30, 5979-5991 (2010).
- Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. A. Comparison of different slicing planes in preservation of major hippocampal pathway fibers in the mouse. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 1-17 (2017).
- Maier, N., Morris, G., Johenning, F. W., Schmitz, D. An approach for reliably investigating hippocampal sharp wave-ripples in vitro. PLoS One. 4, 6925 (2009).
- Schlingloff, D., Kali, S., Freund, T. F., Hajos, N., Gulyas, A. I. Mechanisms of sharp wave initiation and ripple generation. Journal of Neuroscience. 34, 11385-11398 (2014).
- McCloskey, D. P., Scharfman, H. E. Progressive, potassium-sensitive epileptiform activity in hippocampal area CA3 of pilocarpine-treated rats with recurrent seizures. Epilepsy Research. 97, 92-102 (2011).
- McMahon, L. L., Williams, J. H., Kauer, J. A. Functionally distinct groups of interneurons identified during rhythmic carbachol oscillations in hippocampus in vitro. Journal of Neuroscience. 18, 5640-5651 (1998).
- Pöschel, B., Heinemann, U., Draguhn, A. High frequency oscillations in the dentate gyrus of rat hippocampal slices induced by tetanic stimulation. Brain Research. 959, 320-327 (2003).
- Hájos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. European Journal of Neuroscience. 29, 319-327 (2009).
- Hájos, N., Mody, I. Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content. Journal of Neuroscience Methods. 183, 107-113 (2009).
- Dengler, C. G., Yue, C., Takano, H., Coulter, D. A. Massively augmented hippocampal dentate granule cell activation accompanies epilepsy development. Nature Publishing Group. , 1-17 (2017).
- Ting, J. T., et al. Preparation of acute brain slices using an optimized N -methyl-D-glucamine protective recovery method. Journal of Visualized Experiments. 132, 1-13 (2018).
- Westerhof, N., Lankhaar, J. W., Westerhof, B. E. The arterial windkessel. Medical and Biological Engineering and Computing. 47, 131-141 (2009).
- Shi, W. X., Bunney, B. S. A small volume chamber for electrical recording from submerged brain slices and a pulse-free medium supply system using a peristalic pump. Journal of Neuroscience Methods. 35, 235-240 (1990).
