Summary
Protokollet har utvecklats för att effektivt extrahera intakta histoner från sorghumbladmaterial för profilering av hisstone post-translationella modifieringar som kan fungera som potentiella epigenetiska markörer för att underlätta tekniska torka resistenta grödor.
Abstract
Histoner tillhör en familj av mycket bevarade proteiner i eukaryoter. De packar DNA i nukleosomer som funktionella enheter av kromatin. Post-translationella modifieringar (PTMs) av histoner, som är mycket dynamiska och kan läggas till eller tas bort av enzymer, spelar kritiska roller för att reglera genuttryck. I växter är epigenetiska faktorer, inklusive histon PTMs, relaterade till deras adaptiva svar på miljön. Att förstå epigenetisk kontrolls molekylära mekanismer kan ge oöverträffade möjligheter till innovativa bioengineeringslösningar. Häri beskriver vi ett protokoll för att isolera atomkärnorna och rena histoner från sorghum bladvävnad. De extraherade histonerna kan analyseras i sina intakta former genom top-down masspektrometri (MS) i kombination med online omvänd fas (RP) flytande kromatografi (LC). Kombinationer och stoichiometry av flera PTMs på samma histon proteoform kan lätt identifieras. Dessutom kan hisstone tail clipping detekteras med hjälp av LC-MS-arbetsflödet uppifrån och ned, vilket ger den globala PTM-profilen för kärn histoner (H4, H2A, H2B, H3). Vi har tillämpat detta protokoll tidigare för att profilera histon PTMs från sorghum bladvävnad samlas in från en storskalig fältstudie, syftar till att identifiera epigenetiska markörer för torka resistens. Protokollet kan potentiellt anpassas och optimeras för kromatin immunoprecipitation-sekvensering (ChIP-seq), eller för att studera histon PTMs i liknande växter.
Introduction
Den ökande svårighetsgraden och frekvensen av torka förväntas påverka produktiviteten hos spannmålsgrödor1,2. Sorghum är en spannmålsmat och energigröda känd för sin exceptionella förmåga att motstå vattenbegränsande förhållanden3,4. Vi eftersträvar mekanistisk förståelse av samspelet mellan torkastress, växtutveckling och epigenetik av sorghumväxter. Vårt tidigare arbete har visat starka kopplingar mellan växt- och rhizosfärmikrobiom vid torkacklimat och svar påmolekylär nivå 5,6,7. Denna forskning kommer att bana väg för att använda epigenetisk teknik för att anpassa grödor till framtida klimatscenarier. Som en del av arbetet med att förstå epigenetik strävar vi efter att studera proteinmarkörer som påverkar genuttrycket inom växtorganismen.
Histoner tillhör en mycket bevarad familj av proteiner i eukaryoter som packar DNA i nukleosomer som grundläggande enheter av kromatin. Post-translational ändringar (PTMs) av histones regleras dynamiskt för att kontrollera kromatin struktur och påverka gen uttryck. Liksom andra epigenetiska faktorer, inklusive DNA-metylering, spelar histon-PTM viktiga roller i många biologiska processer8,9. Antikroppsbaserade analyser som västerländska blots har i stor utsträckning använts för att identifiera och kvantifiera histon-PTM: er. Dessutom kan interaktionen mellan histon-PTMs och DNA effektivt undersökas av Chromatin immunoprecipitation – sekvensering (ChIP-seq)10. I ChIP-seq berikas kromatin med specifik riktad histon PTM av antikroppar mot den specifika PTM. Sedan kan DNA-fragmenten släppas ut från den berikade kromatin och sekvenseras. Regioner av gener som interagerar med den riktade histonen PTM avslöjas. Alla dessa experiment är dock starkt beroende av antikroppar av hög kvalitet. För vissa histonvarianter/homologer eller kombinationer av PTM kan utvecklingen av robusta antikroppar vara extremt utmanande (särskilt för flera PTM). Dessutom kan antikroppar endast utvecklas om den riktade histonen PTM är känd. 11 Därför är det nödvändigt med alternativa metoder för obefläckad, global profilering av histon-PTM: er.
Masspektrometri (MS) är en kompletterande metod för att karakterisera histon-PTM, inklusive okända PTM-skivor för vilka antikroppar inte ärtillgängliga 11,12. Det väletablerade "bottom-up" MS-arbetsflödet använder proteaser för att smälta proteiner till små peptider före vätskekromatografi (LC) separation och MS-detektion. Eftersom histoner har ett stort antal grundläggande rester (lysin och arginin), trypsin matsmältningen (proteas specifikt för lysin och arginin) i standard bottom-up arbetsflöde skär proteinerna i mycket korta peptider. De korta peptiderna är tekniskt svåra att analysera med standard LC-MS, och bevarar inte informationen om anslutning och stoichiometry av flera PTMs. Användningen av andra enzymer eller kemisk märkning för att blockera lysiner genererar längre peptider som är mer lämpliga för karakterisering av histon PTMs13,14.
Alternativt kan matsmältningssteget utelämnas helt. I denna "top-down" -metod introduceras intakta proteinjoner i MS genom elektrosprayjonisering (ESI) efter online LC-separation, vilket ger joner av de intakta histonproteoformerna. Dessutom kan joner (dvs. proteoformer) av intresse isoleras och fragmenteras i masspektrometern för att ge sekvensjonerna för identifiering och PTM-lokalisering. Därför har ms uppifrån och ned fördelen att bevara proteoform-nivåinformationen och fånga anslutningen av flera PTMs och terminal trunkeringar på samma proteoform15,16. Top-down experiment kan också ge kvantitativ information och erbjuda insikter om biomarkörer på intakt proteinnivå17. Här beskriver vi ett protokoll för att extrahera hisstone från sorghum leaf och analysera de intakta histonerna av top-down LC-MS.
De exempeldata som visas i figur 1 och figur 2 kommer från sorghumblad som samlats in vecka 2 efter plantering. Även om variation av avkastning förväntas, är detta protokoll i allmänhet agnostiskt för specifika prov villkor. Samma protokoll har framgångsrikt använts för sorghum växtbladsvävnad som samlats in från 2, 3, 5, 8, 9 och 10 veckor efter plantering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbereda sorghumbladmaterial
OBS: Sorghumplantorna odlades i jord på fältet i Parlier, CA.
- Samla sorghumblad från växter i 50 ml centrifuger och frys omedelbart röret i flytande kväve. Samla bladvävnad genom att riva av det tredje och fjärde helt uppkomna bladet från den primära rorkulten.
Mer information om fälttillstånd, provtillväxt och insamling finns i den publicerade rapporten18. - Mala bladen med flytande kväve och överför omedelbart till ett centrifugeringsrör.
- Förvara markbladet vid -80 °C tills det används. Ta ca 4 g kryo-slipat bladpulver för histonanalys av varje prov.
2. Beredning av buffertar och material (3–4 timmar)
OBS: Lösningarna för högkoncentrationslager kan göras i förväg och lagras tills de används. Men alla arbetsbuffertar måste göras färska på extraktionsdagen (genom utspädning från lager och blandning med annat innehåll) och placeras på is under processen. Hela försöket bör utföras vid 4 °C om inget annat rekommenderas.
- Förbered 2,5 M sackaros genom att lösa upp 42,8 g sackaros (342,30 g/mol) i 15 ml sterilt vatten på värmeplattan i en glasbehållare med kontinuerlig omrörning. Ta upp volymen till 50 ml när sackarosen har lösts upp helt. Förvara sackarosen i 4 °C tills den används.
- Förbered 1 M Tris pH 8 genom att lösa upp 1,576 g Tris HCl i 10 ml H2O i ett 15 ml centrifugeringsrör. Justera pH med NaOH till 8 och kontrollera med pH-papper. Förvara den vid 4 °C tills den används.
- Förbered 1 M Dithiothreitol (DTT) genom att väga 231 mg DTT (154,25 g/mol) och lösa upp det i 1,5 ml sterilt vatten. DTT måste göras färskt eller använda lagrade frysta alikvoter.
- (Valfritt) Förbered de extra hämmarna genom att blanda tre olika salter. Bered 18,38 mg natriumortrat (183,91 g/mol) i 1 ml sterilt vatten och bered sedan separat natrium butyrat genom att tillsätta 11,008 mg natrium butyrat (110,09 g/mol) i 1 ml sterilt vatten. Förbered det slutliga saltet genom att tillsätta 4,199 mg natriumfluorid (41,99 g/mol) i 1 ml vatten. Blanda de tre saltlösningarna i lika stor volym som stamlösning för "ytterligare hämmare" (33 mM av var och en av de tre kemikalierna).
OBS: Natrium vanadinpolymeriserar vid koncentrationer över 0,1 mM under neutralt pH. Det rekommenderas att aktivera natrium vanadinat för att depolymerisera det för maximal effekt enligt publicerade protokoll19. Alternativt är aktiverat natrium vanadin kommersiellt tillgängligt. Häri aktiverades inte natrium vanadin avsiktligt, så effekten minskar inte. Aktiverat natrium vanadinat har ännu inte testats för detta protokoll. - Förbered 1 M MgCl2 genom att lösa upp 0,952 g vattenfri magnesiumklorid (95,2 g/mol) i 10 ml H2O i ett 15 mL centrifugrör. Förvara 1 M MgCl2 vid 4 °C tills den används.
- Förbered 10% (v/v) Triton X-100 genom att blanda 53,5 g Triton X-100 med 35 ml sterilt vatten, ta upp till 50 ml vatten och förvara det vid rumstemperatur.
- Förbered 5% Guanidinbuffert pH7 (kallad "Gdn-buffert") som kommer att användas för att konditionera hartset minst över natten – förbered 0,1 M kaliumvätefosfatdike (K2HPO4) genom att väga 870 mg K2HPO4 och upplösa i 50 ml sterilt vatten och lagra vid 4 °C.
- Väg 0,7 g guaanidinhydroklorid och lös upp i 0,1 M K2HPO4 till en slutlig volym på 14 ml. Justera pH till 7 genom att kontrollera med pH-papper.
- Blötlägg det torra svaga katjonutbytet (WCX) harts i 5% Guaanidinbuffert pH 7 över natten. Ta bort supernatanten och fyll på med färsk 5% Gdn-buffert och blötlägg den igen över natten för att låta hartset helt jämkalibrera (tills supernatanten har samma pH som den ursprungliga bufferten).
- Innan du påbörjar experimentet i nästa avsnitt, blanda reagenserna för att göra EB1-, EB2A- och EB2B-buffert baserat på tabell 1. Tillsätt alla inhibitorer och DTT färska strax före användning.
| Reagenser | Lagerkoncentration | EB1 | EB2A | EB2B |
| Volym (ml) | Volym (ml) | Volym (ml) | ||
| Sackaros | 2.5M | 4.4 | 1.25 | 0.5 |
| Tris HCl pH8 (tris HCl pH8) | 1M (1 M) | 0.25 | 0.125 | 0.05 |
| Dtt | 1M (1 M) | 0.125 | 0.0625 | 0.025 |
| H2O | 20.225 | 9.6875 | 4.375 | |
| proteashämmare (PI) tablett | 0,5 piller | 0,5 piller | 0,5 piller | |
| Ytterligare inhibitorer (valfritt) | 33mM | 0.25 | 0.125 | 0.05 |
| MgCl2 | 1M (1 M) | 0.125 | 0.05 | |
| Triton X100 | 10% | 1.25 | ||
| Total volym | 25 ml | 12,5 ml | 5 ml | |
Tabell 1: Sammansättning för extraktionsbuffertar.
- Gör Nuclei Lysis Buffer (NLB) baserat på tabell 2. Förbered NLB i förväg och förvara vid 4 °C tills det används. Tillsätt PI tabletter färska strax före användning vid 1x (0,5 tablett per 5 ml). Se tabell 2 för specifika volymer.
| Nlb | Lagerkoncentration | Volym (ml) |
| Nacl | 5M | 0.4 |
| Tris HCl pH8 (tris HCl pH8) | 1M (1 M) | 0.05 |
| Triton X100 | 10% | 0.5 |
| Edta | 0.5M | 0.2 |
| H2O | 3.85 | |
| PI-tabletter | 0,5 piller | |
| Ytterligare inhibitorer (tillval) | 33mM | 0.05 |
| Total volym | 5 ml |
Tabell 2: Sammansättning för kärnlysbufferten (NLB).
3. Förfarandet för isolering av atomkärnor
OBS: Det rekommenderas att utföra steg 3.1-3.3 av den första dagen (2-3 h), spara atomkärnorna i NLB-buffert vid -80 °C och återuppta följande dag (eller senare) för proteinrening (4 h). Nuclei isolering steg i detta protokoll anpassades från en sorghum ChIP-seq protokoll som används vid Joint Genome Institute. Ytterligare tvättar och sackarosgradientseparation kan krävas för att säkerställa kärnrenhet för ChIP-seq-applikationer.
- Filtrering av skräp (~0,5 h)
- Väg markbladspulver ~4 g, se till att det förblir fruset genom att placera på torr is eller flytande kväve tills det är klart att användas.
- Tillsätt proteashämmartabletter till EB1 till en slutlig koncentration på 0, 2x (0, 5 tablett för 25 ml per prov). Använd en miniatyr plast mortel eller en pipettspets för att förkrossa tabletter i ett mikrocentrifugrör innan du lägger till buffertar för att hjälpa till att lösa upp tabletten i bufferten. För att förhindra materialförlust, tillsätt PI-tabletten och soniska bufferten för att lösa upp tabletten.
- Tillsätt 20 ml EB1 till det frysta malda bladpulvret, virvel försiktigt och blanda dem tills pulvret är helt upphängt. Fortsätt blanda försiktigt i ~10 min.
- Filtrera genom nät 100, skölj det filtrerade materialet två gånger med 2 ml EB1 varje gång.
OBS: Både filtratet och det filtrerade skräpet ska vara gröna. Om man spårar med ett mikroskop bör man kunna se intakta kärnor och intakta kloroplaster i filtratet vid denna tidpunkt. Majoriteten av stora skräp bör vara frånvarande / uttömda. Blanda färgämnen som metylenblått med prov. Atomkärnor kan lätt observeras som ~3–5 μm diameter mörkblå/akvamarinsfärer när de visualiseras med ett mål på 20x, 40x och/eller 100x. I förhållande till atomkärnor är kloroplaster lika stora, men gröna i färg och ofta mer ovala i form. Vacuoles liknar också atomkärnor i storlek och form, men de kommer inte lätt att ta upp Metylenblå färgämnet. - Centrifugera det kombinerade filtratet vid 3 000 x g i 10 min vid 4 °C i en svängande skopanrotor till pelletsskräp och stora subcellulära organeller, inklusive atomkärnor och kloroplaster.
OBS: Det rekommenderas att förbereda EB2A under denna snurr (se steg 3.2.1). - Dekanta supernaten, var noga med att inte störa pelleten.
OBS: Eftersom inget rengöringsmedel ännu har tillsatts bör pelleten förbli intensiv grön och supernaten ska på sin mest vara blekgrön/gul.
- Lysis av icke-målorganeller (~0,5 h)
- Förbered EB2A genom att tillsätta proteashämmare till en slutlig koncentration på 0, 4x (0, 5 tablett per 12,5 ml EB2A).
- Återanvänd pelleten från steg 3.1.6 i 5 ml EB2A och inkubera på is i 10 minuter med skonsam blandning.
OBS: Tvättmedelskoncentrationen måste optimeras för att företrädesvis lysa intakta celler och kloroplaster men inte atomkärnor. Mängden som krävs kan variera mellan organismer. Det rekommenderas att kontrollera om det finns lys av kloroplaster och retention av intakta kärnor under mikroskop. - Centrifug vid 2 100 x g i 15 min vid 4 °C i en svängande skopanrotor till pelletsskräp och atomkärnor.
OBS: I detta skede bör supernatanten vara intensivt grön, och pelleten ska vara mycket mindre grön än vad som observerats i de tidigare stadierna på grund av lyset av kloroplaster och klorofyllfrisättning i cytosolen. - Dekanta supernaten, var noga med att inte störa pelleten.
- Isolering av atomkärnor från kvarvarande cytoplasmatiska föroreningar (~0,5 h)
- Förbered EB2B genom att tillsätta proteashämmare till en slutlig koncentration på 1x (0,5 tablett per 5 ml EB2B).
- Återanvänd rå kärnpellets från steg 3,2,3 i 2 ml EB2B.
OBS: EB2B innehåller inte Triton X-100, så ingen ytterligare lys bör uppstå vid denna tidpunkt. - Centrifug vid 2 100 x g i 15 min vid 4 °C i en svängande skopanrotor till pelletsskräp och atomkärnor.
OBS: Små organeller och cytoplasmakomponenter bör inte pellets, så de bör förbli i supernatanten. - Dekanta supernaten, var noga med att inte störa pelleten.
- Återanvänd pelleten med 250 μL NLB (tillsätt 0, 5 proteashämmartabletter färska för 5 ml).
OBS: Målet är att återanvända kärnorna i en minsta mängd NLB utan betydande materialförlust. Eftersom NLB är mycket trögflytande och pelletsen innehåller en stor mängd olösligt skräp är det mycket svårt att pipettera och tenderar att klamra sig fast på insidan av pipettspetsar. Av denna anledning rekommenderas att återanvända samma pipettspets när det är möjligt. Om det handlar om restmaterial i en pipettspets, häng helt enkelt pipetten från en hylla eller rack i ~ 1 min för att låta gravitationen samla material vid spetsens öppning. Använd inte aggressivt pipetten för att återanvända pelletsen. Använd istället pipettspetsen som omrörstång tills det pelleterade materialet kan aspirera in i pipettspetsen. Dvs det är helt okej för stora pelletsklumpar att stanna i detta skede så länge det kan dras in i en pipettspets. - Virvel 15 s på max för att homogenisera och delvis återanvända materialet. Sonicate i 5 min vid 4 °C, förvara sedan vid -80 °C.
OBS: För efterföljande steg, kom ihåg att den totala mängden NLB som tillsätts är 250 μL, men den totala skenbara volymen av provet kan vara upp till dubbelt så mycket på grund av olösligt skräp. Provet fryses och tinas för att hjälpa till med lys av atomkärnor.
- Nuclei lysis och histonutvinning (~4 h)
- Tillsätt 750 μL 5% Gdn-buffert till det tinade provet. Sonicate i 15 min vid 4 °C.
- Överför provet till ett enda 2 ml-rör och snurra 10 000 x g i 10 min vid 4 °C.
Obs: Supernatanten kommer sannolikt att se grön ut. Följande kromatografisteg bör ta bort de flesta pigmenten från proteinet. - Medan du väntar på steg 3.4.1 och 3.4.2, förbered kolumnen för jonutbyteskromatografirensning. Skölj kromatografikolonnen med 2 ml acetonitril och 4 ml vatten för att minimera föroreningen på ytan.
- Ladda 200 ~300 μL WCX-harts (förkonderat med 5% Gdn-buffert) på kromatografikolonnen. Låt hartset lägga sig. Tvätta fyra gånger med 1 ml 5% Gdn-buffert. Håll röret och kolonnen på is under resten av reningsstegen.
- Sätt kromatografikolonnen på ett uppsamlingsrör på 2 ml. Lasta supernatanten från steg 3.4.2 långsamt på hartsbädden utan att störa hartset (försök att långsamt släppa från sidan av rören). Låt lösningen flöda genom gravitationen. När lösningen strömmar igenom, ladda eluenten tillbaka till toppen av kolumnen 6-8 gånger för att tillåta maximal bindning till hartset. Kassera sedan eluenten.
- Ladda 2 ml 5% Gdn-buffert för att tvätta icke-histonproteiner från kolonnen. Kassera eluenten.
- Elute histones med 1 ml 20% Gdn buffert. Samla eluenten, som innehåller histonproteiner.
- Använd 3 kDa molekylviktsavskuret (MWCO) spinnfilter (0,5 ml) för att avsalta eluenten från steg 3.4.6. Före användning, ladda 500 μL tvättlösningsmedel (0,2% myrsyra i 3% ACN) och snurra ner det två gånger för att rengöra filtret.
OBS: Vi rekommenderar att du börjar tvätta MWCO-filtret medan du utför anvisningarna för hartskromatografi för att spara tid. Följande rotationsfiltersteg tar ~3–4 h. - Ladda först 500 μL histonprov, snurra på 14 000 x g i ~25 min för att minska volymen ner till ~100 μL. Ladda sedan ytterligare 400 μL prov och snurra på 14 000 x g igen i ~ 25 min. Ladda de sista 100 μL provet, skölj provröret med 300 μL tvättlösningsmedel och ladda lösningsmedlet i filtret. Snurra på 14 000 x g igen i ~25 min.
- Ladda 400 μL tvättlösningsmedel, snurra vid 14 000 x g i ~25 min för att minska volymen till ~100 μL eller mindre. Varje cykel minskar saltkoncentrationen med en femtedel. Upprepa i ytterligare tre cykler för att få guanidinkoncentrationen till ~ 0,01%. Vänd filtret till ett rent uppsamlingsrör och snurra vid 1 000 x g i 2 min. Spara det renade histonprovet vid -20 °C eller -80 °C för analys.
OBS: Det rekommenderas att snurra längre (30–40 min) i sista steget för att minimera provvolymen för att uppnå högre koncentration. Volymen ska kunna gå ner till 50–70 μL.
4. Masspektrometri av renade histoner
- Datainsamling av flytande kromatografimasspektrometri (LC-MS)
- Uppskatta proteinkoncentrationen med Bicinchoninic Acid (BCA) enligt tillverkarens protokoll.
OBS: BCA kan bara ge en uppskattning av den totala proteinkoncentrationen, men inte kvaliteten på histonrening. Om MS-instrumentering inte är lätt tillgänglig för kontroll av kvaliteten på histonrening kan western blot användas. Omvänd fas LC i kombination med 210 nm ultraviolett absorbansdetektering enligt beskrivningen i vår tidigare rapport kan också användas20. Kromatogrammet kan jämföras med en känd standard för kontroll av provkvalitet. Olika organismer kan dock ha olika elueringsprofiler. Därför rekommenderas starkt att använda histonstandarder från liknande organismer. - Anslut en C18-analyskolonn (RP) (t.ex. 3 μm 300 Å, kolonnens innerdiameter 75 μm, ytterdiameter 360 μm, längd 70 cm) och en C18-fälla (t.ex. 3,6 μm, kolonnens innerdiameter 150 μm, ytterdiameter 360 μm, längd 5 cm) till ett nanoflödesvätska med dubbla pumpar (t.ex. Waters NanoAcquity). Binära lösningsmedel är A: 0,1% myrsyra i vatten och B: 0,1% myrsyra i acetonitril.
OBS: Det dubbla pump-LC:et har en tvättpump och en lutningspump. Båda pumparna går igenom två steg i varje analys – ett fångststadium följt av analysstadiet. I fångststadiet strömmar tvättpumpen in i fällan och lutningspumpen strömmar in i analyskolonnen. I det analytiska skedet kopplas fällan till analyskolonnen och övertoningspumpen strömmar in i båda kolumnerna. Tvättpumpen går sedan till avfallet. - Svällningssteg: Ställ in LC-metoden för att först ladda 1–2 μg histonprov på fällans kolonn. Avsalta provet med tvättpumpen vid 3 μL/min 5% lösningsmedel B i 10 min. Ställ in analyspumpen på 0,3 μL/min 5% lösningsmedel B för jämvikt.
- Analysstadium: Ställ in lutningspumpen (0,3 μL/min) så att den startar från 5 % B och rampen till 30 % på 15 min. Öka sedan till 41% B vid 100 min innan en hög organisk tvätt upp till 95% B i slutet.
Övertoningen kan optimeras beroende på de olika kvarhållningsprofilerna på enskilda kolumner. Vanligtvis framkallar fullängds histoner cirka 30%-40% B på de angivna LC-villkoren. Längre övertoningar kan användas för att öka antalet MS2-spektra för att fånga fler histonproteoformer. - Ställ in databeroende anskaffningsmetod på en högupplöst MS (t.ex. Thermo Orbitrap Fusion Lumos eller liknande) med ETD-kapacitet (Electron Transfer Dissociation). Använd det intakta proteinläget och utför alla nödvändiga kalibreringar som tillverkaren föreslår. Kritiska parametrar beskrivs nedan. Dessa kommer att vara specifika för det instrument som används.
- MS1: skanningsområde 600–2 000 m/z, upplösning 120k (vid m/z 200), 4 mikroscans, AGC mål 1E6, max injektion 50 ms.
- MS2: resolution 120k; 1 mikroskanna; AGC-mål 1E6; Databeroende MS/MS: alternerande ETD (25 ms reaktionstid, max insprutningstid 500 ms) och högre energikollisionell dissociation (HCD, 28% normaliserad kollisionsenergi med ±5% stegad energi, max insprutningstid 100 ms); isoleringsfönster på 0,6 Da; högsta avgiftsstater.
- Dynamisk uteslutning: 120 s tidsfönster, ±0.7 Da massfönster. Exkludera laddningsstater som är lägre än 5 och obestämda laddningsstater.
- Kör några injektioner av peptid- eller histonstandarder på nya kolumner för att balansera och kontrollera systemet innan du kör de faktiska proverna. För att köra ett stort antal prover, lägg till korta ämnen eller tvättar mellan proverna för att minimera överföring. Låt pelarna balansera i 15–20 minuter vid startförhållandet (5 % lösningsmedel B) före nästa prov.
OBS: Längre LC-gradienter och högre maximal injektionstid för MS2 kan förbättra spektralkvaliteten för att identifiera fler histonproteoformer.
- Uppskatta proteinkoncentrationen med Bicinchoninic Acid (BCA) enligt tillverkarens protokoll.
- LC-MS-databehandling och proteoformidentifiering
- Få (sorghum) proteinsekvensen i FAST-format från JGI (https://genome.jgi.doe.gov) eller UniProt (https://www.uniprot.org/).
- Använd MSConvert21 (http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtml) för att konvertera instrumentets rådatafiler (*.raw) till mzML-format.
- Ladda ner TopPIC suite22 (http://proteomics.informatics.iupui.edu/software/toppic/) för databehandling. Programmet kan köras på antingen kommandoraden eller via det grafiska gränssnittet.
- Använd TopFD i TopPIC-sviten för att dekonvolera spektrat från mzML-filen från steg 4.2.2. Standardparametrarna kan användas. Men "prekursorfönstret" (-w) måste minskas till 1 m/z eftersom ett smalt isoleringsfönster används.
- Använd TopPIC i TopPIC-sviten för att identifiera proteoformer. De flesta standardparametrarna kan användas. Ställ in spektrum- och proteoform cutoff-typen på FDR (falsk identifieringshastighet) och ställ in brytvärdet till 0,01 (1 % FDR) eller efter önskemål. Ställ in feltoleransen "proteoform" på 5 (Dalton). Läs in FASTA-filen från steg 4.2.1 och filen "*_ms2.msalign" från steg 4.2.4. Starta sedan sökningen.
OBS: Inställningen "proteoform feltolerans" kombinerar proteoformer med liknande massor (± 5 Da) som en. Detta bidrar till att minska redundansen i proteoformräkningen. Det bör dock användas med försiktighet eftersom stor tolerans kommer att slå samman proteoformer med små eller inga massskillnader. Den här parametern är endast tillgänglig i TopPIC version 1.3 eller senare. - De identifierade proteoformerna kan undersökas i filen "*_proteoform.csv" eller visualiseras med hjälp av Topview-modulen under mappen "*_html" i utdata.
- Proteoforms-listan som genereras från stegen ovan med TopPIC kommenterar de histon-PTM:erna som massförskjutningar. För att lokalisera enskilda PTM:er måste en ändringslista inkluderas. Detaljerad beskrivning finns i TopPIC-handboken. Alternativt kan du gå vidare till nästa steg för att utföra en kompletterande dataanalys med hjälp av Informed-Proteomics-paketet23 (https://github.com/PNNL-Comp-Mass-Spec/Informed-Proteomics).
- Följ instruktionerna och använd PbfGen-modulen för att konvertera instrumentråvaran till en PBF-fil. Dekonvolera sedan MS1-data med ProMex-modulen för att mata ut en ms1ft-fil (funktionslista, varje funktion representerar en unik kombination av massa och kvarhållningstid).
- Skapa en fokuserad FASTA för Informed-Proteomics med hjälp av den identifierade proteinlistan från TopPIC i steg 4.2.6.
OBS: Att söka i hela genomet med Hjälp av Informed-Proteomics med ett stort antal variabla PTM:er kan vara extremt långsamt och kan orsaka krascher. Därför rekommenderas att minska storleken på FASTA genom att endast inkludera målproteinerna. - Skapa en riktad ändringslista för att söka efter kortstens-PTM:er efter formatet i exempelfilen. De vanliga PTMs att inkludera är: Lysin acetylering, lysin mono-metylering, lysin di-metylering, lysin tri-metylering, serin/treonin/tyrosin fosforylering, protein N-terminal acetylering, metionin/cystein oxidation. För sorghum bör protein N-terminal monometylering, di-metylering och trimetylering tillsättas.
Informed-Proteomics söker bara efter PTM:er som anges i listan. Om ospecificerade PTM finns, kan proteoformen inte identifieras eller kan vara felidentifierad till andra proteoformer. PTM-listan bör dock hållas så kort som möjligt för att minimera söktiden. - Kör MSPathFinder-modulen för att identifiera proteoformer med hjälp av filerna från steg 4.2.8, den fokuserade FASTA från steg 4.2.9 och ändringslistan från steg 4.2.10. Standardparametrarna kan användas.
- Resultaten kan visualiseras i LcMsSpectator genom att läsa in alla resultatfiler.
OBS: Andra bioinformatikverktyg finns tillgängliga för bearbetning och visualisering av uppifrån och ned-data, var och en med sina egnastyrkor 24,25,26,27,28. Sorghum och många andra organismer har begränsad känd information om histon-PTM i databasen. Använd TopPIC först för att identifiera massförskjutningar från PTMs. Denna analys kan lätt upptäcka både kända och okända PTMs. Sedan kan de upptäckta PTMs sökas på ett riktat sätt antingen genom att ange en PTM-lista i TopPIC eller med andra kompletterande verktyg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter protokollet kan histonerna extraheras och identifieras med hjälp av LC-MS-analysen. Rådata och bearbetade resultat finns tillgängliga på MassIVE (https://massive.ucsd.edu/) via anslutning: MSV000085770. Baserat på TopPIC-resultaten från det representativa provet (finns även från MassIVE) identifierade vi 303 histonproteoforms (106 H2A, 72 H2B, 103 H3 och 22 H4 proteoforms). Co-purified ribosomal proteoforms har också upptäckts, vanligtvis eluting tidigt i LC. De består vanligtvis av ~ 20% av de identifierade proteoformerna, men överlappar inte med de histonproteoforms som eluerar i det senare skedet av LC-gradienten. Resultaten kan enkelt visualiseras med de senaste TopPIC- eller Informed-Proteomics-paketen. För demonstration kommer vi att fokusera på datavisualiseringen med hjälp av Informed-Proteomics-paketet, som kan användas för att direkt ladda råa MS-filer och manuellt undersöka proteoformidentifieringar. Observera att båda programvarupaketen använder olika algoritmer och parametrar. Det rapporterade antalet proteoformer kommer inte att vara identiska. Vi rekommenderar att du rapporterar proteoformantalet från TopPIC eftersom det är mer konservativt, och det anser okända PTMs. Informed-Proteomics-paketet har integrerad databehandling och visualisering för enkel manuell validering. För organismer med väl kommenterade PTMs rekommenderar vi ProSightPC24 för bästa platslokalisering. Att kombinera resultaten med flera verktyg kan öka antalet och förtroendet för proteoformidentifieringar.
Efter bearbetning av data med Informed-Proteomics kan LC-MS-funktionskartan visualiseras i LcMsSpectator, som visar de decentraliserade proteinmassorna mot LC-retentionstiden. Genom att klicka på de identifierade proteoformerna i programvaran markeras den tillhörande funktionen med en liten grön rektangel i funktionskartan. Stora histonproteiner bör ses i specifika regioner på kartan, vilket indikerar experimentens framgång. Figur 1a visar en representativ LC-MS-funktionskarta över intakta histoner. Hisstensproteoformer i full längd markeras i de streckade rutorna. De flesta proteoformer som upptäcks kan identifieras med ms2-data.
Bild 1b visar inzoomningen i regionen med H2A- och H2B-proteoformer. De flesta av dem har N-terminaländringar på 42 Da. Denna nominella massa motsvarar antingen trimetylering (42,05 Da) eller acetylering (42,01 Da), som vanligtvis ses för histoner. Deras exakta massor skiljer sig endast med 0,04 Da och är svåra att skilja på den intakta proteinnivån (~ 2 ppm). I högupplöst MS2-spektra kan PTMs enkelt differentieras och bekräftas på grund av fragmentens lägre massa29. Dessutom har H2A- och H2B-histoner flera homologer med mycket liknande sekvenser som noterats av de olika UniProt-anslutningsnumren i figur 1b. Återigen kan högupplöst LC-MS-analys enkelt identifiera och differentiera dem. Två typer av H2As identifierades för sorghum histones. Histonerna på 16 kDa H2A i figur 1b har förlängda terminalsvansar i de icke-bevarade regionerna av histoner. En annan grupp H2A-histoner utan de förlängda svansarna (14 kDa) kan ses i figur 1c.
För H4 histones identifierades N-terminal acetylering som den stora PTM. Ytterligare lysin acetylationer och metionin oxidationer kan också observeras helt enkelt genom att undersöka massskillnaderna mellan funktionerna i figur 1d. Vi observerade också en okänd modifiering av 112,9 Da utöver N-terminalacetylering (funktionen ovan "3Ac" i figur 1d). Detta är sannolikt några okända kanaler från reagenset som används i preparatet. Vi har tidigare upptäckt sulfatjonkanaler på H4, som kan hänföras till restsalter i kombination med hög grundlighet av histonproteiner. För H3 identifierades två proteinsekvenser H3.3 och H3.2 (figur 1e). Även om dessa två proteinsekvenser skiljer sig åt vid endast 4 rester (32, 42, 88 och 91), kan de fortfarande lätt särskiljas i LC-MS baserat på separationen i båda dimensionerna, massan och retentionstiden. H3 proteiner är kraftigt modifierade av varierande grader av metylering och acetylering. Den höga graden av modifiering kan enkelt visualiseras av de täta, parallella linjerna i funktionskartan, som är 14 Da ifrån varandra. Tre metyleringsgrupper (14*3 Da) har dock samma nominella massa som en acetylering (42 Da). Eftersom dessa PTMs inte lätt kan lösas på intakt proteinnivå kallas de "metylekvivalenter" (dvs. multiplar av 14 Da; en acetylering är lika med tre metylekvivalenter). I figur 1eär H3-proteoformer märkta i form av metylekvivalenter baserat på deras intakta massa. På grund av begränsad upplösning av RPLC-separationen är många olika H3-proteoformer sannolikt med eluerande och fragmenterade i samma spektrum. Den metod som presenteras här kommer endast att identifiera de mest rikliga kombinationerna av metylering och acetylering som illustreras i figur 2. För mer omfattande karakterisering av H3 krävs fortfarande mer riktadanalys 30,31.
Bild 1: LC-MS-funktionskarta på intakta histoner extraherade från sorghumblad. Figuren visar LC-retentionstid (i minuter) jämfört med den molekylära massan för alla upptäckta proteoformer. Logg överflödet visas av färgskalan bredvid toppkartan (logga 10 överflöd). a)De stora histontopparna är märkta med de streckade rutorna. De flesta av funktionerna utanför lådorna är trunkerade histoner och ribosomala proteiner. Inzoomningsvyer för varje grupp av histoner:( b) H2B och 16 kDa H2A,( c) H3,( d) 14 kDa H2A och (e) H3. UniProts anslutningsnummer noteras tillsammans med varje funktion, följt av upptäckta PTM: er. "Ac", "jag", "+O" indikerar acetylering, metylering respektive oxidation. Ibär två trunkerade H2A C5YZA9 proteoforms märkta, som hade en eller två C-terminal alanin klippta (visas som -A*, och -AA*). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Ett representativt exempel på proteoformidentifiering visas i figur 2 med MSPathfinder och visualiseras i LcMsSpectator. Fragmenteringsspektrumet i figur 2a genererades med hjälp av ETD, vilket ger c- och z-typjoner längs proteinets ryggrad. HCD med samma prekursor kan användas för att validera identifieringen, men HCD ger i allmänhet begränsad sekvenstäckning20. Prekursorjonerna i föregående och nästa MS1-spektra visas i figur 2b,c, med deras matchade isotoptoppar markerade i lila. Sekvenstäckningskartan i figur 2d kan hjälpa till att lokalisera eventuella PTM:er. En identifiering med högt förtroende bör ha de flesta fragmenten matchade, prekursorjonen matchad och bra sekvenstäckning för att hjälpa till att lokalisera PTM:er. I det här exemplet identifierades en H3.2 proteoform med två PTMs- di-metylering på K9 och metylering på K27. Enligt samma metod kan andra proteoformer med olika PTM:er och terminal trunkeringar valideras manuellt.
Figur 2: Representativt exempel på en identifierad histon H3.2 proteoform. H3.2 preteoform meddess a)ETD-spektrum,b)prekursorjon i föregående MS1-spektrum,c)prekursorjon i nästa MS1-spektrum ochd) täckningskartaför sekvenser. Cjonerna från N-ändstationen är märkta med cyan, och zjonerna från C-ändstationen är i rosa. Två PTMs identifierades och markerades i gult i (d) med deras massa skift kommenterade. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kvantitativ jämförelse av de upptäckta histon proteoformerna kan avslöja potentiella epigenetiska markörer. Vi har tillämpat detta protokoll tidigare på 48 sorghumprover som samlats in från fältet ("ytterligare hämmare" användes inte i denna studie)29. Två olika genotyper av sorghum jämfördes som svar på pre-blommande eller post-blommande torka. Genom att jämföra proteoformens relativa överflöd upptäckte vi några intressanta förändringar av trunkerade histonproteoformer som är specifika för provförhållanden som visas i figur 3. C-terminal trunkering av H4 observerades endast i veckorna 3 och 9 för några av proverna(figur 3a,b). För H3.2 var N-terminal trunkerade proteoformer i allmänhet rikligare under vecka 10 (Figur 3c,d). Däremot tenderar C-terminal trunkerad H3.2 att ses i tidigare tidpunkter(figur 3c). Ännu viktigare var att de två genotyperna inte svarade på exakt samma sätt. H4 C-terminal trunkerade proteoformer var betydligt vanligare i BTx642 än i RTx430(figur 3b). Sådana data avslöjar potentiella epigenetiska markörer för växtutveckling och stresstolerans som kan testas ytterligare med andra tekniker.
Figur 3: Kvantitativ jämförelse av histonproteoformer. a)Värmekarta över H4-proteoformer i olika prover. För varje proteoform normaliserades det överflöd som extraherades från ms-data uppifrån och ned till summan av alla identifierade H4 proteoforms i varje analys, vilket ger "relativa överflöd". Värdena skalades sedan till maximalt för varje rad för att bättre visa förändringarna i proteoformer med lågt överflöd. Det skalade relativa överflödet betecknas i färgnyckeln längst ned i värmekartan. Tillväxtförhållanden noteras på den horisontella axeln (Pre: pre-flowering drought, Post: post-flowering drought). Tre replikat grupperas tillsammans och separeras av svarta vertikala ränder från andra förhållanden. För prover märkta med asterisker förvärvades endast tekniska replikat. Proteoformer representeras på den vertikala axeln, i formatet "startrester – ändelserester: massa; putativ modifiering". b)Relativt överflödsdiagram för de trunkerade H4-proteoformerna 2–99 (proteoformer som markeras i fetstili a) summeras vid olika förhållanden. Nyckeln till symbolerna visas i förklaringen i det övre högra hörnet. Fyllda punkter i mitten av felstaplarna är medelvärdena. c)Värmekartan över H3.2-proteoformer ochd)överflödsdiagram för alla identifierade N-terminalkortncerade H3.2 visas i samma format som för H4. Proteoforms mindre än 8 kDa i (c) utelämnades för enkelhetens skull. N-terminalen och C-terminal trunkerade H3.2 proteoforms visade olika svar över tillväxtförhållandena. Tryckt med tillstånd från ELSEVIER från ref.29. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det presenterade protokollet beskriver hur man extraherar histoner från sorghumblad (eller mer allmänt växtblad) prover. Den genomsnittliga histonavkastningen förväntas vara 2–20 μg per 4–5 g sorghumbladmaterial. Materialen är tillräckligt rena för nedströms hisstensanalys av LC-MS (mestadels histoner med ~ 20% ribosomal proteinförorening). Lägre utbyte kan erhållas på grund av provvariationer eller potentiell felaktig hantering/fel i hela protokollet. Det är viktigt att upprätthålla kärnans integritet innan kärnan i lyssteget är avgörande. Därför bör aggressiv virvel och pipetting undvikas innan NLB tillsätts. Dessutom kan förlust av atomkärnor uppstå när man tar bort supernatanterna från pelletsen. Var försiktig så att pelletsen inte störs vid pipetting. Triton X-100-koncentrationen på 1% optimerades för att selektivt lysa de icke-riktade organellerna men inte kärnorna (steg 3.2). Optimal tvättmedelskoncentration för andra vävnader eller organismer kan vara annorlunda och måste bestämmas experimentellt. Färgförändring av supernatanten under filtreringsprocessen kan indikera potentiella problem som ineffektiv frisättning av kloroplast eller otillräcklig slipning av blad. Om möjligt, använd ett mikroskop för att kontrollera om kloroplaster och retention av intakta kärnor efter varje steg för att ytterligare optimera protokollet (särskilt om protokollet för andra vävnader eller växter ändras). Detta protokoll har endast testats med sorghum bladvävnad. Det fungerar inte för sorghum rotvävnad sannolikt på grund av störningar från jord. Applicering på andra växtbladsvävnader har inte testats och applicering på olika växter kan behöva ytterligare optimering. För anpassning av nukleiisoleringsprotokollet för ChIP-seq-applikationer rekommenderas ytterligare en separation av sackarosgradienttäthet efter steg 3.3.4 (innan NLB används) att minska cytoplasmisk kontaminering. På grund av de omfattande saneringsstegen förväntas små mängder rester av icke-nukleimaterial inte orsaka betydande störningar för histonanalys i LC-MS och kan lämnas med pelleten.
Flera inledande studier misslyckades vid användning av kommersiella tabletter av fosfatashämmare (t.ex. PhosSTOP). Supernatanten i steg 3.1.6 tycktes vara intensiv grön när tabletterna användes i extraktionsbufferten. Det slutliga extraktet visade lågt antal identifierade histoner. Vi misstänker att de proprietära ingredienserna i tabletterna kan ha orsakat atomkärnor före steg 3.4, vilket minskar det totala histonutbytet. En annan möjlig orsak till misslyckande är inkompatibiliteten hos ingredienserna i histonreningssteget med jonbyttshartset (steg 3.4). Vi har använt detta protokoll för att konsekvent extrahera hög renhet histoner för efterföljande LC-MS över 150 prover. I genomsnitt kunde vi få högre avkastning utan att använda "ytterligare hämmare" (opublicerade data). Därför rekommenderas att försiktigt testa nya hämmare när du ändrar eller anpassar detta protokoll för andra ändamål. Om fosforylering inte är av intresse kan fosfatashämmarna utelämnas i extraktionsbuffertarna.
Stegen i 3,4 kan ta 3–4 timmar eller mer. Det rekommenderas att bryta protokollet om 2 dagar - frysa kärnpelleten från steg 3.3 och utföra reningen dag 2 (eller senare). Frys-tina cykeln kan delvis hjälpa kärnan lys. MWCO-filterstegen (3.4.7) kan vara mycket tidskrävande men kan enkelt skalas upp genom att förbereda flera prover parallellt. Tillsätt inte proteashämmartabletterna i steg 3.4. Många kommersiella tabletter innehåller polymerer (t.ex. polyetenglykol) som fyllmedel, vilket kommer att störa LC-MS-analysen. I detta steg borde de flesta andra proteiner ha tagits bort eller denaturerats, så enzymhämmare är inte kritiska. Det är dock fortfarande nödvändigt att hålla proverna vid 4 °C eller frysta för att minimera nedbrytningen.
Enligt detta protokoll kan histoner framgångsrikt extraheras från sorghumblad. Histone PTMs kan karakteriseras med LC-MS. Metoden kan potentiellt tillämpas på storskaliga studier för att jämföra sten-PTM mellan olika biologiska prover (t.ex. olika genotyper, växter som odlas under olika förhållanden osv.) vilket framgår av exempeldata i figur 3. Databehandling kräver dock fortfarande omfattande manuell analys för att säkert tilldela proteoformer, särskilt för oväntade (eller nya) PTM: er. Ny utveckling inom bioinformatikverktyg förväntas automatisera arbetsflödet och avsevärt öka dataflödet för storskaliga studier. En annan begränsning är att den övre MS-metoden för närvarande inte lätt kan skilja många proteoformer av hypermodifierad H3 (t.ex. flera platser för mono/di/tri-metlylation och acetylering). LC:et med omvänd fas med en dimension kan inte helt separera de olika H3-proteoformerna. Därför kommer MS2-spektrat i H3 vanligtvis att innehålla fragment från flera proteoformer och kan inte enkelt och säkert dekonvoluteras. Att kombinera uppifrån och ner med bottom-up- eller middle-down-metoder30,32,33 kan vara särskilt fördelaktigt för karakterisering av histon H3. Alternativt kan flerdimensionell separation övervägas för att förbättra djupet av uppifrån och ner MS34,35,36.
Histone PTM profilering av LC-MS möjliggör upptäckt av nya epigenetiska markörer för design av kromatinmodifierare och förbättra växternas motståndskraft mot svåra miljöförhållanden. En pilotstudie med sorghum från två sorter och odlad under torka på fältet visade att selektiva ädelstensterminalklippning i blad kan vara relaterad till torkacklimatisering och växtutveckling29. De identifierade histonmarkörerna kan fungera som mål med kompletterande tekniker som ChIP-seq. En omfattande förståelse av epigenetiska faktorer från dessa kompletterande tekniker skulle vara oumbärlig för att konstruera innovativa lösningar på grödor som svar på miljöförändringar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Vi tackar Ronald Moore och Thomas Fillmore för att de hjälpte till med masspektrometriexperiment och Matthew Monroe för datadeposition. Denna forskning finansierades genom bidrag från US Department of Energy (DOE) Biological and Environmental Research genom projektet Epigenetic Control of Drought Response in Sorghum (EPICON) under tilldelningsnummer DE-SC0014081, från USDA (USDA; CRIS 2030-21430-008-00D) och genom Joint BioEnergy Institute (JBEI), en anläggning sponsrad av DOE (Contract DE-AC02-05CH11231) mellan Lawrence Berkeley National Laboratory och DOE. Forskningen utfördes med Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) (grid.436923.9), ett DOE Office of Science User Facility sponsrat av Office of Biological and Environmental Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4L | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-5G | |
| EDTA, 500mM Solution, pH 8.0 | EMD Millipore Corp | 324504-500mL | |
| Formic Acid | Thermo Scientific | 28905 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma | G3272-100G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| Potassium phosphate, dibasic | Sigma | P3786-100G | |
| Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tablets | Roche | 5892791001 | |
| Sodium butyrate | Sigma | 303410-5G | Used for histone deacetylase inhibitor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S1888 | |
| Sodium Fluoride | Sigma | S7020-100G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 450243-10G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sucrose | Sigma | S7903-5KG | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 g | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-100ML | |
| Weak cation exchange resin, mesh 100-200 analytical (BioRex70) | Bio-Rad | 142-5842 | |
| Disposables | |||
| Chromatography column (Bio-Spin) | BIO-RAD | 732-6008 | |
| Mesh 100 filter cloth | Millipore Sigma | NY1H09000 | This is part of the Sigma kit (catalog # CELLYTPN1) for plant nuclei extraction. Similar filters with the same mesh size can be used. |
| Micropipette tips (P20, P200, P1000) | Sigma | ||
| Tube, 50mL/15mL, Centrifuge, Conical | Genesee Scientific | 28-103 | |
| Tube, Microcentrifuge, 1.5/2 mL | Sigma | ||
| Equipment | |||
| Analytical Balance | Fisher Scientific | 01-912-401 | |
| Beakers (50mL – 2L) | |||
| Microcentrifuge with cooling | Fisher Scientific | 13-690-006 | |
| Micropipettes | |||
| Swinging-bucket centrifuge with cooling | Fisher Scientific | ||
| Vortex | Fisher Scientific | 50-728-002 | |
| Water bath Sonicator | Fisher Scientific | 15-336-120 |
References
- Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D., Basra, S. M. A. Plant drought stress: Effects, mechanisms and management. Agronomy for Sustainable Development. , 153-188 (2009).
- Dai, A. Drought under global warming: a review. Wiley Interdisciplinary Reviews: Climate Change. 2 (1), 45-65 (2011).
- Rooney, W. L., Blumenthal, J., Bean, B., Mullet, J. E. Designing sorghum as a dedicated bioenergy feedstock. Biofuels, Bioproducts and Biorefining. 1 (2), 147-157 (2007).
- Mullet, J. E., Klein, R. R., Klein, P. E. Sorghum bicolor - an important species for comparative grass genomics and a source of beneficial genes for agriculture. Current Opinion in Plant Biology. 5 (2), 118-121 (2002).
- Xu, L., et al. Drought delays development of the sorghum root microbiome and enriches for monoderm bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4284-4293 (2018).
- Gao, C., et al. Strong succession in arbuscular mycorrhizal fungal communities. ISME Journal. 13 (1), 214-226 (2019).
- Gao, C., et al. Fungal community assembly in drought-stressed sorghum shows stochasticity, selection, and universal ecological dynamics. Nature Communications. 11 (1), (2020).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
- Yuan, L., Liu, X., Luo, M., Yang, S., Wu, K. Involvement of histone modifications in plant abiotic stress responses. Journal of Integrative Plant Biology. 55 (10), 892-901 (2013).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews. Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
- Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. Quantitative proteomic analysis of histone modifications. Chemical Reviews. 115 (6), 2376-2418 (2015).
- Moradian, A., Kalli, A., Sweredoski, M. J., Hess, S. The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).
- Sidoli, S., Garcia, B. A. Characterization of individual histone posttranslational modifications and their combinatorial patterns by mass spectrometry-based proteomics strategies. Methods in Molecular Biology. 1528, Clifton, N.J. 121-148 (2017).
- Maile, T. M., et al. Mass spectrometric quantification of histone post-translational modifications by a hybrid chemical labeling method. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 1148-1158 (2015).
- Dang, X., et al. The first pilot project of the consortium for top-down proteomics: a status report. Proteomics. 14 (10), 1130-1140 (2014).
- Schaffer, L. V., et al. Identification and quantification of proteoforms by mass spectrometry. Proteomics. 19 (10), 1800361 (2019).
- Cupp-Sutton, K. A., Wu, S. High-throughput quantitative top-down proteomics. Molecular Omics. , (2020).
- Varoquaux, N., et al. Transcriptomic analysis of field-droughted sorghum from seedling to maturity reveals biotic and metabolic responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 27124 (2019).
- Gordon, J. A. Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor. Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).
- Zhou, M., et al. Profiling changes in histone post-translational modifications by top-down mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1507, Clifton, N.J. 153-168 (2017).
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Kou, Q., Xun, L., Liu, X. TopPIC: a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization. Bioinformatics (Ocford, England). 32 (22), (2016).
- Park, J., et al. Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics. Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).
- LeDuc, R. D., et al. The C-Score: a bayesian framework to sharply improve proteoform scoring in high-throughput top down proteomics. Journal of Proteome Research. 13 (7), 3231-3240 (2014).
- Fornelli, L., et al. Advancing top-down analysis of the human proteome using a benchtop quadrupole-orbitrap mass spectrometer. Journal of Proteome Research. 16 (2), 609-618 (2017).
- Sun, R. X., et al. pTop 1.0: A high-accuracy and high-efficiency search engine for intact protein identification. Analytical Chemistry. 88 (6), 3082-3090 (2016).
- Xiao, K., Yu, F., Tian, Z. Top-down protein identification using isotopic envelope fingerprinting. Journal of Proteomics. 152, 41-47 (2017).
- Cai, W., et al. MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (2), 703-714 (2016).
- Zhou, M., et al. Top-down mass spectrometry of histone modifications in sorghum reveals potential epigenetic markers for drought acclimation. Methods. , San Diego, Calif. (2019).
- Garcia, B. A., Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Pervasive combinatorial modification of histone H3 in human cells. Nature Methods. 4 (6), 487-489 (2007).
- Zheng, Y., et al. Unabridged analysis of human histone H3 by differential top-down mass spectrometry reveals hypermethylated proteoforms from MMSET/NSD2 overexpression. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (3), 776-790 (2016).
- Garcia, B. A., et al. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).
- Holt, M. V., Wang, T., Young, N. L. One-pot quantitative top- and middle-down analysis of GluC-digested histone H4. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2514-2525 (2019).
- Tian, Z., et al. Enhanced top-down characterization of histone post-translational modifications. Genome Biology. 13 (10), (2012).
- Wang, Z., Ma, H., Smith, K., Wu, S. Two-dimensional separation using high-pH and low-pH reversed phase liquid chromatography for top-down proteomics. International Journal of Mass Spectrometry. 427, 43-51 (2018).
- Gargano, A. F. G., et al. Increasing the separation capacity of intact histone proteoforms chromatography coupling online weak cation exchange-HILIC to reversed phase LC UVPD-HRMS. Journal of Proteome Research. 17 (11), 3791-3800 (2018).
