Summary
Protokollen er udviklet til effektivt at udtrække intakte histoner fra sorghum bladmaterialer til profilering af histone post-translationelle modifikationer, der kan tjene som potentielle epigenetiske markører til støtte engineering tørke resistente afgrøder.
Abstract
Histoner tilhører en familie af stærkt bevarede proteiner i eukaryoter. De pakker DNA ind i nukleosomer som funktionelle enheder af chromatin. Postoversættelsesændringer (PTM'er) af histoner, som er meget dynamiske og kan tilsættes eller fjernes af enzymer, spiller afgørende roller i reguleringen af genekspression. I planter er epigenetiske faktorer, herunder histone-PTM'er, relateret til deres adaptive reaktioner på miljøet. Forståelse af de molekylære mekanismer i epigenetisk kontrol kan give hidtil usete muligheder for innovative bioengineeringsløsninger. Heri beskriver vi en protokol til at isolere kernerne og rense histoner fra sorghum bladvæv. De udvundne histoner kan analyseres i deres intakte former ved top-down massespektrometri (MS) kombineret med online omvendt fase (RP) flydende kromatografi (LC). Kombinationer og støkiometri af flere PTMs på samme histone proteoform kan let identificeres. Derudover kan histone hale klipning påvises ved hjælp af top-down LC-MS workflow, således at give den globale PTM profil af centrale histoner (H4, H2A, H2B, H3). Vi har anvendt denne protokol tidligere til at profilere histone PTMs fra sorghum bladvæv indsamlet fra en storstilet feltundersøgelse, der har til formål at identificere epigenetiske markører for tørkeresistens. Protokollen kan potentielt tilpasses og optimeres til chromatin immunoprecipitation-sekventering (ChIP-seq), eller til at studere histone PTMs i lignende planter.
Introduction
Tørkens stigende alvor og hyppighed forventes at påvirke kornafgrødernes produktivitet1,2. Sorghum er en kornfødevare - og energiafgrøde , der er kendt for sin ekstraordinære evne til at modstå vandbegrænsende forhold3,4. Vi forfølger mekanistisk forståelse af samspillet mellem tørke stress, planteudvikling, og epigenetik af sorghum [Sorghum bicolor (L.) Moench] planter. Vores tidligere arbejde har vist stærke forbindelser mellem plante og rhizosfære mikrobiom i tørke akklimatisering og reaktioner på molekylært niveau5,6,7. Denne forskning vil bane vejen for at udnytte epigenetisk teknik til at tilpasse afgrøder til fremtidige klimascenarier. Som en del af indsatsen for at forstå epigenetik sigter vi mod at studere proteinmarkører, der påvirker genekspressionen i planteorganismen.
Histoner tilhører en meget bevaret familie af proteiner i eukaryoter, der pakker DNA i nukleosomer som grundlæggende enheder af kromatin. Postoversættelsesændringer (PTM'er) af histoner reguleres dynamisk for at kontrollere kromatinstrukturen og påvirke genekspression. Ligesom andre epigenetiske faktorer, herunder DNA-methylering, spiller histone PTMs vigtige roller i mange biologiske processer8,9. Antistof-baserede assays såsom vestlige blots har i vid udstrækning været brugt til at identificere og kvantificere histone PTMs. Desuden kan samspillet mellem histone PTMs og DNA effektivt undersøges ved Chromatin immunoprecipitation – sekventering (ChIP-seq)10. I ChIP-seq beriges chromatin med specifik målrettet histone PTM af antistoffer mod den specifikke PTM. Derefter kan DNA-fragmenter frigives fra den berigede kromatin og sekventeres. Regioner af gener, der interagerer med den målrettede histone PTM er afsløret. Men alle disse eksperimenter er stærkt afhængige af antistoffer af høj kvalitet. For nogle histonevarianter/homologer eller kombinationer af PTM'er kan udvikling af robuste antistoffer være ekstremt udfordrende (især for flere PTM'er). Derudover kan antistoffer kun udvikles, hvis den målrettede histone PTM er kendt. 11 Det er derfor nødvendigt med alternative metoder til ikke-målrettet, global profilering af histone-PTM'er.
Massespektrometri (MS) er en supplerende metode til at karakterisere histone-PTM'er, herunder ukendte PTM'er, for hvilke antistoffer ikke er tilgængelige11,12. Den veletablerede "bottom-up" MS-arbejdsgang bruger proteaser til at fordøje proteiner i små peptider før væskekromatografi (LC) adskillelse og MS-detektion. Fordi histoner har et stort antal grundlæggende rester (lysin og arginin), skærer trypsin fordøjelsen (protease specifik for lysin og arginin) i standard bottom-up workflow proteinerne i meget korte peptider. De korte peptider er teknisk vanskelige at analysere af standard LC-MS, og bevarer ikke oplysningerne om tilslutningsmuligheder og støkiometri af flere PTM'er. Brugen af andre enzymer eller kemisk mærkning til at blokere lysiner genererer længere peptider, der er mere egnede til karakterisering af histone PTMs13,14.
Alternativt kan fordøjelsestrinnet udelades fuldstændigt. I denne "top-down" tilgang introduceres intakte proteinioner i MS ved elektrosprayionisering (ESI) efter online LC-adskillelse, hvilket giver ioner af de intakte histone-proteoformer. Desuden kan ioner (dvs. proteoformer) af interesse isoleres og fragmenteres i massespektrometeret for at give sekvensionerne til identifikation og PTM-lokalisering. Derfor top-down MS har den fordel at bevare proteoform-niveau oplysninger og fange tilslutningen af flere PTMs og terminal afkortninger på samme proteoform15,16. Top-down-eksperimenter kan også give kvantitativ information og give indsigt i biomarkører på det intakte proteinniveau17. Heri beskriver vi en protokol til at udtrække histone fra sorghumblad og analysere de intakte histoner ved top-down LC-MS.
De eksempeldata, der er vist i figur 1 og figur 2, er fra sorghumblad indsamlet i uge 2 efter plantningen. Selv om der forventes variation i udbyttet, er denne protokol generelt agnostiker over for specifikke prøvebetingelser. Den samme protokol er med succes blevet brugt til sorghum plantebladvæv indsamlet fra 2, 3, 5, 8, 9 og 10 uger efter plantning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tilberedning af sorghumbladmateriale
BEMÆRK: Sorghumplanterne blev dyrket i jord i marken i Parlier, CA.
- Opsamle sorghum blade fra planter i 50 mL centrifuge rør og straks fryse røret i flydende nitrogen. Indsamle bladvæv ved at rive den tredje og fjerde fuldt fremkomne blad fra den primære rorpind.
BEMÆRK: Flere detaljer om felttilstand, stikprøvevækst og indsamling findes i den offentliggjorte rapport18. - Grind blade med flydende nitrogen og straks overføre til en centrifuge rør.
- Jordbladet opbevares ved -80 °C, indtil det er i brug. Tag omkring 4 g kryo-malet bladpulver til histoneanalyse af hver prøve.
2. Forberedelse af buffere og materialer (3-4 timer)
BEMÆRK: De høje koncentrationsbestandsløsninger kan laves på forhånd og opbevares indtil brug. Men alle arbejdsbuffere skal gøres friske på ekstraktionsdagen (ved fortynding fra lageret og blanding med andet indhold) og placeres på is under processen. Hele forsøget skal udføres ved 4 °C, medmindre andet anbefales.
- Der fremstilles 2,5 M saccharose ved opslysning af 42,8 g saccharose (342,30 g/mol) i 15 mL sterilt vand på varmepladen i en glasbeholder under konstant omrøring. Volumenet bringes op til 50 mL, når saccharosesen er helt opløst. Saccharoseen opbevares i 4 °C, indtil den anvendes.
- Forbered 1 M Tris pH 8 ved at opløse 1,576 g Tris HCl i 10 mL H2O i et 15 mL centrifugerør. Juster pH med NaOH til 8 og tjek med pH-papir. Den opbevares ved 4 °C, indtil den er i brug.
- Der fremstilles 1 M Dithiothreitol (DTT) ved at veje 231 mg DTT (154,25 g/mol) og opløse det i 1,5 mL sterilt vand. DTT skal være fersk eller opbevares frosne aliquots.
- (Valgfrit) Forbered de ekstra hæmmere ved at blande tre forskellige salte. Der fremstilles 18,38 mg natrium orthovanadat (183,91 g/mol) i 1 mL sterilt vand, og der fremstilles derefter natrium butyrat separat ved tilsætning af 11,008 mg natrium butyrat (110,09 g/mol) i 1 mL sterilt vand. Det endelige salt fremstilles ved at tilsætte 4,199 mg natriumfluorid (41,99 g/mol) i 1 mL vand. Bland de tre saltopløsninger sammen i samme volumen som stamopløsning for "yderligere hæmmere" (33 mM af hver af de tre kemikalier).
BEMÆRK: Natriumcarfat polymeriserer i koncentrationer på over 0,1 mM under neutral pH. Det tilrådes at aktivere natrium vanadate at depolymerisere det for maksimal effekt efter offentliggjorte protokoller19. Alternativt er aktivt natriumcaradat kommercielt tilgængeligt. Heri blev natriumcaradat ikke aktiveret med vilje, så effekten bliver ikke reduceret. Aktiveret natriumcaradat er endnu ikke testet for denne protokol. - Der fremstilles 1 M MgCl2 ved opløsning af 0,952 g vandfri magnesiumchlorid (95,2 g/mol) i 10 mL H2O i et 15 mL centrifugerør. 1 M MgCl2 opbevares ved 4 °C, indtil den anvendes.
- Forbered 10% (v/v) Triton X-100 ved at blande 53,5 g Triton X-100 med 35 mL sterilt vand, bring op til 50 mL med vand og opbevar det ved stuetemperatur.
- Forbered 5% Guanidine buffer pH7 (benævnt "Gdn buffer"), der vil blive brugt til at konditionere harpiksen mindst natten over – forbered 0,1 M kalium hydrogenphosphatdibasic (K2HPO4)ved at veje 870 mg K2HPO4 og opløse i 50 ml sterilt vand og opbevare ved 4 °C.
- Der afvejes 0,7 g guanidinhydrochlorid, og der opløses i 0,1 M K2HPO4 til et slutvolumen på 14 mL. Juster pH til 7 ved at kontrollere med pH-papir.
- Blød den tørre svage kation udveksling (WCX) harpiks i 5% Guanidine buffer pH 7 natten. Fjern supernatanten og genopfyld med frisk 5% Gdn buffer og blød den igen natten over for at lade harpiksen være helt ekvilibrerende (indtil supernatanten har samme pH som den oprindelige buffer).
- Før eksperimentet påbegyndes i næste afsnit, blandes reagenserne for at fremstille EB1-, EB2A- og EB2B-bufferen baseret på tabel 1. Tilsæt alle hæmmere og DTT frisk lige før brug.
| Reagenser | Koncentration af bestanden | EB1 | EB2A | EB2B |
| Bind (mL) | Bind (mL) | Bind (mL) | ||
| Saccharose | 2,5 mio. | 4.4 | 1.25 | 0.5 |
| Tris HCl pH8 | 1 mio. | 0.25 | 0.125 | 0.05 |
| DTT | 1 mio. | 0.125 | 0.0625 | 0.025 |
| H2O | 20.225 | 9.6875 | 4.375 | |
| protease-hæmmertablet (PI) | 0,5 pille | 0,5 pille | 0,5 pille | |
| Yderligere hæmmere (valgfrit) | 33mM | 0.25 | 0.125 | 0.05 |
| MgCl2 | 1 mio. | 0.125 | 0.05 | |
| Triton X100 | 10% | 1.25 | ||
| Samlet lydstyrke | 25 mL | 12,5 mL | 5 mL | |
Tabel 1: Sammensætning af udtræksbuffere (EL).
- Gør Nuclei Lysis Buffer (NLB) baseret på tabel 2. NLB skal forberedes på forhånd og opbevares ved 4 °C, indtil den er i brug. Tilsæt PI tabletter friske lige før brug på 1x (0,5 tablet pr 5 mL). Se tabel 2 for specifikke bind.
| Nlb | Koncentration af bestanden | Bind (mL) |
| Nacl | 5M | 0.4 |
| Tris HCl pH8 | 1 mio. | 0.05 |
| Triton X100 | 10% | 0.5 |
| Edta | 0,5 mio. | 0.2 |
| H2O | 3.85 | |
| PI-tablets | 0,5 pille | |
| Yderligere hæmmere (valgfrit) | 33mM | 0.05 |
| Samlet lydstyrke | 5 mL |
Tabel 2: Sammensætning af nuclei lysis buffer (NLB).
3. Nuclei-isolationsproceduren
BEMÆRK: Det anbefales at udføre trin 3.1-3.3 i den første dag (2-3 timer), gemme kernerne i NLB-bufferen ved -80 °C og genoptage den følgende dag (eller senere) til proteinrensning (4 timer). Kerneisoleringstrinnene i denne protokol blev tilpasset fra en sorghum ChIP-seq-protokol, der anvendes på Det Fælles Genome Institut. Der kan være behov for yderligere vask og saccharosegradientadskillelse for at sikre kernerenhed til ChIP-seq-applikationer.
- Filtrering af snavs (~0,5 h)
- Vejet bladpulver ~4 g, og sørg for, at det forbliver frosset ved at anbringe tøris eller flydende nitrogen, indtil det er klar til brug.
- Der tilsættes proteasehæmmertabletter til EB1 til en endelig koncentration på 0,2x (0,5 tablet for 25 mL pr. prøve). Brug en miniature plast pestle eller en pipette spids til at pre-knuse tabletter i en mikrocentrifuge rør før tilsætning til buffere til støtte i opløsning af tabletten i bufferen. For at forhindre materialetab skal du tilføje PI-tabletten og sonikere bufferen for at opløse tabletten.
- Tilsæt 20 mL EB1 til det frosne jordbladpulver, forsigtigt vortex og bland dem, indtil pulveret er helt suspenderet. Fortsæt med at blande forsigtigt i ~ 10 min.
- Filtrer gennem mesh 100, skylning af det filtrerede materiale to gange med 2 mL EB1 hver gang.
BEMÆRK: Både filtratet og det filtrerede affald skal være grønt. Hvis man sporer ved hjælp af et mikroskop, skal man kunne se intakte kerner og intakte kloroplaster i filtratet på dette tidspunkt. Størstedelen af tyktarmen skal være fraværende/udtømt. Bland farvestoffer som methylenblåt med prøve. Nuclei kan let observeres som ~ 3-5 μm diameter mørkeblå / akvamarin kugler, når visualiseret ved hjælp af en 20x, 40x, og / eller 100x mål. I forhold til kerner er kloroplaster ens i størrelse, men grønlige i farve og ofte mere ovale i form. Vacuoles ligner også kerner i størrelse og form, men de vil ikke let tage op Methylen blå farvestof. - Centrifuge det kombinerede filtrat ved 3.000 x g i 10 minutter ved 4 °C i en svingende skovlrotor til pelletrester og store subcellulære organeller, herunder kerner og kloroplaster.
BEMÆRK: Det anbefales at forberede EB2A under dette spin (se trin 3.2.1). - Dekanter supernatanten, og pas på ikke at forstyrre pelleten.
BEMÆRK: Da der endnu ikke er tilsat vaskemiddel, skal pelletlen forblive intens grøn, og supernatanten skal højst være lysegrøn/gul.
- Lysis af ikke-målorganeller (~0,5 h)
- Forbered EB2A ved at tilsætte proteasehæmmere til en endelig koncentration på 0,4x (0,5 tablet pr. 12,5 mL EB2A).
- Resuspend pellet fra trin 3.1.6 i 5 mL EB2A og inkuber på is i 10 minutter med blid blanding.
BEMÆRK: Vaskemiddelkoncentrationen skal optimeres til fortrinsvis lyse intakte celler og kloroplaster, men ikke kerner. Den krævede mængde kan variere mellem organismer. Det anbefales at kontrollere for lysis af kloroplaster og opbevaring af intakte kerner under mikroskop. - Centrifuge ved 2.100 x g i 15 minutter ved 4 °C i en svingende skovlrotor til pelletrester og kerner.
BEMÆRK: På dette stadium skal supernatanten være intenst grøn, og pellet skal være meget mindre grøn end observeret i de foregående faser på grund af lysis af kloroplaster og klorofyludslip i cytosolen. - Dekanter supernatanten, og pas på ikke at forstyrre pelleten.
- Isolering af kerner fra de resterende cytoplasmiske forurenende stoffer (~0,5 h)
- Forbered EB2B ved at tilsætte proteasehæmmere til en endelig koncentration på 1x (0,5 tablet pr. 5 mL EB2B).
- Genbrug af rå kernepiller fra trin 3.2.3 i 2 mio.
BEMÆRK: EB2B indeholder ikke Triton X-100, så der bør ikke forekomme yderligere lysis på nuværende tidspunkt. - Centrifuge ved 2.100 x g i 15 minutter ved 4 °C i en svingende skovlrotor til pelletrester og kerner.
BEMÆRK: Små organeller og cytoplasmiske komponenter bør ikke pellet, så de bør forblive i supernatanten. - Dekanter supernatanten, og pas på ikke at forstyrre pelleten.
- Pelletpen opsættes igen ved hjælp af 250 μL NLB (tilsæt 0,5 proteasehæmmertablet frisk til 5 mL).
BEMÆRK: Målet er at genbruge kernerne i et minimum af NLB uden væsentlige materielle tab. Fordi NLB er meget tyktflydende, og pellets indeholder en stor mængde uopløseligt snavs, er det meget vanskeligt at pipette og har tendens til at klamre sig til indersiden af pipettespidser. Af denne grund anbefales det at genbruge den samme pipettespids, når det er muligt. Hvis det drejer sig om restmateriale i en pipettespids, skal du blot hænge pipetten fra en hylde eller et stativ i ~1 min. for at gøre det muligt for tyngdekraften at samle materiale ved spidsens åbning. Du må ikke aggressivt pipette for at genbruge pellets. Brug i stedet pipettespidsen som rørestang, indtil det pelleterede materiale kan suges ind i pipettespidsen. dvs. det er helt fint for store pellet klumper at bo på dette tidspunkt, så længe det kan trækkes ind i en pipette spids. - Vortex 15 s ved max at homogenisere og delvist genbruge materialet. Sonicate i 5 min ved 4 °C, derefter opbevares ved -80 °C.
BEMÆRK: For efterfølgende trin skal du være opmærksom på, at den samlede mængde NLB, der tilsættes, er 250 μL, men prøvens samlede synlige volumen kan være op til dobbelt så meget på grund af uopløseligt snavs. Prøven fryses og optøs for at hjælpe med lysis af kerner.
- Nuclei lysis og histone udvinding (~4 h)
- Der tilsættes 750 μL 5% Gdn-buffer til den optøede prøve. Sonicate i 15 minutter ved 4 °C.
- Prøven overføres til et enkelt 2 mL rør, og der spins 10.000 x g i 10 min ved 4 °C.
BEMÆRK: Supernatanten vil sandsynligvis se grøn ud. Følgende kromatografitrin bør fjerne de fleste pigmenter fra proteinet. - Mens du venter på trin 3.4.1 og 3.4.2, skal kolonnen forberedes til ionbytningskromatografioprydning. Kromatografisøjlen skylles med 2 ml acetonitril og 4 ml vand for at minimere kontaminering på overfladen.
- 200~300 μL WCX-harpiks (forbetinget med 5% Gdn-buffer) indlæses på kromatografikolonnen. Lad harpiksen falde til ro. Vask fire gange med 1 mL 5% Gdn buffer. Hold røret og søjlen på is i resten af rensningstrinnene.
- Sæt kromatografikolonnen på et 2 mL opsamlingsrør. Lad supernatanten fra trin 3.4.2 langsomt på harpiksbunden uden at forstyrre harpiksen (prøv langsomt at falde fra siden af rørene). Lad opløsningen flyde igennem ved tyngdekraften. Når opløsningen strømmer igennem, skal du lade eluenten tilbage til toppen af kolonnen 6-8 gange for at tillade maksimal binding til harpiksen. Kassér derefter eluent.
- Belastning 2 mL af 5% Gdn buffer til at vaske ikke-histone proteiner fra kolonnen. Kassér eluent.
- Elute histoner med 1 mL 20% Gdn buffer. Saml eluent, som indeholder histoneproteiner.
- Brug 3 kDa-spinfilter (MWCO) (molecular weight cut off) (0,5 mL) til at afsalte eluent fra trin 3.4.6. Før brug fyldes 500 μL vaskeopløsningsmiddel (0,2% myresyre i 3% ACN) og drej det ned to gange for at rengøre filteret.
BEMÆRK: Det anbefales at begynde at vaske MWCO-filteret, mens du udfører harpikskromatografitrinnene for at spare tid. Følgende trin til spinfilter tager ~3-4 timer. - Første belastning 500 μL histoneprøve, spin ved 14.000 x g i ~ 25 min for at reducere volumen ned til ~ 100 μL. Derefter indlæses yderligere 400 μL prøve og spin ved 14.000 x g igen i ~ 25 min. De sidste 100 μL prøven skal fyldes, prøveglasset skylles med 300 μL vaskeopløsningsmiddel, og opløsningsmidlet indlæses i filteret. Spin på 14.000 x g igen i ~ 25 min.
- Lad 400 μL vaskeopløsningsmiddel, spin ved 14.000 x g i ~ 25 min for at reducere volumen til ~ 100 μL eller mindre. Hver cyklus reducerer saltkoncentrationen med en femtedel. Gentag for yderligere tre cyklusser for at bringe guanidin koncentration til ~ 0,01%. Vend filteret i et rent opsamlingsrør, og drej ved 1.000 x g i 2 min. Den rensede histoneprøve skal kasseres ved -20 °C eller -80 °C til analyse.
BEMÆRK: Det anbefales at dreje længere (30-40 min) ved sidste trin for at minimere prøvevolumen for at opnå højere koncentration. Volumenet skal kunne gå ned til 50-70 μL.
4. Massespektrometri af rensede histoner
- Erhvervelse af flydende kromatografimassespektrometri (LC-MS)
- Estimer proteinkoncentrationen ved bicinchoninsyreanalyse (BCA) efter producentens protokol.
BEMÆRK: BCA kan kun give et skøn over den samlede proteinkoncentration, men ikke kvaliteten af histonerensning. Hvis MS-instrumentering ikke er let tilgængelig til kontrol af kvaliteten af histonerensning, kan western blot anvendes. Omvendt fase LC kombineret med 210 nm ultraviolet absorbansdetektion som beskrevet i vores tidligere rapport kan også bruges20. Kromatogrammet kan sammenlignes med en kendt standard for kontrol af prøvekvaliteten. Forskellige organismer kan dog have forskellige elueringsprofiler. Derfor anbefales det stærkt at bruge histonestandarder fra lignende organismer. - Tilslut en C18 omvendt fase (RP) analytisk kolonne (f.eks. 3 μm 300 Å, søjlens indre diameter 75 μm, ydre diameter 360 μm, længde 70 cm) og en C18-fældekolonne (f.eks. 3,6 μm, kolonneindviklet diameter 150 μm, ydre diameter 360 μm, længde 5 cm) til et dual-pumpe nanoflow væskekromatografisystem (f.eks. Waters NanoAcquity). De binære opløsningsmidler er A: 0,1% myresyre i vand, og B: 0,1% myresyre i acetononitril.
BEMÆRK: Den dobbelte pumpe-LC omfatter en vaskepumpe og en gradientpumpe. Begge pumper gennemgår to faser i hver analyse – et fældefangststadium efterfulgt af analysefasen. I diffuseringsfasen strømmer vaskepumpen ind i fældekolonnen, og gradientpumpen strømmer ind i analysekolonnen. I analysefasen kombineres diffuseringskolonnen med analysekolonnen, og gradientpumpen strømmer ind i begge kolonner. Vaskepumpen går derefter til affaldet. - Diffuseringsstadie: Opsæt rembursmetoden til første indlæsning af 1-2 μg histoneprøve på diffuseringskolonnen. Afsalt prøven med vaskepumpen ved 3 μL/min. 5% opløsningsmiddel B i 10 min. Analysepumpen indstilles til 0,3 μL/min. 5% opløsningsmiddel B for ækvilibrering.
- Analytisk fase: Indstil gradientpumpen (0,3 μL/min.) til at starte ved fra 5% B og rampe til 30% ved 15 min. Derefter øges til 41% B ved 100 min før en høj organisk vask op til 95% B i slutningen.
BEMÆRK: Forløbet kan optimeres afhængigt af de forskellige opbevaringsprofiler på individuelle kolonner. Typisk, fuld længde histoner elute omkring 30%-40% B på de angivne LC betingelser. Længere gradienter kan bruges til at øge antallet af MS2-spektre for at fange flere histone-proteoformer. - Konfigurer dataafhængig anskaffelsesmetode på en MS-funktion med høj opløsning (f.eks. Thermo Orbitrap Fusion Lumos eller lignende) med etd-kapacitet (Electron Transfer Dissociation). Brug intakt proteintilstand, og udfør alle de nødvendige kalibreringer som foreslået af producenten. Kritiske parametre er beskrevet nedenfor. Disse vil være specifikke for det anvendte instrument.
- MS1: scanningsområde 600-2.000 m/z, opløsning 120k (ved m/z 200), 4 mikroscans, AGC-mål 1E6, maks. injektion 50 ms.
- MS2: opløsning 120k; 1 mikroscanning; AGC-mål 1E6; dataafhængig MS/MS: vekslende ETD (25 ms reaktionstid, maks. injektionstid 500 ms) og kollisionsafkobling med højere energi (HCD, 28 % normaliseret kollisionsenergi med ±5 % trinsenergi, maks. injektionstid 100 ms) isolationsvindue på 0,6 Da; højeste opladningsstater.
- Dynamisk udelukkelse: 120 s tidsvindue, ±0,7 Da masse vindue. Ekskluder gebyrstater, der er lavere end 5, og ikke-fastsatte opladningstilstande.
- Kør et par injektioner af peptid eller histone standarder på nye kolonner til at ekvilibrere og kontrollere systemet, før du kører de faktiske prøver. Til kørsel af et stort antal prøver tilsættes korte emner eller vaskes ind mellem prøverne for at minimere overførsel. Lad kolonnerne ekvilibrere i 15-20 minutter ved starttilstanden (5% opløsningsmiddel B) før næste prøve.
BEMÆRK: Længere LC-gradienter og højere maksimal injektionstid for MS2 kan forbedre spektralkvaliteten for at identificere flere histone-proteoformer.
- Estimer proteinkoncentrationen ved bicinchoninsyreanalyse (BCA) efter producentens protokol.
- LC-MS databehandling og proteoform identifikation
- Få fat i (sorghum) proteinsekvensen i FASTA-format fra JGI (https://genome.jgi.doe.gov) eller UniProt (https://www.uniprot.org/).
- Brug MSConvert21 (http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtml) til at konvertere instrumentets rå datafiler (*.raw) til mzML-format.
- Hent TopPIC suite22 (http://proteomics.informatics.iupui.edu/software/toppic/) til databehandling. Programmet kan køres på enten kommandolinjen eller via den grafiske grænseflade.
- Brug TopFD i TopPIC-pakken til at dekonvolutere spektre fra mzML-filen fra trin 4.2.2. Standardparametrene kan bruges. Men "forløbervinduet" (-w) skal reduceres til 1 m/z, fordi der bruges et smalt isolationsvindue.
- Brug TopPIC i TopPIC-suiten til at identificere proteoformer. De fleste standardparametre kan bruges. Indstil spektret og proteoform cutoff type til FDR (falsk opdagelse sats) og indstille cutoff værdi til 0,01 (1% FDR) eller som ønsket. Angiv "proteoform-fejltolerancen" til 5 (Dalton). Indlæs FASTA-filen fra trin 4.2.1 og filen "*_ms2.msalign" fra trin 4.2.4. Start derefter søgningen.
BEMÆRK: Indstillingen "proteoform fejltolerance" kombinerer proteoformer med lignende masser (± 5 Da) som en. Dette er med til at reducere antallet af afskedigelser i proteoformen. Det bør dog bruges med forsigtighed, fordi stor tolerance vil fusionere proteoforms med små eller ingen masseforskelle. Denne parameter er kun tilgængelig i TopPIC version 1.3 eller nyere. - De identificerede proteoforms kan undersøges i "*_proteoform.csv"-filen eller visualiseres ved hjælp af Topview-modulet under mappen "*_html" i outputtet.
- Listen over proteoforms, der genereres ud fra ovenstående trin ved hjælp af TopPIC, angiver histone-PTM'erne som masseskift. Hvis du vil lokalisere individuelle PTM'er, skal der medtages en ændringsliste. Detaljeret beskrivelse findes i TopPIC manualen. Alternativt kan du gå videre til næste trin for at udføre en supplerende dataanalyse ved hjælp af Informed-Proteomics-pakke23 (https://github.com/PNNL-Comp-Mass-Spec/Informed-Proteomics).
- Følg vejledningen, og brug PbfGen-modulet til at konvertere instrumentets rådata til en PBF-fil. Dekonvoluter derefter MS1-dataene ved hjælp af ProMex-modulet for at udskrive en ms1ft-fil (funktionslisten, hver funktion repræsenterer en unik kombination af masse- og retentionstid).
- Opret en fokuseret FASTA for Informed-Proteomics ved hjælp af den identificerede proteinliste fra TopPIC i trin 4.2.6.
BEMÆRK: Søgning i hele genomet ved hjælp af Informed-Proteomics med stort antal variable PTM'er kan være ekstremt langsom og kan forårsage nedbrud. Derfor anbefales det at reducere størrelsen af FASTA ved kun at inkludere målproteinerne. - Opret en målrettet ændringsliste for at søge efter HISTONE-PTM'er efter formatet i eksempelfilen. De almindelige PTM'er, der skal omfattes, er: Lysinacetylering, lysinmono-methylering, lysindi-methylering, serin/threonine/tyrosinphoosphorylation, protein N-terminal acetylering, methionin/cysteinoxidation. For sorghum tilsættes protein N-terminal mono-methylering, di-methylering og trimethylering.
BEMÆRK: Informed-Proteomics søger kun efter PTM'er, der er angivet på listen. Hvis der findes uspecificerede PTM'er, identificeres proteoformen muligvis ikke, eller den kan fejlagtigt identificeres til andre proteoforms. PTM-listen skal dog holdes så kort som muligt for at minimere søgetiden. - Udfør MSPathFinder-modulet for at identificere proteoformularer ved hjælp af filerne fra trin 4.2.8, den fokuserede FASTA fra trin 4.2.9 og ændringslisten fra trin 4.2.10. Standardparametrene kan bruges.
- Resultaterne kan visualiseres i LcMsSpectator ved at indlæse alle resultatfilerne.
BEMÆRK: Andre bioinformatikværktøjer er tilgængelige til behandling og visualisering af top-down-data, hver med sine egne styrker24,25,26,27,28. Sorghum og mange andre organismer har begrænset kendte oplysninger om histone PTMs i databasen. Brug TopPIC først til at identificere masseskift fra PTM'er. Denne analyse kan let opdage både kendte og ukendte PTM'er. Derefter kan de fundne PTM'er søges på en målrettet måde enten ved at angive en PTM-liste i TopPIC eller med andre komplementære værktøjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter protokollen kan histonerne udtrækkes og identificeres ved hjælp af LC-MS-analysen. De rå data og behandlede resultater er tilgængelige på MassIVE (https://massive.ucsd.edu/) via tiltrædelse: MSV000085770. Baseret på TopPIC resultater fra den repræsentative prøve (fås også fra MassIVE), identificerede vi 303 histone proteoforms (106 H2A, 72 H2B, 103 H3, og 22 H4 proteoforms). Co-renset ribosomal proteoforms er også blevet opdaget, typisk eluting tidligt i LC. De består normalt af ~ 20% af de identificerede proteoforms, men overlapper ikke med histone proteoforms eluting i den senere fase af LC gradient. Resultaterne kan nemt visualiseres med de nyeste TopPIC- eller Informed-Proteomics-pakker. Til demonstration vil vi fokusere på datavisualisering ved hjælp af Informed-Proteomics-pakken, som kan bruges til direkte at indlæse rå MS-filer og manuelt undersøge proteoformidentifikationer. Bemærk, at begge softwarepakker bruger forskellige algoritmer og parametre. De rapporterede antal proteoforms vil ikke være identiske. Vi anbefaler, at du rapporterer proteoformtællingerne fra TopPIC, fordi det er mere konservativt, og det betragter ukendte PTMs. Informed-Proteomics-pakken har integreret databehandling og visualisering for nem manuel validering. For organismer med godt kommenterede PTM'er anbefaler vi ProSightPC24 for bedste lokalisering af webstedet. Hvis du kombinerer resultaterne ved hjælp af flere værktøjer, kan det øge antallet af proteoformidentifikationer og tilliden til proteoformidentifikationer.
Efter behandling af data med Informed-Proteomics kan LC-MS-funktionskortet visualiseres i LcMsSpectator, som viser de dekonvoluterede proteinmasser mod LC-retentionstiden. Ved at klikke på de identificerede proteoforms i softwaren fremhæves den tilknyttede funktion med et lille grønt rektangel i funktionskortet. Større histoneproteiner skal ses i specifikke områder af kortet, hvilket indikerer eksperimentets succes. Figur 1a viser et repræsentativt LC-MS-funktionskort over intakte histoner. Histone-proteoformer i fuld længde fremhæves i de stiplede bokse. De fleste fundne proteoforms kan trygt identificeres ved hjælp af MS2-data.
Figur 1b viser zoom ind i regionen med H2A- og H2B-proteoforme. De fleste af dem har N-terminal modifikationer af 42 Da. Denne nominelle masse svarer til enten trimethylering (42,05 Da) eller acetylering (42,01 Da), som almindeligvis ses for histoner. Deres nøjagtige masser adskiller sig kun med 0,04 Da og er vanskelige at skelne på det intakte proteinniveau (~ 2 ppm). I ms2-spektre med høj opløsning kan PTM'erne let differentieres og bekræftes på grund af fragmenternes lavere masse29. Desuden har H2A og H2B histoner flere homologer med meget lignende sekvenser som bemærket af de forskellige UniProt tiltrædelse numre i figur 1b. Igen kan LC-MS-analyse med høj opløsning let identificere og differentiere dem. To typer af H2As blev identificeret for sorghum histoner. De 16 kDa H2A histoner i figur 1b har udvidet terminal haler i de ikke-bevarede regioner histoner. En anden gruppe H2A histoner uden de udvidede haler (14 kDa) kan ses i figur 1c.
For H4 histoner blev N-terminal acetylering identificeret som den største PTM. Yderligere lysinacetyler og methioninoxidationer kan også observeres blot ved at undersøge masseforskellene mellem funktionerne i figur 1d. Vi observerede også en ukendt ændring af 112,9 Da ud over N-terminalen acetylering (funktionen ovenfor "3Ac" i figur 1d). Dette er sandsynligvis nogle ukendte addukter fra det reagens, der anvendes i præparatet. Vi har tidligere opdaget sulfation adducts på H4, som kan tilskrives resterende salte kombineret med høj basicitet af histone proteiner. For H3 blev der identificeret to proteinsekvenser H3.3 og H3.2 (figur 1e). Selvom disse to proteinsekvenser kun adskiller sig ved 4 rester (32, 42, 88 og 91), kan de stadig let skelnes i LC-MS baseret på adskillelsen i begge dimensioner, masse og retentionstid. H3 proteiner er stærkt modificeret ved varierende grader af methylering og acetylering. Den høje grad af modifikation kan let visualiseres af de tætte, parallelle linjer i funktionskortet, som er 14 Da fra hinanden. Tre methyleringsgrupper (14*3 Da) har imidlertid samme nominelle masse som en acetylering (42 Da). Da disse PTM'er ikke let kan løses på intakt proteinniveau, kaldes de "methylækvivalenter" (dvs. multipla af 14 Da; en acetylering er lig med tre methylækvivalenter). I figur 1eer H3-proteoforme mærket i form af methylækvivalenter baseret på deres intakte masse. På grund af den begrænsede opløsning af RPLC-adskillelsen er mange forskellige H3-proteoformer sandsynligvis co-eluting og fragmenteret i samme spektrum. Den her beskrevne metode vil kun identificere de mest udbredte kombinationer af methylering og acetylering som illustreret i figur 2. For mere omfattende karakterisering af H3, mere målrettet analyse er stadig påkrævet30,31.
Figur 1: LC-MS feature map på intakte histoner udvundet af sorghum blade. Figuren viser LC retention tid (i minutter) vs den molekylære masse for alle påviste proteoforms. Den log overflod er vist ved farveskalaen ved siden af det øverste kort (log 10 overflod). (a)De store histonetoppe er mærket af de stiplede bokse. De fleste af funktionerne uden for kasserne er afkortet histoner og ribosomale proteiner. Zoom-in-visninger for hver gruppe histoner: (b) H2B og 16 kDa H2A, (c) H3, (d) 14 kDa H2A og (e) H3. UniProt-tiltrædelsesnumrene noteres ved siden af hver funktion efterfulgt af fundne PTMs. "Ac", "me", "+O" angiver henholdsvis acetylering, methylering og oxidation. I (b) er to afkortede H2A C5YZA9 proteoforms mærket, som havde en eller to C-terminal alanin klippet (vist som -A *, og -AA *). Klik her for at se en større version af dette tal.
Et repræsentativt eksempel på proteoformidentifikation vises i Figur 2 ved hjælp af MSPathfinder og visualiseres i LcMsSpectator. Fragmenteringsspektret i figur 2a blev genereret ved hjælp af ETD, som giver c- og z-typeioner langs protein rygraden. HCD af samme prækursor kan bruges til at validere identifikationen, men HCD giver generelt begrænset sekvensdækning20. Prækursorionerne i de foregående og næste MS1-spektre er vist i figur 2b,c, hvor deres matchede isotoper er fremhævet med lilla. Sekvensdækningskortet i Figur 2d kan hjælpe med at lokalisere eventuelle PTM'er. En høj-tillid identifikation bør have de fleste af de fragmenter matchede, forløber ion matchede, og god sekvens dækning for at hjælpe lokalisere PTMs. I dette eksempel blev en H3.2-proteoform identificeret med to PTM'er - di-methylering på K9 og methylering på K27. Efter samme metode kan andre proteoformularer med forskellige PTM'er og terminalafkortninger valideres manuelt.
Figur 2: Repræsentativt eksempel på en identificeret histone H3.2 proteoform. H3.2 præteoform med dets (a) ETD-spektrum,b) prækursorion i det tidligere MS1-spektrum,c) prækursorion i det næste MS1-spektrum og (d) sekvensdækningskort. C-ionerne fra N-endestationen er mærket i cyan, og zionerne fra C-endestationen er i pink. To PTM'er blev identificeret og fremhævet med gult i (d) med deres masseskift kommenteret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Kvantitativ sammenligning af de påviste histoneproteoforms kan afsløre potentielle epigenetiske markører. Vi har anvendt denne protokol tidligere på 48 sorghumprøver indsamlet fra marken ("yderligere hæmmere" blev ikke brugt i denne undersøgelse)29. To forskellige genotyper af sorghum blev sammenlignet som reaktion på præ-blomstring eller post-blomstring tørke. Ved at sammenligne den relative overflod af proteoforms opdagede vi nogle interessante ændringer af afkortede histoneproteoforms, der er specifikke for prøvebetingelser som vist i figur 3. C-terminalafkortning af H4 blev kun observeret i uge 3 og 9 for nogle af prøverne(figur 3a,b). For H3.2 var N-terminal afkortede proteoforme generelt mere rigelige i uge 10(figur 3c,d). I modsætning hertil har C-terminalen afkortet H3.2 tendens til at blive set i tidligere tidspunkter (Figur 3c). Endnu vigtigere var det, at de to genotyper ikke svarede på nøjagtig samme måde. H4 C-terminalen afkortede proteoforms var betydeligt mere rigelige i BTx642 end i RTx430 (Figur 3b). Sådanne data afslører potentielle epigenetiske markører for planteudvikling og stresstolerance, der kan testes yderligere med andre teknikker.
Figur 3: Kvantitativ sammenligning af histoneproteoforms. (a)Heatmap af histone H4 proteoforms på tværs af forskellige prøver. For hver proteoform blev den overflod, der blev udtrukket fra MS-data fra top-down, normaliseret til summen af alle identificerede H4-proteoformer i hver analyse, hvilket gav den "relative overflod". Værdierne blev derefter skaleret til maksimum for hver række for bedre at kunne vise ændringerne i proteoformer med lav overflod. Den skalerede relative overflod er angivet i farvetasten i bunden af varmekortet. Vækstbetingelser er noteret på den vandrette akse (Pre: pre-blomstring tørke, Post: post-blomstrende tørke). Tre replikater er grupperet sammen og er adskilt af sorte lodrette striber fra andre forhold. For prøver mærket med stjerner blev der kun anskaffet tekniske replikater. Proteoforms er repræsenteret på den lodrette akse i formatet "startrester – slutrester: masse; ændring". (b) Relativ overflod af de afkortede H4-proteoformer 2-99 (proteoformer fremhævet med fed skrift i (a) lægges sammen) under forskellige forhold. Nøglen til symbolerne vises i forklaringen i øverste højre hjørne. Udfyldte prikker midt på fejllinjerne er gennemsnitsværdierne. c) Varmekort over H3.2 proteoforme ogd) tæthedsplot for alle identificerede N-terminalafkortede H3.2 er vist i samme format som for H4. Proteoforms mindre end 8 kDa i (c) blev udeladt for enkelhed. N-terminalen og C-terminalen afkortede H3.2 proteoforms viste forskellige reaktioner på tværs af vækstbetingelserne. Genoptrykt med tilladelse fra ELSEVIER fra ref.29. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den præsenterede protokol beskriver, hvordan man udtrækker histoner fra sorghumblad (eller mere generelt planteblad) prøver. Det gennemsnitlige histoneudbytte forventes at blive 2-20 μg pr. 4-5 g sorghumbladmateriale. Materialerne er tilstrækkeligt rene til downstream histone analyse af LC-MS (for det meste histoner med ~ 20% ribosomal proteinforurening). Lavere udbytte kan opnås på grund af stikprøvevariationer eller potentiel forkert håndtering/svigt i hele protokollen. Det er af afgørende betydning at bevare kernernes integritet, før nuclei lysis-trinnet er kritisk. derfor bør aggressiv hvirvelstrømning og pipetter undgås, før der tilsættes NLB. Derudover kan tab af kerner forekomme, når supernatanterne fjernes fra pellets. Der skal udvises forsigtighed for ikke at forstyrre pellets ved pipettering. Triton X-100 koncentrationen på 1% blev optimeret til selektivt lyse de ikke-målrettede organeller, men ikke kernerne (trin 3.2). Optimal vaskemiddelkoncentration for andet væv eller organismer kan være anderledes og skal bestemmes eksperimentelt. Farveændring af supernatanten under filtreringsprocessen kan indikere potentielle problemer som ineffektiv frigivelse af kloroplast eller utilstrækkelig slibning af blad. Hvis det er muligt, skal du bruge et mikroskop til at kontrollere lysis af kloroplaster og opbevaring af intakte kerner efter hvert trin for yderligere at optimere protokollen (især hvis du ændrer protokollen for andre væv eller planter). Denne protokol er kun blevet testet med sorghum bladvæv. Det virker ikke for sorghum rodvæv sandsynligvis på grund af interferens fra jorden. Anvendelse på andre plantebladvæv er ikke blevet testet, og anvendelse på forskellige planter kan have brug for yderligere optimering. Ved tilpasning af kerneisoleringsprotokollen til ChIP-seq-applikationer anbefales det at reducere cytoplasmisk kontaminering med yderligere saccharosegradienttæthed efter trin 3.3.4 (før brug af NLB). På grund af de omfattende oprydningstrin forventes små mængder resterende ikke-kernematerialer ikke at forårsage betydelig interferens for histoneanalyse i LC-MS og kan efterlades med pellet.
Flere indledende forsøg mislykkedes ved brug af kommercielle tabletter af fosfatasehæmmere (f.eks. PhosSTOP). Supernatanten i trin 3.1.6 syntes at være intens grøn, da tabletterne blev brugt i ekstraktionsbufferen. Det sidste uddrag viste et lavt antal identificerede histoner. Vi har mistanke om, at de proprietære ingredienser i tabletterne kan have forårsaget nuclei lysis før trin 3.4, hvilket reducerer det samlede histoneudbytte. En anden mulig årsag til fiasko er uforeneligheden af ingredienserne i histonerensningstrinnet med ionbytterharpiksen (trin 3.4). Vi har brugt denne protokol til konsekvent at udtrække høj renhed histoner til efterfølgende LC-MS over 150 prøver. I gennemsnit var vi i stand til at opnå højere udbytte uden at bruge de "ekstra hæmmere" (ikke-offentliggjorte data). Derfor anbefales det forsigtigt at teste nye hæmmere, når du ændrer eller tilpasser denne protokol til andre formål. Hvis fosforylering ikke er af interesse, kan fosfatasehæmmerne udelades i ekstraktionsbufferne.
Trinene i 3,4 kan tage 3-4 timer eller mere. Det anbefales at bryde protokollen om 2 dage - frys kernen pellet fra trin 3.3 og udføre rensningen på dag 2 (eller senere). Fryse-optøningscyklussen kan delvist hjælpe nuclei lysis. MWCO-filtertrinnene (3.4.7) kan være meget tidskrævende, men kan let skaleres op ved at forberede flere prøver parallelt. Proteasehæmmertabletterne må ikke tilsættes i trin 3.4. Mange kommercielle tabletter indeholder polymerer (f.eks. polyethene glycol) som fyldstoffer, hvilket vil forstyrre LC-MS-analysen. På dette trin skulle de fleste andre proteiner have været fjernet eller denatureret, så enzymhæmmere er ikke kritiske. Det er dog stadig nødvendigt at holde prøverne ved 4 °C eller frosne for at minimere nedbrydningen.
Efter denne protokol, kan histoner med succes udvindes fra sorghum blade. Histone PTMs kan karakteriseres med LC-MS. Metoden kan potentielt anvendes på store undersøgelser til sammenligning af histone-PTMs mellem forskellige biologiske prøver (f.eks. forskellige genotyper, planter dyrket under forskellige forhold osv.), som vist i eksempeldataene i figur 3. Databehandling kræver dog stadig omfattende manuel analyse for trygt at tildele proteoforms, især for uventede (eller nye) PTM'er. Nye udviklinger inden for bioinformatikværktøjer forventes at automatisere arbejdsgangen og øge gennemløbet for store undersøgelser betydeligt. En anden begrænsning er, at top-down MS-metoden i øjeblikket ikke let kan skelne mellem mange proteoformer af hypermodificeret H3 (f.eks. flere steder med mono/di/tri-metlylation og acetylering). Den enkelte dimension omvendt fase LC kan ikke helt adskille de forskellige H3 proteoforms. Derfor vil MS2-spektre af H3 typisk indeholde fragmenter fra flere proteoformer og kan ikke let og trygt dekonvoluteres. Ved at kombinere top-down med bottom-up eller midt-down metoder30,32,33 kan være særligt gavnligt for karakterisering af histone H3. Alternativt kan flerdimensionel adskillelse anses for at forbedre dybden af top-down MS34,35,36.
Histone PTM profilering af LC-MS gør det muligt opdagelsen af nye epigenetiske markører til at designe chromatin modifikatorer og forbedre modstandsdygtigheden af planter til alvorlige miljøforhold. En pilotundersøgelse, der anvendte sorghum fra to sorter og dyrket under tørkeforhold i marken, viste, at selektiv histoneterminalklipning i blade kan være relateret til tørkeakklimatisering og planteudvikling29. De identificerede histonemarkører kan tjene som mål ved hjælp af komplementære teknikker som ChIP-seq. En omfattende forståelse af de epigenetiske faktorer, der opnås ved disse komplementære teknikker, vil være uundværlig for at skabe innovative tekniske løsninger på afgrøder som reaktion på miljøændringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Vi takker Ronald Moore og Thomas Fillmore for at hjælpe med massespektrometri eksperimenter, og Matthew Monroe for data deposition. Denne forskning blev finansieret af tilskud fra US Department of Energy (DOE) Biological and Environmental Research gennem Epigenetic Control of Drought Response i Sorghum (EPICON) projekt under tildeling nummer DE-SC0014081, fra US Department of Agriculture (USDA; CRIS 2030-21430-008-00D), og gennem Joint BioEnergy Institute (JBEI), en facilitet sponsoreret af DOE (Contract DE-AC02-05CH11231) mellem Lawrence Berkeley National Laboratory og DOE. Forskningen blev udført ved hjælp af Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) (grid.436923.9), en DOE Office of Science User Facility sponsoreret af Office of Biological and Environmental Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4L | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-5G | |
| EDTA, 500mM Solution, pH 8.0 | EMD Millipore Corp | 324504-500mL | |
| Formic Acid | Thermo Scientific | 28905 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma | G3272-100G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| Potassium phosphate, dibasic | Sigma | P3786-100G | |
| Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tablets | Roche | 5892791001 | |
| Sodium butyrate | Sigma | 303410-5G | Used for histone deacetylase inhibitor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S1888 | |
| Sodium Fluoride | Sigma | S7020-100G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 450243-10G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sucrose | Sigma | S7903-5KG | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 g | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-100ML | |
| Weak cation exchange resin, mesh 100-200 analytical (BioRex70) | Bio-Rad | 142-5842 | |
| Disposables | |||
| Chromatography column (Bio-Spin) | BIO-RAD | 732-6008 | |
| Mesh 100 filter cloth | Millipore Sigma | NY1H09000 | This is part of the Sigma kit (catalog # CELLYTPN1) for plant nuclei extraction. Similar filters with the same mesh size can be used. |
| Micropipette tips (P20, P200, P1000) | Sigma | ||
| Tube, 50mL/15mL, Centrifuge, Conical | Genesee Scientific | 28-103 | |
| Tube, Microcentrifuge, 1.5/2 mL | Sigma | ||
| Equipment | |||
| Analytical Balance | Fisher Scientific | 01-912-401 | |
| Beakers (50mL – 2L) | |||
| Microcentrifuge with cooling | Fisher Scientific | 13-690-006 | |
| Micropipettes | |||
| Swinging-bucket centrifuge with cooling | Fisher Scientific | ||
| Vortex | Fisher Scientific | 50-728-002 | |
| Water bath Sonicator | Fisher Scientific | 15-336-120 |
References
- Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D., Basra, S. M. A. Plant drought stress: Effects, mechanisms and management. Agronomy for Sustainable Development. , 153-188 (2009).
- Dai, A. Drought under global warming: a review. Wiley Interdisciplinary Reviews: Climate Change. 2 (1), 45-65 (2011).
- Rooney, W. L., Blumenthal, J., Bean, B., Mullet, J. E. Designing sorghum as a dedicated bioenergy feedstock. Biofuels, Bioproducts and Biorefining. 1 (2), 147-157 (2007).
- Mullet, J. E., Klein, R. R., Klein, P. E. Sorghum bicolor - an important species for comparative grass genomics and a source of beneficial genes for agriculture. Current Opinion in Plant Biology. 5 (2), 118-121 (2002).
- Xu, L., et al. Drought delays development of the sorghum root microbiome and enriches for monoderm bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4284-4293 (2018).
- Gao, C., et al. Strong succession in arbuscular mycorrhizal fungal communities. ISME Journal. 13 (1), 214-226 (2019).
- Gao, C., et al. Fungal community assembly in drought-stressed sorghum shows stochasticity, selection, and universal ecological dynamics. Nature Communications. 11 (1), (2020).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
- Yuan, L., Liu, X., Luo, M., Yang, S., Wu, K. Involvement of histone modifications in plant abiotic stress responses. Journal of Integrative Plant Biology. 55 (10), 892-901 (2013).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews. Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
- Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. Quantitative proteomic analysis of histone modifications. Chemical Reviews. 115 (6), 2376-2418 (2015).
- Moradian, A., Kalli, A., Sweredoski, M. J., Hess, S. The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).
- Sidoli, S., Garcia, B. A. Characterization of individual histone posttranslational modifications and their combinatorial patterns by mass spectrometry-based proteomics strategies. Methods in Molecular Biology. 1528, Clifton, N.J. 121-148 (2017).
- Maile, T. M., et al. Mass spectrometric quantification of histone post-translational modifications by a hybrid chemical labeling method. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 1148-1158 (2015).
- Dang, X., et al. The first pilot project of the consortium for top-down proteomics: a status report. Proteomics. 14 (10), 1130-1140 (2014).
- Schaffer, L. V., et al. Identification and quantification of proteoforms by mass spectrometry. Proteomics. 19 (10), 1800361 (2019).
- Cupp-Sutton, K. A., Wu, S. High-throughput quantitative top-down proteomics. Molecular Omics. , (2020).
- Varoquaux, N., et al. Transcriptomic analysis of field-droughted sorghum from seedling to maturity reveals biotic and metabolic responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 27124 (2019).
- Gordon, J. A. Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor. Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).
- Zhou, M., et al. Profiling changes in histone post-translational modifications by top-down mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1507, Clifton, N.J. 153-168 (2017).
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Kou, Q., Xun, L., Liu, X. TopPIC: a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization. Bioinformatics (Ocford, England). 32 (22), (2016).
- Park, J., et al. Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics. Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).
- LeDuc, R. D., et al. The C-Score: a bayesian framework to sharply improve proteoform scoring in high-throughput top down proteomics. Journal of Proteome Research. 13 (7), 3231-3240 (2014).
- Fornelli, L., et al. Advancing top-down analysis of the human proteome using a benchtop quadrupole-orbitrap mass spectrometer. Journal of Proteome Research. 16 (2), 609-618 (2017).
- Sun, R. X., et al. pTop 1.0: A high-accuracy and high-efficiency search engine for intact protein identification. Analytical Chemistry. 88 (6), 3082-3090 (2016).
- Xiao, K., Yu, F., Tian, Z. Top-down protein identification using isotopic envelope fingerprinting. Journal of Proteomics. 152, 41-47 (2017).
- Cai, W., et al. MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (2), 703-714 (2016).
- Zhou, M., et al. Top-down mass spectrometry of histone modifications in sorghum reveals potential epigenetic markers for drought acclimation. Methods. , San Diego, Calif. (2019).
- Garcia, B. A., Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Pervasive combinatorial modification of histone H3 in human cells. Nature Methods. 4 (6), 487-489 (2007).
- Zheng, Y., et al. Unabridged analysis of human histone H3 by differential top-down mass spectrometry reveals hypermethylated proteoforms from MMSET/NSD2 overexpression. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (3), 776-790 (2016).
- Garcia, B. A., et al. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).
- Holt, M. V., Wang, T., Young, N. L. One-pot quantitative top- and middle-down analysis of GluC-digested histone H4. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2514-2525 (2019).
- Tian, Z., et al. Enhanced top-down characterization of histone post-translational modifications. Genome Biology. 13 (10), (2012).
- Wang, Z., Ma, H., Smith, K., Wu, S. Two-dimensional separation using high-pH and low-pH reversed phase liquid chromatography for top-down proteomics. International Journal of Mass Spectrometry. 427, 43-51 (2018).
- Gargano, A. F. G., et al. Increasing the separation capacity of intact histone proteoforms chromatography coupling online weak cation exchange-HILIC to reversed phase LC UVPD-HRMS. Journal of Proteome Research. 17 (11), 3791-3800 (2018).
