Summary
Bu protokol, spontan keskin dalga dalgalanma aktivitesi sergileyen farelerden yatay hipokampal-entorhinal korteks (HEC) dilimlerinin hazırlanmasını açıklar. Dilimler basitleştirilmiş bir arayüz tutma odasında inkübe edilir ve kayıtlar, doku oksijenlenmesini ve ağ düzeyinde aktivitenin kendiliğinden ortaya çıkmasını teşvik etmek için hızlı akan yapay beyin omurilik sıvısı ile su altında koşullar altında gerçekleştirilir.
Abstract
Akut kemirgen beyin dilimlemesi, elektrofizyoloji, mikroskopi ve farmakoloji kullanarak tek hücreli çözünürlükle sinir devrelerinin organizasyonu ve işlevi hakkında fikir edinmek için çekişli deneysel bir yaklaşım sunar. Bununla birlikte, in vitro deneylerin tasarımında önemli bir husus, farklı dilim preparatlarının in vivo olarak gözlemlendiği gibi doğal sinirsel aktivite kalıplarını ne ölçüde yeniden özetlediğidir. Sağlam beyinde, hipokampal ağ, uyanık tüketici durumlar veya REM olmayan uyku sırasında meydana gelen keskin dalga dalgalanma komplekslerinin (SWR' ler) örneklediği gibi, hayvanın davranışsal durumunu yansıtan yüksek oranda senkronize popülasyon aktivitesi oluşturur. SWR'ler ve diğer ağ aktivitesi biçimleri, uygun koşullar altında izole hipokampal dilimlerde kendiliğinden ortaya çıkabilir. Hipokampal ağ aktivitesinin araştırılmasına güçlü beyin dilimi araç setini uygulamak için, doku sağlığını ve hipokampal ağ içindeki fonksiyonel bağlantının korunmasını optimize eden bir yaklaşım kullanmak gerekir. Fareler transkardiyal olarak soğuk sakkaroz bazlı yapay beyin omurilik sıvısı ile perfüzyona edilir. Hipokampus içeren yatay dilimler, sinaptik bağlantıyı korumak için 450 μm kalınlığında kesilir. Dilimler arabirim stili bir bölmede kurtarılır ve kayıtlar için batık bir odaya aktarılır. Kayıt odası, dilimin oksijenlenmesini iyileştirmek için yapay beyin omurilik sıvısının yüksek akış hızında çift yüzeyli süperfüzyonu için tasarlanmıştır. Bu protokol, karmaşık ve spontan ağ aktivitesinin in vitro araştırılmasına uygun sağlıklı doku sağlar.
Introduction
Canlı hipokampal dilimlerden in vitro elektrofizyolojik ölçüm, sayısız avantajı olan güçlü bir deneysel yaklaşımdır. Deneyci, dokudaki bireysel nöronlardan ölçümleri doğrudan görselleştirmek ve toplamak için bir mikroskop, mikromanipülatörler ve bir kayıt sistemi kullanabilir. Doku dilimleri ayrıca optogenetik, kemogenetik veya farmakolojik deneyler için fotostimülasyon veya ilaç teslimatı için çok erişilebilir.
Hipokampal ağ, hücredışı yerel alan potansiyeli 1 ,2,3,4,5'tesalınımlar olarak görülebilen vivo yüksek senkron nüfus aktivitesi oluşturur. Beyin dilimi yöntemleri, bu nöronal ağ salınımlarının altında kalan hücresel ve devre mekanizmaları hakkında fikir edinmek için yararlanmıştır. Maier ve ark.'ın temel çalışmaları, keskin dalga dalga komplekslerinin (SWR' ler) ventral hipokampus6,7dilimlerinde kendiliğinden ortaya çıkabileceğini göstermiştir. Birden fazla araştırmacının sonraki çalışmaları, hipokampus8,9,10'un ağ durumunu düzenlemede nöromodülatörlerin rolü ve daha önce in vivo11'deki davranış sırasında aktif olan nöronal toplulukların in vitro yeniden aktasyonlarını yönlendiren sinaptik mekanizmalar da dahil olmak üzere SWR'lerin birçok yönünü yavaş yavaş aydınlattı. Beyin dilimi deneyleri ayrıca gama aralığı salınımı (30-100 Hz), bellek kodlamasını desteklediğine ve12 , 13'ü geri çağırdığına inanılan ayrı bir hipokampal ağ durumu hakkında fikir sağlamıştır. Son olarak, hipokampüsün ve ilişkili yapıların temporal lob epilepsisinin patofizyolojisyolojislerindeki merkezi rolünü kabul eden14,15, araştırmacılar epileptiform aktivitenin neslini ve yayılmasını araştırmak için hipokampal dilim preparatlarını kullanmıştır. Carter ve arkadaşları, kronik epileptik hayvanlardan hazırlanan kombine hipokampal-entorhinal korteks dilimlerinin kendiliğinden in vitro16'daepileptikform akıntılar oluşturabileceğini göstermiştir. Daha sonra Karlócai ve arkadaşları, hipokampal dilimlerde epileptiform deşarjların altında yatan mekanizmaları, değiştirilmiş iyon konsantrasyonlarına sahip modifiye yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) (mg2+ veya yükseltilmiş K+azaltılmış) veya eklenen ilaçlar (4AP veya gabazin)17kullanarak araştırdı.
Araştırmacılar anahtar şekillerde farklılık gösteren çok sayıda hipokampal dilim yaklaşımı geliştirmiştir: (1) dilimde bulunan hipokampüsün bölgesi (dorsal, orta veya ventral); (2) entorhinal korteks gibi ekstrahippocampal dokuların varlığı veya yokluğu; (3) dilimleri kesmek için kullanılan yönlendirme (koronal, sagittal, yatay veya eğik); ve (4) dilimlemeden sonra dokunun tutulduğu koşullar (ACSF'ye tamamen batırılmış veya ACSF ve nemlendirilmiş, karbojen bakımından zengin hava arayüzünde tutulur).
Hangi dilimleme yaklaşımının kullanılacağı deneysel amaç tarafından belirlenmelidir. Örneğin, sualtı koşullarında tutulan dorsal hipokampüsün enine veya koronal dilimleri intrahippocampal devre ve sinaptik plastisitenin araştırılması için çok etkili bir şekilde kullanılmıştır18,19,20. Bununla birlikte, bu tür preparatlar kendiliğinden ventral hipokampus 21,22,23'tendilimler kadar kolay ağ salınımları oluşturmaz. Kalıcı SWR aktivitesi durumu dorsal ve ventral hipokampus24'tenenine dilimlerde tetanik stimülasyon ile indüklenebilir, spontan SWR'ler ventral dilimlerde daha kolay gözlenir7,25.
Dorsal ve ventral hipokampus arasındaki doğal fizyolojik ve anatomik ayrım, hem in vivo hem de in vitro26yapılan çalışmalarla desteklenmektedir. Sıçanlardaki kayıtlar, sırt ve ara hipokampus boyunca güçlü bir şekilde tutarlı teta ritimleri ortaya çıkardı, ancak ventral bölge ile hipokampüsün geri kalanı arasında zayıf tutarlılık27. Vivo'daki SWR'ler sırt ve ara hipokampus arasında kolayca yayılırken, ventral hipokampustan kaynaklanan SWR'ler genellikle yerel kalır28. Sırt ve ara hipokampusta bulunan CA3 piramidal nöronlardan kaynaklanan ilişkisel projeksiyonlar, hipokampüsün boyuna ekseni boyunca uzun mesafeler yansıtır. Ventral bölgelerden kaynaklanan CA3 projeksiyonları nispeten yerel kalır ve bu nedenle dilimleme işlemi sırasında kopma olasılığı daha düşüktür29,30. Bu nedenle ventral dilimler, popülasyon senkron oluşturmak için gerekli yinelenen ağı daha iyi koruyabilir. Ventral dilimlerin in vitro spontan ağ aktiviteleri üretme eğilimi, daha dorsal bölgelere kıyasla piramidal nöronların daha yüksek içsel uyarılmazlığını veya ventral hipokampusta daha zayıf GABAerjik inhibisyonu yansıtabilir31. Gerçekten de, ventral hipokampal dilimler epileptiform aktiviteye daha duyarlıdır32,33. Bu nedenle, spontan fizyolojik8,9,11,24 veya patolojik16,34,35,36 ağ salınımlarının birçok çalışması geleneksel olarak yatay bir dilimleme yaklaşımı kullanmıştır, bazen fronto-oksipital yönde hafif bir açı ile, ventral hipokampus enine düzlemine paralel doku dilimleri verir.
Dilimdeki birçok hücre kesileceği için ağ bağlantısı, dilimleme yordamı tarafından kaçınılmaz olarak etkileniyor. Dilim ve hazırlıkta tutulan dokunun açısı ve kalınlığı, ilgi çekici devrelerdeki bağlantıyı optimize etmek için düşünülmelidir. Birçok çalışma, fizyolojik veya patolojik ağ salınımları bağlamında iki yapı arasındaki etkileşimleri araştırmak için yatay kombine hipokampal-entorhinal korteks dilimlerini (HEC) kullanmıştır. Roth ve arkadaşları, SWR aktivitesinin HEC dilimi37aracılığıyla yayılmasını göstermek için hipokampüsün CA1 alt alanı ve medial entorhinal korteksin V katmanından çift kayıt gerçekleştirdi. Epileptiform aktivitenin birçok çalışması, epileptiform deşarjların corticohippocampal ağ 16,35 ,36,38üzerinden nasıl yayıldığını araştırmak için HEC dilim hazırlığını kullanmıştır. Bozulmamış corticohippocampal döngünün korunmasının spontan SWR'ler, epileptikform deşarjlar veya gama salınımları için bir ön koşul olmadığını belirtmek önemlidir; ağ salınımları, dorsal veya ventral hipokampüsün enine dilimlerinde, bağlı parahippocampal dokular21 , 22 , 23,25,39, 40,41ile üretilebilir. Hipokampal dilimlerdeki ağ salınımlarının spontan üretimi için daha önemli bir faktör, daha kalın bir dilim (400-550 μm) CA2 / CA3 tekrarlayan ağ21, 22 ,25'te daha fazla bağlantıyıkoruyacağından,her dilimin kalınlığı olabilir.
Açılı yatay HEC dilimleri (fronto-oksipital yönde yaklaşık 12 ° açı ile kesilmiş) corticohippocampal döngü11, 16,34,35,42fonksiyonel bağlantısını incelemek için kullanılmış olsa da, bu tür açılı preparatlar spontan ağ aktivitesi için gerekli değildir43,44,45. Bununla birlikte, açılı bir dilimleme düzleminin kullanılması, araştırmacının aşağı veya yukarı doğru bir açı uygulanıp uygulanmadığına bağlı olarak, ventral veya ara hipokampüsün enine yönelimli lamelini en iyi şekilde koruyan dilimleri seçici olarak yapmasına izin verir (Şekil 1). Bu yaklaşım kavramsal olarak papatheodoropoulos ve ark., 2002 tarafından kullanılan benzerdir, kim her hipokampus ücretsiz parçaladı ve daha sonra tüm dorsal-ventral eksen boyunca enine dilimler oluşturmak için bir doku helikopteri kullandı21. Ventral ve dorsal-ara hipokampus arasındaki yukarıda belirtilen fonksiyonel ayrımlar ışığında, araştırmacılar deneyler tasarlarken veya sonuçları yorumlarken dilimlerin anatomik kökenini göz önünde bulundurmalıdır. Dilimleme işlemi sırasında bir agar rampası kullanmak, tercihen ara veya ventral hipokampustan dilimler üretmenin basit bir yoludur.
Hipokampal dilimler, batık bir bölmede (doku tamamen ACSF'ye batırılmış olarak) veya arayüz tarzı bir odada (örneğin, Oslo veya Haas odası, dilimler yalnızca ince bir akan ortam filmiyle kaplanmış olarak) muhafaza edilebilir. Arayüz bakımı, nöronal sağkalımını destekleyen ve yüksek düzeyde internöral aktiviteye izin veren dokunun oksijenlenmesini arttırır. Geleneksel olarak, batık kayıt koşulları, ağ düzeyinde salınımların istikrarlı bir şekilde ifade edilmesi için yeterli doku oksijenasyonu sağlamayan daha yavaş bir ACSF akış hızı kullanır. Batık hipokampal dilimlerde karbachol kaynaklı gama salınımları sadece geçici olarak46,47, gözlenirken, arayüz kayıt odalarında10, 48,49' da sıkıca tutulabilirler. Bu nedenle, karmaşık spontan aktivite in vitro ile ilgili birçok çalışma, keskin dalga dalgalanma kompleksleri 6 ,7, 8,9,10,25,37, gama salınımları 10 , 13 ve epileptiform aktivite16,38,45,47'yi araştırmak için arayüz kayıt odalarına güvendi.
Batık tarzdaki bir kayıt odasında, tek tek hücreleri görselleştirmek ve kayıtlar için sağlıklı görünen hücreleri seçici olarak hedeflemek için daldırma mikroskobu hedefi kullanılabilir. Batık preparat ayrıca hücresel milieu üzerinde ince kontrol sağlar, çünkü dalgıçlık ilaçların veya diğer bileşiklerin dokuya hızlı bir şekilde difüzyonunu kolaylaştırır. Bu nedenle, kararlı ağ salınımlarının batık koşullar altında sürdürüldüğü değiştirilmiş bir metodoloji güçlü bir deneysel yaklaşımı temsil eder. Bu yaklaşım, hipokampal dilimlerin dokuya oksijen beslemesini artırmak için yüksek acsf (~ 6 mL / dk) akış hızına sahip değiştirilmiş bir sualtı kayıt odasına transfer etmeden önce birkaç saat boyunca basitleştirilmiş bir arayüz tarzı tutma odasında iyileştiği Hájosveark.'ınçalışmasıyla örneklenmiştir. Bu koşullar altında, yüksek düzeyde internöron aktivitesi ve kararlı spontan ağ salınımları su altında bir kayıt odasında tutulabilir. Bu değiştirilmiş yaklaşım, araştırmacıların görsel olarak yönlendirilmiş tam hücre yama kelepçe kayıtları gerçekleştirmelerini ve morfolojik olarak tanımlanmış hücre tiplerinin karbachol kaynaklı gama salınımlarına katkısını karakterize etmelerini sağlar12. SWR'ler, ACSF11,48,49hızlı akış hızına sahip batık hipokampal dilimlerde de kendiliğinden oluşabilir. Maier ve arkadaşları, batık bir kayıt odasına transfer edilmeden önce bir arayüz odasında kurtarılan hipokampal dilimlerin güvenilir bir şekilde spontan SWR'ler sergilediğini, oysa batık bir kayıt odasına transfer edilmeden önce bir behere batırılmış olarak kurtarılan dilimlerin daha küçük uyarılmış alan tepkileri, daha düşük spontan sinaptik akım seviyeleri gösterdiğini ve sadece çok nadiren spontanSWR'lersergilediğini göstermiştir 43 . Schlingloff ve arkadaşları, parvalbumin ifade eden sepet hücrelerinin spontan SWR44'ünneslindeki rolünü göstermek için bu geliştirilmiş metodolojiyi kullandı.
Aşağıdaki protokol, yatay hipokampal dilimlerdeki kendiliğinden aktif nöronların arayüz koşullarında kurtarılabileceği ve daha sonra farmakolojik veya optogenetik manipülasyonlar ve görsel olarak yönlendirilmiş kayıtlar için uygun bir su altında kayıt odasında tutulabileceği bir dilimleme yöntemi ssunuyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm yöntemler Columbia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (AC-AAAU9451) tarafından onaylanmıştır.
1. Çözümler hazırlayın
- Tablo 1'de açıklandığı gibi dilimleme için sakkaroz kesme çözeltisi hazırlayın.
NOT: 1 L sakkaroz çözeltisi hazırladıktan sonra, bir buz tepsisinde az miktarda (yaklaşık 100-200 mL) dondurun. Bu donmuş sakkaroz buz küpleri buzlu bir bulamaç içine karıştırılacaktır (bkz. adım 4.3). - Tablo 2'de açıklandığı gibi kayıt için yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) hazırlayın.
- eser metalleri ve diğer safsızlıkları gidermek için filtrelenmiş 1 mL arıtılmış suda 0,05844 g NaCl çözerek 1 M NaCl'yi stimülasyon pipetleri için hazırlayın.
NOT: Sakkaroz kesme çözeltisi ve ACSF her deney için taze hazırlanmalıdır.
2. Agar rampası hazırlayın
- Agar tozlarını eser metalleri ve diğer safsızlıkları gidermek için filtrelenmiş arıtılmış suya eriterek% 4 agar (örneğin, 50 mL suda 2 g agar) hazırlayın. Karışımı bir mikrodalga fırında kaynamaya başlayana kadar ısıtın (yaklaşık 30-60 s). Erimiş agarı bir kalıba dökün ve yaklaşık 12 ° eğimdeki bir buzdolabında 4 ° C'de soğumasını ve katılaşmasını bekleyin.
NOT: Bir kalıp için, 4 cm uzunluğunda ve yaklaşık 0,8 cm yüksekliğinde bir rampa oluşturacak kadar erimiş agar dökülmüş bir açıyla ayarlanmış herhangi bir cam veya plastik kap kullanılabilir.
3. Dilimleme alanını sahnele
- Yaklaşık 250 mL ACSF ile bir dilim geri kazanım odası içeren 400 mL'lik bir kabı doldurun; 32 °C'ye kadar ısıtılmış bir su banyosuna yerleştirin ve karbojen (%95 oksijen gazı/%5 karbondioksit gazı) ile köpürmeye başlayın.
NOT: Geri kazanım kabını, tutma odasının naylon a örgüsünü çözeltinin en yüzeyine yerleştirmek için yeterli sıvı ile doldurun, böylece dilimler sıcak çözelti karışımının ve havanın arayüzünde tutulacaktır (Şekil 1). Naylon ağın üzerine küçük lens kağıdı parçaları yerleştirin. Dilimler, daha sonra dilimleri kayıt odasına ayrı ayrı aktarmak için kullanılabilecek lens kağıdının üzerine uzanır (bkz. adım 6.6). - Rahatlamak ve karbojen ile köpürmeye başlamak için bir buz kovasına sakkaroz çözeltisi ile bir şişe yerleştirin.
NOT: Geri kazanım kabı ve sakkaroz çözeltisi, fare izofluran odasına yerleşmeden önce en az 30 dakika boyunca karbojen köpürerek sırasıyla ısıtılmalı ve soğutulmalıdır. - Önceden hazırlanmış, donmuş sakkaroz çözeltisi buz küplerinin tepsisini dondurucudan çıkarın ve kısmen çözülmek için tezgaha yerleştirin.
- Temiz çift kenarlı jiletlerin yarısını mikrotom içine yerleştirin ve gerekirse kalibre edin. Diseksiyon sırasında kullanılmak üzere jiletin diğer yarısını bir kenara koyun.
- Dilimleme odasına bir karbojen hattı ve sıcaklık probu çalıştırın ve odayı soğutmak için buzla çevrelenin.
- İki tek kullanımlık emici ped ile kaplı temiz bir tezgah veya masa hazırlayın. Tüm diseksiyon aletlerini ve üç parça laboratuvar bandını, transkardiyal perfüzyonun yapılacağı sol ped üzerine dağıtın.
NOT: Diseksiyon aletleri arasında küçük Bonn makası, disektör makası, büyük spatula/kaşık, mikrospatula, yeni bıçaklı neşter, spatula, keskin/künt cerrahi makas, büyük doku asaları ve küçük doku asaları bulunur (bkz. Malzeme Tablosu). - Perfüzyon alanının sağındaki diğer emici pedde, 100 mm çapında bir cam Petri kabının kapağına dairesel bir filtre kağıdı yerleştirin. Petri kabının altını kapağın yanına yerleştirin ve kabın her iki parçasına da bir karbojen hattı yerleştirin.
- Küçük bir agar rampasını kesmek için jilet veya neşter kullanın (açılı yüzey boyunca yaklaşık 4 cm, 0,8 cm yüksekliğinde, 2 cm genişliğinde). Rampanın bir parçasını uzun ucundan kesin ve bir agar destek bloğu oluşturmak için ters çevirin. Agar rampasını ve destek bloğunu dilimleme platformuna yapıştırmak ve bir kenara ayırmak için siyanoakrilat yapıştırıcı kullanın.
NOT: Agar'ın destek bloğu, dilimleme sırasında beynin stabilize etmesine yardımcı olur ve gereksiz dokuları her dilimden ayıracak bir yüzey sağlar (Şekil 1).
4. Transkardiyal perfüzyon
- 60 mL kapasiteli şırınnayı, sakkaroz kesme çözeltisi için tezgah tepesinden yaklaşık 18 inç yukarıda bir rezervuar olarak askıya alın (örneğin, dikey bir direk üzerinde üç uçlu döner kelepçe kullanarak). Boruyu rezervuarın dibine takın, boruyu bir rulo kelepçeden geçirin ve tüpün diğer ucunu temiz bir 20 G iğneye bağlayın.
- 60 mL'lik rezervuarı yaklaşık 30 mL soğutulmuş sakkaroz çözeltisi ile doldurun ve perfüzyonu sürekli kabarcıklamak için bir karbojen hattını sakkaroz rezervuarına yönlendirin.
NOT: Sakkarozun herhangi bir sıkışmış kabarcık olmadan boru ve iğneden aktığından emin olun. Akış hızı, iğneden sürekli damlayan sakkaroz akışına sahip olacak kadar hızlı olmalıdır. - Bir blender kullanarak, donmuş sakkarotu ezin ve buzlu bir bulamaç haline getirin ve bulamacı dağıtmak için büyük spatula / kaşığı kullanın.
- Cam Petri kabı kapağının kenarlarına az miktarda sakkaroz bulamacı yerleştirin. Petri kabının tabanına az miktarda sakkaroz bulamacı ekleyin.
- Perfüzyon sıvısı rezervuarı için kabaca 20-30 mL sakkaroz bulamacı ekleyin, rezervuar çok soğuk, ağırlıklı olarak sıvı sakkarozun bir karışımını içerene kadar 30 mL soğutulmuş sıvı sakkaroz ile iyice karıştırın.
- Fareyi bir izofluran buharlaştırıcıya bağlı bir odaya yerleştirin. Yaklaşık 2 L/dk'da oksijen akışı ile buharlaştırıcının kadranını çevirerek izoflurane %5 konsantrasyonda teslim edin ve bir zamanlayıcı başlatın.
NOT: Dilimlerin ne kadar hızlı elde edildiğini ölçmek için bu zamanlayıcıyı dilimleme boyunca devam ettirin. İşlem mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır, böylece dilimleme tamamlanır ve doku, hayvanın izofluran odasına girmesinin 15-20 dakika içinde arayüz odasında geri kazanılır. Derin anestezi durumunun sağlandığından emin olmak için fareyi izleyin. En az 5 dakika sonra, fare derinden uyuşturulmalı ve parmak sıkışmalarına tepkisiz olmalıdır. - Fareyi izofluran odasından çıkarmadan hemen önce, Petri kabı kapağını yaklaşık 3-5 mm derinliğe kadar soğutulmuş sakkaroz çözeltisi ile doldurun ve Petri kabı tabanını yaklaşık 1,0 cm derinliğe kadar soğutulmuş sakkaroz çözeltisi ile doldurun.
- Fareyi hızlı bir şekilde sol emici pedine aktarın ve ön ayakları ve kuyruğu sabitlemek için 3 bant parçasını kullanın. Herhangi bir kesi yapılmadan önce farenin tepkisiz olduğundan emin olmak için bir arka ayak parmağı kıstırma gerçekleştirin. Büyük doku tokmaklarını ve cerrahi makası kullanarak, cildi çadırlayın ve sternumun dibinden göğsün üstüne kadar uzunlamasına bir kesi yapın. Asaları kullanarak sternuma çekin ve diyaframı kesmek için makası kullanın.
NOT: Farenin bilincinin yerine gelmemesini sağlamak için farenin ilk konumlandırılması ve diyaframı kesmek için ilk birkaç kesi mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır. İşlem boyunca yeterli anestezi derinliğini sağlamak için, perfüzyon sırasında izofluran vermek için fareye bir burun konisi yerlenebilir. - Her iki taraftaki göğüs kafesini kesmek için makası kullanın, ön ayakla vücudun birleştiği noktaya doğru büyük bir hareketle kesin. Önps ile göğüs kafesinin önünü uzağa ve kafaya doğru sallayın ve ardından büyük makası kullanarak yatay bir kesikle tamamen çıkarın. Büyük tokaları kullanarak kalbi yerinde tutun ve 20 G perfüzyon iğnesini sol ventrikül içine yerleştirin. İğne doğru şekilde konumlandıktan sonra, soğutulmuş sakkaroz çözeltisi ventrikülü doldurduğu için kalbin sol tarafı hızla solgun olmalıdır.
- Sağ atriyuma kesmek ve kanın dolaşım sisteminden akmasını sağlamak için küçük distör makasını kullanın. Kesiler doğru yapılırsa, kalbe minimum hasar verilmeli ve perfüzyon boyunca pompalama işlemine devam etmelidir.
NOT: Yuvarlanmış kağıt parçaları, kalpten kan ve sakkaroz çözeltisini yok etmek ve işlem sırasında perfüzyon iğnesinin görünürlüğünü korumak için kullanılabilir. - Perfüzyon iğnesinin yerinde kalmasını ve sol ventrikülden düşmemesini sağlayın. Uygun bir akış hızı ve yerleşim ile karaciğer 20-30 sn ile açık tenli / bej bir renge solmaya başlayacaktır.
- 30-45 sn'den sonra, farenin kafasını kesmek için büyük makası kullanın. Başı sol elde tutarak, cildi kafatasından uzaklaştırın veya soyun. İyi perfüzyonlu bir hayvanda, kafatası çok solgun olmalı ve beyin, açıkça görülebilen kan damarları olmadan kafatasından çok açık pembe bir renk (beyaza yaklaşan) görünmelidir.
5. Beyni çıkarın ve dilimleri kesin
- Küçük Bonn makasını kullanarak, kafatasının önünde, gözlerin yanında orta çizgiye doğru kafatasından iki yanal kesik yapın. Kafatasının tabanının her iki tarafında iki ek kesik yapın.
- Başı, çoğunlukla soğutulmuş sakkaroz çözeltisine daldırılması gereken cam Petri kabının dibine aktarın. Kafatasının uzunluğu boyunca orta çizgiyi kesmek için küçük Bonn makasını kullanın, alttaki beyin dokusunun hasar görmesini en aza indirmek için makasla yukarı çekerek. Küçük doku asalarını kullanarak, kafatasının her iki tarafını sıkıca kavrayın ve bir kitap açmak gibi beyinden yukarı ve uzağa sallayın.
- Kafatasının kapaklarını açık tutmak ve mikrospatulayı beynin altına koku ampullerinin yanına yerleştirmek için sol elin parmaklarını kullanın. Beyni kafatasından sakkaroza çevirin ve beyin sapını kesmek için mikrospatulayı kullanın. Kalan kan, kürk veya diğer dokuları çıkarmak için beyni yıkayın.
- Beyni cam Petri kabının kapağına aktarmak için büyük spatula / kaşığı kullanın. Çift kenarlı jiletin diğer yarısı daha önce ayrılmışken, önce beyincikleri ve daha sonra koku ampulleri de dahil olmak üzere beynin en ön kısmını çıkarmak için iki koronal kesim yapın (Şekil 1).
- Agar rampasına siyanoakrilat yapıştırıcı uygulayın. Çok kısa bir süre beyni büyük doku tokmaklarını kullanarak bir kuru filtre kağıdı parçasına yerleştirin ve hemen agar rampasına aktarın, beynin ventral yüzeyini yapıştırıcıya yerleştirin.
NOT: Ara hipokampüsün dilimleri için, beyin ön kısmı rampanın eğimine bakan ve arka kısmı bıçağa daha yakın olacak şekilde yönlendirilmelidir. Ventral hipokampüsün dilimleri için, beyni ön ucu rampanın eğiminden aşağı doğru, arka ucu rampanın üstünde, bıçaktan daha uzakta olacak şekilde yönlendirin. Her iki durumda da, beyin rampanın tepesine konumlandırılmalıdır, böylece beynin koronal kesimli yüzeyi ağar destek bloğuna temas etmelidir (Şekil 1). - Agar ve beyin ile dilimleme platformunu mikrotomların dilimleme odasına yerleştirin ve soğutulmuş sakkaroz çözeltisi ile tamamen daldırın. Bazı sakkaroz bulamacı odaya aktarmak için büyük spatula / kaşığı kullanın, donmuş sakkarozu eritmek için karıştırın ve karışımın sıcaklığını hızla ~ 1-2 ° C'ye düşürün.
NOT: Dilimleme boyunca sıcaklık göstergesini izleyin. Sakkaroz çözeltisi 3 °C'nin üzerinde ısınırsa, daha fazla bulamaç ekleyin ve sıcaklığı tekrar düşürmek için karıştırın. - Mikrotom hızı 0,07 mm/s olarak ayarlanmış 450 μm kalınlığında dilimleri kesin. Her dilim serbest bırakıldığında, önce iki yarımküreyi ayırmak için küçük doku tokalarını ve keskin bir neşteri kullanın ve daha sonra dilim öncelikle hipokampus ve parahippocampal bölgelerden oluşana kadar dokuyu kesin (Şekil 1).
- Dilimleri arayüz kurtarma odasına ayrı ayrı aktarmak için plastik bir transfer pipeti kullanın, bu da dilimleri kaplayan sadece ince bir ACSF menisküs ile ACSF'nin arayüzüne ve havaya konumlandıklarından emin olmak için. Odanın kapağını sıkıca kapatın ve dilimlerin 30 dakika boyunca 32 °C'de toparlanmasını sağlar.
- 32 ° C'deki ilk geri kazanımdan sonra, arayüz geri kazanım odasını su banyosundan getirin ve manyetik karıştırma çubuğunun oda içinde ACSF dolaşımını teşvik etmesi için yavaş bir hıza ayarlanmış bir karıştırıcıya yerleştirin. Dilimler 90 dakika daha iyileştikçe oda sıcaklığına yavaş yavaş soğumasını bekleyin. Kurtarma odasının sürekli olarak karbojen ile kabarcıklı olduğundan emin olun ve büyük kabarcıkların dilimlerin altına sıkışmasına izin vermeyin.
6. Spontan aktivitenin yerel alan potansiyeli (LFP) kayıtlarını gerçekleştirin
- Satın alma yazılımını çalıştıran bilgisayar, bilgisayara bağlı monitör, uyarıcılar, mikromanipülatör, sıcaklık kontrolörü, mikroskop ışık kaynağı, mikroskop takılı kamera, mikroelektrod amplifikatör, sayısallaştırıcı ve peristaltik pompa dahil olmak üzere gerekli tüm ekipmanları açarak LFP kayıtlarına hazırlanın. Merkezi bir vakum sistemi kullanıyorsanız, ACSF'yi kayıt odasından çıkaracak vakum hattını hazırlamak için duvar vanasını açın.
- Isıtılmış rezervuarı ACSF ile doldurun, ardından borunun bir ucunu köpüren ACSF içeren 400 mL'lik kabın içine yerleştirin. ACSF'yi 400 mL'lik beherden ısıtılmış rezervuara ve rezervuardan kayıt odasına yönlendirmek için peristaltik pompayı açın. Sıkışan kabarcıkları serbest bırakmak için boruya dokunun veya kıstırın.
- Kayıt odasından geçen ACSF akış hızının hızlı (~ 8-10 mL / dk) olduğundan emin olmak için peristaltik pompayı ayarlayın. ACSF'nin kayıt odasının merkezinde 32 °C olduğundan emin olmak için bir sıcaklık probu kullanın.
NOT: ACSF peristaltik bir pompa kullanılarak kayıt odasına teslim edilirse, yüksek debi akış hızında önemli bir dalgalanmaya neden olabilir. Boruya entegre edilmiş bir dizi boş şırıngdan oluşan basit bir titreşim sönümleyici kullanılarak tutarlı akış hızları elde edilebilir (Şekil 2). - Isıtılmış filament çekerek borosilikat cam kılcal damarlardan stimülasyon ve kayıt pipetleri hazırlayın. Çekme protokolü, stimülasyon veya yerel alan potansiyel kayıt elektrotları için 2-3 MOhm direncine sahip pipetler verecek şekilde yapılandırılmalıdır.
- Stimülasyon pipetlerini ACSF ile 1 M NaCl ve LFP pipetlerle doldurun.
- ACSF akışını duraklatmak için boruyu kısaca sıkıştırın ve pompayı kapatın. Lens kağıdının bir köşesini kavramak için ince forseps kullanarak bir dilimi kayıt odasına aktarın, dilim lens kağıdına yapışır. Lens kağıdını yerleştirin ve dilim aşağı bakacak şekilde kayıt odasına dilimleyin, ardından dilimi kayıt odasına batırarak lens kağıdını "soyun". Dilimi bir arp kullanarak sabitleyin.
NOT: Harps, U şeklinde paslanmaz çelik veya platin ve ince naylon filament kullanılarak önceden yapılmış veya laboratuvarda yapılabilir. - Manuel mikromanipülatöre NaCl dolgulu bir stimülasyon pipeti yerleştirin ve pipet ucunu yavaşça dilimin yüzeyine (örneğin stratum radiatum tabakasında) yaklaşık 30-45° açıyla ilerletin. Pipet ucu dokuya girdikten sonra, pipeti yavaşça ileri doğru ilerletin ve dilim içindeki aksonlara gereksiz yere zarar verebilecek yanal veya dikey yöndeki büyük hareketlerden kaçının. Pipet ucunu dilime en az 50-100 μm derinliğe yerleştirin ve dilimleme sırasında yüzeye yakın hücrelerin zarar görmesini önleyin.
- Motorlu mikromanipülatöre bağlı pipet tutucusuna ACSF dolu bir LFP pipet yerleştirin. Ağız basıncını veya bir stopcock valfi ve pipet tutucuya kısa bir boru uzunluğu ile bağlanmış 1 mL şırınna kullanarak çok hafif bir pozitif basınç uygulayın.
NOT: İlgi sinyallerini kaydetmek için LFP pipetlerini dilim içinde konumlandırın: keskin dalga dalgalanmaları durumunda, stratum piramitine (SP) bir LFP pipeti ve stratum radiatumunda (SR) ikinci bir pipet yerleştirilmelidir. Bu yapılandırma, SR'deki negatif keskin dalganın ve SP'deki yüksek frekanslı dalgalanma salınımının eşzamanlı kayıtlarına izin verir (Şekil 3). - Mikromanipülatör kullanarak, LFP pipetinin ucunu yaklaşık 30-45 ° 'lik bir açıyla ilgi alanına (örneğin, CA1 piramidal hücre tabakası) yavaşça ilerletin. Pipet ucunu dilime en az 50-100 μm derinliğe yerleştirin ve dilimleme sırasında yüzeye yakın hücrelerin zarar görmesini önleyin. LFP pipeti ilerletirken, alma yazılımını kullanarak sürekli olarak küçük bir voltaj testi darbesi sunun ve elektrot direncinde ani bir artış meydana gelen bir artışa dikkat edin. Bu, pipetin tıkandığını veya bir hücreye bastırıldığını gösterebilir.
- LFP pipet ilgi alanına konumlandıktan sonra, pipet tutucusuna bağlı boru üzerindeki vanayı açarak pozitif basıncı dikkatlice serbest bırakın.
- LFP'yi aynı anda ikinci bir konuma kaydetmek için, 6.8–6.10 adımlarını ikinci bir pipet ve mikromanipülatörle yineleyin.
- Pipetin seri direncini düzeltmek için alım yazılımındaki köprü dengesi işlevini kullandıktan sonra yerel alan potansiyelinde spontan aktiviteyi kaydetmek için mevcut kelepçe konfigürasyonunda mikroelektrod amplifikatörü kullanın. Spontan SWR'ler SP tabakasının hücre dışı potansiyelinde pozitif sapmalar olarak görünecektir (Şekil 3).
- Uyarılmış alan potansiyellerini kaydetmek için, NaCl dolu stimülasyon pipeti aracılığıyla kısa (200 abd) kare voltaj darbesi sağlamak için sayısallaştırıcıya bağlı uyarıcıları kullanın. Bir dizi tepki genliğini çağrıştıracak şekilde stimülasyon gerilim kadranını ayarlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, bu protokolde açıklandığı gibi hazırlanan HEC dilimlerinden temsili kayıtlar sunulmaktadır. Bir arayüz tutma odasında kurtarmadan sonra (Şekil 1C), dilimler tek tek su altında bir kayıt odasına aktarılır (Şekil 2B). Kayıt odası, peristaltik bir pompa kullanılarak karbojen doymuş ACSF ile birlikte verilir (Şekil 2A). Pompa ilk olarak ACSF'yi bir tutma kabından ısıtılmış bir hazneye çeker. Karbojen hatları, ortamın sürekli oksijenlenmesini sağlamak için hem tutma kabına hem de ısıtılmış rezervuara yerleştirilir. Bir dizi hava dolu şırınnadan oluşan bir titreşim sönümleyici, hızlı peristalsis tarafından üretilen akış hızındaki dalgalanmaları en aza indirmek için peristaltik pompa ile kayıt odası arasına yerleştirilmiştir. Her şırınddaki hava cebi, pompanın her döngüsünün neden olduğu basınç değişikliklerini emer, böylece kayıt odası acsf52,53'ünpürüzsüz ve tutarlı bir akışını alır. Titreşim sönümleyiciden sonra konumlandırılmış bir satır içi ısıtıcı, KAYıT odasına girerken ACSF sıcaklığının 32 °C'de tutulmasını sağlar.
Bu örnekte, çift yüzeyli superfüzyon kayıt odası üç adet 3D baskılı katmandan oluşur (Şekil 2B). Alt katman, vakum yağı ile sabitlanmış bir kapak kapağına uyacak dikdörtgen bir kesmeye sahiptir. Orta katman, iki yatay destek ile uzun oval bir odanın alt yarısını içerir. Naylon filament bu desteklere tutturularak (kabaca her 0,5 mm'de bir) ve siyanoakrilat yapıştırıcı ile sabitlenmiştir. Dilim bu asılmış filamentin üzerine dayanacaktır. Üst katman, gümüş klorür öğütülmüş peletlerin yerleştirilebileceği küçük kuyularla birlikte oval odanın üst yarısını içerir. Odanın uzun oval şekli, ACSF'nin hızlı laminer akışını teşvik etmek için tasarlanmıştır.
Şekil 3'te bu protokole göre hazırlanan HEC dilimlerinden temsili kayıtlar sunulmaktadır. Başlangıçta dilim sağlığını değerlendirmek için, stratum radiatumda (SR) 1 M NaCl ile dolu bir pipet kullanılarak saha postynaptik potansiyelleri (fPS'ler) çağrılır. Sağlıklı dilimlerde, elektriksel stimülasyon küçük bir presynaptik lif volesine ve hızlı bir başlangıç inişe sahip büyük bir postynaptik potansiyele sahip bir fPSP üretmelidir(Şekil 3B, sol üst). Sağlıklı dilimlerde, spontan keskin dalga dalgalanmaları (SWR'ler) stratum piramitüldeki LFP'de pozitif sapmalar olarak görülebilir(Şekil 3B, sol alt). Suboptimal dilimlerde fPS'ler büyük bir fiber vole ve nispeten küçük bir postynaptik potansiyel gösterir ve bu tür dilimler kendiliğinden SWR göstermez(Şekil 3B, sağ). IN VITRO'daki SWR'ler yayınlanan açıklamalarla tutarlı özellikler gösterir: SP katmanında, SR katmanındaki negatif alan potansiyeliyle eşleştirilmiş, üst üste bindirilmiş yüksek frekanslı salınımlı pozitif bir alan potansiyeli (Şekil 3C). CA2'de kaydedilen tek bir SWR yıldız işaretiyle gösterilir (Şekil 3C, sağ). HEC dilimlerindeki SWR'ler CA2/CA3 tekrarlayan devrelerden kaynaklanır ve CA1'e yayılır. CA2 ve CA1 SP katmanında gözlenen tek bir SWR yıldız işaretiyle gösterilir(Şekil 3D, sağ). Bu temsili örnekte, CA2 SWR (yeşil), her bölgede kaydedilen SWR zarfının (2-30 Hz'de filtrelenmiş) yer paylaşımında gösterildiği gibi, CA1 'de (mavi) birkaç milisaniye yol açar.
Şekil 1: Yatay açılı hipokampal-entorhinal korteks (HEC) dilimlerinin hazırlanması. (A) (i) Beyni çıkardıktan sonra, beynin arka ve ön kısımlarını çıkarmak için jiletle iki koronal kesim gerçekleştirin. (ii) Agar rampası mikrotom dilimleme platformuna yapıştırılmış iki açılı kısımdan oluşur. Ara hipokampüsün dilimlerini hazırlamak için, beyin bloğunu ön yüzey eğime bakacak şekilde agar rampasına yerleştirin ve rampanın uzun destek kısmıyla temas edin. Daha fazla ventral hipokampus dilimleri hazırlamak için, beyin bloğunu ön yüzey eğimden aşağı bakacak şekilde agar rampasına yerleştirin, böylece arka kesim yüzeyi rampanın uzun destek kısmıyla temas eder. (iii) Her dilim serbest bırakıldıkça, yarımküreleri ayırmak ve gereksiz dokuyu çıkarmak için neşterle birkaç kesik daha yapın. (B) Elde edilen dilimin DAPI tarafından etiketlenmiş hücre çekirdekleri ile temsili görüntüsü. (C) Bir arayüz kurtarma odasında, dilimler, ACSF yüzeyi ile seviyeli paslanmaz çelik veya naylon bir ağın üzerine lens kağıdı parçalarına yerleştirilir. Seramik bir kabarcığı karbojeni hazneye iletir ve manyetik bir karıştırma çubuğu odadaki sıvıyı sürekli olarak karıştırır. ACSF'nin ince bir filmi, dilimin üst yüzeyini kaplar ve odanın nemli karbojen bakımından zengin havasından oksijen difüzyonunu artırır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: ACSF dağıtım tüpünde titreşim sönümleyicili çift yüzeyli superfüzyon kayıt odası. (A) Süperfüzyon sisteminin şeması. ACSF 32 °C'ye kadar ısıtılır, sürekli karbojen gazı ile kabarcıklanır ve bir dizi hava dolu şırınnadan oluşan titreşim sönümleyicili bir peristaltik pompa kullanılarak yaklaşık 8-10 mL/ dak'da teslim edilir. (B) Kayıt odası, ortası naylon filament ile asılmış üç adet 3D baskılı katmandan oluşur. Dilim bu asılmış filamente dayanır ve ACSF dokunun üstünde ve altında akar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: HEC dilimlerinden gelen spontan keskin dalga dalgalanmalarının temsili kayıtları. (A) Kayıt ve stimülasyon elektrotlarının konumlarını gösteren HEC diliminin basitleştirilmiş bir diyagramı. (B) LFP etkinliğinin hem aktif, sağlıklı bir dilimden hem de yetersiz bir dilimden temsili kayıtları. Sağlıklı dilim (solda, yeşil) SP katmanının yerel alan potansiyelinde düzensiz olarak meydana gelen pozitif sapmalar olarak görülebilen büyük uyarılmış alan tepkilerini ve spontan keskin dalga dalgalanmalarını (SWR' ler) gösterir. Buna karşılık, sağlıksız bir dilim küçük uyarılmış alan yanıtları gösterir ve spontan etkinlik yoktur (sağda, gri). (C) SR katmanındaki LFP'de negatif sapma ve SP katmanında LFP'de altta bulunan pozitif sapma ile yüksek frekanslı salınımdan oluşan CA2 bölgesindeki SWR'lerin temsili kayıtları. Sinyal genliğinin üç standart sapmasından büyük her kanaldaki tepeler kırmızı renkle vurgulanır. 2–30 Hz'lik bir bandpass filtresi, SP ve SR katmanındaki keskin dalganın altında kalan pozitif ve negatif zarfı izole ederken, SP katmanındaki dalgalanmanın yüksek frekanslı salınımını izole etmek için 80-250 Hz'lik bir bandpass filtresi kullanılır. (D) TÜP BEBEK, CA2/CA3'ten CA1'e yayılır. Bu temsili kayıtlarda, CA2'deki SWR'ler (yeşil, alt), CA1'de (mavi, üst) birkaç milisaniye önce gelir. Sinyal genliğinin üç standart sapmasından büyük her kanaldaki tepeler kırmızı renkle vurgulanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| moleküler ağırlık (gram / mol) | son konsantrasyon (mM) | gram / 1 L sakkaroz kesme çözeltisi | ||
| Sakaroz | C12H22O11 | 342.3 | 195 | 66.749 |
| sodyum klorür | Nacl | 58.44 | 10 | 0.584 |
| Glikoz | C6H12O6 | 180.08 | 10 | 1.801 |
| sodyum bikarbonat | NaHCO3 | 84.01 | 25 | 2.1 |
| potasyum klorür | Kartal | 74.55 | 2.5 | 0.186 |
| sodyum fosfat monobasik susuz | NaH2PO4 | 137.99 | 1.25 | 0.173 |
| sodyum piruvat | C3H3Nao3 | 110.04 | 2 | 0.22 |
| stok konsantrasyonu (M) | son konsantrasyon (mM) | mililitreler / 1L sakkaroz kesme çözümü | ||
| kalsiyum klorür | CaCl2 | 1 | 0.5 | 0.5 |
| magnezyum klorür | MgCl2 | 1 | 7 | 7 |
Tablo 1: Sakkaroz kesme çözeltisinin bileşimi. İz metalleri ve diğer safsızlıkları gidermek için filtrelenmiş yaklaşık 0,75 L arıtılmış su ile başlayın. Çözeltiyi manyetik bir karıştırma çubuğuyla karıştırırken her katıyı çözün. Tüm katı maddeler çözüldükten sonra, 10 dakika boyunca çözeltiden kabarcık karbojen gazı. MgCl2 ve CaCl2 çözümlerini ekleyin ve toplam hacmi 1 L'ye çıkarmak için su ekleyin. Ozmolarite 315 ila 325 mOsm arasında ve pH yaklaşık 7.4 olmalıdır.
| moleküler ağırlık (gram / mol) | son konsantrasyon (mM) | gram / 2L ACSF | ||
| sodyum klorür | Nacl | 58.44 | 125 | 14.61 |
| Glikoz | C6H12O6 | 180.08 | 12.5 | 4.502 |
| sodyum bikarbonat | NaHCO3 | 84.01 | 25 | 4.201 |
| potasyum klorür | Kartal | 74.55 | 3.5 | 0.522 |
| sodyum fosfat monobasik susuz | NaH2PO4 | 137.99 | 1.25 | 0.345 |
| askorbik asit | C6H8O6 | 176.12 | 1 | 0.352 |
| sodyum piruvat | C3H3Nao3 | 110.04 | 3 | 0.66 |
| stok konsantrasyonu (M) | son konsantrasyon (mM) | mililitreler / 2L ACSF | ||
| kalsiyum klorür | CaCl2 | 1 | 1.6 | 3.2 |
| magnezyum klorür | MgCl2 | 1 | 1.2 | 2.4 |
Tablo 2: Yapay beyin omurilik sıvısının bileşimi. İz metalleri ve diğer safsızlıkları gidermek için filtrelenmiş yaklaşık 1,5 L arıtılmış su ile başlayın. Çözeltiyi manyetik bir karıştırma çubuğuyla karıştırırken her katıyı çözün. Tüm katı maddeler çözüldükten sonra, 10 dakika boyunca çözeltiden kabarcık karbojen gazı. MgCl2 ve CaCl2 çözümlerini ekleyin ve toplam hacmi 2 L'ye getirmek için su ekleyin. Ozmolarite 315 ila 325 mOsm arasında ve pH yaklaşık 7.4 olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Doku sağlığını teşvik etmek ve spontan doğal ağ aktivitesinin ortaya çıkmasını desteklemek için tasarlanmış bu dilimleme protokolünde birkaç adım vardır: fare transkardiyel olarak soğutulmuş sakkaroz kesme çözeltisi ile perfüzyona sahiptir; yatay-entorhinal korteks (HEC) dilimleri ara veya ventral hipokampustan 450 μm kalınlığında kesilir; dilimler ısıtılmış ACSF ve nemlendirilmiş, karbojen bakımından zengin hava arayüzünde iyileşir; kayıt sırasında dilimler ACSF ile 32 ° C'ye ısıtılır ve batık bir kayıt odasında çift yüzeyli süperfüzyon ile hızlı bir akış hızında teslim edilir.
Dilim sağlığı, in vitroağ salınımlarının üretimi için son derece önemlidir. Genç hayvanlar daha sağlıklı dilimler verecektir ve genellikle genç veya ergen farelerde transkardiyal perfüzyon adımı atlanabilir. Hayvanlar yaşlandıkça, sağlıklı dilimler yapmak giderek zorlaşır, ancak bazı araştırmalar (hastalık modelleri veya boyuna çalışmalar gibi) yetişkin veya yaşlanan hayvanların kullanılmasını gerektirir. Örneğin Dengler ve ark., pilokarpin ile tedavi edilen kronik epileptik yetişkin farelerden HEC dilimlerinin hazırlanmasında transkardiyal perfüzyonlar kullandı50. Yetişkin farelerle, dokuyu soğutmak, beyindeki kanı temizlemek ve beyni kafatasından çıkarmadan önce metabolik aktiviteyi azaltmak için soğutulmuş sakkaroz kesme çözeltisi ile transkardiyal perfüzyon yapmak faydalıdır51. Bununla birlikte, transkardiyal perfüzyonların eğitimin doğru bir şekilde yapılmasını gerektirdiğini ve prosedürün hızlı ve hayvan refahı için risk oluşturmayacak şekilde gerçekleştirilmesini sağlamak için dikkatli olunması gerektiğini belirtmek önemlidir. Mümkün olduğunda, transkardiyal perfüzyonların kullanılmasını önlüyor olacak şekilde genç hayvanları kullanmak için deneyler tasarlanmalıdır. Yetersiz dilim preparatında, devam eden ağ salınımlarını desteklemek için özellikle internöronlar olmak üzere yeterli sağlıklı hücre olmayacaktır. Deney sırasında dilim sağlığını değerlendirmek için, ilk olarak çağrıştırılan alan potansiyellerini kaydetmek yararlıdır (örneğin, stratum radiatum, SR'de bir stimülasyon pipeti ve bir kayıt pipeti ile). Sağlıklı bir dilimde, SR tabakasındaki stimülasyon, nispeten küçük bir presynaptik lif volesine sahip büyük bir alan postynaptik potansiyelini (fPSP) çağrıştıracaktır (Şekil 3).
Bu protokol tarafından üretilen dilimler yatay hipokampal-entorhinal korteks (HEC) dilimleridir. Daha da önemlisi, hipokampal dilimlerin SWR'ler gibi ağ aktivitelerini kendiliğinden oluşturması için ne parahippocampal dokunun dahil edilmesi ne de açılı kesim gereklidir. Nitekim, birçok çalışma fizyolojik25,40 , 41,44veya patolojik ağ salınımlarının yönlerini sorgulamak için yatay veya enine hipokampal dilimleri kullanmıştır33,38. Bu protokolde beynin bir agar rampasına yerleştirilmesi, deneycinin ventral veya ara hipokampustan seçici olarak daha fazla dilim üretmesini sağlar (Şekil 1), hipokampus26,31'inboyuna ekseni boyunca var olan fonksiyonel heterojenliği dikkate alan deneysel hedefler için yararlı olabilir. Dilimlerin anatomik kökeni bir faktör değilse, agar rampası hariç tutulabilir ve gerçek bir yatay kesme düzlemi orta-ventral hipokampüsün dilimlerini verecektir. Her yatay doku dilimi serbest bırakıldıkça, dilimin çoğu yabancı kısımları üç basit kesikle çıkarılabilir ve hipokampus ve parahippocampal bölge de dahil olmak üzere bazı çevre dokuyu içeren kabaca dikdörtgen bir dilim bırakılır (Şekil 1). Tüm ekstrahippocampal dokuları çıkarmak için daha fazla diseksiyon yapılabilir, ancak dilim arpın kolayca yerleştirilebilmesi için çevredeki dokunun dahil edilmesi faydalıdır, böylece naylon filamentler hipokampus boyunca uygun şekilde dinlenmez. Yukarıda tartışıldığı gibi, kombine HEC dilimi aynı zamanda fizyolojik 37 veya patolojik16,35 , 36 ,38 ağ salınımları bağlamında daha büyük bir corticohippocampal ağı araştırmak için yararlı bir preparattır.
Bu protokoldeki temel faktör, hem iyileşme aşamasında hem de kayıtlar sırasında dokuya oksijen akışını optimize etmektir. Ağ salınımlarının birçok çalışması, doğrudan mikrotomdan bir arayüz kayıt odasına aktarılan ve taze ACSF'nin sürekli perfüzyonu ile iyileşmesine izin verilen dilimler halinde gerçekleştirilir. Birkaç saatlik kurtarma işleminden sonra, kayıtlar aynı arabirim odasında gerçekleştirilebilir. Böylece, dilimler deneyin tüm süresi boyunca ACSF ve nemli karbojen bakımından zengin hava arayüzünde tutulur. Bu protokolde sunulan alternatif metodolojide, dilimler, tek tek dilimler yeterince hızlı ACSF akış hızlarına sahip batık stilli bir kayıt odasına aktarılmadan önce en az iki saat boyunca arabirim stili bir tutma odasında kurtarılır. Bu koşullar altında hazırlanan dilimler kararlı gama salınımları12 veya spontan SWR aktivitesi43. Arayüz tarzı bir tutma odasında dilim kurtarma kritik bir adımdır: Maier ve arkadaşları, ACSF'ye tamamen batırılmış bir beherde iyileşen dilimlerin daha küçük uyarılmış alan potansiyelleri, daha az sıklıkta spontan postynaptik akımlar sergilediğini ve sadece nadiren spontan ağ aktivitesi ürettiğini göstermiştir43. Benzer şekilde, Hájos ve ark. hızlı ACSF akış hızlarının spontan inhibitör postynaptik akımların daha yüksek bir frekansına neden olduğunu göstererek, internöronal aktivitenin arttığını düşündürmektedir49. Kayıt süresi boyunca, kayıt odasının hızlı bir akış hızında (en az 6 mL / dk)43teslim edilen nispeten küçük bir ACSF hacmine sahip olması koşuluyla, çift yüzeyli süperfüzyon kesinlikle gerekli değildir. Bu protokolde sunulan 3D baskılı kayıt odası (Şekil 2B) nispeten uygun maliyetli ve basit bir seçenektir, ancak daha küçük hacimleri tutmak, ortamın laminer akışını teşvik etmek veya çift yüzeyli süperfüzyon sağlamak için tasarlanmış ticari olarak kullanılabilir sualtı kayıt odaları da vardır (örneğin, aşırı ölü ACSF hacmine izin veren dairesel kayıt odalarının aksine).
Bu protokol, geleneksel bir arabirim kayıt odası gereksinimi olmadan ağ salınımlarını kaydetmeye izin verirken, birkaç sınırlama vardır. Dilimler kurtarma süresi boyunca ACSF-hava arayüzünde tutulsa da, geleneksel Haas tarzı arayüz kayıt odalarında olduğu gibi sürekli taze ortam perfüzyonu almazlar. Dilimler, kurtarma odasından su altında kalan kayıt odasına ayrı ayrı (ince forseps kullanılarak) aktarılmalıdır. Ayrıca, hızlı akış hızları, özellikle ACSF peristaltik bir pompa ile teslim edilirse, bazı kayıtlar için sorunlu kararsızlığa ve hareket yapıtlarına neden olabilir. Hızlı akış hızlarını korumak ve mekanik bozuklukları en aza indirmek için, basit bir titreşim sönümleyici perfüzyon sistemine entegre edilebilir(Şekil 2). Bu titreşim sönümleyici Windkessel etkisikullanılarak çalışır 52Boş şırınnaların elastik rezervuar görevi gören hava cepleri içerdiği, peristaltik pompanın silindirleri tarafından üretilen dalgalı basıncı emdiği53. Bununla birlikte, bir darbe sönümleyicinin dahil olması, kayıt odasına ACSF sağlayan boruya uzunluk ekleyebilir ve oksijen kaynağını dilime etkileyebilir. Akış hızları sadece kararlı ağ salınımları sağlamak için gerektiği kadar hızlı olmalıdır ve peristaltik bir pompa kullanılırsa, peristalsis'in neden olduğu titreşimi en aza indirmek, titreşim sönümleyici kullanımını önlemek ve kayıt odasına ACSF sağlayan borunun mümkün olduğunca kısa olmasını sağlamak için çok sayıda silindir (> 12) kullanan bir pompa olmalıdır. Hızlı akış hızları ile gerçekleştirilen kayıtlar, deneylerin medyaya değerli veya pahalı ilaçların veya bileşiklerin eklenmesini gerektiriyorsa sorunlu olabilecek büyük hacimlerde ACSF gerektirir. Çift yüzeyli bir süperfüzyon odası, dilimin her iki tarafına oksijenli ortam sağlamak için iki sıvı girişine sahip özel olarak inşa edilmiş bir kayıt odası gerektirse de, orta derecede ACSF akış hızları48ile spontan ağ salınımları gözlenebilir. Bu protokol, spontan aktiviteyi gözlemleme olasılığını artırmak için hem hızlı bir akış hızı (titreşim sönümleyici ile stabilize edilmiş) hem de çift yüzeyli bir süperfüzyon odası kullanır.
Son olarak, bu protokol hayvan başına üretilen dilim sayısı açısından düşük bir verime sahiptir. 450 μm kalınlığında yatay dilimleme, tercih edilen yönde az sayıda HEC dilimi verir (dilimin hipokampüsün enine eksenine etkili bir şekilde paralel olduğu). Bu dilimlerden, tipik olarak, hipokampi başına sadece bir veya iki spontan SWR aktivitesi sergiler, başka bir yerde bildirilenden daha az43. Daha kalın dilimler muhtemelen daha yüksek derecede tekrarlayan bağlantı içerse de, biraz daha ince dilimlerin (400 μm) kesilmesi, SWR etkinliği ile enine yönelimli dilimlerin faresi başına daha fazla sayıda sonuç verebilir. Ek olarak, ventral hipokampüsün gerçek yatay veya aşağı açılı dilimlerini kullanan deneylerde birden fazla dilimin güvenilir bir şekilde spontan SWR aktivitesi sergileme olasılığı daha yüksek olabilir. Mevcut protokol, ventral hipokampus25,26,31'dendilimlere kıyasla spontan ağ aktivitesi sergileme olasılığı daha düşük olabilecek ara hipokampüsün yukarı açılı yatay dilimlerinin kullanımını içerir. Son olarak, bu protokol ergen ve yetişkin farelerden dilimler kullandı. Transkardiyal perfüzyonlar yaşlı hayvanlardan dilimlerin kalitesini artırabilirken, spontan ağ aktivitelerini gözlemleme olasılığı, genç hayvanlardan dilimlerin kullanılmasıyla artabilir12,41,44.
Özetle, bu protokol, keskin dalga dalgalanması kompleksleri şeklinde karmaşık spontan ağ aktivitesi gösterebilen ara veya ventral hipokampal formasyondan açılı yatay hipokampal-entorhinal korteks dilimleri veren bir fare beyni dilimleme yaklaşımı sunar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarın açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazar, Steve Siegelbaum'a destek için teşekkür eder. Finansman 5R01NS106983-02 ve 1 F31 NS113466-01 tarafından sağlanmaktadır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Lulzbot | LulzBot TAZ 6 | |
| Acute brain slice incubation holder | NIH 3D Print Exchange | 3DPX-001623 | Designed by ChiaMing Lee, available at https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623 |
| Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma Aldrich | A9187-500MG | |
| Ag-Cl ground pellets | Warner | 64-1309, (E205) | |
| agar | Becton, Dickinson | 214530-500g | |
| ascorbic acid | Alfa Aesar | 36237 | |
| beaker (250 mL) | Kimax | 14000-250 | |
| beaker (400 mL) | Kimax | 14000-400 | |
| biocytin | Sigma Aldrich | B4261 | |
| blender | Oster | BRLY07-B00-NP0 | |
| Bonn scissors, small | becton, Dickinson | 14184-09 | |
| borosilicate glass capillaries with filament (O.D. 1.5 mm, I.D. 0.86 mm, length 10 cm) | Sutter Instruments | BF150-86-10HP | Fire polished capillaries are preferable. |
| calcium chloride solution (1 M) | G-Biosciences | R040 | |
| camera | Olympus | OLY-150 | |
| compressed carbogen gas (95% oxygen / 5% carbon dioxide) | Airgas | X02OX95C2003102 | |
| compressed oxygen | Airgas | OX 200 | |
| constant voltage isolated stimulator | Digitimer Ltd. | DS2A-Mk.II | |
| coverslips (22x50 mm) | VWR | 16004-314 | |
| cyanoacrylate adhesive | Krazy Glue | KG925 | Ideally use the brush-on form for precision |
| data acquisition software | Axograph | N/A | Any equivalent software (e.g. pClamp) would work. |
| Dell Precision T1500 Tower Workstation Desktop | Dell | N/A | Catalog number will depend on specific computer - any computer will work as long as it can run electrophysiology acquisition software. |
| Digidata 1440A | Molecular Devices | 1-2950-0367 | |
| digital timer | VWR | 62344-641 | 4-channel Traceable timer |
| disposable absorbant pads | VWR | 56616-018 | |
| dissector scissors | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| double-edge razor blades | Personna | BP9020 | |
| dual automatic temperature controller | Warner Instrument Corporation | TC-344B | |
| dual-surface or laminar-flow optimized recording chamber | N/A | N/A | The chamber presented in this protocol is custom made. A commercial equivalent would be the RC-27L from Warner Instruments. |
| equipment rack | Automate Scientific | FR-EQ70" | A rack is not strictly necessary but useful for organizing electrophysiology |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethyiether)- N,N,N',N'-teetraacetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | 324626-25GM | |
| filter paper | Whatman | 1004 070 | |
| fine scale | Mettler Toledo | XS204DR | |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| glass petri dish (100 x 15 mm) | Corning | 3160-101 | |
| glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G8877-250MG | |
| ice buckets | Sigma Aldrich | BAM168072002-1EA | |
| isoflurane vaporizer | General Anesthetic Services | Tec 3 | |
| lab tape | Fisher Scientific | 15-901-10R | |
| lens paper | Fisher Scientific | 11-996 | |
| light source | Olympus | TH4-100 | |
| magnesium chloride solution (1 M) | Quality Biological | 351-033-721EA | |
| magnetic stir bars | Fisher Scientific | 14-513-56 | Catalog number will be dependent on the size of the stir bar. |
| micromanipulator | Luigs & Neumann | SM-5 | |
| micromanipulator (manual) | Scientifica | LBM-2000-00 | |
| microscope | Olympus | BX51WI | |
| microspatula | Fine Science Tools | 10089-11 | |
| monitor | Dell | 2007FPb | |
| MultiClamp 700B Microelectrode Amplifier | Molecular Devices | MULTICLAMP 700B | The MultiClamp 700B should include headstages, pipette holders, and a model cell. |
| N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), (HEPES) | Sigma Aldrich | H3375-25G | |
| needle (20 gauge, 1.5 in length) | Becton, Dickinson | 305176 | |
| nylon filament | YLI Wonder Invisible Thread | 212-15-004 | size 0.004. This cat. # is from Amazon.com |
| nylon mesh | Warner Instruments Corporation | 64-0198 | |
| perstaltic pump | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
| Phosphocreatine di(tris) salt | Sigma Aldrich | P1937-1G | |
| pipette holders | Molecular Devices | 1-HL-U | |
| platinum wire | World Precision | PT0203 | |
| polylactic acid (PLA) filament | Ultimaker | RAL 9010 | |
| potassium chloride | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| potassium gluconate | Sigma Aldrich | 1550001-200MG | |
| potassium hydroxide | Sigma Aldrich | 60377-1KG | |
| razor blades | VWR | 55411-050 | |
| roller clamp | World Precision Instruments | 14041 | |
| scale | Mettler Toledo | PM2000 | |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| slice harp | Warner | SHD-26GH/2 | |
| sodium bicarbonate | Fisher Chemical | S233-500 | |
| sodium chloride | Sigma Aldrich | S9888-1KG | |
| sodium phosphate monobasic anhydrous | Fisher Chemical | S369-500 | |
| sodium pyruvate | Fisher Chemical | BP356-100 | |
| spatula | VWR | 82027-520 | |
| spatula/spoon, large | VWR | 470149-442 | |
| sterile scalpel blades | Feather | 72044-10 | |
| stirrer / hot plate | Corning | 6795-220 | |
| stopcock valves, 1-way | World Precision Instruments | 14054 | |
| stopcock valves, 3-way | World Precision Instruments | 14036 | |
| sucrose | Acros Organics | AC177142500 | |
| support for swivel clamps | Fisher Scientific | 14-679Q | |
| surgical scissors, sharp/blunt | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| syringe (1 mL) | Becton, Dickinson | 309659 | |
| syringe (60 mL with Luer-Lok tip) | Becton, Dickinson | 309653 | |
| three-pronged clamp | Fisher Scientific | 05-769-8Q | |
| tissue forceps, large | Fine Science Tools | 11021-15 | |
| tissue forceps, small | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| tubing | Tygon | E-3603 | ID 1/16 inch, OD 3/16 inch |
| tubing | Tygon | R-3603 | ID 1/8 inch, OD 1/4 inch |
| vacuum grease | Dow Corning | 14-635-5D | |
| vibrating blade microtome | Leica | VT 1200S | |
| vibration-dampening table with faraday cage | Micro-G / TMC-ametek | 2536-516-4-30PE | |
| volumetric flask (1 L) | Kimax | KIM-28014-1000 | |
| volumetric flask (2 L) | PYREX | 65640-2000 | |
| warm water bath | VWR | 1209 |
References
- Buzsáki, G., Lai-Wo, S., Vanderwolf, C. H. Cellular bases of hippocampal EEG in the behaving rat. Brain Research Reviews. 6, 139-171 (1983).
- Buzsáki, G. Hippocampal sharp waves: Their origin and significance. Brain Research. 398, 242-253 (1986).
- Buzsáki, G., Horváth, Z., Urioste, R., Hetke, J., Wise, K.
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents — EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews Neuroscience. 13, 407-420 (2012).
- Buzsáki, G. Hippocampal sharp wave-ripple: A cognitive biomarker for episodic memory and planning. Hippocampus. 25, 1073 (2015).
- Maier, N., et al. Reduction of high-frequency network oscillations (ripples) and pathological network discharges in hippocampal slices from connexin 36-deficient mice. Journal of Physiology. 541, 521-528 (2002).
- Maier, N., Nimmrich, V., Draguhn, A. Cellular and network mechanisms underlying spontaneous sharp wave-ripple complexes in mouse hippocampal slices. Journal of Physiology. 550, 873-887 (2003).
- ul Haq, R., et al. Adrenergic modulation of sharp wave-ripple activity in rat hippocampal slices. Hippocampus. 22, 516-533 (2012).
- ul Haq, R., et al. Serotonin dependent masking of hippocampal sharp wave ripples. Neuropharmacology. 101, 188-203 (2016).
- Maier, P., Kaiser, M. E., Grinevich, V., Draguhn, A., Both, M. Differential effects of oxytocin on mouse hippocampal oscillations in vitro. European Journal of Neuroscience. 44, 2885-2898 (2016).
- Mizunuma, M., et al. Unbalanced excitability underlies offline reactivation of behaviorally activated neurons. Nature Neuroscience. 17, 503-505 (2014).
- Hájos, N., et al. Spike timing of distinct types of GABAergic interneuron during hippocampal gamma oscillations in vitro. Journal of Neuroscience. 24, 9127-9137 (2004).
- Geschwill, P., et al. Synchronicity of excitatory inputs drives hippocampal networks to distinct oscillatory patterns. Hippocampus. , (2020).
- Rutecki, P. A., Grossmann, R. G., Armstrong, D., Irish-Loewen, S. Electrophysiological connections between the hippocampus and entorhinal cortex in patients with complex partial seizures. Journal of Neurosurgery. 70, 667-675 (1989).
- Lothman, E. W., Bertram, E. H., Stringer, J. L.
- Carter, D. S., Deshpande, L. S., Rafiq, A., Sombati, S., Delorenzo, R. J. Characterization of spontaneous recurrent epileptiform discharges in hippocampal - cortical slices prepared from chronic epileptic animals. Seizure: European Journal of Epilepsy. 20, 218-224 (2011).
- Karlócai, M. R., et al. Physiological sharp wave-ripples and interictal events in vitro: What's the difference. Brain. 137, 463-485 (2014).
- Leroy, F., et al. Input-timing-dependent plasticity in the hippocampal CA2 region and its potential role in social memory. Neuron. 95, 1089-1102 (2017).
- Sun, Q., et al. Proximodistal heterogeneity of hippocampal CA3 pyramidal neuron intrinsic properties, connectivity, and reactivation during memory recall. Neuron. 95, 656-672 (2017).
- Masurkar, A. V., et al. Medial and lateral entorhinal cortex differentially excite deep versus superficial CA1 pyramidal neurons. Cell Reports. 18, 1-13 (2017).
- Papatheodoropoulos, C., Kostopoulos, G. Spontaneous, low frequency (∼2-3 Hz) field activity generated in rat ventral hippocampal slices perfused with normal medium. Brain Research Bulletin. 57, 187-193 (2002).
- Papatheodoropoulos, C., Kostopoulos, G. Spontaneous GABAA-dependent synchronous periodic activity in adult rat ventral hippocampal slices. Neuroscience Letters. 319, 17-20 (2002).
- Kubota, D., Colgin, L. L., Casale, M., Brucher, F. A., Lynch, G.
- Behrens, C. J., Van Den Boom, L. P., De Hoz, L., Friedman, A., Heinemann, U. Induction of sharp wave - complexes in vitro and reorganization of hippocampal networks. Nature Neuroscience. 8, 1560-1567 (2005).
- Kouvaros, S., Papatheodoropoulos, C. Prominent differences in sharp waves, ripples and complex spike bursts between the dorsal and the ventral rat hippocampus. Neuroscience. 352, 131-143 (2017).
- Strange, B. A., Witter, M. P., Lein, E. S., Moser, E. I. Functional organization of the hippocampal longitudinal axis. Nature Reviews Neuroscience. 15, 655-669 (2014).
- Patel, J., Fujisawa, S., Berényi, A., Royer, S., Buzsáki, G. Traveling Theta Waves along the Entire Septotemporal Axis of the Hippocampus. Neuron. 75, 410-417 (2012).
- Patel, J., Schomburg, E. W., Berényi, A., Fujisawa, S., Buzsáki, G. Local generation and propagation of ripples along the septotemporal axis of the hippocampus. Journal of Neuroscience. 33, 17029-17041 (2013).
- Fricke, R., Cowan, W. M. An autoradiographic study of the commissural and ipsilateral hippocampo-dentate projections in the adult rat. Journal of Comparative Neurology. 181, 253-269 (1978).
- Ishizuka, N. O. R., Weber, J., Amaral, D. G. Organization of intrahippocampal projections originating from CA3 pyramidal cells in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 623, 580-623 (1990).
- Papatheodoropoulos, C. Electrophysiological evidence for long-axis intrinsic diversification of the hippocampus. Frontiers in Bioscience - Landmark. 23, 109-145 (2018).
- Gilbert, M., Racine, R. J., Smith, G. K. Epileptiform burst responses in ventral vs dorsal hippocampal slices. Brain Research. 361, 389-391 (1985).
- Papatheodoropoulos, C., Moschovos, C., Kostopoulos, G. Greater contribution of N-methyl-D-aspartic acid receptors in ventral compared to dorsal hippocampal slices in the expression and long-term maintenance of epileptiform activity. Neuroscience. 135, 765-779 (2005).
- Jones, R. S. G., Heinemann, U. Synaptic and intrinsic responses of medial entorhinal cortical cells in normal and magnesium-free medium in vitro. Journal of Neurophysiology. 59, (1988).
- Rafiq, A., Delorenzo, R. J., Coulter, D. A. Generation and propagation of epileptiform discharges in a combined entorhinal cortex / hippocampal slice. Journal of Neurophysiology. 70, 1962-1974 (1993).
- Stoop, R., Pralong, E. Functional connections and epileptic spread between hippocampus, entorhinal cortex and amygdala in a modified horizontal slice preparation of the rat brain. European Journal of Neuroscience. 12, 3651-3663 (2000).
- Roth, F. C., Beyer, K. M., Both, M., Draguhn, A., Egorov, A. V. Downstream effects of hippocampal sharp wave ripple oscillations on medial entorhinal cortex layer V neurons in vitro. Hippocampus. 26, 1493-1508 (2016).
- Bertsche, A., Bruehl, C., Pietz, J., Draguhn, A. Region- and pattern-specific effects of glutamate uptake blockers on epileptiform activity in rat brain slices. Epilepsy Research. 88, 118-126 (2010).
- Wu, C., Shen, H., Luk, W. P., Zhang, L. A fundamental oscillatory state of isolated rodent hippocampus. Journal of Physiology. 540, 509-527 (2002).
- Colgin, L. L., Jia, Y., Sabatier, J. M., Lynch, G. Blockade of NMDA receptors enhances spontaneous sharp waves in rat hippocampal slices. Neuroscience Letters. 385, 46-51 (2005).
- Ellender, T. J., Nissen, W., Colgin, L. L., Mann, E. O., Paulsen, O. Priming of hippocampal population bursts by individual perisomatic-targeting interneurons. The Journal of Neuroscience. 30, 5979-5991 (2010).
- Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. A. Comparison of different slicing planes in preservation of major hippocampal pathway fibers in the mouse. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 1-17 (2017).
- Maier, N., Morris, G., Johenning, F. W., Schmitz, D. An approach for reliably investigating hippocampal sharp wave-ripples in vitro. PLoS One. 4, 6925 (2009).
- Schlingloff, D., Kali, S., Freund, T. F., Hajos, N., Gulyas, A. I. Mechanisms of sharp wave initiation and ripple generation. Journal of Neuroscience. 34, 11385-11398 (2014).
- McCloskey, D. P., Scharfman, H. E. Progressive, potassium-sensitive epileptiform activity in hippocampal area CA3 of pilocarpine-treated rats with recurrent seizures. Epilepsy Research. 97, 92-102 (2011).
- McMahon, L. L., Williams, J. H., Kauer, J. A. Functionally distinct groups of interneurons identified during rhythmic carbachol oscillations in hippocampus in vitro. Journal of Neuroscience. 18, 5640-5651 (1998).
- Pöschel, B., Heinemann, U., Draguhn, A. High frequency oscillations in the dentate gyrus of rat hippocampal slices induced by tetanic stimulation. Brain Research. 959, 320-327 (2003).
- Hájos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. European Journal of Neuroscience. 29, 319-327 (2009).
- Hájos, N., Mody, I. Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content. Journal of Neuroscience Methods. 183, 107-113 (2009).
- Dengler, C. G., Yue, C., Takano, H., Coulter, D. A. Massively augmented hippocampal dentate granule cell activation accompanies epilepsy development. Nature Publishing Group. , 1-17 (2017).
- Ting, J. T., et al. Preparation of acute brain slices using an optimized N -methyl-D-glucamine protective recovery method. Journal of Visualized Experiments. 132, 1-13 (2018).
- Westerhof, N., Lankhaar, J. W., Westerhof, B. E.
- Shi, W. X., Bunney, B. S. A small volume chamber for electrical recording from submerged brain slices and a pulse-free medium supply system using a peristalic pump. Journal of Neuroscience Methods. 35, 235-240 (1990).
