Summary
وقد تم تطوير البروتوكول لاستخراج فعال histones سليمة من مواد أوراق الذرة الرفيعة لتحديد ملامح التعديلات اللاحقة الهيستون التي يمكن أن تكون بمثابة علامات اللاجينية المحتملة للمساعدة في هندسة المحاصيل المقاومة للجفاف.
Abstract
تنتمي Histones إلى عائلة من البروتينات المحفوظة للغاية في eukaryotes. أنها حزمة الحمض النووي في نيوكلوزومات وحدات وظيفية من الكروماتين. إن التعديلات اللاحقة للترجمة (PTMs) من الهستونات، التي تتسم بديناميكية عالية ويمكن إضافتها أو إزالتها بواسطة الإنزيمات، تلعب أدوارًا حاسمة في تنظيم التعبير الجيني. في النباتات، ترتبط العوامل اللاجينية، بما في ذلك PTMs هيستون، باستجاباتها التكيفية للبيئة. يمكن أن يؤدي فهم الآليات الجزيئية للتحكم في اللاجينية إلى توفير فرص غير مسبوقة لحلول الهندسة الحيوية المبتكرة. هنا، نحن وصف بروتوكول لعزل النوى وتنقية histones من أنسجة ورقة الذرة الرفيعة. يمكن تحليل الهستونات المستخرجة في أشكالها سليمة من خلال قياس الطيف الكتلي (MS) من أعلى إلى أسفل إلى جانب الكروماتوغرافيا السائلة (LC) على الإنترنت مع عكس المرحلة (RP). يمكن بسهولة تحديد تركيبات و قياس التشنج من PTMs متعددة على نفس بروتيوفورم الحجر. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الكشف عن قطع ذيل هيستون باستخدام سير العمل LC-MS من أعلى إلى أسفل، وبالتالي، مما يؤدي إلى التشكيل الجانبي PTM العالمي من الهستونات الأساسية (H4، H2A، H2B، H3). لقد طبقنا هذا البروتوكول في السابق على تعريف HISTONE PTMs من أنسجة أوراق الذرة الرفيعة التي تم جمعها من دراسة ميدانية واسعة النطاق ، تهدف إلى تحديد العلامات اللاجينية لمقاومة الجفاف. ويمكن تكييف البروتوكول وتحسينه لتسلسل التسلسل المناعي للكروماتين (ChIP-eq)، أو لدراسة PTMs هيستون في النباتات المماثلة.
Introduction
ومن المتوقع أن تؤثر شدة وتواتر الجفاف المتزايد على إنتاجية محاصيل الحبوب1،2. الذرة الرفيعة هي محصول من الحبوب الغذائية والطاقة معروف بقدرته الاستثنائية على تحمل الظروف التي تحد من المياه3،4. نحن نسعى لفهم ميكانيكي للتفاعل بين الإجهاد الجفاف، والتنمية النباتية، وعلم الوراثة من الذرة الرفيعة[الذرة الرفيعة ثنائية الألوان (L.) Moench). وقد أظهرت أعمالنا السابقة صلات قوية بين النبات وrizosphere الميكروبيوم في التغلب على الجفاف والاستجابات على المستوى الجزيئي5،6،7. وسيمهد هذا البحث الطريق لاستخدام الهندسة اللاجينية في تكييف المحاصيل مع سيناريوهات المناخ في المستقبل. كجزء من الجهود المبذولة لفهم علم الوراثة اللاجينية، نهدف إلى دراسة علامات البروتين التي تؤثر على التعبير الجيني داخل الكائن النباتي.
تنتمي Histones إلى عائلة عالية الحفظ من البروتينات في نوى النياريوتيات التي تحزم الحمض النووي في النويات كوحدات أساسية من الكروماتين. يتم تنظيم التعديلات اللاحقة لترجمات (PTMs) من الهستونات بشكل ديناميكي للتحكم في بنية الكروماتين والتأثير على التعبير الجيني. مثل غيرها من العوامل اللاجينية، بما في ذلك ال DNA methylation، PTMs هيستون تلعب أدوارا هامة في العديد من العمليات البيولوجية8،9. وقد استخدمت على نطاق واسع المقايسات المضادة المستندة إلى مثل البقع الغربية لتحديد وقياس PTMs histone. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون التفاعل بين PTMs histone والحمض النووي بحث فعال من قبل كروماتين المناعي – تسلسل (ChIP-eq)10. في ChIP-seq، يتم إثراء الكروماتين مع محددة المستهدفة هيستون PTM من قبل الأجسام المضادة ضد PTM محددة. ثم، يمكن أن تتحرر شظايا الحمض النووي من الكروماتين المخصب وتسلسل. يتم الكشف عن مناطق الجينات التي تتفاعل مع PTM هيستون المستهدفة. ومع ذلك، تعتمد جميع هذه التجارب بشكل كبير على الأجسام المضادة عالية الجودة. بالنسبة لبعض المتغيرات هيستون / homologs أو مجموعات من PTMs ، يمكن أن يكون تطوير الأجسام المضادة القوية صعبة للغاية (خاصة بالنسبة لـ PTMs متعددة). بالإضافة إلى ذلك، يمكن تطوير الأجسام المضادة فقط إذا كان من المعروف PTM هيستون المستهدفة. 11 ولذلك، من الضروري إيجاد طرق بديلة لأساليب غير مستهدفة، والتنميط العالمي لـ HISTONE PTMs.
قياس الطيف الكتلي (MS) هو طريقة تكميلية لتوصيف PTMs histone ، بما في ذلك PTMs غير معروف التي الأجسام المضادة غير متوفرة11،12. يستخدم سير عمل MS "من أسفل إلى أعلى" الراسخة البروتيازات لهضم البروتينات إلى ببتيدات صغيرة قبل فصل الكروماتوغرافيا السائلة (LC) والكشف عن التصلب المتعدد. لأن histones لديها أعداد كبيرة من المخلفات الأساسية (ليسين والأرجينين)، والهضم التربسين (البروتياز محددة لايسين والأرجينين) في سير العمل من أسفل إلى أعلى القياسية تخفيضات البروتينات في الببتيدات قصيرة جدا. الببتيدات القصيرة يصعب تحليلها من الناحية الفنية بواسطة LC-MS القياسية، ولا تحافظ على المعلومات حول الاتصال والقياس الرصين لـ PTMs متعددة. استخدام الإنزيمات الأخرى أو وضع العلامات الكيميائية لمنع lysines يولد الببتيدات الأطول التي هي أكثر ملاءمة لتوصيف PTMs هيستون13,14.
بدلا من ذلك، يمكن حذف خطوة الهضم تماما. في هذا النهج "من أعلى إلى أسفل"، يتم إدخال أيونات البروتين سليمة في التصلب العصبي المتعدد عن طريق التأين الكهربائي (ESI) بعد فصل LC على الانترنت، مما أسفر عن أيونات من بروتيوفورم هيستون سليمة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن عزل الأيونات (أي بروتيوفورمات) ذات الأهمية وتفتيتها في مطياف الكتلة لتسفر عن أيونات التسلسل لتحديد الهوية وتوطين PTM. ومن ثم، فإن MS من أعلى إلى أسفل لديه ميزة للحفاظ على المعلومات على مستوى البروتيفورم والتقاط الاتصال متعددة PTMs والقتابات الطرفية على نفس البروتيوفورم15،16. ويمكن أيضا أن توفر التجارب من أعلى إلى أسفل معلومات كمية وتقديم رؤى من المؤشرات الحيوية في مستوى البروتين سليمة17. هنا، ونحن وصف بروتوكول لاستخراج هيستون من ورقة الذرة البيضاء وتحليل histones سليمة من أعلى إلى أسفل LC-MS.
والبيانات التي تظهر في الشكل 1 والشكل 2 هي من أوراق الذرة الرفيعة التي تم جمعها في الأسبوع الثاني بعد الزراعة. على الرغم من توقع اختلاف العائد، فإن هذا البروتوكول غير ملحد لظروف عينة محددة. وقد تم استخدام البروتوكول نفسه بنجاح لالأنسجة نبات الذرة الرفيعة التي تم جمعها من 2، 3، 5، 8، 9، و 10 أسابيع بعد زرع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد مادة أوراق الذرة الرفيعة
ملاحظة: تزرع نباتات الذرة الرفيعة في التربة في الحقل في بارلييه، كاليفورنيا.
- جمع أوراق الذرة الرفيعة من النباتات في أنابيب أجهزة الطرد المركزي 50 مل وتجميد الأنبوب فورا في النيتروجين السائل. جمع الأنسجة ورقة من قبل تمزيق قبالة ورقة الثالث والرابع ظهرت تماما من الحرث الابتدائي.
ملاحظة: يمكن العثور على مزيد من التفاصيل عن حالة الحقل ونمو العينة و المجموعة في التقرير المنشور18. - طحن يترك مع النيتروجين السائل ونقلها على الفور إلى أنبوب الطرد المركزي.
- تخزين ورقة الأرض في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. اتخاذ حوالي 4 غرام من مسحوق ورقة البرد الأرض لتحليل هيستون لكل عينة.
2. إعداد المخازن المؤقتة والمواد (3-4 ساعة)
ملاحظة: يمكن إجراء حلول الأسهم تركيز عالية في وقت مسبق وتخزينها حتى استخدامها. ولكن يجب أن تكون جميع المخازن المؤقتة العاملة طازجة في يوم الاستخراج (عن طريق التخفيف من المخزون والاختلاط مع المحتويات الأخرى) وأن توضع على الجليد أثناء العملية. وينبغي أن يتم تنفيذ التجربة بأكملها عند 4 درجات مئوية ما لم يوصَ بخلاف ذلك.
- إعداد 2.5 M السكروز عن طريق حل 42.8 غرام من السكروز (342.30 غرام / مول) في 15 مل من الماء المعقم على لوحة الحرارة في وعاء زجاجي مع اثارة مستمرة. إحضار ما يصل إلى حجم 50 مل مرة واحدة السكروز قد حلت تماما. تخزين السكروز في 4 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- إعداد 1 M تريس pH 8 عن طريق حل 1.576 غرام من تريس HCl في 10 مل من H2O في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. اضبط درجة الـ PH مع NaOH إلى 8 وتحقق مع ورق درجة اله PH. تخزينها عند 4 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- إعداد 1 م ديثيوثريل (DTT) عن طريق وزنها 231 ملغ من DTT (154.25 غرام /مول) وتذويبه في 1.5 مل من الماء المعقم. يجب أن يكون DTT الطازجة أو استخدام aliquots المجمدة المخزنة.
- (اختياري) إعداد مثبطات إضافية عن طريق خلط ثلاثة أملاح مختلفة. إعداد 18.38 ملغ من orthovanadate الصوديوم (183.91 ز /مول) في 1 مل من الماء المعقم، ثم إعداد بوتيرات الصوديوم بشكل منفصل عن طريق إضافة 11.008 ملغ من بوتيرات الصوديوم (110.09 ز/مول) في 1 مل من الماء المعقم. إعداد الملح النهائي بإضافة 4.199 ملغ من فلوريد الصوديوم (41.99 غ/مول) في 1 مل من الماء. مزيج من ثلاثة محالل معا في حجم متساو كما حل الأسهم ل "مثبطات إضافية" (33 mM من كل من المواد الكيميائية الثلاث).
ملاحظة: الصوديوم فانادايت البلمرة بتركيزات أعلى من 0.1 mM تحت درجة الH محايدة. وينصح لتنشيط فانادات الصوديوم لdpolymerize ذلك لأقصى قدر من الفعالية بعد نشر البروتوكولات19. بدلا من ذلك، فانادات الصوديوم المنشط هو متاح تجاريا. هنا، لم يتم تنشيط فانادات الصوديوم عمدا، وبالتالي فإن فعالية لا تحصل على تخفيض. لم يتم اختبار فانادات الصوديوم المنشط لهذا البروتوكول حتى الآن. - إعداد 1 م من MgCl2 عن طريق حل 0.952 غرام من كلوريد المغنيسيوم اللامائية (95.2 غرام /مول) في 10 مل من H2O في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. تخزين 1 M MgCl2 في 4 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- إعداد 10٪ (v/v) تريتون X-100 عن طريق خلط 53.5 غرام من تريتون X-100 مع 35 مل من الماء المعقم، وجلب ما يصل إلى 50 مل مع الماء وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد 5٪ Guanidine العازلة pH7 (المشار إليها باسم "Gdn العازلة") التي سيتم استخدامها لشرط الراتنج على الأقل بين عشية وضحاها – إعداد 0.1 M فوسفات البوتاسيوم ديباسيك الهيدروجين (K2HPO4)عن طريق وزنها 870 ملغ من K2HPO4 والذوبان في 50 مل من الماء المعقم وتخزينها في 4 درجة مئوية.
- تزن 0.7 غرام من هيدروكلوريد غوانيدين وتذوب في 0.1 M K2HPO4 إلى حجم النهائي من 14 مل. ضبط درجة اله إلى 7 عن طريق التحقق مع ورقة درجة اله pH.
- نقع ال تجفيف الزنخة الزند تبادل (WCX) الراتنج في 5٪ Guanidine العازلة pH 7 بين عشية وضحاها. إزالة supernatant وإعادة ملء مع عازلة Gdn 5٪ الطازجة ونقع مرة أخرى بين عشية وضحاها للسماح للراتنج اتزان تماما (حتى ينبت لديه نفس pH كما المخزن الأصلي).
- قبل البدء في التجربة في القسم التالي، قم بخلط الكواشف لجعل مخزن EB1 و EB2A و EB2B مستندًا إلى الجدول 1. إضافة جميع مثبطات وDTT الطازجة قبل الاستخدام.
| الكواشف | تركيز المخزون | EB1 | EB2A | EB2B |
| حجم الصوت (مل) | حجم الصوت (مل) | حجم الصوت (مل) | ||
| السكروز | 2.5 مليون | 4.4 | 1.25 | 0.5 |
| تريس HCl pH8 | 1M | 0.25 | 0.125 | 0.05 |
| DTT | 1M | 0.125 | 0.0625 | 0.025 |
| H2O | 20.225 | 9.6875 | 4.375 | |
| مثبطات البروتياز (PI) اللوحي | 0.5 حبة | 0.5 حبة | 0.5 حبة | |
| مثبطات إضافية (اختياري) | 33mM | 0.25 | 0.125 | 0.05 |
| MgCl2 | 1M | 0.125 | 0.05 | |
| تريتون X100 | 10% | 1.25 | ||
| الحجم الإجمالي | 25 مل | 12.5 مل | 5 مل | |
الجدول 1: تركيب مخازن الاستخراج المؤقتة (EBs).
- جعل Nuclei Lysis العازلة (NLB) استنادا إلى الجدول 2. إعداد NLB مقدما وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى الاستخدام. أضف أقراص PI طازجة قبل الاستخدام فقط عند 1x (0.5 قرص لكل 5 مل). انظر الجدول 2 للاطلاع على وحدات تخزين محددة.
| Nlb | تركيز المخزون | حجم الصوت (مل) |
| NaCl | 5M | 0.4 |
| تريس HCl pH8 | 1M | 0.05 |
| تريتون X100 | 10% | 0.5 |
| EDTA | 0.5 مليون | 0.2 |
| H2O | 3.85 | |
| أقراص PI | 0.5 حبة | |
| مثبطات إضافية (اختياري) | 33mM | 0.05 |
| الحجم الإجمالي | 5 مل |
الجدول 2: تكوين العازلة للتحلل النووي (NLB).
3. إجراء عزل النوكلي
ملاحظة: يوصى بإجراء الخطوات 3.1-3.3 من اليوم الأول (2-3 ساعة)، وحفظ النوى في المخزن المؤقت NLB عند -80 درجة مئوية واستئناف اليوم التالي (أو في وقت لاحق) لتنقية البروتين (4 ساعات). تم تكييف خطوات عزل النوى في هذا البروتوكول من بروتوكول chip-chip الذرة الرفيعة المستخدمة في معهد الجينوم المشترك. قد تكون هناك حاجة إلى غسلات إضافية وفصل تدرج السكروز لضمان نقاء النوى لتطبيقات ChIP-seq.
- ترشيح الحطام (~ 0.5 ساعة)
- تزن الأرض ورقة مسحوق ~ 4 ز, ضمان أنها لا تزال مجمدة عن طريق وضع على الجليد الجاف أو النيتروجين السائل حتى جاهزة للاستخدام.
- أضف أقراص مثبطات البروتياز إلى EB1 إلى تركيز نهائي 0.2x (0.5 قرص مقابل 25 مل لكل عينة). استخدام بلاستي مصغرة أو تلميح ماصة لسحق أقراص قبل في أنبوب microcentrifuge قبل إضافة إلى المخازن المؤقتة للمساعدة في حل من قرص في المخزن المؤقت. لمنع فقدان المواد، أضف قرص PI و sonicate المخزن المؤقت لإذابة الجهاز اللوحي.
- أضف 20 مل من EB1 إلى مسحوق أوراق الأرض المجمدة، ودوامة بلطف وخلطها حتى يتم تعليق المسحوق تماما. الحفاظ على الاختلاط بلطف لمدة 10 دقيقة ~ .
- تصفية من خلال شبكة 100، شطف المواد المصفاة مرتين مع 2 مل من EB1 في كل مرة.
ملاحظة: يجب أن يكون كل من الترشيح والحطام المصفى أخضر. إذا تتبع باستخدام المجهر، ينبغي للمرء أن يكون قادرا على رؤية النوى سليمة والبلاستيدات الكلورية سليمة في الترشيح في هذه المرحلة. وينبغي أن تغيب معظم الأنقاض الكبيرة/تستنفد. خلط الأصباغ مثل الميثيلين الأزرق مع العينة. Nuclei يمكن ملاحظته بسهولة كما ~ 3-5 ميكرومتر قطر الأزرق الداكن / aquamarine المجالات عندما تصور باستخدام 20x، 40x، و / أو 100x الهدف. بالنسبة للنياوي، والبلاستيدات مماثلة في الحجم، ولكن مخضر في اللون وغالبا ما تكون أكثر بيضاوية في الشكل. Vacuoles هي أيضا مماثلة لنوية في الحجم والشكل، لكنها لن تأخذ بسهولة حتى صبغة الميثيلين الأزرق. - الطرد المركزي وfiltrate مجتمعة في 3000 س ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية في الدوار دلو يتأرجح إلى حطام بيليه والعضيات تحت الخلية الكبيرة، بما في ذلك النوى والبلاستيدات الكلورية.
ملاحظة: من المستحسن إعداد EB2A أثناء هذا الدوران (راجع الخطوة 3.2.1). - Decant الماحتَم، الحرص على عدم إزعاج بيليه.
ملاحظة: بما أنه لم يتم بعد إضافة أي منظفات، يجب أن تظل الكريه خضراء شديدة ويجب أن يكون الماظر، على الأكثر، أخضر شاحب/ أصفر.
- تحلل العضيات غير المستهدفة (~ 0.5 ساعة)
- إعداد EB2A عن طريق إضافة مثبطات البروتياز إلى تركيز نهائي من 0.4x (0.5 قرص لكل 12.5 مل EB2A).
- Resuspend بيليه من الخطوة 3.1.6 في 5 مل من EB2A واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة مع خلط لطيف.
ملاحظة: يجب تحسين تركيز المنظفات لتفضيل الخلايا السليمة والبلاستيدات الكلورية ولكن ليس النوى. ويمكن أن يختلف المبلغ المطلوب من كائن حي إلى آخر. من المستحسن التحقق من تحلل من البلاستيك والاستبقاء من النوى سليمة تحت المجهر. - أجهزة الطرد المركزي في 2100 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية في الدوار دلو يتأرجح إلى حطام بيليه ونوى.
ملاحظة: في هذه المرحلة، يجب أن يكون الياقة الخضراء بشكل مكثف، وينبغي أن تكون بيليه أقل بكثير من خضراء مما لوحظ في المراحل السابقة بسبب التحلل من الكلور والكلوروفير الإفراج في السيتوسول. - Decant الماحتَم، الحرص على عدم إزعاج بيليه.
- عزل النوى من الملوثات السيتوبلازمية المتبقية (~ 0.5 ساعة)
- إعداد EB2B عن طريق إضافة مثبطات البروتياز إلى تركيز نهائي من 1x (0.5 قرص لكل 5 مل EB2B).
- إعادة تعليق بيليه النووية الخام من الخطوة 3.2.3 في 2 مل من EB2B.
ملاحظة: لا يحتوي EB2B Triton X-100، لذلك لا يجب أن يحدث أي تحلل إضافية عند هذه النقطة. - أجهزة الطرد المركزي في 2100 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية في الدوار دلو يتأرجح إلى حطام بيليه ونوى.
ملاحظة: يجب أن لا العضيات الصغيرة والمكونات السيتوبلازمية بيليه، لذلك ينبغي أن تبقى في افرا. - Decant الماحتَم، الحرص على عدم إزعاج بيليه.
- Resuspend بيليه باستخدام 250 ميكرولتر من NLB (إضافة 0.5 حبوب مثبطات البروتياز الطازجة ل5 مل).
ملاحظة: الهدف هو إعادة تعليق النوى في الحد الأدنى من NLB دون خسارة مادية كبيرة. لأن NLB لزجة جدا والكريات تحتوي على كمية كبيرة من الحطام غير قابلة للذوبان، فمن الصعب جدا أن الماصات ويميل إلى التشبث داخل نصائح ماصات. لهذا السبب، فمن المستحسن لإعادة استخدام نفس تلميح ماصة كلما كان ذلك ممكنا. إذا كان المعني مع المواد المتبقية في طرف ماصة، ببساطة تعليق ماصة من الرف أو رف لمدة 1 دقيقة ~ للسماح للجاذبية لجمع المواد في افتتاح طرف. لا ماصة بقوة لإعادة تعليق الكريات. بدلا من ذلك، استخدم تلميح ماصة كقضيب ضجة حتى يمكن أن تستنشق المواد بيليته في تلميح ماصة. أي، أنها على ما يرام تماما لكتل بيليه كبيرة للبقاء في هذه المرحلة طالما أنه يمكن أن يوجه إلى تلميح ماصة. - دوامة 15 s كحد أقصى لتجانس وإعادة جزئيا المواد. Sonicate لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية، ثم تخزينها في -80 درجة مئوية.
ملاحظة: بالنسبة للخطوات اللاحقة، ضع في اعتبارك أن إجمالي كمية NLB المضافة هي 250 ميكرولتر، ولكن يمكن أن يصل الحجم الإجمالي الظاهري للعينة إلى ضعف الكمية بسبب الحطام غير القابل للذوبان. يتم تجميد العينة وذوبانها للمساعدة في تحلل النوى.
- تحلل النوى واستخراج هيستون (~ 4 ح)
- أضف 750 ميكرولتر من 5٪ من احتياطي Gdn إلى العينة المذابة. سونيكات لمدة 15 دقيقة عند 4 درجة مئوية.
- نقل عينة إلى أنبوب واحد 2 مل وتدور 10،000 س ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
ملاحظة: من المرجح أن يبدو المُنَتَكّر أخضر. خطوات الكروماتوغرافيا التالية يجب إزالة معظم أصباغ من البروتين. - أثناء الانتظار على الخطوة 3.4.1 و 3.4.2، إعداد العمود لتنظيف اللوني تبادل الأيونات. شطف العمود الكروماتوغرافيا مع 2 مل من الأسيتونيتريل و 4 مل من الماء لتقليل التلوث على السطح.
- تحميل 200 ~ 300 ميكرولتر من راتنج WCX (مكيفة مسبقا مع 5٪ Gdn العازلة) على عمود الكروماتوغرافيا. دع الراتنج يستقر غسل أربع مرات مع 1 مل من 5٪ Gdn العازلة. الحفاظ على أنبوب وعمود على الجليد لبقية خطوات تنقية.
- وضع العمود الكروماتوغرافيا على أنبوب جمع 2 مل. تحميل افرنح من الخطوة 3.4.2 ببطء على السرير الراتنج دون تعطيل الراتنج (في محاولة لإسقاط ببطء من جانب الأنابيب). دع الحل يتدفق من خلال الجاذبية. كما يتم تدفق الحل من خلال، تحميل eluent مرة أخرى إلى أعلى العمود 6-8 مرات للسماح الربط الأقصى للراتنج. ثم، تجاهل الوينت.
- تحميل 2 مل من 5٪ Gdn العازلة لغسل البروتينات غير هيستون قبالة العمود. تجاهل الـ(مِلّد)
- elute histones مع 1 مل 20٪ Gdn العازلة. جمع الويين، الذي يحتوي على بروتينات هيستون.
- استخدام 3 كيلو ادا قطع الوزن الجزيئية قبالة (MWCO) تدور فلتر (0.5 مل) لساللت eluent من الخطوة 3.4.6. قبل الاستخدام، قم بتحميل 500 ميكرولتر غسل المذيبات (0.2٪ حمض فليك في 3٪ ACN) وتدور عليه مرتين لتنظيف مرشح.
ملاحظة: من المستحسن البدء في غسل مرشح MWCO أثناء تنفيذ خطوات الراتنج اللوني لتوفير الوقت. الخطوات التالية التصفية تدور تأخذ ~ 3-4 ح. - أول تحميل 500 ميكرولتر من عينة هيستون، تدور في 14،000 س ز لمدة 25 دقيقة ~ للحد من حجم وصولا الى ~ 100 ميكرولتر. ثم قم بتحميل 400 ميكرولتر آخر من العينة وتدور في 14000 x ز مرة أخرى لمدة 25 دقيقة. تحميل 100 ميكرولتر النهائي من العينة، شطف أنبوب العينة مع 300 ميكرولتر غسل المذيبات وتحميل المذيبات في التصفية. تدور في 14،000 س ز مرة أخرى لمدة 25 دقيقة.
- تحميل 400 ميكرولتر المذيبات غسل، تدور في 14، 000 س ز لمدة 25 دقيقة ~ للحد من حجم إلى ~ 100 ميكرولتر أو أقل. كل دورة يقلل من تركيز الملح بنسبة الخمس. كرر لثلاث دورات أخرى لتحقيق تركيز الجوانيدين إلى ~ 0.01٪. عكس مرشح في أنبوب جمع نظيفة وتدور في 1000 س ز لمدة 2 دقيقة. حفظ عينة هيستون تنقية في -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية للتحليل.
ملاحظة: يوصى بالدوران لفترة أطول (30-40 دقيقة) في الخطوة الأخيرة لتقليل حجم العينة للحصول على تركيز أعلى. يجب أن يكون حجم يمكن أن تنخفض إلى 50-70 ميكرولتر.
4. قياس الطيف الشامل من histones النقية
- اِلحصول على بيانات قياس الطيف الكتلي الكتلي اللوني السائل (LC-MS)
- تقدير تركيز البروتين من قبل حمض Bicinchoninic (BCA) اختبار بعد بروتوكول الشركة المصنعة.
ملاحظة: يمكن أن توفر BCA فقط تقديرًا لتركيز البروتين الكلي ، ولكن ليس جودة تنقية الحجر الهيستوني. إذا لم تكن أجهزة MS متاحة بسهولة للتحقق من جودة تنقية الحجر الهيستون، يمكن استخدام البقعة الغربية. عكس المرحلة LC إلى جانب 210 نانومتر الكشف عن امتصاص الأشعة فوق البنفسجية كما هو موضح في تقريرنا السابق يمكن أيضا أن تستخدم20. يمكن مقارنة الكروماتوغرام مع معيار معروف لفحص جودة العينة. ومع ذلك، يمكن أن يكون للكائنات الحية المختلفة ملامح مختلفة من elution. ولذلك، فإن استخدام معايير هيستون من الكائنات المماثلة ينصح بشدة. - توصيل عمود تحليلي للمرحلة المُعكسة C18 (RP) (على سبيل المثال، 3 ميكرومتر 300 ه، عمود القطر الداخلي 75 ميكرومتر، القطر الخارجي 360 ميكرومتر، طول 70 سم) وعمود مصيدة C18 (على سبيل المثال، 3.6 ميكرومتر، قطر العمود الداخلي 150 ميكرومتر، القطر الخارجي 360 ميكرومتر، طول 5 سم) إلى نظام كروماتوغرافي نانوي تدفقي مزدوج (على سبيل المثال، مياه نانوAcquity). المذيبات الثنائية هي A: 0.1٪ حمض فليك في الماء، وB: 0.1٪ حمض فليك في الأسيتونتريل.
ملاحظة: تشمل المضخة المزدوجة LC مضخة غسيل ومضخة متدرجة. تمر كلتا المضختين بمرحلتين في كل تحليل – وهي مرحلة ملائمة تليها المرحلة التحليلية. في مرحلة التراكب، تتدفق مضخة الغسيل إلى عمود التراكب وتتدفق مضخة التدرج إلى العمود التحليلي. في المرحلة التحليلية، يقترن عمود التراكب بالعمود التحليلي، وتتدفق مضخة التدرج في كلا العمودين. مضخة الغسيل ثم يذهب إلى النفايات. - مرحلة التراكب اللوني: قم بإعداد طريقة LC لتحميل 1-2 ميكروغرام من عينة حجر الهيستون على عمود التراكب. Desalt العينة من مضخة الغسيل في 3 ميكرولتر / دقيقة 5٪ المذيب B لمدة 10 دقيقة. تعيين المضخة التحليلية في 0.3 μL / دقيقة 5٪ المذيبات B لتحقيق التوازن.
- المرحلة التحليلية: تعيين مضخة التدرج (0.3 ميكرولتر / دقيقة) لتبدأ من 5٪ B ومنحدر إلى 30٪ في 15 دقيقة. ثم، زيادة إلى 41٪ B في 100 دقيقة قبل غسل عضوي عالية تصل إلى 95٪ B في نهاية.
ملاحظة: يمكن تحسين التدرج استناداً إلى ملفات تعريف الاستبقاء مختلفة على الأعمدة الفردية. عادة، الهستونات كاملة الطول تتر حول 30٪ -40٪ B على شروط LC المحددة. يمكن استخدام التدرجات الأطول لزيادة أعداد أطياف MS2 لالتقاط المزيد من بروتيوفورمات هيستون. - إعداد طريقة اقتناء تعتمد على البيانات على MS عالية الدقة (على سبيل المثال، Thermo Orbitrap Fusion Lumos أو ما شابه ذلك) مع إمكانية انفصال نقل الإلكترون (ETD). استخدام وضع البروتين سليمة وتنفيذ جميع المعايرات اللازمة على النحو المقترح من قبل الشركة المصنعة. وفيما يلي وصف للبارامترات الهامة. وستكون هذه محددة للأداة المستخدمة.
- MS1: نطاق المسح الضوئي 600-2,000 م/ز, القرار 120k (في م/ ز 200), 4 microscans, AGC الهدف 1E6, حقن ماكس 50 مللي ثانية.
- MS2: دقة 120k; 1 ميكروسكان؛ الهدف 1E6 من AGC؛ البيانات تعتمد MS / MS: بالتناوب ETD (25 مللي وقت رد فعل, ماكس حقن الوقت 500 مللي ثانية) وأعلى الطاقة تفكك تصادمي (HCD, 28٪ تطبيع طاقة الاصطدام مع الطاقة ±5٪ صعدت, أقصى وقت الحقن 100 مللي ثانية); نافذة العزل من 0.6 دا؛ الأولوية في حالات أعلى تكلفة.
- استبعاد ديناميكي: نافذة زمنية 120 s، ±0.7 دا نافذة الشامل. استبعاد حالات الشحن أقل من 5 و حالات رسوم غير محددة.
- تشغيل عدد قليل من الحقن من الببتيد أو معايير هيستون على أعمدة جديدة لتكليل والتحقق من النظام، قبل تشغيل العينات الفعلية. لتشغيل عدد كبير من العينات، إضافة الفراغات القصيرة أو يغسل بين العينات لتقليل حمل أكثر. دع الأعمدة توازنات لمدة 15-20 دقيقة عند شرط البدء (5٪ مذيب B) قبل العينة التالية.
ملاحظة: يمكن للتدرجات LC الأطول ووقت الحقن الأقصى الأعلى لـ MS2 تحسين الجودة الطيفية لتحديد المزيد من بروتيوفورمات هيستون.
- تقدير تركيز البروتين من قبل حمض Bicinchoninic (BCA) اختبار بعد بروتوكول الشركة المصنعة.
- معالجة البيانات LC-MS وتحديد البروتيفورم
- الحصول على تسلسل البروتين (الذرة الرفيعة) في شكل FASTA من JGI (https://genome.jgi.doe.gov) أو UniProt (https://www.uniprot.org/).
- استخدم MSConvert21 (http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtml) لتحويل ملفات البيانات الأولية لأداة (*.raw) إلى تنسيق mzML.
- تحميل جناح توببيك22 (http://proteomics.informatics.iupui.edu/software/toppic/) لمعالجة البيانات. يمكن تشغيل البرنامج إما في سطر الأوامر أو من خلال واجهة رسومية.
- استخدم TopFD في مجموعة TopPIC لإلغاء تحديد الأطياف من ملف mzML من الخطوة 4.2.2. يمكن استخدام المعلمات الافتراضية. ولكن "النافذة السلائف" (-w) تحتاج إلى تخفيض إلى 1 م / ض بسبب استخدام نافذة عزل ضيقة.
- استخدم TopPIC في جناح توببيك لتحديد البروتيوفورمات. يمكن استخدام معظم المعلمات الافتراضية. تعيين الطيف والبروتيفورم قطع نوع لFDR (معدل اكتشاف كاذبة) وتعيين قيمة قطع إلى 0.01 (1٪ FDR) أو حسب الرغبة. تعيين "التسامح خطأ proteoform" إلى 5 (دالتون). تحميل الملف FASTA من الخطوة 4.2.1 و "* _ms2.msalign" الملف من الخطوة 4.2.4. ثم ابدأ البحث.
ملاحظة: "التسامح مع الخطأ proteoform" إعداد سوف تجمع بين proteoforms مع الجماهير مماثلة (± 5 دا) كواحد. وهذا يساعد على تقليل التكرار في تعداد البروتيفورم. ومع ذلك، ينبغي استخدامه بحذر لأن التسامح الكبير سوف دمج proteoforms مع اختلافات صغيرة أو لا كتلة. تتوفر هذه المعلمة فقط في TopPIC الإصدار 1.3 أو الإصدار الأحدث. - يمكن فحص بروتيوفورمات محددة في ملف "* _proteoform.csv" أو تصور باستخدام وحدة Topview تحت المجلد "* _html" من الإخراج.
- قائمة البروتيفورمات التي تم إنشاؤها من الخطوات أعلاه باستخدام TopPIC تعليقات توضيحية PTMs هيستون كتحولات جماعية. لكي يتم توطين PTMs الفردية، يجب تضمين قائمة تعديل. يمكن الاطلاع على وصف مفصل في دليل TopPIC. وبدلاً من ذلك، انتقل إلى الخطوة التالية لإجراء تحليل بيانات تكميلي باستخدام الحزمة23 (https://github.com/PNNL-Comp-Mass-Spec/Informed-Proteomics) المستنيرة Proteomics.
- اتبع الإرشادات واستخدام الوحدة النمطية PbfGen لتحويل البيانات الخام أداة إلى ملف PBF. ثم deconvolute البيانات MS1 باستخدام وحدة ProMex لإخراج ملف ms1ft (قائمة المعالم ، كل ميزة تمثل مزيجا فريدا من كتلة والاحتفاظ بالوقت).
- إنشاء FASTA مركزة لبروتيوميكس علم باستخدام قائمة البروتين المحدد من TopPIC في الخطوة 4.2.6.
ملاحظة: يمكن أن يكون البحث في الجينوم بأكمله باستخدام علم-Proteomics مع عدد كبير من PTMs متغير بطيئة للغاية وقد يسبب أعطال. ولذلك، فمن المستحسن للحد من حجم FASTA فقط بما في ذلك البروتينات المستهدفة. - إنشاء قائمة تعديل المستهدفة للبحث عن PTMs histone التالية التنسيق في ملف المثال. PTMs المشتركة لتشمل هي: Lysine acetylation, ليسين أحادية الميثيليشن, ليسين دي-ميليسيشن, ليسين ثلاثية- ميثيليشن, سيرين/ثريونين/التيروزين فوسفوريليشن, بروتين N-terminal أستيليشن, ميثيونين/سيستين أكسدة. بالنسبة للذرة الرفيعة، البروتين N-terminal أحادية الميثيل، ثنائي الميثيل، و 10000000، ينبغي أن يضاف.
ملاحظة: يتم فقط البحث عن PTMs المحددة في القائمة. إذا كانت PTMs غير محددة موجودة، قد لا يتم تحديد البروتيفورم، أو قد يكون خطأ في تحديدها إلى بروتيوفورمات أخرى. ومع ذلك، يجب أن تبقى قائمة PTM قصيرة قدر الإمكان لتقليل وقت البحث. - تنفيذ الوحدة النمطية MSPathFinder لتعريف proteoforms باستخدام الملفات من الخطوة 4.2.8 و FASTA مركزة من الخطوة 4.2.9 وقائمة التعديل من الخطوة 4.2.10. يمكن استخدام المعلمات الافتراضية.
- يمكن تصور النتائج في LcMsSpectator عن طريق تحميل كافة ملفات النتائج.
ملاحظة : أدوات المعلوماتية الحيوية الأخرى متاحة لمعالجة وتصور البيانات من أعلى إلى أسفل ، ولكل منها نقاط القوة الخاصةبه 24،25،26،27،28. سورغوم والعديد من الكائنات الحية الأخرى لديها معلومات محدودة معروفة بشأن PTMs هيستون في قاعدة البيانات. استخدم TopPIC أولاً لتحديد التحولات الجماعية من PTMs. يمكن أن يكتشف هذا التحليل بسهولة كل من PTMs المعروفة وغير المعروفة. ثم، يمكن البحث عن PTMs المكتشفة بطريقة مستهدفة إما عن طريق تحديد قائمة PTM في TopPIC، أو مع أدوات تكميلية أخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد البروتوكول، يمكن استخراج الهستونات وتحديدها باستخدام تحليل LC-MS. تتوفر البيانات الأولية والنتائج المعالجة في Massive (https://massive.ucsd.edu/) عن طريق الانضمام: MSV000085770. استنادا إلى نتائج TopPIC من عينة تمثيلية (متاحة أيضا من Massive)، حددنا 303 بروتيوفورم هيستون (106 H2A، 72 H2B، 103 H3، و 22 H4 proteoforms). كما تم الكشف عن بروتويفورمات الريبوسومية المنقية، وعادة ما يتم التهيّم في وقت مبكر من LC. وعادة ما تتكون من ~ 20 ٪ من بروتيوفورمات محددة ، ولكن لا تتداخل مع بروتيوفورم هيستون يتلخص في مرحلة لاحقة من الانحدار LC. ويمكن تصور النتائج بسهولة مع أحدث حزم TopPIC أو علم بروتيوميكس. من أجل العرض التوضيحي، سوف نركز على تصور البيانات باستخدام حزمة Informed-Proteomics، والتي يمكن استخدامها لتحميل ملفات MS الأولية مباشرة وفحص تحديدات البروتيفورم يدويًا. يرجى ملاحظة أن كلا الحزمة من البرامج استخدام خوارزميات مختلفة والمعلمات. لن تكون أعداد البروتيفورم المبلغ عنها متطابقة. نوصي بالإبلاغ عن تعدادات البروتيفورم من TopPIC لأنها أكثر تحفظًا ، وهي لا تأخذ في الاعتبار PTMs غير معروف. وقد تكاملت مجموعة Informed-Proteomics مع معالجة البيانات والتصور لسهولة التحقق اليدوي. بالنسبة للكائنات ذات PTMs المشروحة جيداً، نوصي بـ ProSightPC24 للحصول على أفضل توطين للموقع. يمكن الجمع بين النتائج باستخدام أدوات متعددة زيادة عدد وثقة الهويات البروتيفورم.
بعد معالجة البيانات مع Informed-Proteomics، يمكن تصور خريطة ميزة LC-MS في LcMsSpectator، الذي يعرض كتل البروتين deconvoluted ضد وقت الاحتفاظ بالسي. من خلال النقر على بروتيوفورمات محددة في البرنامج، سيتم تمييز الميزة المرتبطة مع مستطيل أخضر صغير في خريطة الميزة. وينبغي أن ينظر إلى البروتينات الرئيسية في مناطق محددة من الخريطة، مما يدل على نجاح التجربة. ويبين الشكل 1a خريطة مميزة LC-MS تمثيلية للستونات الهستونات السليمة. يتم تمييز بروتيوفورمات هيستون كامل الطول في المربعات المتقطعة. يمكن التعرف على معظم بروتيوفورمات الكشف عن بثقة باستخدام بيانات MS2.
ويبين الشكل 1ب التكبير في المنطقة مع H2A و H2B proteoforms. معظمها لديها تعديلات N-المحطة الطرفية من 42 دا. هذه الكتلة الاسمية تقابل إما ثلاثية الاثيللي (42.05 د) أو أسيتيل (42.01 دا)، والتي عادة ما ينظر إليها لهستونات. تختلف كتلها الدقيقة فقط بنسبة 0.04 Da ويصعب التفريق بينها على مستوى البروتين السليم (~2 جزء في المليون). في أطياف عالية الدقة MS2 ، يمكن تمييز PTMs بسهولة وتأكيدها بسبب الكتلة السفلية للشظايا29. بالإضافة إلى ذلك، H2A و H2B لهيستونات متعددة مع متواليات مشابهة جدا كما لوحظ من قبل أرقام الانضمام UniProt مختلفة في الشكل 1b. مرة أخرى، يمكن تحليل LC-MS عالية الدقة بسهولة تحديد وتمييزها. تم تحديد نوعين من H2As للذرة الرفيعة هيستونات. وقد وسعت 16 كيلو ادا H2A histones في الشكل 1b ذيول المحطة الطرفية في المناطق غير المحفوظة من histones. مجموعة أخرى من h2A هيستونات دون ذيول الموسعة (14 كيلو Da) يمكن أن ينظر إليها في الشكل 1c.
بالنسبة للستونات H4، تم تحديد أسيتيل N الطرفية باعتبارها PTM الرئيسية. يمكن أيضا ملاحظة إضافية lysine أسيتيليشنات و أكسدة الميثيونين ببساطة عن طريق دراسة الاختلافات كتلة من الميزات في الشكل 1d. لاحظنا أيضا تعديل غير معروف من 112.9 دا بالإضافة إلى أسيتيل N الطرفية (ميزة أعلاه "3Ac" في الشكل 1d). هذا هو على الأرجح بعض adducts غير معروف من الكاشف المستخدمة في التحضير. لقد سبق أن اكتشفنا كبريتات أيونات على H4 ، والتي قد تعزى إلى الأملاح المتبقية جنبا إلى جنب مع ارتفاع أساس بروتينات الحجر. بالنسبة لH3، تم تحديد تسلسلين للبروتين H3.3 و H3.2(الشكل 1e). على الرغم من أن هذين تسلسل البروتين تختلف في 4 فقط بقايا (32، 42، 88، و 91)، فإنها لا تزال يمكن تمييزها بسهولة في LC-MS على أساس فصل في كل من البعد، والكتلة، ووقت الاحتفاظ. يتم تعديل بروتينات H3 بشكل كبير بدرجات متفاوتة من الميثيليشن والأسيتيل. يمكن تصور درجة عالية من التعديل بسهولة من قبل خطوط كثيفة، متوازية في الخريطة ميزة، والتي هي 14 دا وبصرف النظر. ومع ذلك، فإن ثلاث مجموعات من المثيلات (14*3 Da) لها الكتلة الاسمية المتساوية لأسيتيل واحد (42 دا). ولأن هذه الـ PTMs لا يمكن حلها بسهولة عند مستوى البروتين السليم، يشار إليها على أنها "مكافئات الميثيل" (أي مضاعفات 14 Da؛ وتساوى أسيتيل واحدة ثلاثة مكافئات الميثيل). في الشكل 1e، يتم تصنيف بروتيوفورمات H3 في شكل مكافئات الميثيل على أساس كتلتها السليمة. بسبب محدودية دقة فصل RPLC ، من المرجح أن العديد من بروتيوفورم H3 المختلفة هي المشاركة في التهيّم والتجزئة في نفس الطيف. الطريقة المعروضة هنا سوف تحدد فقط تركيبات الأكثر وفرة من الميثيل والتنكيل كما هو موضح في الشكل 2. لتوصيف أكثر شمولا من H3، لا يزال مطلوبا تحليل أكثر استهدافا30،31.
الشكل 1: خريطة ميزة LC-MS على الهستونات سليمة المستخرجة من أوراق الذرة الرفيعة. ويبين هذا الرقم LC الاحتفاظ الوقت (في دقائق) مقابل الكتلة الجزيئية لجميع بروتيوفورم المكتشفة. يتم عرض وفرة السجل من خلال مقياس اللون بجوار الخريطة العليا (سجل 10 وفرة). (أ)القمم الرئيسية هيستون هي التي وصفت من قبل المربعات متقطعة. يتم اقتطاع معظم الميزات خارج صناديق histones والبروتينات الريبوسومية. التكبير في وجهات النظر لكل مجموعة من histones: (ب) H2B و 16 كيلو دا H2A، (ج) H3، (د) 14 كيلو Da H2A، و (ه) H3. ويلاحظ أرقام الانضمام UniProt جنبا إلى جنب مع كل ميزة، تليها PTMs المكتشفة. "Ac"، "أنا"، "+ س" تشير إلى أستيليشن، والميثيل، والأكسدة، على التوالي. في (b)، يتم تسمية بروتيوفورمين من النوع H2A C5YZA9 ، والتي كانت قص أو اثنين من ألانين C-terminal (تظهر كـ -A *، و -AA *). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
مثال تمثيلي لتعريف البروتيفورم مبين في الشكل 2 باستخدام MSPathfinder وتصوره في LcMsSpectator. تم إنشاء طيف التجزئة في الشكل 2a باستخدام ETD، الذي ينتج أ ج و z نوع الأيونات على طول العمود الفقري للبروتين. ويمكن استخدام HCD من نفس السلائف للتحقق من الهوية، ولكن عادة ما يوفر هذا الرقم تغطية تسلسلية محدودة20. وتظهر الأيونات السليفة في أطياف MS1 السابقة والتالية في الشكل 2b,c، مع تسليط الضوء على قمم النظائر المتطابقة باللون الأرجواني. يمكن أن تساعد خريطة تغطية التسلسل في الشكل 2d في ترجمة أي PTMs محتملة. وينبغي أن يكون التعرف على درجة عالية من الثقة مطابقة معظم الشظايا، ومطابقة أيونات السلائف، وتغطية تسلسلية جيدة للمساعدة في تحديد موضعية PTMs. في هذا المثال، تم تحديد بروتيوفورم H3.2 مع اثنين من PTMs - di-methylation على K9 والميثيل على K27. باتباع نفس الأسلوب، يمكن التحقق يدويا من صحة بروتيوفورمات أخرى مع PTMs مختلفة والاقتطاعات الطرفية.
الشكل 2: مثال تمثيلي لبروتيفورم histone H3.2 المحدد. H3.2 preteoform مع(أ)ETD الطيف،(ب)السلائف أيون في الطيف MS1 السابقة،(ج)أيون السلائف في الطيف MS1 المقبل، و (د) خريطة التغطية تسلسل. أيونات ج من ن-دلفينوس هي وصفت باللون السماوي، والأيونات z من سي-دلفينوس هي باللون الوردي. تم تحديد PTMs اثنين وتسليط الضوء عليها باللون الأصفر في (d) مع تفاصيل تحولاتها الجماعية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يمكن أن تكشف المقارنة الكمية للبروتيفورمات الهستونية المكتشفة علامات اللاجينية المحتملة. وقد طبقنا هذا البروتوكول سابقاً على 48 عينة من الذرة الرفيعة تم جمعها من الحقل (لم تستخدم "مثبطات إضافية" في هذه الدراسة)29. وتمت مقارنة نمطين جينيين مختلفين من الذرة الرفيعة استجابة للجفاف الذي كان يحدث قبل الازدهار أو ما بعد الجفاف المزهر. من خلال مقارنة الوفرة النسبية للبروتيفورمات ، اكتشفنا بعض التغييرات المثيرة للاهتمام من بروتيوفورمات هينيون مبتورة محددة لظروف العينة كما هو موضح في الشكل 3. لم يلاحظ اقتطاع المحطة الطرفية C من H4 إلا في الأسبوعين 3 و 9 لبعض العينات (الشكل 3أ ، ب). بالنسبة لH3.2، كانت بروتيوفورمات N-terminal المقتطعة عموماً أكثر وفرة في الأسبوع 10(الشكل 3ج، د). في المقابل، C-المحطة الطرفية اقتطاع H3.2 تميل إلى أن ينظر إليها في وقت سابق من النقاط الزمنية(الشكل 3c). والأهم من ذلك أن النمطين الجينيين لم يستجيبا بنفس الطريقة. كانت بروتيوفورمات H4 C-terminal مبتورة أكثر وفرة في BTx642 مما كانت في RTx430 (الشكل 3b). وتكشف هذه البيانات عن علامات غير مُتَوَلِّبة محتملة للتنمية النباتية وتحمل الإجهاد يمكن اختبارها أكثر باستخدام تقنيات أخرى.
الشكل 3: المقارنة الكمية لبروتيوفورمات هيستون. (أ)خريطة الحرارة من بروتيوفورمات H4 هيستون عبر عينات مختلفة. لكل بروتيوفورم، تم تطبيع الوفرة المستخرجة من بيانات التصلب المتعدد من أعلى إلى أسفل إلى مجموع جميع بروتيوفورم H4 المحدد في كل تحليل، مما أسفر عن "الوفرة النسبية". ثم تم تحجيم القيم إلى الحد الأقصى لكل صف لإظهار التغييرات في بروتيوفورمات الوفرة المنخفضة بشكل أفضل. يتم الإشارة إلى الوفرة النسبية المتدرج في مفتاح اللون في الجزء السفلي من خريطة الحرارة. ويلاحظ وجود ظروف نمو على المحور الأفقي (قبل: الجفاف قبل المزهرة، ما بعد الجفاف المزهر). يتم تجميع ثلاثة النسخ المتماثلة معاً ويتم فصلها بواسطة خطوط عمودية سوداء من شروط أخرى. وبالنسبة للعينات التي تحمل علامات نجمية، لم يتم الحصول إلا على النسخ المتماثلة التقنية. يتم تمثيل بروتيوفورمات على المحور الرأسي، في شكل "بقايا البداية - بقايا النهاية: كتلة؛ تعديل مُتَوقِر". (ب)مؤامرة الوفرة النسبية لبروتيوفورمات H4 المقتورة 2-99 (يتم تلخيص البروتيفورمات التي تم تمييزها بالأحرف العريضة في(أ)في ظروف مختلفة. يتم عرض مفتاح الرموز في وسيلة الإيضاح في الزاوية العلوية اليمنى. النقاط المملوءة في منتصف أشرطة الأخطاء هي متوسط القيم. (ج)يتم عرض خريطة الحرارة من H3.2 proteoforms و (d) مؤامرة وفرة لجميع المحدد N-المحطة H3.2 مبتور H3.2 في نفس الشكل مثل تلك لH4. تم حذف بروتيوفورمات أصغر من 8 كيلو بايت في (c)للبساطة. وأظهرت محطة N وC-المحطة الطرفية المقصوصة H3.2 proteoforms استجابات مختلفة عبر ظروف النمو. أعيد طبعه بإذن من إلسفير من المرجع29. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
البروتوكول المعروض يصف كيفية استخراج histones من أوراق الذرة (أو عموما ورقة النبات) عينات. ومن المتوقع أن يكون متوسط العائد من الحجر الهحي 2-20 ميكروغرام لكل 4-5 غرام من مادة أوراق الذرة الرفيعة. المواد هي نقية بما فيه الكفاية لتحليل المصب هيستون من قبل LC-MS (في الغالب histones مع ~ 20٪ تلوث البروتين الريبوسومي). قد يتم الحصول على عائد أقل بسبب تباينات العينات أو سوء معالجة/فشل محتمل خلال البروتوكول. الحفاظ على سلامة النوى قبل خطوة الانحلال هو أمر بالغ الأهمية; لذلك، يجب تجنب دوامة العدوانية و pipetting قبل إضافة NLB. بالإضافة إلى ذلك، قد يحدث فقدان النوى عند إزالة المواد الخارقة من الكريات. يجب توخي الحذر لعدم تعطيل الكريات عند الأنابيب. تم تحسين تركيز Triton X-100 البالغ 1٪ لتجميل العضيات غير المستهدفة بشكل انتقائي ولكن ليس النوى (الخطوة 3.2). قد يكون التركيز الأمثل للمنظفات للأنسجة أو الكائنات الحية الأخرى مختلفًا ويحتاج إلى تحديد تجريبي. تغير اللون من عظمى أثناء عملية الترشيح يمكن أن تشير إلى قضايا محتملة مثل إطلاق غير فعال من الكلوروبلاست أو غير كافية طحن ورقة. إذا كان ذلك ممكنا، واستخدام المجهر للتحقق من تحلل من البلاستيك والكلور والاحتفاظ بالنوى سليمة بعد كل خطوة لزيادة تحسين البروتوكول (وخاصة إذا تعديل البروتوكول للأنسجة أو النباتات الأخرى). وقد تم اختبار هذا البروتوكول فقط مع أنسجة ورقة الذرة الرفيعة. لا يعمل للذرة الرفيعة أنسجة الجذر المرجح بسبب تدخل من التربة. لم يتم اختبار التطبيق على أنسجة أوراق نباتية أخرى وقد يحتاج التطبيق إلى محطات مختلفة إلى تحسين إضافي. لتكييف بروتوكول عزل النوى لتطبيقات ChIP-seq، ينصح فصل كثافة تدرج سكروز إضافية بعد الخطوة 3.3.4 (قبل استخدام NLB) للحد من التلوث السيتوبلازمي. وبسبب خطوات التنظيف الواسعة النطاق، لا يتوقع أن تتسبب كميات صغيرة من المواد المتبقية غير النووية في تداخل كبير في تحليل الحجر الهحي في LC-MS ويمكن تركها مع البيليه.
فشلت عدة تجارب أولية عند استخدام أقراص تجارية من مثبطات الفوشطاتاز (مثل فوستوب). ويبدو أن المُنَتَكَل في الخطوة 3.1.6 أخضر شديد عندما كانت الأقراص تستخدم في المخزن المؤقت لاستخراجها. وأظهر المقتطف النهائي عدداً منخفضاً من الستونات المحددة. ونحن نشك في أن المكونات الملكية في أقراص قد تسبب في تحلل النوى قبل الخطوة 3.4، والحد من العائد الكلي لهستون. سبب آخر ممكن للفشل هو عدم توافق المكونات في خطوة تنقية الحجر الهيستون مع راتنج تبادل الأيونات (الخطوة 3.4). لقد استخدمنا هذا البروتوكول لاستخراج باستمرار histones نقاء عالية لLC - MS اللاحقة أكثر من 150 عينات. في المتوسط، تمكنا من الحصول على عائد أعلى دون استخدام "مثبطات إضافية" (بيانات غير منشورة). لذلك، ينصح باختبار مثبطات جديدة بحذر عند تعديل أو تكييف هذا البروتوكول لأغراض أخرى. إذا لم تكن الفسفورية ذات أهمية، يمكن حذف مثبطات الفوشطاتاز في مخازن الاستخراج.
يمكن أن الخطوات في 3.4 يستغرق 3-4 ح أو أكثر. من المستحسن كسر البروتوكول في 2 أيام - تجميد بيليه نوكلي من الخطوة 3.3 وتنفيذ تنقية في اليوم 2 (أو في وقت لاحق). دورة التجميد ذوبان قد تساعد جزئيا في تحلل النوى. يمكن أن تستغرق خطوات مرشح MWCO (3.4.7) وقتًا طويلاً للغاية ولكن يمكن توسيع نطاقها بسهولة عن طريق إعداد عينات متعددة بالتوازي. لا تقم بإضافة أقراص مثبطات البروتياز في الخطوة 3.4. تحتوي العديد من الأقراص التجارية على بوليمرات (مثل البوليثين غليكول) كشوّل، مما سيتداخل مع تحليل LC-MS. في هذه الخطوة، كان ينبغي إزالة معظم البروتينات الأخرى أو التشويه، لذلك مثبطات الإنزيم ليست حرجة. ومع ذلك، لا يزال من الضروري إبقاء العينات عند 4 درجة مئوية أو مجمدة لتقليل التحلل إلى أدنى حد.
بعد هذا البروتوكول، يمكن استخراج الهستونات بنجاح من أوراق الذرة الرفيعة. يمكن أن تتميز هيستون PTMs مع LC-MS. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على دراسات واسعة النطاق لمقارنة PTMs histone بين عينات بيولوجية مختلفة (على سبيل المثال، الأنواع الجينية المختلفة، النباتات التي تزرع في ظل ظروف مختلفة، الخ) كما هو مبين في بيانات المثال في الشكل 3. ومع ذلك، معالجة البيانات لا تزال تتطلب تحليلاً يدوياً واسع النطاق لتعيين بثقة البروتيفورمات، خاصة بالنسبة لـ PTMs غير متوقعة (أو رواية). ومن المتوقع أن تعمل التطورات الجديدة في أدوات المعلوماتية الأحيائية على أتمتة سير العمل وزيادة إنتاجية الدراسات على نطاق واسع بشكل كبير. وثمة قيد آخر هو أن طريقة MS من أعلى إلى أسفل، حاليا، لا يمكن بسهولة التفريق بين العديد من بروتيوفورمات H3 المعدلة بشكل مفرط (على سبيل المثال، مواقع متعددة من أحادية / دي / ثلاثية metlylation و acetylation). لا يمكن للبعد الواحد عكس المرحلة LC فصل تماما بروتيوفورم H3 مختلفة. ولذلك، فإن أطياف MS2 من H3 عادة ما تحتوي على أجزاء من بروتيوفورمات متعددة ولا يمكن تفكيكها بسهولة وثقة. الجمع بين من أعلى إلى أسفل مع الأساليب من أسفل إلى أعلى أو من منتصف إلى أسفل30،32،33 يمكن أن تكون مفيدة بشكل خاص لتوصيف H3 histone. بدلا من ذلك، يمكن النظر في فصل متعدد الأبعاد لتحسين عمق MS من أعلى إلى أسفل34،35،36.
Histone PTM التنميط من قبل LC-MS تمكن اكتشاف علامات اللاجينية رواية لتصميم المعدلات الكروماتين وتحسين مرونة النباتات للظروف البيئية القاسية. وأشارت دراسة تجريبية باستخدام الذرة الرفيعة من صنفين من الأصناف ونمت في ظل ظروف الجفاف في هذا المجال إلى أن القطع الطرفي الانتقائي في الأوراق قد يكون مرتبطاً بالتأقلم مع الجفاف والتنمية النباتية29. وقد تكون علامات Histone المحددة بمثابة أهداف من خلال تقنيات تكميلية مثل ChIP-seq. وسيكون الفهم الشامل للعوامل اللاجينية المكتسبة من هذه التقنيات التكميلية لا غنى عنه لهندسة حلول مبتكرة للمحاصيل استجابة للتغيرات البيئية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
اي.
Acknowledgments
نشكر رونالد مور وتوماس فيلمور للمساعدة في تجارب الطيف الشامل، وماثيو مونرو لترسب البيانات. تم تمويل هذا البحث من خلال منح من وزارة الطاقة الأمريكية (DOE) البحوث البيولوجية والبيئية من خلال مكافحة اللاجينية لمكافحة الجفاف في مشروع SORGHUM (EPICON) تحت رقم المنحة DE-SC0014081، من وزارة الزراعة الأمريكية (وزارة الزراعة الأمريكية( CRIS 2030-21430-008-00D)، ومن خلال معهد الطاقة الحيوية المشترك (JBEI)، وهو مرفق برعاية DOE (العقد DE-AC02-05CH11231) بين مختبر لورانس بيركلي الوطني و DOE. وقد أُجري البحث باستخدام مختبر العلوم الجزيئية البيئية (EMSL) (grid.436923.9)، وهو مرفق تابع لمكتب العلوم التابع لوزارة الطاقة برعاية مكتب البحوث البيولوجية والبيئية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4L | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-5G | |
| EDTA, 500mM Solution, pH 8.0 | EMD Millipore Corp | 324504-500mL | |
| Formic Acid | Thermo Scientific | 28905 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma | G3272-100G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| Potassium phosphate, dibasic | Sigma | P3786-100G | |
| Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tablets | Roche | 5892791001 | |
| Sodium butyrate | Sigma | 303410-5G | Used for histone deacetylase inhibitor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S1888 | |
| Sodium Fluoride | Sigma | S7020-100G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 450243-10G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sucrose | Sigma | S7903-5KG | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 g | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-100ML | |
| Weak cation exchange resin, mesh 100-200 analytical (BioRex70) | Bio-Rad | 142-5842 | |
| Disposables | |||
| Chromatography column (Bio-Spin) | BIO-RAD | 732-6008 | |
| Mesh 100 filter cloth | Millipore Sigma | NY1H09000 | This is part of the Sigma kit (catalog # CELLYTPN1) for plant nuclei extraction. Similar filters with the same mesh size can be used. |
| Micropipette tips (P20, P200, P1000) | Sigma | ||
| Tube, 50mL/15mL, Centrifuge, Conical | Genesee Scientific | 28-103 | |
| Tube, Microcentrifuge, 1.5/2 mL | Sigma | ||
| Equipment | |||
| Analytical Balance | Fisher Scientific | 01-912-401 | |
| Beakers (50mL – 2L) | |||
| Microcentrifuge with cooling | Fisher Scientific | 13-690-006 | |
| Micropipettes | |||
| Swinging-bucket centrifuge with cooling | Fisher Scientific | ||
| Vortex | Fisher Scientific | 50-728-002 | |
| Water bath Sonicator | Fisher Scientific | 15-336-120 |
References
- Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D., Basra, S. M. A. Plant drought stress: Effects, mechanisms and management. Agronomy for Sustainable Development. , 153-188 (2009).
- Dai, A. Drought under global warming: a review. Wiley Interdisciplinary Reviews: Climate Change. 2 (1), 45-65 (2011).
- Rooney, W. L., Blumenthal, J., Bean, B., Mullet, J. E. Designing sorghum as a dedicated bioenergy feedstock. Biofuels, Bioproducts and Biorefining. 1 (2), 147-157 (2007).
- Mullet, J. E., Klein, R. R., Klein, P. E. Sorghum bicolor - an important species for comparative grass genomics and a source of beneficial genes for agriculture. Current Opinion in Plant Biology. 5 (2), 118-121 (2002).
- Xu, L., et al. Drought delays development of the sorghum root microbiome and enriches for monoderm bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4284-4293 (2018).
- Gao, C., et al. Strong succession in arbuscular mycorrhizal fungal communities. ISME Journal. 13 (1), 214-226 (2019).
- Gao, C., et al. Fungal community assembly in drought-stressed sorghum shows stochasticity, selection, and universal ecological dynamics. Nature Communications. 11 (1), (2020).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
- Yuan, L., Liu, X., Luo, M., Yang, S., Wu, K. Involvement of histone modifications in plant abiotic stress responses. Journal of Integrative Plant Biology. 55 (10), 892-901 (2013).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews. Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
- Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. Quantitative proteomic analysis of histone modifications. Chemical Reviews. 115 (6), 2376-2418 (2015).
- Moradian, A., Kalli, A., Sweredoski, M. J., Hess, S. The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).
- Sidoli, S., Garcia, B. A. Characterization of individual histone posttranslational modifications and their combinatorial patterns by mass spectrometry-based proteomics strategies. Methods in Molecular Biology. 1528, Clifton, N.J. 121-148 (2017).
- Maile, T. M., et al. Mass spectrometric quantification of histone post-translational modifications by a hybrid chemical labeling method. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 1148-1158 (2015).
- Dang, X., et al. The first pilot project of the consortium for top-down proteomics: a status report. Proteomics. 14 (10), 1130-1140 (2014).
- Schaffer, L. V., et al. Identification and quantification of proteoforms by mass spectrometry. Proteomics. 19 (10), 1800361 (2019).
- Cupp-Sutton, K. A., Wu, S. High-throughput quantitative top-down proteomics. Molecular Omics. , (2020).
- Varoquaux, N., et al. Transcriptomic analysis of field-droughted sorghum from seedling to maturity reveals biotic and metabolic responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 27124 (2019).
- Gordon, J. A. Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor. Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).
- Zhou, M., et al. Profiling changes in histone post-translational modifications by top-down mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1507, Clifton, N.J. 153-168 (2017).
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Kou, Q., Xun, L., Liu, X. TopPIC: a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization. Bioinformatics (Ocford, England). 32 (22), (2016).
- Park, J., et al. Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics. Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).
- LeDuc, R. D., et al. The C-Score: a bayesian framework to sharply improve proteoform scoring in high-throughput top down proteomics. Journal of Proteome Research. 13 (7), 3231-3240 (2014).
- Fornelli, L., et al. Advancing top-down analysis of the human proteome using a benchtop quadrupole-orbitrap mass spectrometer. Journal of Proteome Research. 16 (2), 609-618 (2017).
- Sun, R. X., et al. pTop 1.0: A high-accuracy and high-efficiency search engine for intact protein identification. Analytical Chemistry. 88 (6), 3082-3090 (2016).
- Xiao, K., Yu, F., Tian, Z. Top-down protein identification using isotopic envelope fingerprinting. Journal of Proteomics. 152, 41-47 (2017).
- Cai, W., et al. MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (2), 703-714 (2016).
- Zhou, M., et al. Top-down mass spectrometry of histone modifications in sorghum reveals potential epigenetic markers for drought acclimation. Methods. , San Diego, Calif. (2019).
- Garcia, B. A., Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Pervasive combinatorial modification of histone H3 in human cells. Nature Methods. 4 (6), 487-489 (2007).
- Zheng, Y., et al. Unabridged analysis of human histone H3 by differential top-down mass spectrometry reveals hypermethylated proteoforms from MMSET/NSD2 overexpression. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (3), 776-790 (2016).
- Garcia, B. A., et al. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).
- Holt, M. V., Wang, T., Young, N. L. One-pot quantitative top- and middle-down analysis of GluC-digested histone H4. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2514-2525 (2019).
- Tian, Z., et al. Enhanced top-down characterization of histone post-translational modifications. Genome Biology. 13 (10), (2012).
- Wang, Z., Ma, H., Smith, K., Wu, S. Two-dimensional separation using high-pH and low-pH reversed phase liquid chromatography for top-down proteomics. International Journal of Mass Spectrometry. 427, 43-51 (2018).
- Gargano, A. F. G., et al. Increasing the separation capacity of intact histone proteoforms chromatography coupling online weak cation exchange-HILIC to reversed phase LC UVPD-HRMS. Journal of Proteome Research. 17 (11), 3791-3800 (2018).
