Summary
Het protocol is ontwikkeld om intacte histonen effectief te extraheren uit sorghumbladmaterialen voor profilering van histon post-translationele modificaties die kunnen dienen als potentiële epigenetische markers om droogtebestendige gewassen te helpen.
Abstract
Histonen behoren tot een familie van sterk geconserveerde eiwitten in eukaryoten. Ze verpakken DNA in nucleosomen als functionele eenheden van chromatine. Post-translationele modificaties (PTM's) van histonen, die zeer dynamisch zijn en door enzymen kunnen worden toegevoegd of verwijderd, spelen een cruciale rol bij het reguleren van genexpressie. In planten zijn epigenetische factoren, waaronder histon-PTM's, gerelateerd aan hun adaptieve reacties op het milieu. Inzicht in de moleculaire mechanismen van epigenetische controle kan ongekende mogelijkheden bieden voor innovatieve bio-engineeringoplossingen. Hierin beschrijven we een protocol om de kernen te isoleren en histonen te zuiveren uit sorghumbladweefsel. De geëxtraheerde histonen kunnen in hun intacte vormen worden geanalyseerd door top-down massaspectrometrie (MS) in combinatie met online reversed-phase (RP) vloeibare chromatografie (LC). Combinaties en stoichiometrie van meerdere PTM's op dezelfde histon proteoform kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd. Bovendien kan histone tail clipping worden gedetecteerd met behulp van de top-down LC-MS workflow, wat het wereldwijde PTM-profiel van kerntonen oplevert (H4, H2A, H2B, H3). We hebben dit protocol eerder toegepast om histon-PTM's te profileren uit sorghumbladweefsel verzameld uit een grootschalig veldonderzoek, gericht op het identificeren van epigenetische markers van droogtebestendigheid. Het protocol kan mogelijk worden aangepast en geoptimaliseerd voor chromatine immunoprecipatie-sequencing (ChIP-seq), of voor het bestuderen van histon PTM's in vergelijkbare planten.
Introduction
De toenemende ernst en frequentie van de droogte zal naar verwachting van invloed zijn op de productiviteit van graangewassen1,2. Sorghum is een graanvoedsel - en energiegewas dat bekend staat om zijn uitzonderlijke vermogen om waterbeperkende omstandigheden te weerstaan3,4. We streven naar mechanistisch begrip van het samenspel tussen droogtestress, plantenontwikkeling en epigenetica van sorghum [Sorghum bicolor (L.) Moench] planten. Ons vorige werk heeft sterke verbindingen aangetoond tussen het microbioom van planten en rhizosfeer bij droogte acclimatisatie en reacties op moleculair niveau5,6,7. Dit onderzoek zal de weg vrijmaken voor het gebruik van epigenetische engineering bij het aanpassen van gewassen aan toekomstige klimaatscenario's. Als onderdeel van de inspanningen om epigenetica te begrijpen, streven we ernaar eiwitmarkers te bestuderen die de genexpressie in het plantenorganisme beïnvloeden.
Histonen behoren tot een sterk geconserveerde familie van eiwitten in eukaryoten die DNA in nucleosomen verpakken als fundamentele eenheden van chromatine. Post-translationele modificaties (PTM's) van histonen zijn dynamisch gereguleerd om de chromatinestructuur te beheersen en de genexpressie te beïnvloeden. Net als andere epigenetische factoren, waaronder DNA-methylatie, spelen histon-PTM's een belangrijke rol in veel biologische processen8,9. Op antilichamen gebaseerde tests zoals westerse vlekken zijn veel gebruikt om histon-PTM's te identificeren en te kwantificeren. Bovendien kan de interactie van histon-PTM's en DNA effectief worden onderzocht door Chromatine-immunoprecipitatie – sequencing (ChIP-seq)10. In ChIP-seq wordt chromatine met specifieke gerichte histon PTM verrijkt met antilichamen tegen die specifieke PTM. Vervolgens kunnen de DNA-fragmenten uit het verrijkte chromatine worden vrijgegeven en worden gesequentieerd. Regio's van genen die interageren met de beoogde histon PTM worden onthuld. Al deze experimenten zijn echter sterk afhankelijk van antilichamen van hoge kwaliteit. Voor sommige histonvarianten/homologen of combinaties van PTM's kan de ontwikkeling van robuuste antilichamen zeer uitdagend zijn (vooral voor meerdere PTM's). Bovendien kunnen antilichamen alleen worden ontwikkeld als de beoogde histon PTM bekend is. 11 Daarom zijn alternatieve methoden nodig voor ongetargette, globale profilering van histon-PTM's.
Massaspectrometrie (MS) is een aanvullende methode om histon-PTM 's te karakteriseren, met inbegrip van onbekende PTM 's waarvoor geen antilichamen beschikbaar zijn11,12. De gevestigde "bottom-up" MS-workflow maakt gebruik van proteasen om eiwitten te verteren tot kleine peptiden voorafgaand aan vloeistofchromatografie (LC) scheiding en MS-detectie. Omdat histonen grote aantallen basisresten (lysine en arginine) hebben, snijdt de trypsinevertering (protease specifiek voor lysine en arginine) in de standaard bottom-up workflow de eiwitten in zeer korte peptiden. De korte peptiden zijn technisch moeilijk te analyseren door standaard LC-MS, en behouden niet de informatie over de connectiviteit en stoichiometrie van meerdere PTMs. Het gebruik van andere enzymen of chemische etikettering om lysines te blokkeren genereert langere peptiden die meer geschikt zijn voor karakterisering van histone PTMs13,14.
Als alternatief kan de spijsverteringsstap volledig worden weggelaten. In deze "top-down" benadering worden intacte eiwitionen in de MS geïntroduceerd door elektrospray ionisatie (ESI) na online LC-scheiding, wat ionen oplevert van de intacte histon proteoformen. Bovendien kunnen ionen (d.w.z. proteoformen) van belang worden geïsoleerd en gefragmenteerd in de massaspectrometer om de sequentie-ionen voor identificatie en PTM-lokalisatie op te leveren. Daarom heeft top-down MS het voordeel dat de informatie op proteoform-niveau behouden blijft en de connectiviteit van meerdere PTM 's en terminale afknijpingen op hetzelfde proteoform15,16vastlegt . Top-down experimenten kunnen ook kwantitatieve informatie bieden en inzichten bieden van biomarkers op het intacte eiwitniveau17. Hierin beschrijven we een protocol om histon uit sorghumblad te extraheren en de intacte histonen te analyseren door LC-MS van bovenaf.
De voorbeeldgegevens in figuur 1 en figuur 2 zijn afkomstig van sorghumblad dat in week 2 na het planten is verzameld. Hoewel variatie van de opbrengst wordt verwacht, is dit protocol over het algemeen agnostisch voor specifieke steekproefomstandigheden. Hetzelfde protocol is met succes gebruikt voor sorghum plantenbladweefsel verzameld vanaf 2, 3, 5, 8, 9 en 10 weken na het planten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiden van sorghum bladmateriaal
OPMERKING: De sorghumplanten werden gekweekt in grond in het veld in Parlier, CA.
- Verzamel sorghumbladeren van planten in centrifugebuizen van 50 ml en vries de buis onmiddellijk in vloeibare stikstof. Verzamel bladweefsel door het derde en vierde volledig opgedoken blad van de primaire helmstok af te scheuren.
OPMERKING: Meer details over de toestand van het veld, de groei van de steekproef en de verzameling zijn te vinden in het gepubliceerde rapport18. - Maal bladeren met vloeibare stikstof en breng onmiddellijk over in een centrifugebuis.
- Bewaar het gemalen blad op -80 °C tot gebruik. Neem ongeveer 4 g cryo-gemalen bladpoeder voor een histonanalyse van elk monster.
2. Buffers en materialen voorbereiden (3-4 uur)
OPMERKING: De voorraadoplossingen met hoge concentratie kunnen van tevoren worden gemaakt en tot gebruik worden opgeslagen. Maar alle werkbuffers moeten vers worden gemaakt op de dag van de extractie (door verdunning uit voorraad en mengen met andere inhoud) en tijdens het proces op ijs worden geplaatst. Het hele experiment moet bij 4 °C worden uitgevoerd, tenzij anders wordt aanbevolen.
- Bereid 2,5 M sacharose door 42,8 g sacharose (342,30 g/mol) op te lossen in 15 ml steriel water op de warmteplaat in een glazen bak met continu roeren. Breng het volume op 50 ml zodra de sacharose volledig is opgelost. Bewaar de sacharose in 4 °C tot gebruik.
- Bereid 1 M Tris pH 8 door 1,576 g Tris HCl op te lossen in 10 ml H2O in een centrifugebuis van 15 ml. Stel de pH met NaOH in op 8 en controleer met pH-papier. Bewaar het op 4 °C tot gebruik.
- Bereid 1 M Dithiothreitol (DTT) door 231 mg DTT (154,25 g/mol) te wegen en op te lossen in 1,5 ml steriel water. DTT moet vers worden gemaakt of bevroren aliquots worden gebruikt.
- (Optioneel) Bereid de extra remmers voor door drie verschillende zouten te mengen. Bereid 18,38 mg natriumorthopaat (183,91 g/mol) in 1 ml steriel water en bereid vervolgens afzonderlijk natrium butyraat door 11,008 mg natrium butyraat (110,09 g/mol) toe te voegen aan 1 ml steriel water. Bereid het laatste zout door 4,199 mg natriumfluoride (41,99 g/mol) toe te voegen in 1 ml water. Meng de drie zoutoplossingen samen in gelijke volume als voorraadoplossing voor "extra remmers" (33 mM van elk van de drie chemicaliën).
OPMERKING: Natrium vanadate polymeriseert bij concentraties hoger dan 0,1 mM onder neutrale pH. Het wordt aanbevolen natrium vanadaat te activeren om het te depolymeriseren voor maximale werkzaamheid volgens gepubliceerde protocollen19. Als alternatief is geactiveerd natrium vanadate in de handel verkrijgbaar. Hierin werd natrium vanadate niet opzettelijk geactiveerd, dus de werkzaamheid wordt niet verminderd. Geactiveerd natrium vanadate is nog niet getest op dit protocol. - Bereid 1 M MgCl2 door 0,952 g watervrij magnesiumchloride (95,2 g/mol) op te lossen in 10 ml H2O in een centrifugebuis van 15 ml. Bewaar 1 M MgCl2 bij 4 °C tot gebruik.
- Bereid 10% (v/v) Triton X-100 door 53,5 g Triton X-100 te mengen met 35 ml steriel water, breng tot 50 ml met water en bewaar het op kamertemperatuur.
- Bereid 5% Guanidine buffer pH7 (aangeduid als "Gdn buffer") die zal worden gebruikt om de hars ten minste 's nachts te conditioneren – bereid 0,1 M kaliumwaterstoffosfaat dibasic (K2HPO4) door 870 mg K2HPO4 te wegen en op te lossen in 50 ml steriel water en op te slaan bij 4 °C.
- Weeg 0,7 g guanidinehydrochloride af en los op in 0,1 M K2HPO4 tot een eindvolume van 14 ml. Pas de pH aan op 7 door te controleren met pH-papier.
- Week de droge zwakke kationenuitwisseling (WCX) hars 's nachts in 5% Guanidine buffer pH 7. Verwijder de supernatant en vul bij met verse 5% Gdn buffer en week deze 's nachts opnieuw om de hars volledig in evenwicht te brengen (totdat de supernatant dezelfde pH heeft als de oorspronkelijke buffer).
- Voordat u met het experiment in de volgende sectie begint, mengt u de reagentia om EB1-, EB2A- en EB2B-buffer te maken op basis van tabel 1. Voeg vlak voor gebruik alle remmers en DTT vers toe.
| Reagentia | Voorraadconcentratie | EB1 | EB2A | EB2B |
| Volume (ml) | Volume (ml) | Volume (ml) | ||
| Sacharose | 2.5M | 4.4 | 1.25 | 0.5 |
| Tris HCl pH8 | 1M | 0.25 | 0.125 | 0.05 |
| Dtt | 1M | 0.125 | 0.0625 | 0.025 |
| H2O | 20.225 | 9.6875 | 4.375 | |
| proteaseremmer (PI) tablet | 0,5 pil | 0,5 pil | 0,5 pil | |
| Extra remmers (optioneel) | 33mM | 0.25 | 0.125 | 0.05 |
| MgCl2 | 1M | 0.125 | 0.05 | |
| Triton X100 | 10% | 1.25 | ||
| Totaal volume | 25 ml | 12,5 ml | 5 ml | |
Tabel 1: Samenstelling voor extractiebuffers (CB's).
- Maak de Nuclei Lysis Buffer (NLB) op basis van tabel 2. Bereid NLB van tevoren voor en bewaar op 4 °C tot gebruik. Voeg pi-tabletten vers toe vlak voor gebruik bij 1x (0,5 tablet per 5 ml). Zie tabel 2 voor specifieke volumes.
| Netwerktaakverdeling | Voorraadconcentratie | Volume (ml) |
| Nacl | 5M | 0.4 |
| Tris HCl pH8 | 1M | 0.05 |
| Triton X100 | 10% | 0.5 |
| Edta | 0.5M | 0.2 |
| H2O | 3.85 | |
| PI-tabletten | 0,5 pil | |
| Extra remmers (optioneel) | 33mM | 0.05 |
| Totaal volume | 5 ml |
Tabel 2: Samenstelling voor de kernlysebuffer (NLB).
3. Nuclei isolatieprocedure
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om stappen 3.1–3.3 van de eerste dag (2–3 uur) uit te voeren, de kernen in de NLB-buffer op te slaan bij -80 °C en de volgende dag (of later) te hervatten voor eiwitzuivering (4 uur). De kernisolatiestappen in dit protocol zijn aangepast aan een sorghum ChIP-seq-protocol dat wordt gebruikt in het Joint Genome Institute. Extra wasbeurten en sacharose gradiëntscheiding kunnen nodig zijn om de zuiverheid van de kernen voor ChIP-seq-toepassingen te garanderen.
- Filtratie van vuil (~0,5 uur)
- Weeg gemalen bladpoeder ~4 g af en zorg ervoor dat het bevroren blijft door het op droogijs of vloeibare stikstof te plaatsen totdat het klaar is voor gebruik.
- Voeg proteaseremmertabletten toe aan EB1 tot een uiteindelijke concentratie van 0,2x (0,5 tablet voor 25 ml per monster). Gebruik een miniatuur plastic stamper of een pipettip om tabletten vooraf te pletten in een microcentrifugebuis voordat u buffers toevoegt om te helpen bij het oplossen van de tablet in de buffer. Om materiaalverlies te voorkomen, voegt u de PI-tablet toe en soniceert u de buffer om de tablet op te lossen.
- Voeg 20 ml EB1 toe aan het bevroren gemalen bladpoeder, draai zachtjes en meng ze tot het poeder volledig is opgehangen. Blijf zachtjes mengen gedurende ~ 10 minuten.
- Filter door mesh 100 en spoel het gefilterde materiaal twee keer met telkens 2 ml EB1.
OPMERKING: Zowel het filtraat als het gefilterde vuil moeten groen zijn. Als u met behulp van een microscoop volgt, moet men op dit moment intacte kernen en intacte chloroplasten in het filtraat kunnen zien. De meeste grote brokstukken moeten afwezig/uitgeput zijn. Meng kleurstoffen zoals methyleenblauw met monster. Kernen zijn gemakkelijk waarneembaar als ~3-5 μm diameter donkerblauw/aquamarijn bollen wanneer gevisualiseerd met behulp van een 20x, 40x en/of 100x doelstelling. Ten opzichte van kernen zijn chloroplasten vergelijkbaar in grootte, maar groenachtig van kleur en vaak ovaler van vorm. Vacuolen zijn ook vergelijkbaar met kernen in grootte en vorm, maar ze zullen de Methyleenblauwe kleurstof niet gemakkelijk opnemen. - Centrifugeer het gecombineerde filtraat bij 3.000 x g gedurende 10 min bij 4 °C in een slingerende emmerrotor tot pelletresten en grote subcellulaire organellen, waaronder kernen en chloroplasten.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om EB2A tijdens deze draai voor te bereiden (zie stap 3.2.1). - Decanteer de supernatant en zorg ervoor dat de pellet niet wordt verstoord.
OPMERKING: Aangezien er nog geen wasmiddel is toegevoegd, moet de pellet intens groen blijven en moet het supernatant hooguit lichtgroen/geel zijn.
- Lysis van niet-doel organellen (~0.5 h)
- Bereid EB2A voor door proteaseremmers toe te voegen aan een uiteindelijke concentratie van 0,4x (0,5 tablet per 12,5 ml EB2A).
- Resuspendeer de pellet van stap 3.1.6 in 5 ml EB2A en broed gedurende 10 minuten op ijs met zacht mengen.
OPMERKING: De wasmiddelconcentratie moet worden geoptimaliseerd om intacte cellen en chloroplasten bij voorkeur te lyseren, maar geen kernen. De benodigde hoeveelheid kan per organisme verschillen. Het wordt aanbevolen om te controleren op lyse van chloroplasten en het vasthouden van intacte kernen onder de microscoop. - Centrifugeren bij 2.100 x g gedurende 15 min bij 4 °C in een slingerende emmerrotor tot pelletresten en kernen.
OPMERKING: In dit stadium moet het supernatant intens groen zijn en moet de pellet veel minder groen zijn dan in de vorige stadia werd waargenomen vanwege de lyse van chloroplasten en chlorofylafgifte in het cytosol. - Decanteer de supernatant en zorg ervoor dat de pellet niet wordt verstoord.
- Isolatie van kernen van resterende cytoplasmatische verontreinigingen (~0,5 uur)
- Bereid EB2B voor door proteaseremmers toe te voegen aan een uiteindelijke concentratie van 1x (0,5 tablet per 5 ml EB2B).
- Resuspend ruwe kernkorrel van stap 3.2.3 in 2 ml EB2B.
OPMERKING: EB2B bevat geen Triton X-100, dus er mag op dit moment geen extra lyse optreden. - Centrifugeren bij 2.100 x g gedurende 15 min bij 4 °C in een slingerende emmerrotor tot pelletresten en kernen.
OPMERKING: Kleine organellen en cytoplasmatische componenten mogen niet pelleten, dus ze moeten in het supernatant blijven. - Decanteer de supernatant en zorg ervoor dat de pellet niet wordt verstoord.
- Resuspendeer de pellet met 250 μL NLB (voeg 0,5 proteaseremmertablet vers toe voor 5 ml).
OPMERKING: Het doel is om de kernen in een minimale hoeveelheid NLB te resuspenderen zonder aanzienlijk materiaalverlies. Omdat NLB erg stroperig is en de pellets een grote hoeveelheid onoplosbaar vuil bevatten, is het erg moeilijk om te pipetten en heeft het de neiging om zich vast te klampen aan de binnenkant van pipetpunten. Om deze reden wordt aanbevolen om dezelfde pipettip waar mogelijk opnieuw te gebruiken. Als het gaat om restmateriaal in een pipettip, hangt u de pipet gewoon ~ 1 minuut aan een plank of rek om de zwaartekracht in staat te stellen materiaal te verzamelen bij het openen van de punt. Pipetteer niet agressief om de pellets opnieuw te gebruiken. Gebruik in plaats daarvan de pipettip als roerstaaf totdat het gekorrelde materiaal in de pipetpunt kan worden aangezogen. d.w.z. het is prima voor grote pelletklompen om in dit stadium te blijven, zolang het in een pipetpunt kan worden getrokken. - Vortex 15 s bij max om het materiaal te homogeniseren en gedeeltelijk te resuspenderen. Sonicaat gedurende 5 min bij 4 °C en vervolgens bewaren bij -80 °C.
OPMERKING: Houd er bij de volgende stappen rekening mee dat de totale toegevoegde hoeveelheid NLB 250 μL is, maar het totale schijnbare volume van het monster kan tot twee keer zoveel zijn als gevolg van onoplosbaar puin. Het monster wordt ingevroren en ontdooid om te helpen bij de lyse van kernen.
- Nuclei lysis en histonextractie (~4 uur)
- Voeg 750 μL van 5% Gdn buffer toe aan het ontdooide monster. Sonicaat gedurende 15 min bij 4 °C.
- Breng het monster over in een enkele buis van 2 ml en draai 10.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
OPMERKING: De supernatant ziet er waarschijnlijk groen uit. De volgende chromatografiestappen moeten de meeste pigmenten uit het eiwit verwijderen. - Bereid tijdens het wachten op stap 3.4.1 en 3.4.2 de kolom voor op het opruimen van ionenuitwisselingschromatografie. Spoel de chromatografiekolom af met 2 ml acetonitril en 4 ml water om verontreiniging op het oppervlak te minimaliseren.
- Laad 200 ~300 μL WCX-hars (voorgeconditioneerd met 5% Gdn-buffer) op de chromatografiekolom. Laat de hars bezinken. Was vier keer met 1 ml van 5% Gdn-buffer. Houd de buis en kolom op ijs voor de rest van de zuiveringsstappen.
- Plaats de chromatografiekolom op een verzamelbuis van 2 ml. Laad de supernatant van stap 3.4.2 langzaam op het harsbed zonder de hars te verstoren (probeer langzaam van de zijkant van de buizen te vallen). Laat de oplossing door de zwaartekracht stromen. Terwijl de oplossing doorstroomt, laadt u de eluent 6-8 keer terug naar de bovenkant van de kolom om een maximale binding aan de hars mogelijk te maken. Gooi vervolgens de eluent weg.
- Laad 2 ml van 5% Gdn-buffer om niet-histoneiwitten van de kolom te wassen. Gooi de eluent weg.
- Elute histones met 1 ml 20% Gdn buffer. Verzamel het eluent, dat histoneiwitten bevat.
- Gebruik 3 kDa molecular weight cut off (MWCO) spinfilter (0,5 ml) om het eluent uit stap 3.4.6 te desalt. Laad voor gebruik 500 μL wasmiddel (0,2% mierenzuur in 3% ACN) en draai het twee keer naar beneden om het filter schoon te maken.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om te beginnen met het wassen van het MWCO-filter tijdens het uitvoeren van de harschromatografiestappen om tijd te besparen. De volgende spinfilterstappen duren ~3–4 uur. - Eerste belasting 500 μL van het histonmonster, draai bij 14.000 x g gedurende ~ 25 minuten om het volume te verminderen tot ~ 100 μL. Laad vervolgens nog eens 400 μL monster en draai opnieuw op 14.000 x g gedurende ~ 25 minuten. Laad de laatste 100 μL monster, spoel de monsterbuis af met 300 μL wasmiddel en laad het oplosmiddel in het filter. Draai opnieuw op 14.000 x g gedurende ~ 25 minuten.
- Laad 400 μL wasmiddel, draai op 14.000 x g gedurende ~ 25 minuten om het volume te verminderen tot ~ 100 μL of minder. Elke cyclus vermindert de zoutconcentratie met een vijfde. Herhaal dit nog drie cycli om de guanidineconcentratie op ~0,01% te brengen. Draai het filter om in een schone opvangbuis en draai gedurende 2 minuten op 1.000 x g. Bewaar het gezuiverde histonmonster bij -20 °C of -80 °C voor analyse.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om bij de laatste stap langer (30-40 min) te draaien om het monstervolume te minimaliseren om een hogere concentratie te verkrijgen. Het volume moet kunnen dalen tot 50-70 μL.
4. Massaspectrometrie van gezuiverde histonen
- Gegevensverwerving van vloeibare chromatografiemassaspectrometrie (LC-MS)
- Schatting eiwitconcentratie door Bicinchoninic Acid (BCA) test volgens het protocol van de fabrikant.
OPMERKING: BCA kan alleen een schatting geven van de totale eiwitconcentratie, maar niet van de kwaliteit van de zuivering van histon. Als MS-instrumentatie niet direct beschikbaar is voor het controleren van de kwaliteit van de histonzuivering, kan western blot worden gebruikt. Reversed-phase LC in combinatie met 210 nm ultraviolette absorptiedetectie zoals beschreven in ons vorige rapport kan ook worden gebruikt20. Het chromatogram kan worden vergeleken met een bekende standaard voor het controleren van de monsterkwaliteit. Verschillende organismen kunnen echter verschillende elutieprofielen hebben. Daarom wordt het gebruik van histonnormen van vergelijkbare organismen ten zeerste aanbevolen. - Sluit een C18 omgekeerde fase (RP) analytische kolom aan (bijv. 3 μm 300 Å, kolom binnendiameter 75 μm, buitendiameter 360 μm, lengte 70 cm) en een C18 valkolom (bijv. 3,6 μm, kolom binnendiameter 150 μm, buitendiameter 360 μm, lengte 5cm) tot een dual-pump nanoflow vloeistofchromatografiesysteem (bijv. Waters NanoAcquity). De binaire oplosmiddelen zijn A: 0,1% mierenzuur in water en B: 0,1% mierenzuur in acetonitril.
OPMERKING: De dual pump LC is voorzien van een waspomp en een verlooppomp. Beide pompen doorlopen twee fasen in elke analyse: een vangfase gevolgd door de analytische fase. In de vangfase stroomt de waspomp in de valkolom en stroomt de verlooppomp in de analytische kolom. In de analytische fase wordt de overvulkolom gekoppeld aan de analytische kolom en stroomt de verlooppomp in beide kolommen. De waspomp gaat dan naar het afval. - Overvulfase: Stel de LC-methode in om eerst 1-2 μg histonmonster op de valkolom te laden. Ontkalf het monster door de waspomp bij 3 μL/min 5% oplosmiddel B gedurende 10 minuten. Stel de analysepomp in op 0,3 μL/min 5% oplosmiddel B voor equilibratie.
- Analytische fase: Stel de verlooppomp (0,3 μL/min) in op 5% B en oprit op 30% op 15 min. Verhoog vervolgens tot 41% B op 100 min voor een hoge organische wasbeurt tot 95% B aan het einde.
OPMERKING: Het verloop kan worden geoptimaliseerd, afhankelijk van de verschillende retentieprofielen op afzonderlijke kolommen. Typisch, full-length histonen elute rond 30%-40% B op de gespecificeerde LC voorwaarden. Langere gradiënten kunnen worden gebruikt om het aantal MS2-spectra te verhogen om meer histon proteoformen vast te leggen. - Stel gegevensafhankelijke acquisitiemethode in op een MS met hoge resolutie (bijv. Thermo Orbitrap Fusion Lumos of iets dergelijks) met ETD-capaciteit (Electron Transfer Dissociation). Gebruik de intacte eiwitmodus en voer alle noodzakelijke kalibraties uit zoals voorgesteld door de fabrikant. Kritieke parameters worden hieronder beschreven. Deze zullen specifiek zijn voor het gebruikte instrument.
- MS1: scanbereik 600–2.000 m/z, resolutie 120k (bij m/z 200), 4 microscans, AGC-doel 1E6, maximale injectie 50 ms.
- MS2: resolutie 120k; 1 microscan; AGC-doel 1E6; gegevensafhankelijke MS/MS: afwisselende ETD (25 ms reactietijd, maximale injectietijd 500 ms) en botsingsdissociatie met hogere energie (HCD, 28% genormaliseerde botsingsenergie met ±5% getrapte energie, maximale injectietijd 100 ms); isolatievenster van 0,6 Da; prioriteit bij staten met de hoogste lading.
- Dynamische uitsluiting: 120 s tijdvenster, ±0.7 Da massa venster. Laadstatussen lager dan 5 en onbepaalde laadstatussen uitsluiten.
- Voer een paar injecties van peptide- of histonnormen uit op nieuwe kolommen om het systeem in evenwicht te brengen en te controleren, voordat u de werkelijke monsters uitvoert. Voor het uitvoeren van een groot aantal monsters voegt u korte spaties of wasbeurten tussen de monsters toe om de overdracht te minimaliseren. Laat de kolommen 15-20 minuten in evenwicht zijn bij de starttoestand (5% oplosmiddel B) voor het volgende monster.
OPMERKING: Langere LC-gradiënten en een hogere maximale injectietijd voor MS2 kunnen de spectrale kwaliteit verbeteren voor het identificeren van meer histone proteoforms.
- Schatting eiwitconcentratie door Bicinchoninic Acid (BCA) test volgens het protocol van de fabrikant.
- LC-MS gegevensverwerking en proteoforme identificatie
- Verkrijg de (sorghum) eiwitsequentie in FASTA-formaat van JGI (https://genome.jgi.doe.gov) of UniProt (https://www.uniprot.org/).
- Gebruik MSConvert21 (http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtml) om de onbewerkte gegevensbestanden (*.raw) van het instrument om te zetten in mzML-indeling.
- Download TopPIC suite22 (http://proteomics.informatics.iupui.edu/software/toppic/) voor gegevensverwerking. Het programma kan worden uitgevoerd in een opdrachtregel of via de grafische interface.
- Gebruik TopFD in de TopPIC-suite om de spectra uit het mzML-bestand uit stap 4.2.2 te deconvulseren. De standaardparameters kunnen worden gebruikt. Maar het "voorlopervenster" (-w) moet worden teruggebracht tot 1 m/z omdat een smal isolatievenster wordt gebruikt.
- Gebruik TopPIC in de TopPIC-suite om proteoformen te identificeren. De meeste standaardparameters kunnen worden gebruikt. Stel het spectrum- en proteoforme cutofftype in op FDR (false discovery rate) en stel de cutoff-waarde in op 0,01 (1% FDR) of zoals gewenst. Stel de "proteoform error tolerance" in op 5 (Dalton). Laad het FASTA-bestand vanaf stap 4.2.1 en het bestand "*_ms2.msalign" uit stap 4.2.4. Start dan de zoektocht.
OPMERKING: De instelling "proteoform error tolerance" combineert proteoformen met vergelijkbare massa's (± 5 Da) als één. Dit helpt redundantie in het proteoforme aantal te verminderen. Het moet echter met voorzichtigheid worden gebruikt, omdat grote tolerantie proteoformen zal samenvoegen met kleine of geen massaverschillen. Deze parameter is alleen beschikbaar in TopPIC versie 1.3 of hoger. - De geïdentificeerde proteoformen kunnen worden onderzocht in het bestand "*_proteoform.csv" of worden gevisualiseerd met behulp van de Topview-module onder de map "*_html" van de uitvoer.
- De proteoforms-lijst die is gegenereerd op basis van de bovenstaande stappen met Behulp van TopPIC annoteert de histon-PTM's als massaverschuivingen. Om individuele PPM's te lokaliseren, moet een wijzigingslijst worden opgenomen. Gedetailleerde beschrijving is te vinden in de TopPIC handleiding. U ook doorgaan met de volgende stap om een aanvullende gegevensanalyse uit te voeren met behulp van het Informed-Proteomics-pakket23 (https://github.com/PNNL-Comp-Mass-Spec/Informed-Proteomics).
- Volg de instructies en gebruik de PbfGen-module om de onbewerkte gegevens van het instrument naar een PBF-bestand te converteren. Deconvoluteer vervolgens de MS1-gegevens met behulp van de ProMex-module om een ms1ft-bestand uit te voeren (functielijst, elke functie vertegenwoordigt een unieke combinatie van massa en bewaartijd).
- Maak een gerichte FASTA voor Informed-Proteomics met behulp van de geïdentificeerde eiwitlijst van TopPIC in stap 4.2.6.
OPMERKING: Het doorzoeken van het hele genoom met informed-proteomics met een groot aantal variabele PTM's kan extreem traag zijn en crashes veroorzaken. Daarom wordt aanbevolen om de grootte van FASTA te verminderen door alleen de doeleiwitten op te neemt. - Maak een gerichte wijzigingslijst om te zoeken naar histone-PTM's volgens de indeling in het voorbeeldbestand. De gemeenschappelijke PTM's die moeten worden opgenomen zijn: Lysine acetylation, lysine mono-methylation, lysine di-methylation, lysine tri-methylation, serine/threonine/tyrosine phosphorylation, protein N-terminal acetylation, methionine/cysteine oxidation. Voor sorghum moeten eiwit N-terminale mono-methylatie, di-methylatie en trimethylering worden toegevoegd.
OPMERKING: Informed-Proteomics zoekt alleen naar PTM's die in de lijst zijn opgegeven. Als er niet-gespecificeerde PTM's aanwezig zijn, kan de proteoform niet worden geïdentificeerd of kan deze verkeerd worden geïdentificeerd aan andere proteoformen. De PTM-lijst moet echter zo kort mogelijk worden gehouden om de zoektijd te minimaliseren. - Voer de MSPathFinder-module uit om proteoformen te identificeren met behulp van de bestanden uit stap 4.2.8, de gerichte FASTA uit stap 4.2.9 en de wijzigingslijst uit stap 4.2.10. De standaardparameters kunnen worden gebruikt.
- De resultaten kunnen worden gevisualiseerd in LcMsSpectator door alle resultaatbestanden te laden.
OPMERKING: Andere bioinformaticatools zijn beschikbaar voor het verwerken en visualiseren van top-downgegevens, elk met zijn eigen sterke punten24,25,26,27,28. Sorghum en vele andere organismen hebben beperkte bekende informatie over histon PTM's in de database. Gebruik Eerst TopPIC om massaverschuivingen van PTM's te identificeren. Deze analyse kan gemakkelijk zowel bekende als onbekende PTM's ontdekken. Vervolgens kunnen de gedetecteerde PTM's doelgericht worden doorzocht door een PTM-lijst op te geven in TopPIC of met andere aanvullende tools.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgens het protocol kunnen de histonen worden geëxtraheerd en geïdentificeerd met behulp van de LC-MS-analyse. De ruwe gegevens en verwerkte resultaten zijn beschikbaar bij MassIVE (https://massive.ucsd.edu/) via toetreding: MSV000085770. Op basis van de TopPIC-resultaten van de representatieve steekproef (ook verkrijgbaar bij MassIVE) identificeerden we 303 histon proteoformen (106 H2A, 72 H2B, 103 H3 en 22 H4 proteoforms). Co-gezuiverde ribosomale proteoformen zijn ook gedetecteerd, meestal eluting vroeg in de LC. Ze bestaan meestal uit ~ 20% van de geïdentificeerde proteoformen, maar overlappen niet met de histon proteoformen die in het latere stadium van de LC-gradiënt eluting. De resultaten kunnen eenvoudig worden gevisualiseerd met de nieuwste TopPIC- of Informed-Proteomics-pakketten. Voor demonstratie richten we ons op de datavisualisatie met behulp van het Informed-Proteomics-pakket, dat kan worden gebruikt om onbewerkte MS-bestanden direct te laden en handmatig proteoforme identificaties te onderzoeken. Houd er rekening mee dat beide softwarepakketten verschillende algoritmen en parameters gebruiken. De gerapporteerde aantallen proteoformen zullen niet identiek zijn. We raden aan om de proteoform-tellingen van TopPIC te rapporteren, omdat het conservatiever is en onbekende PTM's overweegt. Informed-Proteomics-pakket heeft geïntegreerde gegevensverwerking en visualisatie voor eenvoudige handmatige validatie. Voor organismen met goed geannoteerde PTM's raden we ProSightPC24 aan voor de beste locatielokalisatie. Het combineren van de resultaten met behulp van meerdere tools kan het aantal en het vertrouwen van proteoforme identificaties verhogen.
Na verwerking van de gegevens met Informed-Proteomics kan de LC-MS-functiekaart worden gevisualiseerd in LcMsSpectator, die de gedeconvoluteerde eiwitmassa's weergeeft ten opzichte van de LC-bewaartijd. Door op de geïdentificeerde proteoformen in de software te klikken, wordt de bijbehorende functie gemarkeerd met een kleine groene rechthoek in de functiekaart. Belangrijke histoneiwitten moeten worden gezien in specifieke regio's van de kaart, wat het succes van het experiment aangeeft. Figuur 1a toont een representatieve LC-MS feature map van intacte histonen. Histone proteoforms over de volledige lengte worden gemarkeerd in de gestreepte vakken. De meeste gedetecteerde proteoformen kunnen met vertrouwen worden geïdentificeerd met behulp van MS2-gegevens.
Figuur 1b toont de inzooming van de regio met H2A- en H2B-proteoformen. De meeste hebben N-terminal aanpassingen van 42 Da. Deze nominale massa komt overeen met trimethylatie (42,05 Da) of acetylatie (42,01 Da), die vaak worden gezien voor histonen. Hun nauwkeurige massa's verschillen slechts met 0,04 Da en zijn moeilijk te onderscheiden op het intacte eiwitniveau (~ 2 ppm). In ms2-spectra met hoge resolutie kunnen de PTM 's gemakkelijk worden onderscheiden en bevestigd vanwege de lagere massa van de fragmenten29. Bovendien hebben H2A- en H2B-histonen meerdere homologen met zeer vergelijkbare sequenties, zoals opgemerkt door de verschillende UniProt-toetredingsnummers in figuur 1b. Nogmaals, LC-MS-analyse met hoge resolutie kan ze gemakkelijk identificeren en differentiëren. Voor sorghum histonen werden twee soorten H2A's geïdentificeerd. De 16 kDa H2A-histonen in figuur 1b hebben verlengde eindstaarten in de niet-geconserveerde gebieden van histonen. Een andere groep H2A-histonen zonder de verlengde staarten (14 kDa) is te zien in figuur 1c.
Voor H4-histonen werd N-terminale acetylatie geïdentificeerd als de belangrijkste PTM. Aanvullende lysine-aceylaties en methionineoxidaties kunnen ook eenvoudig worden waargenomen door de massaverschillen van de kenmerken in figuur 1dte onderzoeken . We hebben ook een onbekende wijziging van 112,9 Da waargenomen naast de N-terminale acetylering (het kenmerk boven "3Ac" in figuur 1d). Dit zijn waarschijnlijk enkele onbekende adducten van het reagens dat in het preparaat wordt gebruikt. We hebben eerder sulfaationenadducten op H4 gedetecteerd, die kunnen worden toegeschreven aan restzouten in combinatie met een hoge basiswaarde van histoneiwitten. Voor H3 werden twee eiwitsequenties geïdentificeerd H3.3 en H3.2 (figuur 1e). Hoewel deze twee eiwitsequenties verschillen bij slechts 4 residuen (32, 42, 88 en 91), zijn ze nog steeds gemakkelijk te onderscheiden in LC-MS op basis van de scheiding in beide dimensies, massa en retentietijd. H3-eiwitten worden sterk gewijzigd door verschillende mate van methylatie en acetylering. De hoge mate van modificatie kan gemakkelijk worden gevisualiseerd door de dichte, parallelle lijnen in de objectkaart, die 14 Da uit elkaar liggen. Drie methylatiegroepen (14*3 Da) hebben echter de gelijke nominale massa als één acetylatie (42 Da). Omdat deze PTM's niet gemakkelijk kunnen worden opgelost op intact eiwitniveau, worden ze "methylequivalenten" genoemd (d.w.z. veelvouden van 14 Da; één acetylyl is gelijk aan drie methylequivalenten). In figuur 1eworden H3-proteobacteren geëtiketteerd in de vorm van methylequivalenten op basis van hun intacte massa. Vanwege de beperkte resolutie van de RPLC-scheiding zijn veel verschillende H3-proteoformen waarschijnlijk co-eluting en gefragmenteerd in hetzelfde spectrum. De hier gepresenteerde methode zal alleen de meest voorkomende combinaties van methylatie en acetylering identificeren, zoals geïllustreerd in figuur 2. Voor een uitgebreidere karakterisering van H3 is nog steeds een meer gerichte analyse vereist30,31.
Figuur 1: LC-MS feature map op intacte histonen geëxtraheerd uit sorghum bladeren. De figuur toont de LC-retentietijd (in minuten) versus de moleculaire massa voor alle gedetecteerde proteoformen. De log abundance wordt weergegeven door de kleurenschaal naast de bovenste kaart (log 10 abundance). (a) De belangrijkste histonpieken worden gelabeld door de gestreepte dozen. De meeste kenmerken buiten de dozen zijn afgekapte histonen en ribosomale eiwitten. Inzoomweergaven voor elke groep histonen: (b) H2B en 16 kDa H2A, (c) H3, (d) 14 kDa H2A en (e) H3. De UniProt-toetredingsnummers worden naast elk kenmerk genoteerd, gevolgd door gedetecteerde PTM's. "Ac", "me", "+O" geven respectievelijk acetylatie, methylatie en oxidatie aan. In (b) worden twee afgeknotte H2A C5YZA9 proteoforms gelabeld, waarbij een of twee C-terminal alanine waren geknipt (weergegeven als -A*, en -AA*). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Een representatief voorbeeld van proteoforme identificatie wordt weergegeven in figuur 2 met MSPathfinder en gevisualiseerd in LcMsSpectator. Het fragmentatiespectrum in figuur 2a werd gegenereerd met behulp van ETD, dat c- en z-typeionen langs de eiwitbackbone oplevert. HCD van dezelfde precursor kan worden gebruikt om de identificatie te valideren, maar HCD biedt over het algemeen beperkte sequentiedekking20. De precursorionen in de vorige en volgende MS1-spectra worden weergegeven in figuur 2b,c, met hun overeenkomende isotooppieken gemarkeerd in paars. De sequentiedekkingskaart in figuur 2d kan helpen bij het lokaliseren van mogelijke PPM's. Een identificatie met een hoog betrouwbaarheidsniveau moet de meeste fragmenten overeenkomen, precursorionen en een goede sequentiedekking hebben om PTM's te helpen lokaliseren. In dit voorbeeld werd een H3.2-proteoform geïdentificeerd met twee PTM's: di-methylatie op K9 en methylatie op K27. Volgens dezelfde methode kunnen andere proteoformen met verschillende PTM's en terminale truncaties handmatig worden gevalideerd.
Figuur 2: Representatief voorbeeld van een geïdentificeerde histon H3.2 proteoform. H3.2 preteoform met zijn (a) ETD-spectrum, (b) precursorion in het vorige MS1-spectrum, (c) precursorion in het volgende MS1-spectrum en (d) sequentiedekkingskaart. De cionen van het N-eindpunt zijn gelabeld in cyaan, en de z-ionen van het C-eindpunt zijn in roze. Twee PTM's werden geïdentificeerd en gemarkeerd in geel in (d) met hun massaverschuivingen geannoteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Kwantitatieve vergelijking van de gedetecteerde histon proteoformen kan potentiële epigenetische markers onthullen. We hebben dit protocol eerder toegepast op 48 sorghummonsters die uit het veld werden verzameld ("extra remmers" werden niet gebruikt in deze studie)29. Twee verschillende genotypen sorghum werden vergeleken als reactie op voorbloeiende of postbloeiende droogtes. Door de relatieve overvloed van de proteoformen te vergelijken, ontdekten we enkele interessante veranderingen van afgeknotte histon proteoformen die specifiek zijn voor de steekproefomstandigheden zoals weergegeven in figuur 3. C-terminale afkapping van H4 werd slechts in week 3 en 9 waargenomen voor sommige monsters (figuur 3a,b). Voor H3.2 waren N-terminal afgeknotte proteoformen over het algemeen overvloediger in week 10 (figuur 3c,d). C-terminal afgeknotte H3.2 daarentegen is meestal te zien in eerdere tijdspunten (figuur 3c). Wat nog belangrijker is, de twee genotypen reageerden niet op precies dezelfde manier. De H4 C-terminal afgeknotte proteoformen waren significant overvloediger in BTx642 dan in RTx430 (figuur 3b). Dergelijke gegevens onthullen potentiële epigenetische markers van plantenontwikkeling en stresstolerantie die verder kunnen worden getest met andere technieken.
Figuur 3: Kwantitatieve vergelijking van histon proteoformen. (a) Heatmap van histone H4 proteoforms over verschillende monsters. Voor elke proteoform werd de overvloed die werd geëxtraheerd uit top-down MS-gegevens genormaliseerd tot de som van alle geïdentificeerde H4-proteoformen in elke analyse, wat de "relatieve overvloed" opleverde. De waarden werden vervolgens geschaald naar het maximum van elke rij om de veranderingen in proteoformen met een lage overvloed beter weer te geven. De geschaalde relatieve overvloed wordt aangegeven in de kleurtoets onder aan de heatmap. Groeiomstandigheden worden genoteerd op de horizontale as (Pre: pre-flowering drought, Post: post-flowering drought). Drie replica's zijn gegroepeerd en worden gescheiden door zwarte verticale strepen van andere omstandigheden. Voor monsters met sterretjes werden alleen technische replica's verkregen. Proteoformen worden weergegeven op de verticale as, in het formaat "startresidu – eindresidu: massa; putatieve wijziging". (b) Relatieve overvloed plot van de afgeknotte H4 proteoforms 2–99 (proteoforms gemarkeerd in vet onder (a) worden samengevat) onder verschillende omstandigheden. De sleutel van de symbolen wordt weergegeven in de legenda in de rechterbovenhoek. Gevulde stippen in het midden van de foutbalken zijn de gemiddelde waarden. (c) Heatmap van H3.2 proteoforms en (d) overvloed plot voor alle geïdentificeerde N-terminal afgeknotte H3.2 worden weergegeven in hetzelfde formaat als die voor H4. Proteoformen kleiner dan 8 kDa in (c) werden weggelaten voor eenvoud. De N-terminal en C-terminal afgekapte H3.2 proteoformen vertoonden verschillende reacties in de groeiomstandigheden. Herdrukt met toestemming van ELSEVIER uit ref.29. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gepresenteerde protocol beschrijft hoe histonen uit sorghumbladmonsters (of meer in het algemeen plantenblad) kunnen worden geëxtraheerd. De gemiddelde histonopbrengst zal naar verwachting 2-20 μg per 4-5 g sorghumbladmateriaal zijn. De materialen zijn voldoende zuiver voor de downstream histonanalyse door LC-MS (meestal histonen met ~20% ribosomale eiwitbesmetting). Een lager rendement kan worden verkregen als gevolg van monstervariaties of mogelijke verkeerde behandeling/fouten in het hele protocol. Het handhaven van de integriteit van de kernen vóór de nuclei lysis stap is van cruciaal belang; daarom moeten agressieve vortexing en pipetten worden vermeden voordat NLB wordt toegevoegd. Bovendien kan verlies van kernen optreden bij het verwijderen van de supernatanten uit de pellets. Er moet op worden gelet dat de pellets niet worden verstoord bij het pipetten. De Triton X-100 concentratie van 1% werd geoptimaliseerd om selectief de niet-gerichte organellen te lysen, maar niet de kernen (stap 3.2). De optimale wasmiddelconcentratie voor andere weefsels of organismen kan anders zijn en moet experimenteel worden bepaald. Kleurverandering van het supernatant tijdens het filtratieproces kan wijzen op mogelijke problemen zoals inefficiënte afgifte van chloroplast of onvoldoende malen van blad. Gebruik indien mogelijk een microscoop om na elke stap te controleren op lyse van chloroplasten en het vasthouden van intacte kernen om het protocol verder te optimaliseren (vooral als het protocol voor andere weefsels of planten wordt gewijzigd). Dit protocol is alleen getest met sorghum bladweefsel. Het werkt niet voor sorghum wortelweefsel waarschijnlijk als gevolg van interferentie van de bodem. Toepassing op andere plantenbladweefsels is niet getest en toepassing op verschillende planten kan extra optimalisatie nodig hebben. Voor het aanpassen van het kernisolatieprotocol voor ChIP-seq-toepassingen wordt geadviseerd om een extra sucrose gradiëntdichtheidsscheiding na stap 3.3.4 (voor gebruik van NLB) te verminderen. Vanwege de uitgebreide opruimstappen wordt niet verwacht dat kleine hoeveelheden resterende niet-kernmaterialen aanzienlijke interferentie zullen veroorzaken voor histone-analyse in LC-MS en met de pellet kunnen worden achtergelaten.
Verschillende eerste onderzoeken mislukten bij het gebruik van commerciële tabletten fosfataseremmers (bijv. PhosSTOP). De supernatant in stap 3.1.6 bleek intens groen te zijn toen de tabletten in de extractiebuffer werden gebruikt. Het laatste extract toonde een laag aantal geïdentificeerde histonen. We vermoeden dat de gepatenteerde ingrediënten in de tabletten vóór stap 3.4 kernlyse hebben veroorzaakt, waardoor de totale histonopbrengst is verminderd. Een andere mogelijke reden voor falen is de onverenigbaarheid van de ingrediënten in de histonzuiveringsstap met de ionenuitwisselingshars (stap 3.4). We hebben dit protocol gebruikt om consistent hoge zuiverheid histonen te extraheren voor daaropvolgende LC-MS meer dan 150 monsters. Gemiddeld konden we een hogere opbrengst behalen zonder de "extra remmers" (ongepubliceerde gegevens) te gebruiken. Daarom wordt geadviseerd om voorzichtig nieuwe remmers te testen bij het wijzigen of aanpassen van dit protocol voor andere doeleinden. Als fosforylering niet van belang is, kunnen de fosfataseremmers in de extractiebuffers worden weggelaten.
De stappen in 3,4 kunnen 3-4 uur of meer duren. Het wordt aanbevolen om het protocol in 2 dagen te breken - bevries de kernkorrel vanaf stap 3.3 en voer de zuivering uit op dag 2 (of later). De vriesdooicyclus kan de kernlyse gedeeltelijk helpen. De MWCO-filterstappen (3.4.7) kunnen zeer tijdrovend zijn, maar kunnen eenvoudig worden opgeschaald door meerdere monsters parallel te bereiden. Voeg de proteaseremmertabletten niet toe in stap 3.4. Veel commerciële tabletten bevatten polymeren (bijv. polyetheenglycol) als vulstoffen, die de LC-MS-analyse zullen verstoren. Bij deze stap hadden de meeste andere eiwitten moeten worden verwijderd of gedenatureerd, dus enzymremmers zijn niet kritisch. Het is echter nog steeds noodzakelijk om de monsters op 4 °C te houden of bevroren om degradatie te minimaliseren.
Volgens dit protocol kunnen histonen met succes worden geëxtraheerd uit sorghumbladeren. Histone PTMs kunnen worden gekenmerkt met LC-MS. De methode kan mogelijk worden toegepast op grootschalige studies voor het vergelijken van histon-PTM's tussen verschillende biologische monsters (bv. verschillende genotypen, planten die onder verschillende omstandigheden worden gekweekt, enz.), zoals blijkt uit de voorbeeldgegevens in figuur 3. Gegevensverwerking vereist echter nog steeds uitgebreide handmatige analyse voor het vol vertrouwen toewijzen van proteoformen, vooral voor onverwachte (of nieuwe) PTM's. Nieuwe ontwikkelingen in bioinformaticatools zullen naar verwachting de workflow automatiseren en de doorvoer voor grootschalige studies aanzienlijk verhogen. Een andere beperking is dat de top-down MS-methode momenteel niet gemakkelijk veel proteoformen van hypergemodeerde H3 kan onderscheiden (bijv. meerdere sites van mono/di/tri-metlylation en acetylation). De omgekeerde-fase LC met één dimensie kan de verschillende H3-proteoformen niet volledig scheiden. Daarom bevat de MS2-spectra van H3 meestal fragmenten van meerdere proteoformen en kan deze niet gemakkelijk en vol vertrouwen worden gedeconvolueerd. Het combineren van top-down met bottom-up of middle-down methoden30,32,33 kan vooral gunstig zijn voor de karakterisering van histone H3. Als alternatief kan multidimensionale scheiding worden overwogen om de diepte van top-down MS34,35,36te verbeteren .
Histone PTM-profilering door LC-MS maakt het mogelijk om nieuwe epigenetische markers te ontdekken voor het ontwerpen van chromatinemodifiers en de veerkracht van planten tegen ernstige omgevingsomstandigheden te verbeteren. Een proefstudie met sorghum van twee cultivars en gekweekt onder droogteomstandigheden in het veld wees uit dat selectief histone terminal knippen in blad verband kan houden met droogte acclimatisatie en plantenontwikkeling29. De geïdentificeerde histonmarkers kunnen als doelwit dienen door middel van complementaire technieken zoals ChIP-seq. Een volledig begrip van epigenetische factoren die met deze complementaire technieken worden verkregen, zou onmisbaar zijn voor het ontwerpen van innovatieve oplossingen voor gewassen als reactie op veranderingen in het milieu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen.
Acknowledgments
We danken Ronald Moore en Thomas Fillmore voor het helpen met massaspectrometrie-experimenten, en Matthew Monroe voor gegevensdepositie. Dit onderzoek werd gefinancierd door subsidies van het Us Department of Energy (DOE) Biological and Environmental Research via het Epigenetic Control of Drought Response in Sorghum (EPICON) project onder awardnummer DE-SC0014081, van het Amerikaanse Ministerie van Landbouw (USDA; CRIS 2030-21430-008-00D), en via het Joint BioEnergy Institute (JBEI), een faciliteit gesponsord door DOE (Contract DE-AC02-05CH11231) tussen Lawrence Berkeley National Laboratory en DOE. Het onderzoek werd uitgevoerd met behulp van Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) (grid.436923.9), een DOE Office of Science User Facility gesponsord door het Office of Biological and Environmental Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4L | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-5G | |
| EDTA, 500mM Solution, pH 8.0 | EMD Millipore Corp | 324504-500mL | |
| Formic Acid | Thermo Scientific | 28905 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma | G3272-100G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| Potassium phosphate, dibasic | Sigma | P3786-100G | |
| Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tablets | Roche | 5892791001 | |
| Sodium butyrate | Sigma | 303410-5G | Used for histone deacetylase inhibitor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S1888 | |
| Sodium Fluoride | Sigma | S7020-100G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 450243-10G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sucrose | Sigma | S7903-5KG | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 g | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-100ML | |
| Weak cation exchange resin, mesh 100-200 analytical (BioRex70) | Bio-Rad | 142-5842 | |
| Disposables | |||
| Chromatography column (Bio-Spin) | BIO-RAD | 732-6008 | |
| Mesh 100 filter cloth | Millipore Sigma | NY1H09000 | This is part of the Sigma kit (catalog # CELLYTPN1) for plant nuclei extraction. Similar filters with the same mesh size can be used. |
| Micropipette tips (P20, P200, P1000) | Sigma | ||
| Tube, 50mL/15mL, Centrifuge, Conical | Genesee Scientific | 28-103 | |
| Tube, Microcentrifuge, 1.5/2 mL | Sigma | ||
| Equipment | |||
| Analytical Balance | Fisher Scientific | 01-912-401 | |
| Beakers (50mL – 2L) | |||
| Microcentrifuge with cooling | Fisher Scientific | 13-690-006 | |
| Micropipettes | |||
| Swinging-bucket centrifuge with cooling | Fisher Scientific | ||
| Vortex | Fisher Scientific | 50-728-002 | |
| Water bath Sonicator | Fisher Scientific | 15-336-120 |
References
- Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D., Basra, S. M. A. Plant drought stress: Effects, mechanisms and management. Agronomy for Sustainable Development. , 153-188 (2009).
- Dai, A. Drought under global warming: a review. Wiley Interdisciplinary Reviews: Climate Change. 2 (1), 45-65 (2011).
- Rooney, W. L., Blumenthal, J., Bean, B., Mullet, J. E. Designing sorghum as a dedicated bioenergy feedstock. Biofuels, Bioproducts and Biorefining. 1 (2), 147-157 (2007).
- Mullet, J. E., Klein, R. R., Klein, P. E. Sorghum bicolor - an important species for comparative grass genomics and a source of beneficial genes for agriculture. Current Opinion in Plant Biology. 5 (2), 118-121 (2002).
- Xu, L., et al. Drought delays development of the sorghum root microbiome and enriches for monoderm bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4284-4293 (2018).
- Gao, C., et al. Strong succession in arbuscular mycorrhizal fungal communities. ISME Journal. 13 (1), 214-226 (2019).
- Gao, C., et al. Fungal community assembly in drought-stressed sorghum shows stochasticity, selection, and universal ecological dynamics. Nature Communications. 11 (1), (2020).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
- Yuan, L., Liu, X., Luo, M., Yang, S., Wu, K. Involvement of histone modifications in plant abiotic stress responses. Journal of Integrative Plant Biology. 55 (10), 892-901 (2013).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews. Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
- Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. Quantitative proteomic analysis of histone modifications. Chemical Reviews. 115 (6), 2376-2418 (2015).
- Moradian, A., Kalli, A., Sweredoski, M. J., Hess, S. The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).
- Sidoli, S., Garcia, B. A. Characterization of individual histone posttranslational modifications and their combinatorial patterns by mass spectrometry-based proteomics strategies. Methods in Molecular Biology. 1528, Clifton, N.J. 121-148 (2017).
- Maile, T. M., et al. Mass spectrometric quantification of histone post-translational modifications by a hybrid chemical labeling method. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 1148-1158 (2015).
- Dang, X., et al. The first pilot project of the consortium for top-down proteomics: a status report. Proteomics. 14 (10), 1130-1140 (2014).
- Schaffer, L. V., et al. Identification and quantification of proteoforms by mass spectrometry. Proteomics. 19 (10), 1800361 (2019).
- Cupp-Sutton, K. A., Wu, S. High-throughput quantitative top-down proteomics. Molecular Omics. , (2020).
- Varoquaux, N., et al. Transcriptomic analysis of field-droughted sorghum from seedling to maturity reveals biotic and metabolic responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 27124 (2019).
- Gordon, J. A. Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor. Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).
- Zhou, M., et al. Profiling changes in histone post-translational modifications by top-down mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1507, Clifton, N.J. 153-168 (2017).
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Kou, Q., Xun, L., Liu, X. TopPIC: a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization. Bioinformatics (Ocford, England). 32 (22), (2016).
- Park, J., et al. Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics. Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).
- LeDuc, R. D., et al. The C-Score: a bayesian framework to sharply improve proteoform scoring in high-throughput top down proteomics. Journal of Proteome Research. 13 (7), 3231-3240 (2014).
- Fornelli, L., et al. Advancing top-down analysis of the human proteome using a benchtop quadrupole-orbitrap mass spectrometer. Journal of Proteome Research. 16 (2), 609-618 (2017).
- Sun, R. X., et al. pTop 1.0: A high-accuracy and high-efficiency search engine for intact protein identification. Analytical Chemistry. 88 (6), 3082-3090 (2016).
- Xiao, K., Yu, F., Tian, Z. Top-down protein identification using isotopic envelope fingerprinting. Journal of Proteomics. 152, 41-47 (2017).
- Cai, W., et al. MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (2), 703-714 (2016).
- Zhou, M., et al. Top-down mass spectrometry of histone modifications in sorghum reveals potential epigenetic markers for drought acclimation. Methods. , San Diego, Calif. (2019).
- Garcia, B. A., Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Pervasive combinatorial modification of histone H3 in human cells. Nature Methods. 4 (6), 487-489 (2007).
- Zheng, Y., et al. Unabridged analysis of human histone H3 by differential top-down mass spectrometry reveals hypermethylated proteoforms from MMSET/NSD2 overexpression. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (3), 776-790 (2016).
- Garcia, B. A., et al. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).
- Holt, M. V., Wang, T., Young, N. L. One-pot quantitative top- and middle-down analysis of GluC-digested histone H4. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2514-2525 (2019).
- Tian, Z., et al. Enhanced top-down characterization of histone post-translational modifications. Genome Biology. 13 (10), (2012).
- Wang, Z., Ma, H., Smith, K., Wu, S. Two-dimensional separation using high-pH and low-pH reversed phase liquid chromatography for top-down proteomics. International Journal of Mass Spectrometry. 427, 43-51 (2018).
- Gargano, A. F. G., et al. Increasing the separation capacity of intact histone proteoforms chromatography coupling online weak cation exchange-HILIC to reversed phase LC UVPD-HRMS. Journal of Proteome Research. 17 (11), 3791-3800 (2018).
