Summary
הפרוטוקול פותח כדי לחלץ ביעילות היסטונים שלמים מחומרי עלה דורה ליצירת פרופיל של שינויים פוסט-תרגומיים של היסטון שיכולים לשמש כסמנים אפיגנטיים פוטנציאליים כדי לסייע בהנדסת יבולים עמידים לבצורת.
Abstract
ההיסטונים שייכים למשפחה של חלבונים שמורים מאוד באיקריוטים. הם אורזים דנ"א לגרעין כיחידות תפקודיות של כרומטין. שינויים פוסט-תרגומיים (PTMs) של היסטונים, שהם דינמיים ביותר וניתן להוסיף או להסירם על ידי אנזימים, ממלאים תפקידים קריטיים בוויסות ביטוי גנים. בצמחים, גורמים אפיגנטיים, כולל PTMs היסטון, קשורים לתגובות הסתגלות שלהם לסביבה. הבנת המנגנונים המולקולריים של בקרה אפיגנטית יכולה להביא הזדמנויות חסרות תקדים לפתרונות הנדסה ביולוגית חדשניים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי לבודד את הגרעינים ולטהר היסטונים מרקמת עלה דורה. ההיסטונים שחולצו ניתן לנתח בצורות שלמות שלהם על ידי ספקטרומטריית מסה מלמעלה למטה (MS) יחד עם כרומטוגרפיה נוזלית הפוכה מקוונת (RP) נוזלית (LC). שילובים stoichiometry של PTMs מרובים על אותו פרוטאופורם היסטון ניתן לזהות בקלות. בנוסף, גזירת זנב histone ניתן לזהות באמצעות זרימת העבודה מלמעלה למטה LC-MS, ובכך, מניב את הפרופיל הגלובלי PTM של היסטונים הליבה (H4, H2A, H2B, H3). יישמנו פרוטוקול זה בעבר כדי פרופיל PTMs histone מרקמת עלה דורה שנאספו ממחקר שדה בקנה מידה גדול, שמטרתו לזהות סמנים אפיגנטיים של עמידות לבצורת. הפרוטוקול יכול להיות מותאם וממוטב עבור כרומטין immunoprecipitation-רצף (ChIP-seq), או לחקר PTMs היסטון בצמחים דומים.
Introduction
החומרה הגוברת ותדירות הבצורת צפוי להשפיע על הפרודוקטיביות של גידולי דגנים1,2. דורה היא יבול מזון ואנרגיה דגנים הידוע ביכולתו יוצאת הדופן לעמוד בתנאים מגבילים מים3,4. אנו רודפים אחר הבנה מכנית של יחסי הגומלין בין מתח בצורת, פיתוח צמחים, ואפיגנטיקה של דורה[דורה bicolor (L. ) Moench] צמחים. העבודה הקודמת שלנו הוכיחה קשרים חזקים בין מיקרוביום צמחים וריזוספירה בהסתגלות בצורת ותגובות ברמה המולקולרית5,6,7. מחקר זה יסלול את הדרך לניצול הנדסה אפיגנטית בהתאמת היבולים לתרחישי אקלים עתידיים. כחלק מהמאמצים בהבנת האפיגנטיקה, אנו שואפים לחקור סמני חלבון המשפיעים על ביטוי הגנים בתוך האורגניזם הצמחי.
היסטונים שייכים למשפחה שמורה מאוד של חלבונים באיקריוטים שאורזים דנ"א לגרעין כיחידות בסיסיות של כרומטין. שינויים פוסט-תרגומיים (PTMs) של ההיסטונים מוסדרים באופן דינמי כדי לשלוט במבנה הכרומטין ולהשפיע על ביטוי הגנים. כמו גורמים אפיגנטיים אחרים, כולל מתילציה DNA, PTMs היסטון לשחק תפקידים חשובים בתהליכים ביולוגיים רבים8,9. מבחנים מבוססי נוגדנים כגון כתמים מערביים שימשו באופן נרחב כדי לזהות ולכמת PTMs היסטון. בנוסף, האינטראקציה של PTMs היסטון ו- DNA ניתן לבדוק ביעילות על ידי חיסוניות כרומטין – רצף (ChIP-seq)10. ב ChIP-seq, כרומטין עם PTM היסטון ממוקד ספציפי מועשר על ידי נוגדנים נגד PTM ספציפי. לאחר מכן, שברי הדנ"א יכולים להשתחרר מהכרומטין המועשר ולרצף אותו. אזורים של גנים המקיימים אינטראקציה עם PTM היסטון ממוקד מתגלים. עם זאת, כל הניסויים האלה מסתמכים במידה רבה על נוגדנים באיכות גבוהה. עבור כמה גרסאות histone / homologs או שילובים של PTMs, פיתוח של נוגדנים חזקים יכול להיות מאתגר מאוד (במיוחד עבור PTMs מרובים). בנוסף, נוגדנים יכולים להיות מפותחים רק אם PTM histone ממוקד ידוע. 11 לכן, שיטות חלופיות עבור untargeted, פרופיל גלובלי של PTMs היסטון נחוצים.
ספקטרומטריית מסה (MS) היא שיטה משלימה לאפיון PTMs היסטון, כולל PTMs לא ידוע עבורו נוגדנים אינם זמינים11,12. זרימת העבודה המבוססת היטב של MS "מלמטה למעלה" משתמשת בפרוטאזות כדי לעכל חלבונים לפפטידים קטנים לפני הפרדת כרומטוגרפיה נוזלית (LC) וזיהוי טרשת נפוצה. מכיוון שלהיסטונים יש מספר גדול של שאריות בסיסיות (ליצין וארגנין), עיכול טריפסין (פרוטאז ספציפי לליצין וארגנין) בזרימת העבודה הסטנדרטית מלמטה למעלה חותך את החלבונים לפפטידים קצרים מאוד. פפטידים קצרים קשה מבחינה טכנית לנתח על ידי LC-MS סטנדרטי, ואינם משמרים את המידע על הקישוריות ואת stoichiometry של PTMs מרובים. השימוש באנזימים אחרים או תיוג כימי לחסימת ליצינים יוצר פפטידים ארוכים יותר המתאימים יותר לאפיון של PTMs היסטון13,14.
לחלופין, ניתן להשמיט לחלוטין את שלב העיכול. בגישה זו "מלמעלה למטה", יוני חלבון שלמים הם הציגו לתוך MS על ידי יינון electrospray (ESI) לאחר הפרדת LC באינטרנט, מניב יונים של פרוטאופורות histone שלמים. בנוסף, יונים (כלומר, פרוטאופורות) של עניין ניתן לבודד ולפצל בספקטרומטר המסה כדי להניב את יוני הרצף לזיהוי לוקליזציה PTM. לפיכך, טרשת נפוצה מלמעלה למטה יש את היתרון כדי לשמר את המידע ברמת proteoform וללכוד את הקישוריות של PTMs מרובים וקטעי מסוף על אותו proteoform15,16. ניסויים מלמעלה למטה יכולים גם לספק מידע כמותי ולהציע תובנות של סמנים ביולוגיים ברמת החלבון שלם17. כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי לחלץ היסטון מעלה דורה ולנתח את ההיסטונים שלמים על ידי LC-MS מלמעלה למטה.
הנתונים לדוגמה המוצגים באיור 1 ובאיור 2 הם של עלה דורה שנאסף בשבוע 2 לאחר השתילה. למרות שצפויה וריאציה של תשואה, פרוטוקול זה הוא בדרך כלל אגנוסטי לתנאי מדגם ספציפיים. אותו פרוטוקול שימש בהצלחה עבור רקמת עלה צמח דורה שנאספו מ 2, 3, 5, 8, 9, ו 10 שבועות לאחר השתילה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת חומר עלה דורה
הערה: צמחי דורה גדלו באדמה בשדה ב Parlier, קליפורניה.
- לאסוף עלי דורה מצמחים לתוך צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל ומיד להקפיא את הצינור בחנקן נוזלי. לאסוף רקמת עלה על ידי קריעת העלה השלישי והרביעי הגיח במלואו מן ההגה הראשי.
הערה: פרטים נוספים על מצב השדה, צמיחת המדגם והאיסוף ניתן למצוא בדוח שפורסם18. - טוחנים עלים עם חנקן נוזלי ומעבירים מיד לצינור צנטריפוגה.
- יש לאחסן את עלה הקרקע ב-80°C עד לשימוש. קח בערך 4 גרם של אבקת עלה קריו-טחון לניתוח היסטון של כל דגימה.
2. הכנת מאגרים וחומרים (3-4 שעות)
הערה: ניתן לבצע את פתרונות מלאי הריכוזיות הגבוהים מראש ולאחסן אותם עד לשימוש. אבל כל מאגרי העבודה חייבים להיעשות טריים ביום החילוץ (על ידי דילול מהמלאי וערבוב עם תכנים אחרים) ולהניח על קרח במהלך התהליך. הניסוי כולו צריך להתבצע ב 4 מעלות צלזיוס אלא אם כן מומלץ אחרת.
- הכן 2.5 M סוכרוז על ידי המסת 42.8 גרם של סוכרוז (342.30 גרם / מול) ב 15 מ"ל של מים סטריליים על צלחת חום במיכל זכוכית עם ערבוב מתמשך. להעלות את עוצמת הקול ל 50 מ"ל פעם סוכרוז התמוסס לחלוטין. לאחסן את סוכרוז ב 4 מעלות צלזיוס עד השימוש.
- הכן 1 M Tris pH 8 על ידי המסת 1.576 גרם של Tris HCl ב 10 מ"ל של H2O בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל. כוונן את ה-pH עם NaOH ל-8 ובדוק עם נייר pH. לאחסן אותו ב 4 מעלות צלזיוס עד השימוש.
- הכן 1 M Dithiothreitol (DTT) על ידי שקילה 231 מ"ג של DTT (154.25 גרם / מול) וממיס אותו במים סטריליים 1.5 מ"ל. DTT חייב להיעשות טרי או להשתמש aliquots קפוא מאוחסן.
- (אופציונלי) לחצו על הלחצן 'קביעות' מכינים את המעכבים הנוספים על ידי ערבוב שלושה מלחים שונים. הכן 18.38 מ"ג של נתרן orthovanadate (183.91 גרם / מול) ב 1 מ"ל של מים סטריליים, ולאחר מכן להכין בנפרד נתרן butyrate על ידי הוספת 11.008 מ"ג של נתרן butyrate (110.09 גרם / מול) ב 1 מ"ל של מים סטריליים. הכן את המלח הסופי על ידי הוספת 4.199 מ"ג של נתרן פלואוריד (41.99 גרם / מול) ב 1 מ"ל של מים. מערבבים את שלושת פתרונות המלח יחד בנפח שווה כמו פתרון מלאי עבור "מעכבים נוספים" (33 מ"מ של כל אחד משלושת הכימיקלים).
הערה: נתרן ואנדאט מתכלה בריכוזים הגבוהים מ-0.1 מ"מ תחת חומציות נייטרלית. מומלץ להפעיל נתרן ונדאטה כדי depolymerize אותו ליעילות מקסימלית בעקבות פרוטוקולים שפורסמו19. לחלופין, נתרן ונדאטה פעיל זמין מסחרית. להלן, נתרן ונדייט לא הופעל בכוונה, ולכן היעילות אינה מצטמצמת. נתרן ונדאט פעיל עדיין לא נבדק לפרוטוקול זה. - הכן 1 M של MgCl2 על ידי המסת 0.952 גרם של מגנזיום כלורי נטול מים (95.2 גרם / מול) ב 10 מ"ל של H2O בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל. יש לאחסן 1 M MgCl2 ב-4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
- הכן 10% (v / v) טריטון X-100 על ידי ערבוב 53.5 גרם של טריטון X-100 עם 35 מ"ל של מים סטריליים, להביא עד 50 מ"ל עם מים ולאחסן אותו בטמפרטורת החדר.
- הכן 5% Guanidine חיץ pH7 (המכונה "מאגר Gdn") שישמש להתנות את ההסתבכות לפחות לילה – להכין 0.1 מ אשלגן מימן פוספט dibasic (K2HPO4)על ידי שקילה 870 מ"ג של K2HPO4 והתמוססות ב 50 מ"ל של מים סטריליים ולאחסן ב 4 °C (69 °F).
- שוקלים 0.7 גרם של גואנידין הידרוכלוריד ומתמוססים ב-0.1 מ',2HPO4 לנפח סופי של 14 מ"ל. התאם את ה- pH ל- 7 על-ידי בדיקה באמצעות נייר pH.
- השרו את השרף של חילופי הקטיון החלשים היבשים (WCX) ב-5% pH של חיץ גואנידין 7 במהלך הלילה. הסר את supernatant ולמלא עם מאגר 5% Gdn טרי להשרות אותו שוב לילה כדי לאפשר את השרף באופן מלא שווה (עד supernatant יש את אותו pH כמו המאגר המקורי).
- לפני תחילת הניסוי בסעיף הבא, מערבבים את ריאגנטים כדי להפוך EB1, EB2A, ו EB2B מאגר מבוסס על טבלה 1. יש להוסיף את כל המעכבים וה-DTT טריים רגע לפני השימוש.
| ריאגנטים | ריכוז מלאי | EB1 | EB2A (EB2A) | EB2B |
| אמצעי אחסון (mL) | אמצעי אחסון (mL) | אמצעי אחסון (mL) | ||
| סוכרוז (נפת) | 2.5 מ' | 4.4 | 1.25 | 0.5 |
| טריס HCl pH8 | 1M | 0.25 | 0.125 | 0.05 |
| DTT (תב" | 1M | 0.125 | 0.0625 | 0.025 |
| H2O | 20.225 | 9.6875 | 4.375 | |
| טבלית מעכב פרוטאז (PI) | 0.5 גלולה | 0.5 גלולה | 0.5 גלולה | |
| מעכבים נוספים (אופציונלי) | 33 מ' | 0.25 | 0.125 | 0.05 |
| MgCl2 | 1M | 0.125 | 0.05 | |
| טריטון X100 | 10% | 1.25 | ||
| נפח כולל | 25 מ"ל | 12.5 מ"ל | 5 מ"ל | |
טבלה 1: הרכב עבור מאגרי חילוץ (EBS).
- הפוך את מאגר תמוגה גרעינית (NLB) מבוסס על טבלה 2. הכינו את NLB מראש ואחסנו ב-4 מעלות צלזיוס עד השימוש. יש להוסיף טבליות PI טריות רגע לפני השימוש ב-1x (0.5 טבליות ל-5 מ"ל). ראה טבלה 2 לקבלת אמצעי אחסון ספציפיים.
| NLB (נ.ל.ב | ריכוז מלאי | אמצעי אחסון (mL) |
| נקלה (נקל) | 5M | 0.4 |
| טריס HCl pH8 | 1M | 0.05 |
| טריטון X100 | 10% | 0.5 |
| אדטה (EDTA) | 0.5 מ' | 0.2 |
| H2O | 3.85 | |
| טבליות PI | 0.5 גלולה | |
| מעכבים נוספים (אופציונלי) | 33 מ' | 0.05 |
| נפח כולל | 5 מ"ל |
טבלה 2: קומפוזיציה עבור מאגר תמוגולי התמוגה (NLB).
3. הליך בידוד גרעיני
הערה: מומלץ לבצע שלבים 3.1-3.3 של היום הראשון (2-3 שעות), לשמור את הגרעינים במאגר NLB ב -80 מעלות צלזיוס ולחדש למחרת (או מאוחר יותר) לטיהור חלבונים (4 שעות). שלבי בידוד הגרעינים בפרוטוקול זה הותאמו מפרוטוקול דורה ChIP-seq המשמש במכון הגנום המשותף. ייתכן שיידרשו שטיפות נוספות והפרדת שיפוע סוכרוז כדי להבטיח טוהר גרעינים ליישומי ChIP-seq.
- סינון פסולת (~ 0.5 שעות)
- לשקול אבקת עלה טחון ~ 4 גרם, להבטיח שהוא נשאר קפוא על ידי הנחת על קרח יבש או חנקן נוזלי עד מוכן לשימוש.
- הוסף טבליות מעכבי פרוטאז ל- EB1 לריכוז סופי של 0.2x (0.5 טבליות עבור 25 מ"ל לדגימה). השתמש עלה פלסטיק מיניאטורי או קצה פיפטה מראש למחוץ טבליות בצינור microcentrifuge לפני הוספת מאגרים כדי לסייע בפירוק של הלוח בחוצץ. כדי למנוע אובדן חומרים, הוסף את לוח ה- PI ו- sonicate את המאגר כדי להמיס את הלוח.
- מוסיפים 20 מ"ל של EB1 לאבקת עלי הקרקע הקפואים, מערבולת בעדינות ומערבבים אותם עד שהאבקה מושעית לחלוטין. ממשיכים לערבב בעדינות במשך כ-10 דקות.
- סנן דרך רשת שינוי 100, לשטוף את החומר המסונן פעמיים עם 2 מ"ל של EB1 בכל פעם.
הערה: גם הסינון וגם הפסולת המסוננת צריכים להיות ירוקים. אם מעקב באמצעות מיקרוסקופ, אחד צריך להיות מסוגל לראות גרעינים שלמים וכלורופלסטים שלמים בסינון בשלב זה. רוב הפסולת הגדולה צריכה להיעדר / להתרוקן. מערבבים צבעים כגון מתילן כחול עם מדגם. גרעינים ניתנים לצפייה בקלות ככדורי כחול כהה/אקוומרין בקוטר 3-5 מיקרומטר כאשר הם מוצגים באמצעות מטרה של 20x, 40x ו/או 100x. יחסית לגרעינים, כלורופלסטים דומים בגודלם, אך ירקרקים בצבע ולעתים קרובות יותר אליפסה בצורתם. Vacuoles דומים גם גרעינים בגודל ובצורה, אבל הם לא בקלות לקחת את הצבע הכחול מתילן. - צנטריפוגה הסינון המשולב ב 3,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ברוטור דלי מתנדנד כדי פסולת גלולה אברונים תת תאיים גדולים, כולל גרעינים וכלורופלסטים.
הערה: מומלץ להכין EB2A במהלך ספין זה (ראה שלב 3.2.1). - Decant supernatant, נזהר לא להפריע גלולה.
הערה: כמו שום חומר ניקוי עדיין לא נוספה, גלולה צריך להישאר ירוק אינטנסיבי supernatant צריך להיות, לפחות, ירוק חיוור / צהוב.
- תמוגה של אברונים שאינם יעד (~ 0.5 שעות)
- הכן EB2A על ידי הוספת מעכבי פרוטאז לריכוז הסופי של 0.4x (0.5 טבליה לכל 12.5 מ"ל EB2A).
- מוציאים מחדש את גלולה משלב 3.1.6 ב 5 מ"ל של EB2A ודגרים על קרח במשך 10 דקות עם ערבוב עדין.
הערה: יש לייעל את ריכוז חומרי הניקוי כדי להסיט באופן מועדף תאים שלמים וכלורופלסטים אך לא גרעינים. הכמות הנדרשת יכולה להשתנות בין אורגניזמים. מומלץ לבדוק תמוגה של כלורופלסטים ושמירה על גרעינים שלמים תחת מיקרוסקופ. - צנטריפוגה ב 2,100 x גרם במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ברוטור דלי מתנדנד לפסולת גלולות וגרעינים.
הערה: בשלב זה, supernatant צריך להיות ירוק מאוד, ואת גלולה צריך להיות הרבה פחות ירוק מאשר נצפתה בשלבים הקודמים בשל התזה של כלורופלסטים שחרור כלורופיל לתוך ציטוזול. - Decant supernatant, נזהר לא להפריע גלולה.
- בידוד גרעינים ממזהמים ציטופלזמיים שנותרו (~ 0.5 שעות)
- הכן EB2B על ידי הוספת מעכבי פרוטאז לריכוז הסופי של 1x (0.5 טבליה לכל 5 מ"ל EB2B).
- Resuspend גלולה גרעינית גולמית משלב 3.2.3 ב 2 מ"ל של EB2B.
הערה: EB2B אינו מכיל טריטון X-100, ולכן אין תמוגה נוספת צריכה להתרחש בשלב זה. - צנטריפוגה ב 2,100 x גרם במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ברוטור דלי מתנדנד לפסולת גלולות וגרעינים.
הערה: אברונים קטנים ורכיבים ציטופלסמיים לא צריך גלולה, ולכן הם צריכים להישאר supernatant. - Decant supernatant, נזהר לא להפריע גלולה.
- Resuspend גלולה באמצעות 250 μL של NLB (להוסיף 0.5 מעכבי פרוטאז הלוח טרי עבור 5 מ"ל).
הערה: המטרה היא resuspend הגרעינים בכמות מינימלית של NLB ללא אובדן חומר משמעותי. בגלל NLB הוא צמיג מאוד כדורי מכילים כמות גדולה של פסולת מסיסים, קשה מאוד פיפטה נוטה להיאחז בחלק הפנימי של טיפים פיפטה. מסיבה זו, מומלץ לעשות שימוש חוזר באותו טיפ פיפטה במידת האפשר. אם מודאגים עם חומר שיורית בקצה פיפטה, פשוט לתלות את פיפטה ממדף או מתלה במשך ~ 1 דקות כדי לאפשר כוח הכבידה לאסוף חומר בפתיחת הקצה. אין באגרסיביות פיפטה כדי resuspend כדורי. במקום זאת, להשתמש קצה פיפטה כמו מוט ערבוב עד החומר גלולה ניתן לשאוף לתוך קצה פיפטה. כלומר, זה בסדר גמור עבור גושים גלולה גדול להישאר בשלב זה כל עוד זה יכול להיגרר לתוך קצה פיפטה. - וורטקס 15 s לכל היותר כדי הומוגניזציה ו resuspend חלקית את החומר. Sonicate במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
הערה: עבור השלבים הבאים, יש לזכור כי הסכום הכולל של NLB הוסיף הוא 250 μL, אבל הנפח הכולל לכאורה של המדגם יכול להיות עד כפליים עקב פסולת בלתי מסיסים. הדגימה קפואה ומופשרת כדי לסייע בתמוגה של גרעינים.
- תמוגה גרעינית ומיצוי היסטון (~ 4 שעות)
- הוסף 750 μL של 5% מאגר Gdn לדגימה מופשרת. Sonicate במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- מעבירים דגימה לצינור יחיד של 2 מ"ל ומסובבים 10,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
הערה: סביר להניח שהעל-טבעי ייראה ירוק. הצעדים הבאים כרומטוגרפיה צריך להסיר את רוב הפיגמנטים מן החלבון. - בזמן ההמתנה בשלב 3.4.1 ו- 3.4.2, הכן את העמודה לניקוי כרומטוגרפיה של חילופי יון. לשטוף את עמוד הכרומטוגרפיה עם 2 מ"ל של אצטוניטריל ו 4 מ"ל של מים כדי למזער את הזיהום על פני השטח.
- טען 200 ~ 300 μL של משרף WCX (מותנה מראש עם 5% מאגר Gdn) על עמודת הכרומטוגרפיה. תן לשוחל להתיישב. לשטוף ארבע פעמים עם 1 מ"ל של 5% מאגר Gdn. שמור את הצינור ואת העמוד על הקרח לשאר שלבי הטיהור.
- שים את עמוד הכרומטוגרפיה על צינור איסוף של 2 מ"ל. לטעון את supernatant משלב 3.4.2 לאט על המיטה שף מבלי לשבש את השרף (לנסות לרדת לאט מצד הצינורות). תן לפתרון לזרום דרך כוח המשיכה. כאשר הפתרון זורם דרך, לטעון את eluent בחזרה לחלק העליון של העמודה 6-8 פעמים כדי לאפשר איגוד מרבי לשורף. לאחר מכן, השלך את האלונט.
- טען 2 מ"ל של 5% מאגר Gdn לשטוף חלבונים שאינם histone מהעמודה. השלך את האלונט.
- היסטונים Elute עם 1 מ"ל 20% מאגר Gdn. לאסוף את eluent, אשר מכיל חלבוני היסטון.
- השתמש 3 kDa משקל מולקולרי לחתוך (MWCO) ספין מסנן (0.5 מ"ל) כדי לנתק את האלונט משלב 3.4.6. לפני השימוש, לטעון 500 μL לשטוף ממס (0.2% חומצה פורמית ב 3% ACN) ולסובב אותו פעמיים כדי לנקות את המסנן.
הערה: מומלץ להתחיל לשטוף את מסנן MWCO בעת ביצוע שלבי כרומטוגרפיה של משרף כדי לחסוך זמן. שלבי סינון הסיבוב הבאים אומתים ~ 3-4 שעות. - הראשון לטעון 500 μL של מדגם histone, להסתובב ב 14,000 x g במשך ~ 25 דקות כדי להפחית את עוצמת הקול עד ~ 100 μL. לאחר מכן לטעון עוד 400 μL של מדגם ולהסתובב ב 14,000 x g שוב במשך ~ 25 דקות. לטעון את הסופי 100 μL של מדגם, לשטוף את הצינור מדגם עם 300 μL לשטוף ממס ולהעמיס את הממס לתוך המסנן. ספין ב 14,000 x g שוב במשך ~ 25 דקות.
- לטעון 400 μL לשטוף ממס, להסתובב ב 14, 000 x g במשך ~ 25 דקות כדי להפחית את נפח ~ 100 μL או פחות. כל מחזור מפחית את ריכוז המלח בחמישית. חזור על הפעולה במשך שלושה מחזורים נוספים כדי להביא את ריכוז הגואנידין ~ 0.01%. הפוך את המסנן לתוך צינור איסוף נקי להסתובב ב 1,000 x g במשך 2 דקות. שמרו את דגימת היסטון המטוהרת ב-20 °C (70 °F) או -80 °C (70 °F) לניתוח.
הערה: מומלץ להסתובב זמן רב יותר (30-40 דקות) בשלב האחרון כדי למזער את נפח המדגם כדי להשיג ריכוז גבוה יותר. עוצמת הקול אמורה להיות מסוגלת לרדת ל 50-70 μL.
4. ספקטרומטריית מסה של היסטונים מטוהרים
- רכישת נתונים ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית נוזלית (LC-MS)
- הערכת ריכוז החלבון על ידי חומצה Bicinchoninic (BCA) assay בעקבות פרוטוקול היצרן.
הערה: BCA יכול רק לספק הערכה של ריכוז החלבון הכולל, אבל לא את האיכות של טיהור היסטון. אם מכשור MS אינו זמין לבדיקת איכות טיהור היסטון, ניתן להשתמש בכתם המערבי. הפוך פאזה LC בשילוב עם זיהוי ספיגה אולטרה סגול 210 ננומטר כמתואר בדו"ח הקודם שלנו ניתן להשתמש גם20. ניתן להשוות את הכרומטוגרמה לסטנדרט ידוע לבדיקת איכות הדגימה. עם זאת, אורגניזמים שונים יכולים להיות פרופילי elution שונים. לכן, שימוש בתקני היסטון מאורגניזמים דומים מומלץ מאוד. - חבר עמודה אנליטית של שלב הפוך C18 (RP) (למשל, 3 מיקרומטר 300 Å, קוטר פנימי עמודה 75 מיקרומטר, קוטר חיצוני 360 מיקרומטר, אורך 70 ס"מ) ועמודת מלכודת C18 (למשל, 3.6 מיקרומטר, קוטר פנימי עמודה 150 מיקרומטר, קוטר חיצוני 360 מיקרומטר, אורך 5 ס"מ) למערכת כרומטוגרפיה נוזלית ננו-זרימה כפולה (למשל, מים NanoAcquity). הממסים הבינאריים הם A: 0.1% חומצה פורמית במים, ו- B: 0.1% חומצה פורמית באצטוניטריל.
הערה: משאבת LC הכפולה כוללת משאבת שטיפה ומשאבת מעבר צבע. שתי המשאבות עוברות שני שלבים בכל ניתוח – שלב לכידה ואחריו השלב האנליטי. בשלב ההשמנה, משאבת הכביסה זורמת לתוך עמודת ההשמנה ומשאבת השיפוע זורמת לתוך העמודה האנליטית. בשלב האנליטי, עמודת ההשמנה משולבת עם העמודה האנליטית, ומשאבת השיפוע זורמת לשתי העמודות. משאבת הכביסה ואז הולך לפסולת. - שלב השמנה: הגדר את שיטת LC כדי לטעון תחילה 1-2 מיקרוגרם של דגימת histone על עמודת ההשמנה. לפתור את המדגם על ידי משאבת לשטוף ב 3 μL / min 5% ממס B במשך 10 דקות. הגדר את המשאבה האנליטית ב 0.3 μL / min 5% ממס B עבור שיווי משקל.
- שלב אנליטי: הגדר את משאבת השיפוע (0.3 μL/min) להתחלה מ- 5% B ורמפה ל- 30% ב- 15 דקות. לאחר מכן, להגדיל ל 41% B ב 100 דקות לפני לשטוף אורגני גבוה עד 95% B בסוף.
הערה: ניתן למטב את מעבר הצבע בהתאם לפרופילי השמירה השונים בעמודות בודדות. בדרך כלל, היסטונים באורך מלא elute סביב 30%-40% B בתנאי LC שצוין. ניתן להשתמש במעברי צבע ארוכים יותר כדי להגדיל את המספרים של ספקטרום MS2 כדי ללכוד פרוטאופורות היסטון יותר. - הגדר שיטת רכישה תלוית נתונים על MS ברזולוציה גבוהה (למשל, Thermo Orbitrap פיוז'ן לומוס או דומה) עם יכולת דיסוציאציה העברת אלקטרונים (ETD). השתמש במצב חלבון שלם ולבצע את כל הכיולות הדרושים כפי שהוצע על ידי היצרן. פרמטרים קריטיים מתוארים להלן. אלה יהיו ספציפיים למכשיר שבו נעשה שימוש.
- MS1: טווח סריקה 600–2,000 מ'/ת, רזולוציה 120k (ב m/z 200), 4 מיקרוסקנים, יעד AGC 1E6, הזרקה מקסימלית 50 אלפיות השנייה.
- MS2: רזולוציה 120k; 1 מיקרוסקן; יעד AGC 1E6; MS/MS תלוי נתונים: תעודת סל לסירוגין (זמן תגובה של 25 אלפיות השנייה, זמן הזרקה מרבי 500 אלפיות השנייה) וניתוק התנגשות באנרגיה גבוהה יותר (HCD, 28% אנרגיית התנגשות מנורמלת עם אנרגיה מדורגת ±5%, זמן הזרקה מרבי 100 אלפיות השנייה); חלון בידוד של 0.6 Da; עדיפות במדינות בעלות הגבוהה ביותר.
- אי-הכללה דינאמית: חלון זמן של 120 שניות, חלון מסה של ±0.7 Da. אל תכלול מצבי חיוב הנמוכים מ- 5 ומדינות חיוב שלא נקבעו.
- הפעל כמה זריקות של תקני פפטיד או histone על עמודות חדשות כדי לאזן ולבדוק את המערכת, לפני הפעלת הדגימות בפועל. להפעלת מספר רב של דגימות, הוסף ריקים קצרים או שוטף בין דגימות כדי למזער את לשאת. תן לעמודות להתייצב במשך 15-20 דקות במצב ההתחלה (5% ממס B) לפני המדגם הבא.
הערה: מעברי צבע ארוכים יותר של LC וזמן הזרקה מרבי גבוה יותר עבור MS2 יכולים לשפר את האיכות הספקטרלית לזיהוי פרוטאופורות היסטון נוספות.
- הערכת ריכוז החלבון על ידי חומצה Bicinchoninic (BCA) assay בעקבות פרוטוקול היצרן.
- עיבוד נתונים LC-MS וזיהוי פרוטאופורם
- השג את רצף החלבונים (דורה) בתבנית FASTA מ- JGI (https://genome.jgi.doe.gov) או מ- UniProt (https://www.uniprot.org/).
- השתמש ב- MSConvert21 (http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtml) כדי להמיר את קבצי הנתונים הגולמיים של המכשיר (*.raw) לתבנית mzML.
- הורד את חבילת TopPIC22 (http://proteomics.informatics.iupui.edu/software/toppic/) לעיבוד נתונים. ניתן להפעיל את התוכנית בשורת הפקודה או באמצעות הממשק הגרפי.
- השתמש ב- TopFD בחבילת TopPIC כדי לרוקן את הספקטרום מקובץ mzML משלב 4.2.2. ניתן להשתמש בפרמטרי ברירת המחדל. אבל "חלון קודמן" (-w) צריך להיות מופחת ל 1 מ '/z כי חלון בידוד צר משמש.
- השתמש ב- TopPIC בחבילת TopPIC כדי לזהות פרוטאופורות. ניתן להשתמש ברוב פרמטרי ברירת המחדל. הגדר את סוג החיתוך של הספקטרום וה- proteoform ל- FDR (שיעור גילוי כוזב) והגדר את ערך החיתוך ל- 0.01 (1% FDR) או לפי הצורך. הגדר את "עמידות השגיאה proteoform" ל 5 (דלתון). טען את קובץ FASTA משלב 4.2.1 ואת הקובץ "*_ms2.msalign" משלב 4.2.4. אז תתחיל את החיפוש.
הערה: ההגדרה "סובלנות שגיאות פרוטאופורם" תשלב פרוטאופורות עם מסות דומות (± 5 Da) כאחד. זה עוזר להפחית את היתירות בספירת פרוטאופורם. עם זאת, יש להשתמש בו בזהירות כי סובלנות גדולה תמזג proteoforms עם הבדלים קטנים או ללא מסה. פרמטר זה זמין רק בגירסה 1.3 של TopPIC ואילך. - ניתן לבדוק את הפרוטאופורמים שזוהו בקובץ "*_proteoform.csv" או לדמיין באמצעות מודול Topview תחת התיקייה "*_html" של הפלט.
- רשימת הפרוטאופורמים שנוצרה מהשלבים לעיל באמצעות TopPIC מבארת את ה- PTMs של histone כשינויים בהמונים. כדי להתאים אישית PTMs בודדים, יש לכלול רשימת שינויים. תיאור מפורט ניתן למצוא במדריך TopPIC. לחלופין, המשך לשלב הבא כדי לבצע ניתוח נתונים משלים באמצעות חבילת Informed-Proteomics23 (https://github.com/PNNL-Comp-Mass-Spec/Informed-Proteomics).
- בצע את ההוראות והשתמש במודול PbfGen כדי להמיר את הנתונים הגולמיים של המכשיר לקובץ PBF. לאחר מכן נטרל את נתוני MS1 באמצעות מודול ProMex כדי ליצור פלט של קובץ ms1ft (רשימת תכונות, כל תכונה מייצגת שילוב ייחודי של זמן מסה ושמירה).
- צור FASTA ממוקד עבור פרוטאומיקה מושכלת באמצעות רשימת החלבונים המזוהים מ- TopPIC בשלב 4.2.6.
הערה: חיפוש הגנום כולו באמצעות Informed-Proteomics עם מספר גדול של PTMs משתנים יכול להיות איטי מאוד ועלול לגרום לקריסות. לכן, מומלץ להקטין את הגודל של FASTA רק על ידי הכללת חלבוני היעד. - צור רשימת שינויים ייעודיים כדי לחפש PTMs histone בעקבות התבנית בקובץ לדוגמה. ה- PTMs הנפוצים לכלול הם: אצטילציה ליצין, מונו-מתילציה ליצין, ליצין די-מתילציה, ליצין תלת-מתילציה, זרחן סרין/טרונין/טירוצין, חלבון N-מסוף אצטילציה, חמצון מתיונין/ציסטאין. עבור דורה, חלבון N-מסוף מונו מתילציה, די מתילציה, טרימתילציה יש להוסיף.
הערה: Proteomics מושכלת מחפשת רק PTMs שצוינו ברשימה. אם קיימים PTMs שלא צוינו, ייתכן שהפרוטאופורם אינו מזוהה, או שהוא מזוהה באופן שגוי לפרוטאופורמים אחרים. עם זאת, יש לשמור את רשימת PTM קצרה ככל האפשר כדי למזער את זמן החיפוש. - בצע את מודול MSPathFinder כדי לזהות פרוטאופורות באמצעות הקבצים משלב 4.2.8, FASTA הממוקד משלב 4.2.9 ורשימת השינויים משלב 4.2.10. ניתן להשתמש בפרמטרי ברירת המחדל.
- ניתן להמחיש את התוצאות ב- LcMsSpectator על-ידי טעינת כל קבצי התוצאות.
הערה: כלים ביואינפורמטיקה אחרים זמינים לעיבוד והדמיה של נתונים מלמעלה למטה, כל אחד עם עוצמות משלו24,25,26,27,28. סורגום ואורגניזמים רבים אחרים יש מידע ידוע מוגבל לגבי PTMs היסטון במסד הנתונים. השתמש תחילה ב- TopPIC כדי לזהות הסטות מסה מ- PTMs. ניתוח זה יכול לגלות בקלות הן PTMs ידועים ולא ידועים. לאחר מכן, ניתן לחפש ב- PTMs שזוהו באופן ייעודי על-ידי ציון רשימת PTM ב- TopPIC או עם כלים משלימים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעקבות הפרוטוקול, ניתן לחלץ ולזהות את ההיסטונים באמצעות ניתוח LC-MS. הנתונים הגולמיים והתוצאות המעובדות זמינים ב- MassIVE (https://massive.ucsd.edu/) באמצעות הצטרפות: MSV000085770. בהתבסס על תוצאות TopPIC מהמדגם הייצוגי (זמין גם מ MassIVE), זיהינו 303 פרוטאופורות histone (106 H2A, 72 H2B, 103 H3, ו 22 פרוטאופורות H4). פרוטאופורמים ריבוזומליים מטוהרים זוהו גם הם, בדרך כלל מגיעים מוקדם ב- LC. הם בדרך כלל מורכבים ~ 20% של proteoforms מזוהה, אבל לא חופפים עם פרוטאופורות histone eluting בשלב מאוחר יותר של שיפוע LC. ניתן לדמיין בקלות את התוצאות באמצעות החבילות העדכניות ביותר של TopPIC או Informed-Proteomics. להדגמה, נתמקד בהדמיית הנתונים באמצעות חבילת Informed-Proteomics, שניתן להשתמש בה כדי לטעון ישירות קבצי MS גולמיים ולבחון באופן ידני זיהויי פרוטאופורה. שים לב ששתי חבילות התוכנה משתמשות באלגוריתמים ובפרמטרים שונים. המספרים המדווחים של פרוטאופורות לא יהיו זהים. אנו ממליצים לדווח על ספירות proteoform מ- TopPIC מכיוון שהוא שמרני יותר, והוא שוקל PTMs לא ידועים. חבילת Informed-Proteomics שילבה עיבוד נתונים ופריטים חזותיים לאימות ידני קל. עבור אורגניזמים עם PTMs מבוארים היטב, אנו ממליצים על ProSightPC24 עבור לוקליזציה האתר הטוב ביותר. שילוב התוצאות באמצעות כלים מרובים יכול להגדיל את מספר וביטחון של זיהויי proteoform.
לאחר עיבוד הנתונים באמצעות Informed-Proteomics, ניתן לדמיין את מפת התכונות של LC-MS ב- LcMsSpectator, המציגה את גושי החלבון המפורקים כנגד זמן השמירה של LC. על ידי לחיצה על proteoforms מזוהה בתוכנה, התכונה המשויכת תודגש עם מלבן ירוק קטן במפת התכונות. חלבוני היסטון עיקריים צריכים להיראות באזורים מסוימים של המפה, מה שמצביע על הצלחת הניסוי. איור 1a מציג מפת תכונות מייצגת של LC-MS של היסטונים שלמים. פרוטאופורות היסטון באורך מלא מסומנות בתיבות המקווקוות. ניתן לזהות בביטחון את רוב הפרוטאופורמים שזוהו באמצעות נתוני MS2.
איור 1b מציג את גודל התצוגה של האזור באמצעות פרוטאופורות H2A ו- H2B. לרובם יש שינויים N-מסוף של 42 Da. מסה נומינלית זו תואמת או trimethylation (42.05 Da) או אצטילציה (42.01 Da), אשר נראים בדרך כלל עבור ההיסטון. ההמונים המדויקים שלהם שונים רק על ידי 0.04 Da וקשה להבדיל ברמת החלבון שלם (~ 2 עמודים לדקה). בספקטרום MS2 ברזולוציה גבוהה, ניתן להבדיל ולאשר בקלות את ה- PTMs בגלל המסה התחתונה של הקטעים29. בנוסף, היסטונים H2A ו- H2B יש הומולוגים מרובים עם רצפים דומים מאוד כפי שצוין על ידי מספרי הצטרפות UniProt שונים באיור 1b. שוב, ניתוח LC-MS ברזולוציה גבוהה יכול לזהות ולהבדיל ביניהם בקלות. שני סוגים של H2As זוהו עבור היסטוני דורה. ההיסטונים של 16 kDa H2A באיור 1b הרחיבו את זנבות הטרמינל באזורים הלא שמורים של ההיטוניות. באיור 1cניתן לראות קבוצה נוספת של היסטוני H2A ללא הזנבות המורחבים (14 kDa).
עבור היסטונים H4, אצטילציה N-מסוף זוהה כPTM הגדול. ניתן לראות גם אצטילציות ליזיניות נוספות וחמצון מתיון פשוט על ידי בחינת ההבדלים ההמוניים בין התכונות באיור 1d. ראינו גם שינוי לא ידוע של 112.9 Da בנוסף לאצטילציה של מסוף N (התכונה לעיל "3Ac" באיור 1d). זה כנראה כמה adducts לא ידוע מן ריאגנט בשימוש בהכנה. זיהינו בעבר תווי יון סולפט על H4, אשר ניתן לייחס מלחים שיורית בשילוב עם בסיסיות גבוהה של חלבוני histone. עבור H3 זוהו שני רצפי חלבונים H3.3 ו- H3.2 (איור 1e). למרות ששני רצפי החלבון האלה שונים זה מזה ב-4 שאריות בלבד (32, 42, 88 ו-91), עדיין ניתן להבחין ביניהם בקלות ב-LC-MS בהתבסס על ההפרדה בשני הממדים, המסה וזמן השמירה. חלבוני H3 מותאמים בכבדות בדרגות שונות של מתילציה ואצטילציה. ניתן לדמיין בקלות את מידת השינוי הגבוהה על ידי הקווים הצפופים והמקביליים במפת התכונות, שהם 14 Da זה מזה. עם זאת, שלוש קבוצות מתילציה (14 *3 Da) יש את המסה הנומינלית שווה אצטילציה אחת (42 Da). מכיוון שלא ניתן לפתור בקלות PTMs אלה ברמת החלבון ללא פגע, הם מכונים "מקבילות מתיל" (כלומר, כפולות של 14 Da; אצטילציה אחת שווה לשלוש שווה ערך מתיל). באיור 1e, פרוטאופורות H3 מסומנות בצורת מקבילות מתיל המבוססות על המסה השלמה שלהן. בשל רזולוציה מוגבלת של הפרדת RPLC, פרוטאופורות H3 רבות ושונות צפויות להתפצל ולפצל אותן באותו ספקטרום. השיטה המוצגת כאן תזהה רק את השילובים הנפוצים ביותר של מתילציה ואצטילציה כפי שמודגם באיור 2. עבור אפיון מקיף יותר של H3, ניתוח ממוקד יותר עדיין נדרש30,31.
איור 1: מפת תכונות LC-MS על היסטונים שלמים המופקים מעלי דורה. האיור מראה זמן שימור LC (בדקות) לעומת המסה המולקולרית עבור כל פרוטאופורות שזוהו. שפע יומן הרישום מוצג על ידי סרגל הצבעים ליד המפה העליונה (יומן 10 שפע). פסגותהיסטון הגדולות מסומנות על ידי הקופסאות המקווקוות. רוב התכונות מחוץ לקופסאות הן היסטון קטוע וחלבונים ריבוזומיים. תצוגות זום-אין עבור כל קבוצה של היסטונים: (b) H2B ו- 16 kDa H2A, (c) H3 , (ד) 14 kDa H2Aו-H3. מספרי ההצטרפות של UniProt מצוינים לצד כל תכונה, ואחריה PTMs שזוהו. ב- (b), שני פרוטאופורות H2A C5YZA9 חתוכות מסומנות, אשר היה אחד או שניים C-מסוף אלנין מקוטע (מוצג -A *, ו-AA*). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
דוגמה מייצגת לזיהוי פרוטאופורם מוצגת באיור 2 באמצעות MSPathfinder ומוצגת באופן חזותי ב- LcMsSpectator. ספקטרום הפיצול באיור 2a נוצר באמצעות ETD, המניב יונים מסוג c ו- z לאורך עמוד השדרה של החלבון. HCD של אותו קודמן יכול לשמש כדי לאמת את הזיהוי, אבל HCD בדרך כלל מספק כיסוי רצף מוגבל20. היונים המבשרים בספקטרום MS1 הקודם והבא מוצגים באיור 2b,c, כשפסגות האיזוטופים התואמות שלהם מודגשות בסגול. מפת כיסוי הרצף באיור 2d יכולה לסייע בהתאם לשפות PTM אפשריות. זיהוי בביטחון גבוה צריך להתאים את רוב הקטעים, יון קודמן וכיסוי רצף טוב כדי לסייע בהתאמה לשפות PTM. בדוגמה זו, פרוטאופורם H3.2 זוהה עם שני PTMs – די-מתילציה ב- K9 ומתילציה ב- K27. בעקבות אותה שיטה, פרוטאופורים אחרים עם PTMs שונים וקטיעות מסוף ניתן לאמת באופן ידני.
איור 2: דוגמה מייצגת לפרוטאופורם H3.2 של היסטון מזוהה. H3.2 preteoform עם הספקטרום שלה (a) ETD, (b) יון הקדמה בספקטרום MS1 הקודם, (c) יון מבשר בספקטרום MS1 הבא, ו - (ד) מפת כיסוי רצף. יונים c מן N-terminus מסומנים ציאן, ואת היונים z מן C-terminus הם בוורוד. שני PTMs זוהו והודגשו בצהוב ב (ד) עם משמרות ההמונים שלהם ביאורים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
השוואה כמותית של פרוטאופורות היסטון שזוהו יכולה לחשוף סמנים אפיגנטיים פוטנציאליים. יישמנו פרוטוקול זה בעבר על 48 דגימות דורה שנאספו מהשטח ("מעכבים נוספים" לא שימשו במחקר זה)29. שני גנוטיפים שונים של דורה הושוו בתגובה לבצורות טרום פריחה או לאחר הפריחה. על ידי השוואת השפע היחסי של הפרוטאופורמים, גילינו כמה שינויים מעניינים של פרוטאופורות היסטון חתוכות הספציפיות לתנאי המדגם כפי שמוצג באיור 3. חיתוך מסוף C של H4 נצפה רק בשבועות 3 ו-9 עבור חלק מהדגימות(איור 3a,b). עבור H3.2, פרוטאופורות חתוכות של N-terminal היו בדרך כלל בשפע יותר בשבוע 10(איור 3c,d). לעומת זאת, H3.2 קטוע C-מסוף נוטים להיראות בנקודות זמן מוקדמות יותר (איור 3c). חשוב מכך, שני הגנוטיפים לא הגיבו באותו אופן בדיוק. פרוטאופורמים חתוכים H4 C-מסוף היו בשפע באופן משמעותי יותר BTx642 מאשר ב RTx430(איור 3b). נתונים כאלה חושפים סמנים אפיגנטיים פוטנציאליים של התפתחות הצמח וסובלנות מתח שניתן לבדוק עוד יותר עם טכניקות אחרות.
איור 3: השוואה כמותית של פרוטאופורות היסטון. (a)מפת חום של פרוטאופורמים H4 histone על פני דגימות שונות. עבור כל פרוטאופורם, השפע שחולץ מנתוני MS מלמעלה למטה היה מנורמל לסכום של כל פרוטאופורות H4 שזוהו בכל ניתוח, והניב את "השפע היחסי". הערכים הוגדלו אז למקסימום של כל שורה כדי להראות טוב יותר את השינויים בפרוטאופורות בעלות שפע נמוך. השפע היחסי שקנה המידה שלו משתנה מסומן במפתח הצבע בתחתית מפת החום. תנאי הצמיחה מצוינים על הציר האופקי (לפני: טרום פריחה בצורת, פוסט: לאחר הפריחה בצורת). שלושה שכפולים מקובצים יחד ומופרדים על-ידי פסים אנכיים שחורים מתנאים אחרים. עבור דוגמאות המסומנים בכוכביות, נרכשו רק משכפלים טכניים. פרוטאופורמים מיוצגים על הציר האנכי, בתבנית "שאריות התחלה – שאריות סיום: מסה; שינוי פואטי". (ב)חלקת שפע יחסית של פרוטאופורות H4 חתוכות 2-99 (פרוטאופורות המסוכמות באותיות מודגשות ב- (א)מסוכמות בתנאים שונים. המפתח לסימנים מוצג במקרא בפינה השמאלית העליונה. נקודות עם מילוי באמצע קווי השגיאה הן הערכים הממוצעים. (ג)מפת חום של פרוטאופורות H3.2 ו- (ד) חלקת שפע עבור כל H3.2 הקצוצים של מסוף N שזוהו מוצגים באותה תבנית כמו אלה של H4. פרוטאופורים הקטנים מ- 8 kDa ב- (c) הושמטו לפשטות. ה-N-מסוף ו- C-מסוף חתך H3.2 proteoforms הראה תגובות שונות על פני תנאי הצמיחה. הודפס מחדש באישור ELSEVIER משופט29. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המוצג מתאר כיצד לחלץ היסטונים מדגימות עלה דורה (או בדרך כלל עלה צמחי). התשואה הממוצעת של היסטון צפויה להיות 2-20 מיקרוגרם לכל חומר עלה דורה 4-5 גרם. החומרים טהורים מספיק לניתוח היסטון במורד הזרם על ידי LC-MS (בעיקר היסטון עם זיהום חלבון ריבוזומלי ~ 20%). ניתן להשיג תשואה נמוכה יותר עקב וריאציות מדגם, או טיפול/כשלים פוטנציאליים לאורך הפרוטוקול. שמירה על שלמות הגרעינים לפני שלב התזה הגרעיני הוא קריטי; לכן, מערבולת אגרסיבית pipetting יש להימנע לפני הוספת NLB. בנוסף, אובדן גרעינים עלול להתרחש בעת הסרת supernatants מן כדורי. יש לנקוט זהירות כדי לא לשבש את כדורי בעת pipetting. ריכוז טריטון X-100 של 1% היה אופטימיזציה באופן סלקטיבי lyse אברונים שאינם ממוקדים אבל לא את הגרעינים (שלב 3.2). ריכוז חומר ניקוי אופטימלי עבור רקמות או אורגניזמים אחרים עשוי להיות שונה צריך להיקבע באופן ניסיוני. שינוי צבע של supernatant במהלך תהליך הסינון יכול להצביע על בעיות פוטנציאליות כגון שחרור לא יעיל של כלורופלסט או שחיקה לא מספקת של עלה. במידת האפשר, השתמש במיקרוסקופ כדי לבדוק תמוגה של כלורופלסטים ושמירה על גרעינים שלמים לאחר כל צעד כדי לייעל עוד יותר את הפרוטוקול (במיוחד אם משנים את הפרוטוקול עבור רקמות או צמחים אחרים). פרוטוקול זה נבדק רק עם רקמת עלה דורה. זה לא עובד עבור רקמת שורש דורה ככל הנראה עקב הפרעה מהאדמה. יישום לרקמות עלה צמח אחרות לא נבדק ויישום לצמחים שונים עשוי להזדקק לאופטימיזציה נוספת. להתאמת פרוטוקול בידוד הגרעינים ליישומי ChIP-seq, מומלץ להפחית זיהום ציטופלסמי נוסף של סוכרוז לאחר שלב 3.3.4 (לפני השימוש ב- NLB). בגלל צעדי הניקוי הנרחבים, כמויות קטנות של שאריות חומרים שאינם גרעיניים אינם צפויים לגרום להפרעה משמעותית לניתוח היסטון ב- LC-MS וניתן להשאירם עם גלולה.
מספר ניסויים ראשוניים נכשלו בעת שימוש בטבליות מסחריות של מעכבי פוספטאז (למשל, PhosSTOP). supernatant בשלב 3.1.6 נראה ירוק אינטנסיבי כאשר הלוחות שימשו במאגר החילוץ. התמצית הסופית הראתה מספר נמוך של היסטונים מזוהים. אנו חושדים שהמרכיבים הקנייניים בטבליות גרמו לתזת גרעינים לפני שלב 3.4, מה שהפחית את תפוקת ההיסטון הכוללת. סיבה אפשרית נוספת לכישלון היא חוסר ההתאמה של החומרים בשלב טיהור היסטון עם שרף חילופי היונים (שלב 3.4). השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לחלץ באופן עקבי היסטוני טוהר גבוה עבור LC-MS הבאים מעל 150 דגימות. בממוצע, הצלחנו להשיג תשואה גבוהה יותר מבלי להשתמש ב"מעכבים הנוספים " (נתונים שלא פורסמו). לכן, מומלץ לבדוק בזהירות מעכבים חדשים בעת שינוי או התאמת פרוטוקול זה למטרות אחרות. אם זרחון אינו מעניין, מעכבי פוספטאז ניתן להשמיט את מאגרי החילוץ.
השלבים ב- 3.4 יכולים להימשך 3-4 שעות או יותר. מומלץ לשבור את הפרוטוקול תוך יומיים – להקפיא את גלולת הגרעינים משלב 3.3 ולבצע את הטיהור ביום השני (או מאוחר יותר). מחזור ההפשרה בהקפאה עשוי לעזור חלקית לתזת הגרעינים. שלבי הסינון של MWCO (3.4.7) עשויים לגזול זמן רב מאוד, אך ניתן לשנות את גודלם בקלות על-ידי הכנת דגימות מרובות במקביל. אין להוסיף את טבליות מעכבי פרוטאז בשלב 3.4. טבליות מסחריות רבות מכילות פולימרים (למשל, פוליאתן גליקול) כמילוי, אשר יפריע ניתוח LC-MS. בשלב זה, רוב החלבונים האחרים היו צריכים להיות מוסרים או denatured, כך מעכבי אנזים אינם קריטיים. עם זאת, עדיין יש צורך לשמור את הדגימות ב 4 מעלות צלזיוס או קפוא כדי למזער את השפלה.
בעקבות פרוטוקול זה, היסטונים ניתן לחלץ בהצלחה מעלי דורה. ניתן לאפיין PTMs היסטון עם LC-MS. ניתן ליישם את השיטה באופן פוטנציאלי על מחקרים בקנה מידה גדול להשוואת PTMs היסטון בין דגימות ביולוגיות שונות (למשל, גנוטיפים שונים, צמחים הגדלים בתנאים שונים וכו ') כפי שמוצג על ידי נתוני הדוגמה באיור 3. עם זאת, עיבוד נתונים עדיין דורש ניתוח ידני נרחב להקצאת פרוטאופורמים בביטחון, במיוחד עבור PTMs בלתי צפויים (או חדשניים). פיתוחים חדשים בכלי ביואינפורמטיקה צפויים להפוך את זרימת העבודה לאוטומטית ולהגדיל באופן משמעותי את התפוקה למחקרים בקנה מידה גדול. מגבלה נוספת היא כי שיטת MS מלמעלה למטה, כיום, לא יכול בקלות להבדיל פרוטאופורות רבות של H3 היפר השתנה (למשל, אתרים מרובים של מונו / di / tri-metlylation ואצטילציה). LC הפוך של ממד יחיד אינו יכול להפריד באופן מלא בין פרוטאופורות H3 השונות. לכן, ספקטרום MS2 של H3 יכיל בדרך כלל שברים ממספר פרוטאופורות ולא ניתן לפרק אותם בקלות ובביטחון. שילוב מלמעלה למטה עם שיטות מלמטה למעלה או באמצע למטה30,32,33 יכול להיות מועיל במיוחד עבור אפיון של histone H3. לחלופין, הפרדה רב מימדית יכולה להיחשב כדי לשפר את העומק של MS מלמעלה למטה34,35,36.
פרופיל Histone PTM על ידי LC-MS מאפשר גילוי סמנים אפיגנטיים חדשניים לעיצוב מכפילי כרומטין ולשפר את עמידותם של צמחים לתנאי סביבה קשים. מחקר פיילוט באמצעות דורה משני זנים וגדל בתנאי בצורת בתחום הצביע על כך שחיתוך מסוף היסטון סלקטיבי בעלים עשוי להיות קשור להתאקלמות בצורת ולפיתוח צמחים29. סמני היסטון שזוהו עשויים לשמש כמטרות על ידי טכניקות משלימות כגון ChIP-seq. הבנה מקיפה של גורמים אפיגנטיים שנרכשו מטכניקות משלימות אלה תהיה הכרחית להנדסת פתרונות חדשניים לגידולים בתגובה לשינויים סביבתיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ללא.
Acknowledgments
אנו מודים לרונלד מור ותומאס פילמור על שעזרו בניסויי ספקטרומטריית מסה, ומתיו מונרו על תצהיר הנתונים. מחקר זה מומן על ידי מענקים ממשרד האנרגיה האמריקאי (DOE) מחקר ביולוגי וסביבתי באמצעות בקרת אפיגנטיקה של תגובת בצורת בסורגום (EPICON) פרויקט תחת מספר הפרס DE-SC0014081, ממשרד החקלאות האמריקאי (USDA; CRIS 2030-21430-008-00D), ובאמצעות מכון BioEnergy המשותף (JBEI), מתקן בחסות DOE (חוזה DE-AC02-05CH11231) בין המעבדה הלאומית לורנס ברקלי DOE. המחקר בוצע באמצעות המעבדה למדעי המולקולריים הסביבתיים (EMSL) (grid.436923.9), משרד DOE של מתקן משתמש מדע בחסות המשרד למחקר ביולוגי וסביבתי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4L | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-5G | |
| EDTA, 500mM Solution, pH 8.0 | EMD Millipore Corp | 324504-500mL | |
| Formic Acid | Thermo Scientific | 28905 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma | G3272-100G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| Potassium phosphate, dibasic | Sigma | P3786-100G | |
| Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tablets | Roche | 5892791001 | |
| Sodium butyrate | Sigma | 303410-5G | Used for histone deacetylase inhibitor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S1888 | |
| Sodium Fluoride | Sigma | S7020-100G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 450243-10G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sucrose | Sigma | S7903-5KG | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 g | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-100ML | |
| Weak cation exchange resin, mesh 100-200 analytical (BioRex70) | Bio-Rad | 142-5842 | |
| Disposables | |||
| Chromatography column (Bio-Spin) | BIO-RAD | 732-6008 | |
| Mesh 100 filter cloth | Millipore Sigma | NY1H09000 | This is part of the Sigma kit (catalog # CELLYTPN1) for plant nuclei extraction. Similar filters with the same mesh size can be used. |
| Micropipette tips (P20, P200, P1000) | Sigma | ||
| Tube, 50mL/15mL, Centrifuge, Conical | Genesee Scientific | 28-103 | |
| Tube, Microcentrifuge, 1.5/2 mL | Sigma | ||
| Equipment | |||
| Analytical Balance | Fisher Scientific | 01-912-401 | |
| Beakers (50mL – 2L) | |||
| Microcentrifuge with cooling | Fisher Scientific | 13-690-006 | |
| Micropipettes | |||
| Swinging-bucket centrifuge with cooling | Fisher Scientific | ||
| Vortex | Fisher Scientific | 50-728-002 | |
| Water bath Sonicator | Fisher Scientific | 15-336-120 |
References
- Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D., Basra, S. M. A. Plant drought stress: Effects, mechanisms and management. Agronomy for Sustainable Development. , 153-188 (2009).
- Dai, A. Drought under global warming: a review. Wiley Interdisciplinary Reviews: Climate Change. 2 (1), 45-65 (2011).
- Rooney, W. L., Blumenthal, J., Bean, B., Mullet, J. E. Designing sorghum as a dedicated bioenergy feedstock. Biofuels, Bioproducts and Biorefining. 1 (2), 147-157 (2007).
- Mullet, J. E., Klein, R. R., Klein, P. E. Sorghum bicolor - an important species for comparative grass genomics and a source of beneficial genes for agriculture. Current Opinion in Plant Biology. 5 (2), 118-121 (2002).
- Xu, L., et al. Drought delays development of the sorghum root microbiome and enriches for monoderm bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4284-4293 (2018).
- Gao, C., et al. Strong succession in arbuscular mycorrhizal fungal communities. ISME Journal. 13 (1), 214-226 (2019).
- Gao, C., et al. Fungal community assembly in drought-stressed sorghum shows stochasticity, selection, and universal ecological dynamics. Nature Communications. 11 (1), (2020).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
- Yuan, L., Liu, X., Luo, M., Yang, S., Wu, K. Involvement of histone modifications in plant abiotic stress responses. Journal of Integrative Plant Biology. 55 (10), 892-901 (2013).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews. Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
- Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. Quantitative proteomic analysis of histone modifications. Chemical Reviews. 115 (6), 2376-2418 (2015).
- Moradian, A., Kalli, A., Sweredoski, M. J., Hess, S. The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).
- Sidoli, S., Garcia, B. A. Characterization of individual histone posttranslational modifications and their combinatorial patterns by mass spectrometry-based proteomics strategies. Methods in Molecular Biology. 1528, Clifton, N.J. 121-148 (2017).
- Maile, T. M., et al. Mass spectrometric quantification of histone post-translational modifications by a hybrid chemical labeling method. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 1148-1158 (2015).
- Dang, X., et al. The first pilot project of the consortium for top-down proteomics: a status report. Proteomics. 14 (10), 1130-1140 (2014).
- Schaffer, L. V., et al. Identification and quantification of proteoforms by mass spectrometry. Proteomics. 19 (10), 1800361 (2019).
- Cupp-Sutton, K. A., Wu, S. High-throughput quantitative top-down proteomics. Molecular Omics. , (2020).
- Varoquaux, N., et al. Transcriptomic analysis of field-droughted sorghum from seedling to maturity reveals biotic and metabolic responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 27124 (2019).
- Gordon, J. A. Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor. Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).
- Zhou, M., et al. Profiling changes in histone post-translational modifications by top-down mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1507, Clifton, N.J. 153-168 (2017).
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Kou, Q., Xun, L., Liu, X. TopPIC: a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization. Bioinformatics (Ocford, England). 32 (22), (2016).
- Park, J., et al. Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics. Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).
- LeDuc, R. D., et al. The C-Score: a bayesian framework to sharply improve proteoform scoring in high-throughput top down proteomics. Journal of Proteome Research. 13 (7), 3231-3240 (2014).
- Fornelli, L., et al. Advancing top-down analysis of the human proteome using a benchtop quadrupole-orbitrap mass spectrometer. Journal of Proteome Research. 16 (2), 609-618 (2017).
- Sun, R. X., et al. pTop 1.0: A high-accuracy and high-efficiency search engine for intact protein identification. Analytical Chemistry. 88 (6), 3082-3090 (2016).
- Xiao, K., Yu, F., Tian, Z. Top-down protein identification using isotopic envelope fingerprinting. Journal of Proteomics. 152, 41-47 (2017).
- Cai, W., et al. MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (2), 703-714 (2016).
- Zhou, M., et al. Top-down mass spectrometry of histone modifications in sorghum reveals potential epigenetic markers for drought acclimation. Methods. , San Diego, Calif. (2019).
- Garcia, B. A., Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Pervasive combinatorial modification of histone H3 in human cells. Nature Methods. 4 (6), 487-489 (2007).
- Zheng, Y., et al. Unabridged analysis of human histone H3 by differential top-down mass spectrometry reveals hypermethylated proteoforms from MMSET/NSD2 overexpression. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (3), 776-790 (2016).
- Garcia, B. A., et al. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).
- Holt, M. V., Wang, T., Young, N. L. One-pot quantitative top- and middle-down analysis of GluC-digested histone H4. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2514-2525 (2019).
- Tian, Z., et al. Enhanced top-down characterization of histone post-translational modifications. Genome Biology. 13 (10), (2012).
- Wang, Z., Ma, H., Smith, K., Wu, S. Two-dimensional separation using high-pH and low-pH reversed phase liquid chromatography for top-down proteomics. International Journal of Mass Spectrometry. 427, 43-51 (2018).
- Gargano, A. F. G., et al. Increasing the separation capacity of intact histone proteoforms chromatography coupling online weak cation exchange-HILIC to reversed phase LC UVPD-HRMS. Journal of Proteome Research. 17 (11), 3791-3800 (2018).
