Summary
Protokol, kuraklığa dayanıklı ürünlerin mühendisliğine yardımcı olmak için potansiyel epigenetik belirteçler olarak hizmet edebilecek histone post-translational modifikasyonların profillenebilmesi için sorgum yaprağı malzemelerinden bozulmamış histonları etkili bir şekilde çıkarmak için geliştirilmiştir.
Abstract
Histonlar, ökaryotlarda yüksek oranda korunmuş protein ailesine aittir. DNA'yı fonksiyonel kromatin birimleri olarak nükleozomlara paketlerler. Son derece dinamik olan ve enzimler tarafından eklenebilen veya çıkarılabilen histonların çeviri sonrası modifikasyonları (PTM'ler) gen ekspresyonunun düzenlenmesinde kritik roller oynar. Bitkilerde, histone PTM'leri de dahil olmak üzere epigenetik faktörler, çevreye adaptif tepkileri ile ilgilidir. Epigenetik kontrolün moleküler mekanizmalarını anlamak, yenilikçi biyomühendislik çözümleri için benzeri görülmemiş fırsatlar getirebilir. Burada, çekirdeği izole etmek ve histonları sorgum yaprak dokusundan arındırmak için bir protokol açıklıyoruz. Çıkarılan histonlar, çevrimiçi ters fazlı (RP) sıvı kromatografisi (LC) ile birlikte yukarıdan aşağıya kütle spektrometresi (MS) ile bozulmamış formlarında analiz edilebilir. Aynı histone proteoformdaki birden fazla PTM'nin kombinasyonları ve stoichiometry kolayca tanımlanabilir. Ek olarak, histone kuyruk kırpması yukarıdan aşağıya LC-MS iş akışı kullanılarak algılanabilir, böylece çekirdek histonların (H4, H2A, H2B, H3) küresel PTM profilini elde eder. Bu protokolü daha önce, kuraklık direncinin epigenetik belirteçlerini tanımlamayı amaçlayan büyük ölçekli bir saha çalışmasından toplanan sorgum yaprak dokusundan histone PTM'lerinin profilini çıkarmak için uygulamiştik. Protokol potansiyel olarak kromatin immünorepipitasyon-dizileme (ChIP-seq) veya benzer bitkilerdeki histone PTM'lerini incelemek için uyarlanabilir ve optimize edilebilir.
Introduction
Artan kuraklık şiddeti ve sıklığının tahıl bitkilerinin verimliliğini etkilemesi bek edilmektedir1,2. Sorgum, su sınırlayıcı koşullara dayanma olağanüstü yeteneği ile bilinen bir tahıl gıda ve enerji mahsulüdür3,4. Kuraklık stresi, bitki gelişimi ve sorgumun epigenetiği [Sorgum çift renkli (L.) Moench] bitkileri arasındaki etkileşimi mekanistik bir şekilde anlamaya çalışıyoruz. Önceki çalışmalarımız kuraklık iklimlendirmesinde bitki ve rizosfer mikrobiyomu ile moleküler düzeyde5,6,7. Bu araştırma, bitkileri gelecekteki iklim senaryolarına uyarlamada epigenetik mühendisliğin kullanılmasının önünü açacaktır. Epigenetiği anlama çabalarının bir parçası olarak, bitki organizmasında gen ekspresyonını etkileyen protein belirteçlerini incelemeyi amaçlıyoruz.
Histonlar, ökaryotlarda DNA'yı kromatin temel birimleri olarak nükleozomlara paketleyen yüksek oranda korunmuş bir protein ailesine aittir. Histonların çeviri sonrası modifikasyonları (PTM' ler) kromatin yapısını kontrol etmek ve gen ekspresyonunu etkilemek için dinamik olarak düzenlenir. DNA metilasyonu da dahil olmak üzere diğer epigenetik faktörler gibi, histone PTM'leri de birçok biyolojik işlemde önemli roller oynar8,9. Batı lekeleri gibi antikor bazlı tahliller, histone PTM'lerini tanımlamak ve ölçmek için yaygın olarak kullanılmıştır. Ek olarak, histone PTM'lerinin ve DNA'nın etkileşimi Chromatin immünorepritasyon ile etkili bir şekilde araştırılabilir - sıralama (ChIP-seq)10. ChIP-seq'te, spesifik hedefli histone PTM'ye sahip kromatin, bu spesifik PTM'ye karşı antikorlarla zenginleştirilir. Daha sonra, DNA parçaları zenginleştirilmiş kromatinden serbest bırakılabilir ve sıralanabilir. Hedeflenen histone PTM ile etkileşime giren genlerin bölgeleri ortaya konmuştır. Bununla birlikte, tüm bu deneyler büyük ölçüde yüksek kaliteli antikorlara dayanır. Bazı histone varyantları / homologları veya PTM kombinasyonları için, sağlam antikorların geliştirilmesi son derece zor olabilir (özellikle birden fazla PTM için). Ek olarak, antikorlar ancak hedeflenen histone PTM biliniyorsa geliştirilebilir. 11 Bu nedenle, histone PTM'lerin hedefsiz, genel profil oluşturma için alternatif yöntemler gereklidir.
Kütle spektrometresi (MS), antikorların bulunmadığı bilinmeyen PTM'ler de dahil olmak üzere histone PTM'leri karakterize etmek için tamamlayıcı bir yöntemdir11,12. Köklü "aşağıdan yukarıya" MS iş akışı, sıvı kromatografi (LC) ayrımı ve MS algılamadan önce proteinleri küçük peptitlere sindirmek için proteaz kullanır. Histonlar çok sayıda temel kalıntıya (lizin ve arginin) sahip olduğundan, standart aşağıdan yukarıya iş akışındaki tripsin sindirimi (lizin ve arginin'e özgü proteaz) proteinleri çok kısa peptitlere keser. Kısa peptitlerin standart LC-MS tarafından analiz etmesi teknik olarak zordur ve birden fazla PTM'nin bağlantısı ve stoichiometry'si hakkındaki bilgileri korumaz. Lizinleri bloke etmek için diğer enzimlerin veya kimyasal etiketlemeninkullanılması,histone PTM'lerin karakterizasyonu için daha uygun olan daha uzun peptitler üretir13,14.
Alternatif olarak, sindirim adımı tamamen atlanabilir. Bu "yukarıdan aşağıya" yaklaşımda, bozulmamış protein iyonları, çevrimiçi LC ayrımından sonra elektrospray iyonizasyonu (ESI) ile MS'e sokulur ve bozulmamış histone proteoformlarının iyonlarını verir. Ek olarak, ilgi çekici iyonlar (yani proteoformlar), tanımlama ve PTM lokalizasyonu için sıra iyonlarını elde etmek için kütle spektrometresinde izole edilebilir ve parçalanabilir. Bu nedenle, yukarıdan aşağıya MS, proteoform düzeyindeki bilgileri koruma ve aynı proteoform15 , 16üzerindeki birden fazla PTM ve terminal kesilmelerinin bağlantısını yakalama avantajına sahiptir. Yukarıdan aşağıya deneyler ayrıca nicel bilgiler sağlayabilir ve bozulmamış protein seviyesindeki biyobelirteçlerin içgörülerini sunabilir17. Burada, sorgum yaprağından histone çıkarmak ve bozulmamış histonları yukarıdan aşağıya LC-MS ile analiz etmek için bir protokol açıklıyoruz.
Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterilen örnek veriler ekimden sonraki 2. haftada toplanan sorgum yaprağındandır. Verim değişimi beklenmekle birlikte, bu protokol genellikle belirli örnek koşullara göre belirsizdir. Aynı protokol, ekimden 2, 3, 5, 8, 9 ve 10 hafta sonra toplanan sorgum bitki yaprak dokusu için başarıyla kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sorgum yaprağı malzemesinin hazırlanması
NOT: Sorgum bitkileri Parlier, CA'daki tarlada toprakta yetiştirildi.
- Sorgum yapraklarını bitkilerden 50 mL santrifüj tüpler halinde toplayın ve tüpü hemen sıvı nitrojen içinde dondurun. Birincil çapalayıcıdan üçüncü ve dördüncü tamamen ortaya çıkan yaprağı kopararak yaprak dokusunu toplayın.
NOT: Alan durumu, örnek büyüme ve toplama hakkında daha fazla ayrıntı yayınlanan rapor18'debulunabilir. - Yaprakları sıvı nitrojenle öğütün ve hemen bir santrifüj tüpüne aktarın.
- Zemin yaprağını kullanıma kadar -80 °C'de saklayın. Her numunenin histone analizi için yaklaşık 4 g kriyo-öğütülmüş yaprak tozu alın.
2. Tampon ve malzemelerin hazırlanması (3–4 saat)
NOT: Yüksek konsantrasyon stok çözümleri önceden yapılabilir ve kullanıma kadar saklanabilir. Ancak tüm çalışan tamponlar ekstraksiyon gününde taze hale getirilmelidir (stoktan seyreltilerek ve diğer içeriklerle karıştırılarak) ve işlem sırasında buza yerleştirilmelidir. Aksi belirtilmedikçe tüm deney 4 °C'de yapılmalıdır.
- 15 mL steril suda 42,8 g sakkaroz (342,30 g/mol) ısı plakasında sürekli karıştırma ile cam bir kapta eriterek 2,5 M sakkaroz hazırlayın. Sakkaroz tamamen eridikten sonra hacmi 50 mL'ye getirin. Sakkarozları kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.
- 15 mL santrifüj tüpünde 10 mL H 2 O'da 1.576 g Tris HCl çözerek1M Tris pH 8 hazırlayın. NaOH ile pH'ı 8'e ayarlayın ve pH kağıdı ile kontrol edin. Kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.
- 231 mg DTT (154,25 g/mol) ağırlığında ve 1,5 mL steril suda eriterek 1 M Dithiothreitol (DTT) hazırlayın. DTT taze yapılmalı veya saklanan dondurulmuş aliquots kullanılmalıdır.
- (İsteğe bağlı) Üç farklı tuzu karıştırarak ek inhibitörleri hazırlayın. 1 mL steril suda 18,38 mg sodyum ortovanadat (183,91 g/mol) hazırlayın, ardından 1 mL steril suya 11.008 mg sodyum bütirat (110,09 g/mol) ekleyerek ayrı sodyum bütirat hazırlayın. 1 mL suya 4.199 mg sodyum florür (41.99 g/mol) ekleyerek son tuzu hazırlayın. Üç tuz çözeltisini "ek inhibitörler" (üç kimyasalın her birinin 33 mM'si) için stok çözeltisi olarak eşit hacimde karıştırın.
NOT: Sodyum vanadat nötr pH altında 0,1 mM'den yüksek konsantrasyonlarda polimerize eder. Yayınlanan protokollerin ardından maksimum etkinlik için depolimerize etmek için sodyum vanadat aktive tavsiye edilir19. Alternatif olarak, aktif sodyum vanadat ticari olarak mevcuttur. Burada, sodyum vanadat kasıtlı olarak aktive edildi, bu nedenle etkinlik azalmaz. Aktif sodyum vanadat bu protokol için henüz test edilmiştir. - 15 mL santrifüj tüpünde 10 mL H2 O'da 0.952 g susuz magnezyum klorür (95.2 g/mol) eriterek 1 M MgCl2hazırlayın. Kullanıma kadar 1 M MgCl2'i 4 °C'de saklayın.
- 53,5 g Triton X-100'ü 35 mL steril su ile karıştırarak %10 (v/v) Triton X-100 hazırlayın, suyla 50 mL'ye kadar getirin ve oda sıcaklığında saklayın.
- Reçineyi en az bir gecede koşullandırmak için kullanılacak % 5 Guanidin tampon pH7 ("Gdn tamponu" olarak adlandırılır) hazırlayın - 870 mg K2HPO4ağırlığında ve 50 mL steril su ve4 °C'de depolayarak 0,1 M potasyum hidrojen fosfat dibasik (K2HPO 4) hazırlayın.
- 0,7 g guanidin hidroklorür tartın ve 0,1 M K2HPO4'te 14 mL'lik son hacme kadar çözün. pH kağıdı ile kontrol larak pH'ı 7'ye ayarlayın.
- Kuru zayıf katyon değişimini (WCX) reçinesini gece boyunca % 5 Guanidin tampon pH 7'ye batırın. Süpernatant çıkarın ve taze% 5 Gdn tampon ile yeniden doldurun ve reçinenin tamamen aşındırmasını sağlamak için bir gecede tekrar ıslatın (süpernatant orijinal tamponla aynı pH'a sahip olana kadar).
- Denemeyi bir sonraki bölümde başlatmadan önce, Tablo 1'itemel alan EB1, EB2A ve EB2B arabelleği yapmak için reaktifleri karıştırın. Kullanmadan hemen önce tüm inhibitörleri ve DTT'yi taze ekleyin.
| Reaktif | Stok konsantrasyonu | EB1 | EB2A | EB2B |
| Birim (mL) | Birim (mL) | Birim (mL) | ||
| Sakaroz | 2.5M | 4.4 | 1.25 | 0.5 |
| Tris HCl pH8 | 1M | 0.25 | 0.125 | 0.05 |
| Dtt | 1M | 0.125 | 0.0625 | 0.025 |
| H2O | 20.225 | 9.6875 | 4.375 | |
| proteaz inhibitörü (PI) tablet | 0.5 hap | 0.5 hap | 0.5 hap | |
| Ek inhibitörler (İsteğe bağlı) | 33mM | 0.25 | 0.125 | 0.05 |
| MgCl2 | 1M | 0.125 | 0.05 | |
| Triton X100 | 10% | 1.25 | ||
| Genel Ses Düzeyi | 25 mL | 12,5 mL | 5 mL | |
Tablo 1: Ekstraksiyon arabellekleri (EBs) için kompozisyon.
- Nuclei Liziz Arabelleği'ni (NLB) Tablo 2'yegöre yapın. NLB'yi önceden hazırlayın ve kullanıma kadar 4 °C'de saklayın. PI tabletleri 1x'te (5 mL başına 0,5 tablet) kullanmadan hemen önce taze ekleyin. Belirli birimler için Tablo 2'ye bakın.
| Nlb | Stok konsantrasyonu | Birim (mL) |
| Nacl | 5M | 0.4 |
| Tris HCl pH8 | 1M | 0.05 |
| Triton X100 | 10% | 0.5 |
| Edta | 0,5M | 0.2 |
| H2O | 3.85 | |
| PI tabletler | 0.5 hap | |
| Ek inhibitörler (isteğe bağlı) | 33mM | 0.05 |
| Genel Ses Düzeyi | 5 mL |
Tablo 2: Çekirdek lizis tamponu (NLB) için kompozisyon.
3. Çekirdek izolasyon prosedürü
NOT: İlk günün 3.1–3.3. adımlarının (2–3 h) gerçekleştirilmesi, çekirdeğin -80 °C'de NLB tamponuna kaydedilmesi ve protein saflaştırması (4 saat) için ertesi gün (veya daha sonra) devam edilmesi önerilir. Bu protokoldeki çekirdek izolasyon adımları, Ortak Genom Enstitüsü'nde kullanılan bir sorgum ChIP-seq protokolünden uyarlanmıştır. ChIP-seq uygulamaları için çekirdek saflığını sağlamak için ek yıkamalar ve sakkaroz gradyan ayrımı gerekebilir.
- Enkazın filtrasyonu (~0,5 saat)
- Zemin yaprağı toz ~4 g tartın, kullanıma hazır olana kadar kuru buz veya sıvı nitrojene yerleştirerek donmuş kalmasını sağlayın.
- EB1'e 0,2x (numune başına 25 mL için 0,5 tablet) son konsantrasyona proteaz inhibitör tabletleri ekleyin. Tabletin tampondaki çözünmesine yardımcı olmak için tamponlara eklemeden önce tabletleri bir mikrosantrifüj tüpünde önceden ezmek için minyatür bir plastik pestle veya pipet ucu kullanın. Malzeme kaybını önlemek için PI tableti ekleyin ve tableti çözmek için tamponu sonicate edin.
- Donmuş öğütülmüş yaprak tozlarına 20 mL EB1 ekleyin, hafifçe girdaplayın ve toz tamamen askıya alınana kadar karıştırın. ~10 dakika boyunca hafifçe karıştırmaya devam edin.
- Mesh 100'den filtreleyin, filtrelenmiş malzemeyi her seferinde 2 mL EB1 ile iki kez durulayın.
NOT: Hem filtrat hem de filtrelenmiş döküntü yeşil olmalıdır. Bir mikroskop kullanarak izleniyorsanız, bu noktada filtrattaki sağlam çekirdekleri ve bozulmamış kloroplastları görebilmelisiniz. Büyük döküntülerin çoğu bulunmamalı/tükenmemelidir. Metilen mavisi gibi boyaları örnekle karıştırın. Çekirdekler, 20x, 40x ve/veya 100x hedef kullanılarak görselleştirildiğinde ~3–5 μm çapında koyu mavi/akuamarin küreler olarak kolayca gözlemlenebilir. Nükleilere göre, kloroplastlar boyut olarak benzerdir, ancak yeşilimsi renklidir ve genellikle daha ovaldir. Vakuoller de boyut ve şekil olarak çekirdeklere benzer, ancak Metilen mavi boyasını kolayca almazlar. - Kombine filtratı 3.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika boyunca pelet kalıntılarına ve çekirdek ve kloroplastlar da dahil olmak üzere büyük hücre altı organellere sallanan bir kova rotorunda santrifüj edin.
NOT: Bu dönüş sırasında EB2A'nın hazırlanması önerilir (bkz. adım 3.2.1). - Peletin rahatsız olmamasına dikkat ürkerek, süpernatantı dekant.
NOT: Henüz deterjan eklenmedikçe, pelet yoğun yeşil kalmalı ve süpernatant en fazla soluk yeşil/sarı olmalıdır.
- Hedef dışı organellerin lizisi (~0,5 saat)
- 0,4x 'lik (12,5 mL EB2A başına 0,5 tablet) son konsantrasyona proteaz inhibitörleri ekleyerek EB2A'yı hazırlayın.
- Peleti 5 mL EB2A'da 3.1.6 adımından yeniden atın ve yumuşak karıştırma ile 10 dakika boyunca buzda kuluçkaya yatırın.
NOT: Deterjan konsantrasyonu tercihen bozulmamış hücreleri ve kloroplastları iyne olacak şekilde optimize edilmelidir, ancak çekirdekleri değil. Gerekli miktar organizmalar arasında değişebilir. Kloroplastların lizisi ve sağlam çekirdeklerin mikroskop altında tutulması için kontrol yapılması önerilir. - 4 °C'de 15 dakika boyunca 2.100 x g'da santrifüj, pelet kalıntılarına ve çekirdeklere sallanan bir kova rotorunda.
NOT: Bu aşamada, süpernatant yoğun bir şekilde yeşil olmalı ve pelet, kloroplastların lizisi ve sitosol içine klorofil salınımı nedeniyle önceki aşamalarda gözlenenden çok daha az yeşil olmalıdır. - Peletin rahatsız olmamasına dikkat ürkerek, süpernatantı dekant.
- Çekirdeklerin kalan sitoplazmik kirleticilerden izolesi (~0,5 saat)
- Son konsantrasyon olan 1x'e (5 mL EB2B başına 0,5 tablet) proteaz inhibitörleri ekleyerek EB2B'yi hazırlayın.
- EB2B'nin 2 mL'sinde 3.2.3 adımından ham nükleer peletin yeniden sünsünsün.
NOT: EB2B Triton X-100 içermez, bu nedenle bu noktada ek lizis oluşmamalıdır. - 4 °C'de 15 dakika boyunca 2.100 x g'da santrifüj, pelet kalıntılarına ve çekirdeklere sallanan bir kova rotorunda.
NOT: Küçük organeller ve sitoplazmik bileşenler pelet olmamalıdır, bu nedenle süpernatanta kalmalıdırlar. - Peletin rahatsız olmamasına dikkat ürkerek, süpernatantı dekant.
- Peletin 250 μL NLB kullanarak yeniden kullanılması (5 mL için taze 0,5 proteaz inhibitörü tableti ekleyin).
NOT: Amaç, çekirdeği önemli bir malzeme kaybı olmadan minimum NLB miktarında yeniden harcamaktır. NLB çok viskoz olduğundan ve peletler çok miktarda çözünmez döküntü içerdiğinden, pipet yapmak çok zordur ve pipet uçlarının içine tutunma eğilimindedir. Bu nedenle, mümkün olduğunda aynı pipet ucunun yeniden kullanılması önerilir. Bir pipet ucundaki artık malzeme ile ilgileniyorsanız, yerçekiminin ucun açılışında malzeme toplamasına izin vermek için pipeti bir raftan veya raftan ~ 1 dakika boyunca asmanız yeterlidir. Peletleri yeniden çıkarmak için agresif bir şekilde pipet yapmayın. Bunun yerine, peletlenmiş malzeme pipet ucuna emişlinceye kadar pipet ucunu bir karıştırma çubuğu olarak kullanın. yani, büyük pelet kümeleri pipet ucuna çekilebildiği sürece bu aşamada kalmak için mükemmeldir. - Malzemeyi homojenize etmek ve kısmen yeniden canlandırmak için maksimumda Vortex 15 s. 4 °C'de 5 dakika sonicate, sonra -80 °C'de saklayın.
NOT: Sonraki adımlar için, eklenen toplam NLB miktarının 250 μL olduğunu, ancak çözünmeyen döküntüler nedeniyle numunenin toplam görünür hacminin iki kata kadar olabileceğini unutmayın. Örnek dondurulur ve çekirdek lizizine yardımcı olmak için çözülür.
- Nüklei lizis ve histone ekstraksiyonu (~4 h)
- Çözülen numuneye 750 μL%5 Gdn tampon ekleyin. 4 °C'de 15 dakika sonicate.
- Numuneyi tek bir 2 mL tüpe aktarın ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 10.000 x g döndürün.
NOT: Süpernatant büyük olasılıkla yeşil görünecektir. Aşağıdaki kromatografi adımları pigmentlerin çoğunu proteinden çıkarmalıdır. - Adım 3.4.1 ve 3.4.2'yi beklerken, sütunu iyon değişimi kromatografisi için temizleyin. Yüzeydeki kirlenmeyi en aza indirmek için kromatografi sütununu 2 mL asetonitril ve 4 mL su ile durulayın.
- Kromatografi sütununa 200 ~ 300 μL WCX reçinesi (% 5 Gdn tamponu ile önceden koşullandırılmış) yükleyin. Reçine yerleşsin. %5 Gdn tamponun 1 mL'si ile dört kez yıkayın. Arıtma adımlarının geri kalanı için tüpü ve kolonu buzda tutun.
- Kromatografi sütununu 2 mL toplama tüpüne koyun. Süpernatantı adım 3.4.2'den reçineyi bozmadan yavaşça reçine yatağına yükleyin (tüplerin yanından yavaşça düşmeye çalışın). Çözeltinin yerçekimiyle akmasına izin verin. Çözelti akarken, reçineye maksimum bağlamaya izin vermek için eluent'i sütunun üstüne 6-8 kez geri yükleyin. Ardından, eluent atın.
- Histone olmayan proteinleri kolondan yıkamak için % 5 Gdn tamponunun 2 mL'sini yükleyin. Eluent atın.
- 1 mL% 20 Gdn tampon ile sulute histones. Histone proteinleri içeren eluent toplayın.
- Eluent'i adım 3.4.6'dan tuzdan arındırmak için 3 kDa moleküler ağırlık kesme (MWCO) spin filtresi (0.5 mL) kullanın. Kullanmadan önce, 500 μL yıkama çözücüsüyü (%3 ACN'de% 0,2 formik asit) yükleyin ve filtreyi temizlemek için iki kez aşağı çevirin.
NOT: Zaman kazanmak için reçine kromatografisi adımlarını gerçekleştirirken MWCO filtresini yıkamaya başlamanız önerilir. Aşağıdaki döndürme filtresi adımları ~3–4 saat sürer. - İlk yük 500 μL histone örneği, hacmi ~100 μL'ye düşürmek için ~ 25 dakika boyunca 14.000 x g'da döndürün. Daha sonra başka bir 400 μL numune yükleyin ve ~25 dakika boyunca tekrar 14.000 x g'da döndürün. Son 100 μL numuneyi yükleyin, numune tüpünü 300 μL yıkama çözücü ile durulayın ve çözücüyü filtreye yükleyin. ~25 dakika boyunca tekrar 14.000 x g'da döndürün.
- 400 μL yıkama çözücü yükleyin, hacmi ~100 μL veya altına düşürmek için ~ 25 dakika boyunca 14.000 x g'da döndürün. Her döngü tuz konsantrasyonu beşte bir oranında azaltır. Guanidin konsantrasyonu ~%0,01'e getirmek için üç döngü daha tekrarlayın. Filtreyi temiz bir toplama tüpüne ters çevirin ve 2 dakika boyunca 1.000 x g'da döndürün. Saflaştırılmış histone örneğini analiz için -20 °C veya -80 °C'ye kaydedin.
NOT: Daha yüksek konsantrasyon elde etmek için numune hacmini en aza indirmek için son adımda daha uzun (30-40 dk) dönmeniz önerilir. Hacim 50-70 μL'ye kadar inebilmelidir.
4. Saflaştırılmış histonların kütle spektrometresi
- Sıvı kromatografi kütle spektrometresi (LC-MS) veri toplama
- Üreticinin protokolünü takiben Bicinchoninic Acid (BCA) test ederek protein konsantrasyonu tahmin edin.
NOT: BCA sadece toplam protein konsantrasyonu tahminini sağlayabilir, ancak histone saflaştırmasının kalitesini sağlayamaz. MS enstrümantasyonu histone saflaştırma kalitesini kontrol etmek için hazır değilse, batı lekesi kullanılabilir. Önceki raporumuzda açıklandığı gibi 210 nm ultraviyole emiciliği tespiti ile birlikte tersfazlı LCde kullanılabilir 20 . Kromatogram, numune kalitesini kontrol etmek için bilinen bir standartla karşılaştırılabilir. Bununla birlikte, farklı organizmalar farklı elution profillerine sahip olabilir. Bu nedenle, benzer organizmalardan histone standartlarının kullanılması şiddetle tavsiye edilir. - Bir C18 ters faz (RP) analitik sütununu bağlayın (örneğin, 3 μm 300 Å, sütun iç çapı 75 μm, dış çapı 360 μm, uzunluk 70 cm) ve C18 tuzak sütunu (örneğin, 3,6 μm, sütun iç çapı 150 μm, dış çapı 360 μm, uzunluk 5cm) çift pompalı nano akışlı sıvı kromatografi sistemine (örneğin, Waters NanoAcquity). İkili çözücüler A: suda% 0.1 formik asit ve B: asetonitrilde% 0.1 formik asittir.
NOT: Çift pompalı LC bir yıkama pompası ve bir degrade pompa içerir. Her iki pompa da her analizde iki aşamadan geçer : bir bindirme aşaması ve ardından analitik aşama. Bindirme aşamasında, yıkama pompası bindirme kolonuna, degrade pompası analitik kolona akar. Analitik aşamada, bindirme sütunu analitik sütunla birleştiğinde degrade pompa her iki sütuna da akar. Yıkama pompası daha sonra çöpe gider. - Bindirme aşaması: LC yöntemini, ilk olarak tuzak sütununa 1–2 μg histone örneği yüklenecek şekilde ayarlayın. Numuneyi 10 dakika boyunca 3 μL/dk%5 solvent B'de yıkama pompası ile tuzdan arındırın. Analitik pompayı denge için %0,3 μL/dk %5 solvent B olarak ayarlayın.
- Analitik aşama: Degrade pompasını (0,3 μL/dk) %5 B'den başlayacak şekilde ayarlayın ve rampayı 15 dakikada %30'a ayarlayın. Daha sonra, sonunda% 95 B'ye kadar yüksek organik yıkamadan önce 100 dakikada% 41 B'ye çıkarın.
NOT: Degrade, tek tek sütunlardaki farklı bekletme profillerine bağlı olarak optimize edilebilir. Tipik olarak, tam uzunlukta histonlar belirtilen LC koşullarında% 30-% 40 B civarında akar. Daha fazla histone proteoform yakalamak için MS2 spektrumlarının sayısını artırmak için daha uzun degradeler kullanılabilir. - Elektron transferi ayrışması (ETD) özelliğine sahip yüksek çözünürlüklü bir MS (örneğin, Thermo Orbitrap Fusion Lumos veya benzeri) üzerinde veriye bağımlı toplama yöntemi ayarlayın. Bozulmamış protein modunu kullanın ve üretici tarafından önerildikçe gerekli tüm kalibrasyonları gerçekleştirin. Kritik parametreler aşağıda açıklanmıştır. Bunlar kullanılan enstrümana özgü olacaktır.
- MS1: tarama aralığı 600–2.000 m/z, çözünürlük 120k (m/z 200'de), 4 mikrokan, AGC hedef 1E6, maksimum enjeksiyon 50 ms.
- MS2: çözünürlük 120k; 1 mikro tarama; AGC hedef 1E6; veriye bağımlı MS/MS: alternatif ETD (25 ms reaksiyon süresi, maksimum enjeksiyon süresi 500 ms) ve daha yüksek enerjili çarpışma ayrışması (HCD, %28 normalleştirilmiş çarpışma enerjisi ile ±5% kademeli enerji, maksimum enjeksiyon süresi 100 ms); 0.6 Da izolasyon penceresi; en yüksek ücretlendirme durumlarında öncelik.
- Dinamik dışlama: 120 s zaman penceresi, ±0.7 Da kütle penceresi. 5'ten küçük ücret durumlarını ve belirlenemeyen ücret durumlarını hariç tutun.
- Gerçek örnekleri çalıştırmadan önce sistemi dengele ve kontrol etmek için yeni sütunlara birkaç peptit veya histone standardı enjeksiyonu çalıştırın. Çok sayıda numune çalıştırmak için, taşımayı en aza indirmek için numunelerin arasına kısa boşluklar veya yıkamalar ekleyin. Sütunların bir sonraki numuneden önce başlangıç koşulunda (%5 solvent B) 15-20 dakika boyunca aşındırmasına izin verin.
NOT: MS2 için daha uzun LC gradyanları ve daha yüksek maksimum enjeksiyon süresi, daha fazla histone proteoform tanımlamak için spektral kaliteyi artırabilir.
- Üreticinin protokolünü takiben Bicinchoninic Acid (BCA) test ederek protein konsantrasyonu tahmin edin.
- LC-MS veri işleme ve proteoform tanımlama
- (Sorgum) protein dizisini FASTA formatında JGI (https://genome.jgi.doe.gov) veya UniProt'tan (https://www.uniprot.org/) alın.
- Enstrüman ham veri dosyalarını (*.raw) mzML biçimine dönüştürmek için MSConvert21 (http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtml) kullanın.
- Veri işleme için TopPICpaketi 22'yi (http://proteomics.informatics.iupui.edu/software/toppic/) indirin. Program komut satırında veya grafik arabirim üzerinden çalıştırılabilir.
- Adım 4.2.2'den mzML dosyasındaki spektrumları ayrıştırmak için TopPIC paketindeki TopFD'yi kullanın. Varsayılan parametreler kullanılabilir. Ancak dar bir yalıtım penceresi kullanıldığından "öncü pencerenin" (-w) 1 m/z'ye düşürülmesi gerekir.
- Proteoformları tanımlamak için TopPIC paketinde TopPIC kullanın. Varsayılan parametrelerin çoğu kullanılabilir. Spektrum ve proteoform kesme türünü FDR (yanlış bulma oranı) olarak ayarlayın ve kesme değerini 0,01 (%1 FDR) veya iseildiği gibi ayarlayın. "Proteoform hata toleransını" 5 (Dalton) olarak ayarlayın. FASTA dosyasını adım 4.2.1'den ve "*_ms2.msalign" dosyasını 4.2.4 adımından yükleyin. O zaman aramaya başla.
NOT: "Proteoform hata toleransı" ayarı, proteoformları benzer kütlelerle (± 5 Da) birleştirir. Bu, proteoform sayılarında artıklığı azaltmaya yardımcı olur. Bununla birlikte, büyük tolerans proteoformları küçük veya hiç kütle farkı olmadan birleştireceğinden dikkatli kullanılmalıdır. Bu parametre yalnızca TopPIC sürüm 1.3 veya sonraki sürümlerinde kullanılabilir. - Tanımlanan proteoformlar "*_proteoform.csv" dosyasında incelenebilir veya çıktının "*_html" klasörü altındaki Topview modülü kullanılarak görselleştirilebilir.
- TopPIC kullanılarak yukarıdaki adımlardan oluşturulan proteoformlar listesi, histone PTM'lerine kütle kayması olarak açıklama ek açıklamalır. Tek tek PTM'leri yerelleştirmek için bir değişiklik listesi eklenmelidir. Ayrıntılı açıklama TopPIC kılavuzunda bulunabilir. Alternatif olarak, Informed-Proteomics paketi23'ü (https://github.com/PNNL-Comp-Mass-Spec/Informed-Proteomics) kullanarak tamamlayıcı bir veri analizi gerçekleştirmek için bir sonraki adıma geçin.
- Yönergeleri izleyin ve enstrüman ham verilerini PBF dosyasına dönüştürmek için PbfGen modülünü kullanın. Ardından, bir ms1ft dosyasının çıktısını almak için ProMex modülini kullanarak MS1 verilerinin ayrıştırın (özellik listesi, her özellik, kütle ve saklama süresinin benzersiz bir birleşimini temsil eder).
- Adım 4.2.6'da TopPIC'ten tanımlanan protein listesini kullanarak Bilgilendirilmiş Proteomik için odaklanmış bir FASTA oluşturun.
NOT: Çok sayıda değişken PTM ile Informed-Proteomics kullanarak tüm genomu aramak son derece yavaş olabilir ve çökmelere neden olabilir. Bu nedenle FASTA'nın boyutunun sadece hedef proteinleri dahil ederek azaltılması önerilir. - Örnek dosyadaki biçimi izleyen histone PTM'lerini aramak için hedeflenen bir değişiklik listesi oluşturun. Dahil edilmesi gereken yaygın PTM'ler şunlardır: Lizin asetilasyonu, lizin mono-metilasyon, lizin di-metilasyon, lizin tri-metilasyon, serine / threonine / tirozin fosforilasyonu, protein N-terminal asetilasyon, metionin / sistein oksidasyonu. Sorgum için protein N-terminal mono-metilasyon, di-metilasyon ve trimetilasyon eklenmelidir.
NOT: Informed-Proteomics yalnızca listede belirtilen PTM'leri arar. Belirtilmemiş PTM'ler varsa, proteoform tanımlanamayabilir veya diğer proteoformlara yanlış tanımlanabilir. Ancak, arama süresini en aza indirmek için PTM listesi mümkün olduğunca kısa tutulmalıdır. - 4.2.8 adımındaki dosyaları, 4.2.9 adımındaki odaklanmış FASTA'yı ve 4.2.10 adımındaki değişiklik listesini kullanarak proteoformları tanımlamak için MSPathFinder modülünü yürütün. Varsayılan parametreler kullanılabilir.
- Sonuçlar, tüm sonuç dosyaları yüklenerek LcMsSpectator'da görselleştirilebilir.
NOT: Diğer biyoinformatik araçlar, her biri kendi güçlü yönleri olan24 , 25 , 26,27,28ile yukarıdan aşağıya verilerin işlenmesi ve görselleştirilmesi için kullanılabilir. Sorgum ve diğer birçok organizma, veritabanındaki histone PTM'leri hakkında sınırlı bilgiye sahiptir. PTM'lerden kütle kaymalarını tanımlamak için önce TopPIC'i kullanın. Bu analiz hem bilinen hem de bilinmeyen PTM'leri kolayca keşfedebilir. Daha sonra, algılanan PTM'ler TopPIC'te bir PTM listesi belirterek veya diğer tamamlayıcı araçlarla hedeflenen bir şekilde aranabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokolün ardından, histonlar LC-MS analizi kullanılarak çıkarılabilir ve tanımlanabilir. Ham veriler ve işlenmiş sonuçlar MassIVE'de (https://massive.ucsd.edu/) katılım yoluyla kullanılabilir: MSV000085770. Temsili numuneden elde edilen TopPIC sonuçlarına dayanarak (MassIVE'den de edinilebilir), 303 histone proteoform (106 H2A, 72 H2B, 103 H3 ve 22 H4 proteoform) tespit ettik. Ko-saflaştırılmış ribozomal proteoformlar da tespit edilmiştir, tipik olarak LC'nin başlarında ortaya çıktı. Genellikle tanımlanan proteoformların ~ % 20'lerinden oluşurlar, ancak LC gradyanının sonraki aşamasında geçen histone proteoformlarla çakışmazlar. Sonuçlar en son TopPIC veya Informed-Proteomics paketleriyle kolayca görselleştirilebilir. Tanıtım için, ham MS dosyalarını doğrudan yüklemek ve proteoform tanımlamalarını manuel olarak incelemek için kullanılabilecek Informed-Proteomics paketini kullanarak veri görselleştirmesine odaklanacağız. Her iki yazılım paketinin de farklı algoritmalar ve parametreler kullandığını lütfen unutmayın. Bildirilen proteoform sayısı aynı olmayacaktır. Proteoform sayılarını TopPIC'ten bildirmenizi öneririz, çünkü daha muhafazakardır ve bilinmeyen PTM'leri dikkate almıştır. Informed-Proteomics paketi, kolay manuel doğrulama için veri işleme ve görselleştirmeyi entegre etti. İyi açıklamalı PTM'lere sahip organizmalar için, en iyi site yerelleştirmesi için ProSightPC24'ü öneririz. Sonuçların birden fazla araç kullanılarak birleştirilmesi, proteoform tanımlamaların sayısını ve güvenini artırabilir.
Verileri Informed-Proteomics ile işledikten sonra, LC-MS özellik haritası, LC saklama süresine karşı dekonvoluted protein kütlelerini görüntüleyen LCMsSpectator'da görselleştirilebilir. Yazılımda tanımlanan proteoformlara tıklayarak, ilişkili özellik, özellik haritasında küçük bir yeşil dikdörtgenle vurgulanacaktır. Ana histon proteinleri haritanın belirli bölgelerinde görülmelidir, bu da deneyin başarısını gösterir. Şekil 1a, bozulmamış histonların temsili bir LC-MS özellik haritasını göstermektedir. Kesikli kutularda tam boy histone proteoformlar vurgulanır. Algılanan çoğu proteoform MS2 verileri kullanılarak güvenle tanımlanabilir.
Şekil 1b, H2A ve H2B proteoformlarla bölgenin yakınlaştırmasını göstermektedir. Çoğunda 42 Da'nın N-terminal modifikasyonları var. Bu nominal kütle, histonlar için yaygın olarak görülen trimetilasyon (42,05 Da) veya asetilasyona (42,01 Da) karşılık gelir. Doğru kütleleri sadece 0.04 Da ile farklılık gösterir ve bozulmamış protein seviyesinde (~2 ppm) ayırt etmek zordur. Yüksek çözünürlüklü MS2 spektrumlarında, PTM'ler parçaların daha düşük kütlesi nedeniyle kolayca ayırt edilebilir ve onaylanabilir29. Ek olarak, H2A ve H2B histonları, Şekil 1b'dekifarklı UniProt katılım sayılarında belirtildiği gibi çok benzer dizilere sahip birden fazla homologa sahiptir. Yine, yüksek çözünürlüklü LC-MS analizi bunları kolayca tanımlayabilir ve ayırt edebilir. Sorgum histonları için iki tip H2A tespit edildi. Şekil 1b'deki 16 kDa H2A histonları, histonların korunamayan bölgelerinde genişletilmiş terminal kuyruklarına sahiptir. Genişletilmiş kuyrukları olmayan başka bir H2A histon grubu (14 kDa) Şekil 1c'degörülebilir.
H4 histonları için N-terminal asetilasyonu ana PTM olarak tanımlandı. Ek lizin asetilasyonları ve metiyon oksidasyonları da sadece Şekil 1d'dekiözelliklerin kütle farklılıkları incelenerek gözlemlenebilir. Ayrıca, N-terminal asetilasyonuna ek olarak 112.9 Da'nın bilinmeyen bir modifikasyonunun da gözlemlendiğini gözlemledik (Şekil 1d'deki"3Ac" üzerindeki özellik). Bu muhtemelen hazırlıkta kullanılan reaktiften bilinmeyen bazı adducts' lardır. Daha önce H4'te, histone proteinlerinin yüksek temelliği ile birlikte artık tuzlara atfedilebilecek sülfat iyon adducts tespit ettik. H3 için H3.3 ve H3.2(Şekil 1e)olmak üzere iki protein dizisi tanımlanmıştır. Bu iki protein dizisi sadece 4 kalıntıda (32, 42, 88 ve 91) farklılık gösterse de, LC-MS'te her iki boyut, kütle ve tutma süresindeki ayrıma bağlı olarak kolayca ayırt edilebilirler. H3 proteinleri, çeşitli derecelerde metilasyon ve asetilasyon ile yoğun bir şekilde değiştirilir. Yüksek modifikasyon derecesi, unsur haritasında 14 Da aralıklı olan yoğun, paralel çizgiler tarafından kolayca görselleştirilebilir. Bununla birlikte, üç metilasyon grubu (14 * 3 Da) bir asetilasyona eşit nominal kütleye sahiptir (42 Da). Bu PTM'ler bozulmamış protein seviyesinde kolayca çözülemediğinden, "metil eşdeğerleri" olarak adlandırılırlar (yani, 14 Da'nın katları; bir asetilasyon üç metil eşdeğerine eşittir). Şekil 1e'de H3 proteoformlar bozulmamış kütlelerine göre metil eşdeğerleri şeklinde etiketlenir. RPLC ayrımının sınırlı çözünürlüğü nedeniyle, birçok farklı H3 proteoformu muhtemelen aynı spektrumda birlikte bulunur ve parçalanır. Burada sunulan yöntem sadece Şekil 2'degösterildiği gibi metilasyon ve asetilasyonun en bol kombinasyonlarını belirleyecektir. H3'ün daha kapsamlı karakterizasyonu için, daha hedefli analiz halagereklidir 30,31.
Şekil 1: Sorgum yapraklarından çıkarılan bozulmamış histonlarda LC-MS özellik haritası. Şekil, tespit edilen tüm proteoformlar için moleküler kütleye karşı LC tutma süresini (dakika olarak) gösterir. Günlük bolluğu, üst haritanın yanındaki renk ölçeğiyle gösterilir (günlük 10 bolluğu). (a) Ana histon tepeleri kesikli kutularla etiketlenir. Kutuların dışındaki özelliklerin çoğu kesilmiş histonlar ve ribozomal proteinlerdir. Her histon grubu için yakınlaştırma görünümleri: (b) H2B ve 16 kDa H2A, (c) H3, (d) 14 kDa H2A ve (e) H3. UniProt katılım numaraları her özelliğin yanı sıra, algılanan PTM'ler ile birlikte not edilir. "Ac", "me", "+O" sırasıyla asetilasyon, metilasyon ve oksidasyonu gösterir. (b), bir veya iki C terminali alanine kırpılmış (-A* ve -AA* olarak gösterilen) iki kesilmiş H2A C5YZA9 proteoform etiketlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Proteoform tanımlamasının temsili bir örneği, MSPathfinder kullanılarak Şekil 2'de gösterilmiş ve LcMsSpectator'da görselleştirilmiştir. Şekil 2a'daki parçalanma spektrumu, protein omurgası boyunca c ve z tipi iyonlar veren ETD kullanılarak oluşturulmuştır. Aynı öncülün HCD'si tanımlamayı doğrulamak için kullanılabilir, ancak HCD genellikle sınırlı sıra kapsamı sağlar20. Önceki ve sonraki MS1 spektrumlarındaki öncül iyonlar Şekil 2b,c'de gösterilmiştir ve eşleşen izotop tepeleri mor renkle vurgulanır. Şekil 2d'deki sıra kapsama haritası, olası PTM'leri yerelleştirmeye yardımcı olabilir. Yüksek güven tanımlaması, PTM'leri yerelleştirmeye yardımcı olmak için parçaların çoğunun eşleşmesi, öncü iyonunun eşleşmesi ve iyi sıra kapsamına sahip olması gerekir. Bu örnekte, iki PTM ile bir H3.2 proteoform tanımlanmıştır: K9'da di-metilasyon ve K27'de metilasyon. Aynı yöntemi izleyerek, farklı PTM'lere ve terminal kesilmelerine sahip diğer proteoformlar manuel olarak doğrulanabilir.
Şekil 2: Tanımlanmış bir histone H3.2 proteoformunun temsili örneği. H3.2 preteoform ile (a) ETD spektrumu, (b) önceki MS1 spektrumunda öncü iyon, (c) bir sonraki MS1 spektrumunda öncü iyon ve (d) sıra kapsama haritası. N-terminustan gelen c iyonları siyan ile etiketlenmiştir ve C-terminustan gelen z iyonları pembe renge bürnür. İki PTM tespit edildi ve kütle kaymalarına açıklama eklenmiş olarak sarı (d) olarak vurgulandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tespit edilen histone proteoformların nicel karşılaştırması potansiyel epigenetik belirteçleri ortaya çıkardı. Bu protokolü daha önce sahadan toplanan 48 sorgum örneğine uyguladık ("bu çalışmada ek inhibitörler kullanılmadı)29. Çiçek öncesi veya çiçek sonrası kuraklıklara yanıt olarak iki farklı sorgum genotipi karşılaştırıldı. Proteoformların göreceli bolluğunu karşılaştırarak, Şekil 3'te gösterildiği gibi örnek koşullara özgü kesilmiş histone proteoformlarının bazı ilginç değişikliklerini keşfettik. H4'ün C-terminal kesilmesi sadece bazı numuneler için 3 ve 9. haftalarda gözlenmiştir (Şekil 3a,b). H3.2 için, N-terminal kesilmiş proteoformlar genellikle 10. haftada daha boldu(Şekil 3c,d). Buna karşılık, C terminali kesilmiş H3.2 daha önceki zaman noktalarında görülme eğilimindedir (Şekil 3c). Daha da önemlisi, iki genotip aynı şekilde yanıt vermedi. H4 C-terminali kesilmiş proteoformlar BTx642'de RTx430'dan(Şekil 3b)önemli ölçüde daha fazlaydı. Bu veriler, diğer tekniklerle daha fazla test edilebilen bitki gelişimi ve stres toleransının potansiyel epigenetik belirteçlerini ortaya koymaktadır.
Şekil 3: Histone proteoformlarının nicel karşılaştırması. (a) Farklı numunelerde histone H4 proteoformlarının ısı haritası. Her proteoform için, yukarıdan aşağıya MS verilerinden çıkarılan bolluk, her analizde tanımlanan tüm H4 proteoformlarının toplamına normalleştirilerek "göreceli bolluk" elde edildi. Değerler daha sonra düşük bolluk proteoformlarındaki değişiklikleri daha iyi göstermek için her satırın en fazlasına ölçeklendirildi. Ölçeklenmiş göreli bolluk, ısı haritasındaki renk anahtarında gösterilir. Büyüme koşulları yatay eksende not edilir (Ön: çiçekli kuraklık öncesi, Post: çiçek sonrası kuraklık). Üç çoğaltma birlikte gruplandırılır ve diğer koşullardan siyah dikey çizgilerle ayrılır. Yıldız işaretleri ile etiketlenmiş numuneler için yalnızca teknik çoğaltmalar elde edilmiştir. Proteoformlar dikey eksende, "başlangıç kalıntısı – bitiş kalıntısı: kütle" biçiminde temsil edilir; putatif modifikasyon". (b) Kesilen H4 proteoformların 2–99 (a)kalın olarak vurgulanan proteoformlar) farklı koşullarda nispeten bolluk arsası toplanır. Sembollerin anahtarı sağ üst köşedeki göstergede gösterilir. Hata çubuklarının ortasındaki doldurulmuş noktalar ortalama değerlerdir. (c) H3.2 proteoformlarının ısı haritası ve (d) tanımlanan tüm N-terminali kesilmiş H3.2 için bolluk arsası H4 için olanlarla aynı formatta gösterilir. 8 kDa in (c) den küçük proteoformlar basitlik için atlandı. N-terminali ve C-terminali kesilmiş H3.2 proteoformları büyüme koşullarında farklı tepkiler gösterdi. ELSEVIER'inref. 29'danizni ile yeniden basılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sunulan protokol, histonların sorgum yaprağı (veya daha genel olarak bitki yaprağı) örneklerinden nasıl çıkarılacağını açıklar. Ortalama histone veriminin 4-5 g sorgum yaprağı malzemesi başına 2-20 μg olması beklenebilir. Malzemeler, LC-MS tarafından aşağı akış histon analizi için yeterince saftır (çoğunlukla ~% 20 ribozomal protein kontaminasyonuna sahip histonlar). Örnek varyasyonlar veya protokol boyunca olası yanlış işlenme/arızalar nedeniyle daha düşük verim elde edilebilir. Çekirdek liziz adımından önce çekirdeğin bütünlüğünü korumak kritik öneme sahiptir; bu nedenle, NLB eklemeden önce agresif girdaplama ve pipetlemeden kaçınılmalıdır. Ek olarak, süpernatantları peletlerden çıkarırken çekirdek kaybı meydana gelebilir. Pipetleme yaparken peletleri bozmamaya dikkat edilmelidir. %1'lik Triton X-100 konsantrasyonu, hedeflenmeyen organelleri seçici olarak çiylendirmek için optimize edildi, ancak çekirdekleri değil (adım 3.2). Diğer doku veya organizmalar için optimum deterjan konsantrasyonu farklı olabilir ve deneysel olarak belirlenmesi gerekebilir. Filtrasyon işlemi sırasında süpernatant renk değişimi, kloroplast verimsiz salınımı veya yaprağın yetersiz taşlanması gibi potansiyel sorunları gösterebilir. Mümkünse, protokolü daha da optimize etmek için her adımdan sonra kloroplastların lizizini ve bozulmamış çekirdeklerin tutulmasını kontrol etmek için bir mikroskop kullanın (özellikle diğer dokular veya bitkiler için protokolü değiştiriyorsanız). Bu protokol sadece sorgum yaprak dokusu ile test edilmiştir. Topraktan gelen parazit nedeniyle muhtemelen sorgum kök dokusu için çalışmaz. Diğer bitki yaprağı dokularına uygulama test edilmiş değildir ve farklı bitkilere uygulama ek optimizasyona ihtiyaç duyabilir. ChIP-seq uygulamaları için çekirdek izolasyon protokolünü uyarlamak için, sitoplazmik kontaminasyonu azaltmak için adım 3.3.4'den sonra (NLB kullanmadan önce) ek bir sakkaroz gradyan yoğunluk ayrımı önerilir. Kapsamlı temizleme adımları nedeniyle, az miktarda çekirdek olmayan malzemenin LC-MS'de histon analizi için önemli bir parazite neden olması beklenmemektedir ve pelet ile bırakılabilir.
Ticari fosfataz inhibitörleri tabletleri (örneğin, PhosSTOP) kullanırken birkaç ilk deneme başarısız oldu. Adım 3.1.6'daki süpernatant, tabletler ekstraksiyon tamponunda kullanıldığında yoğun yeşil görünüyordu. Son ekstrakt, tanımlanmış histonların sayısının düşük olduğunu gösterdi. Tabletlerdeki tescilli bileşenlerin 3.4 adımdan önce çekirdek lizizine neden olduğundan ve genel histon verimini azalttığından şüpheleniyoruz. Başarısızlığın bir diğer olası nedeni, histone saflaştırma adımındaki bileşenlerin iyon değişim reçinesi ile uyumsuzluğudur (adım 3.4). Bu protokolü, sonraki LC-MS için 150'den fazla örnek için sürekli olarak yüksek saflıkta histonlar çıkarmak için kullandık. Ortalama olarak, "ek inhibitörler" (yayınlanmamış veriler) kullanmadan daha yüksek verim elde edebildik. Bu nedenle, bu protokolü başka amaçlar için değiştirirken veya uyarlarken yeni inhibitörleri dikkatlice test etmeniz önerilir. Fosforilasyon ilgi çekici değilse, fosfataz inhibitörleri ekstraksiyon tamponlarında atlanabilir.
3.4'teki adımlar 3-4 saat veya daha fazla sürebilir. Protokolün 2 gün içinde kırılması önerilir: çekirdek peletini adım 3.3'ten dondurun ve saflaştırmayı 2. Donma-çözülme döngüsü çekirdek lizizine kısmen yardımcı olabilir. MWCO filtre adımları (3.4.7) çok zaman alabilir, ancak paralel olarak birden fazla örnek hazırlanarak kolayca ölçeklendirilebilir. Proteaz inhibitörü tabletlerini adım 3.4'e eklemeyin. Birçok ticari tablet, LC-MS analizini kesintiye uğratacak dolgu maddeleri olarak polimerler (örneğin polietilen glikol) içerir. Bu adımda, diğer proteinlerin çoğu çıkarılmış veya denatüre edilmiş olmalıdır, bu nedenle enzim inhibitörleri kritik değildir. Bununla birlikte, bozulmayı en aza indirmek için numuneleri 4 °C'de veya donmuş olarak tutmak gerekir.
Bu protokolden sonra, histonlar sorgum yapraklarından başarıyla çıkarılabilir. Histone PTM'ler LC-MS ile karakterize edilebilir. Yöntem, Şekil 3'tekiörnek verilerle gösterildiği gibi, histone PTM'lerini farklı biyolojik örnekler (örneğin, farklı genotipler, farklı koşullar altında yetiştirilen bitkiler vb.) arasında karşılaştırmak için büyük ölçekli çalışmalara uygulanabilir. Bununla birlikte, veri işleme, özellikle beklenmeyen (veya yeni) PTM'ler için proteoformları güvenle atamak için hala kapsamlı manuel analiz gerektirir. Biyoinformatik araçlardaki yeni gelişmelerin iş akışını otomatikleştirmesi ve büyük ölçekli çalışmalar için verimi önemli ölçüde artırması beklenmektedir. Başka bir sınırlama, yukarıdan aşağıya MS yönteminin, şu anda, hiper modifiye edilmiş H3'ün birçok proteoformunun (örneğin, mono / di / tri-metlylation ve asetilasyon birden fazla sitesi) kolayca ayırt edilememesidir. Tek boyutlu ters fazlı LC, farklı H3 proteoformlarını tam olarak ayıramaz. Bu nedenle, H3'ün MS2 spektrumları genellikle birden çok proteoformdan parçalar içerir ve kolayca ve güvenle çözülemez. Yukarıdan aşağıya, aşağıdan yukarıya veya orta-aşağı yöntemleri30,32,33 ile birleştirmek, histone H3'ün karakterizasyonu için özellikle yararlı olabilir. Alternatif olarak, yukarıdan aşağıya MS34 , 35,36derinliğini iyileştirmek için çok boyutlu ayırma düşünülebilir.
LC-MS tarafından histone PTM profilleme, kromatin değiştiricileri tasarlamak için yeni epigenetik belirteçlerin keşfedilmesini sağlar ve bitkilerin ağır çevre koşullarına karşı dayanıklılığını artırır. İki kültivardan sorgum kullanılarak yapılan ve tarlada kuraklık koşullarında yetiştirilen bir pilot çalışma, yapraktaki seçici histone terminal kupürünün kuraklık alışma ve bitki gelişimi ile ilgili olabileceğini belirtti29. Tanımlanan histone belirteçleri ChIP-seq gibi tamamlayıcı tekniklerle hedef olarak hizmet edebilir. Bu tamamlayıcı tekniklerden elde edilen epigenetik faktörlerin kapsamlı bir şekilde anlaşılması, çevresel değişikliklere yanıt olarak ekinlere yenilikçi çözümler üretmek için vazgeçilmez olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbiri.
Acknowledgments
Ronald Moore ve Thomas Fillmore'a kütle spektrometresi deneylerine yardım ettiği için ve Matthew Monroe'ya veri ifadesi için teşekkür ederiz. Bu araştırma, ABD Tarım Bakanlığı'ndan (USDA) DE-SC0014081 ödül numarası altında Sorgum'da Kuraklık Tepkisinin Epigenetik Kontrolü (EPICON) projesi aracılığıyla ABD Enerji Bakanlığı (DOE) Biyolojik ve ÇevreSel Araştırmalar tarafından finanse edildi; CRIS 2030-21430-008-00D) ve Lawrence Berkeley Ulusal Laboratuvarı ile DOE arasında DOE (Contract DE-AC02-05CH11231) sponsorluğunda bir tesis olan Joint BioEnergy Institute (JBEI) aracılığıyla. Araştırma, Biyolojik ve Çevresel Araştırmalar Ofisi sponsorluğunda bir DOE Bilim Kullanıcı Tesisi Ofisi olan Çevre Moleküler Bilimler Laboratuvarı (EMSL) (grid.436923.9) kullanılarak gerçekleştirildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4L | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-5G | |
| EDTA, 500mM Solution, pH 8.0 | EMD Millipore Corp | 324504-500mL | |
| Formic Acid | Thermo Scientific | 28905 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma | G3272-100G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| Potassium phosphate, dibasic | Sigma | P3786-100G | |
| Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tablets | Roche | 5892791001 | |
| Sodium butyrate | Sigma | 303410-5G | Used for histone deacetylase inhibitor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S1888 | |
| Sodium Fluoride | Sigma | S7020-100G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 450243-10G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sucrose | Sigma | S7903-5KG | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 g | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-100ML | |
| Weak cation exchange resin, mesh 100-200 analytical (BioRex70) | Bio-Rad | 142-5842 | |
| Disposables | |||
| Chromatography column (Bio-Spin) | BIO-RAD | 732-6008 | |
| Mesh 100 filter cloth | Millipore Sigma | NY1H09000 | This is part of the Sigma kit (catalog # CELLYTPN1) for plant nuclei extraction. Similar filters with the same mesh size can be used. |
| Micropipette tips (P20, P200, P1000) | Sigma | ||
| Tube, 50mL/15mL, Centrifuge, Conical | Genesee Scientific | 28-103 | |
| Tube, Microcentrifuge, 1.5/2 mL | Sigma | ||
| Equipment | |||
| Analytical Balance | Fisher Scientific | 01-912-401 | |
| Beakers (50mL – 2L) | |||
| Microcentrifuge with cooling | Fisher Scientific | 13-690-006 | |
| Micropipettes | |||
| Swinging-bucket centrifuge with cooling | Fisher Scientific | ||
| Vortex | Fisher Scientific | 50-728-002 | |
| Water bath Sonicator | Fisher Scientific | 15-336-120 |
References
- Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D., Basra, S. M. A. Plant drought stress: Effects, mechanisms and management. Agronomy for Sustainable Development. , 153-188 (2009).
- Dai, A. Drought under global warming: a review. Wiley Interdisciplinary Reviews: Climate Change. 2 (1), 45-65 (2011).
- Rooney, W. L., Blumenthal, J., Bean, B., Mullet, J. E. Designing sorghum as a dedicated bioenergy feedstock. Biofuels, Bioproducts and Biorefining. 1 (2), 147-157 (2007).
- Mullet, J. E., Klein, R. R., Klein, P. E. Sorghum bicolor - an important species for comparative grass genomics and a source of beneficial genes for agriculture. Current Opinion in Plant Biology. 5 (2), 118-121 (2002).
- Xu, L., et al. Drought delays development of the sorghum root microbiome and enriches for monoderm bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4284-4293 (2018).
- Gao, C., et al. Strong succession in arbuscular mycorrhizal fungal communities. ISME Journal. 13 (1), 214-226 (2019).
- Gao, C., et al. Fungal community assembly in drought-stressed sorghum shows stochasticity, selection, and universal ecological dynamics. Nature Communications. 11 (1), (2020).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
- Yuan, L., Liu, X., Luo, M., Yang, S., Wu, K. Involvement of histone modifications in plant abiotic stress responses. Journal of Integrative Plant Biology. 55 (10), 892-901 (2013).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews. Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
- Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. Quantitative proteomic analysis of histone modifications. Chemical Reviews. 115 (6), 2376-2418 (2015).
- Moradian, A., Kalli, A., Sweredoski, M. J., Hess, S. The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).
- Sidoli, S., Garcia, B. A. Characterization of individual histone posttranslational modifications and their combinatorial patterns by mass spectrometry-based proteomics strategies. Methods in Molecular Biology. 1528, Clifton, N.J. 121-148 (2017).
- Maile, T. M., et al. Mass spectrometric quantification of histone post-translational modifications by a hybrid chemical labeling method. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 1148-1158 (2015).
- Dang, X., et al. The first pilot project of the consortium for top-down proteomics: a status report. Proteomics. 14 (10), 1130-1140 (2014).
- Schaffer, L. V., et al. Identification and quantification of proteoforms by mass spectrometry. Proteomics. 19 (10), 1800361 (2019).
- Cupp-Sutton, K. A., Wu, S. High-throughput quantitative top-down proteomics. Molecular Omics. , (2020).
- Varoquaux, N., et al. Transcriptomic analysis of field-droughted sorghum from seedling to maturity reveals biotic and metabolic responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 27124 (2019).
- Gordon, J. A. Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor. Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).
- Zhou, M., et al. Profiling changes in histone post-translational modifications by top-down mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1507, Clifton, N.J. 153-168 (2017).
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Kou, Q., Xun, L., Liu, X. TopPIC: a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization. Bioinformatics (Ocford, England). 32 (22), (2016).
- Park, J., et al. Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics. Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).
- LeDuc, R. D., et al. The C-Score: a bayesian framework to sharply improve proteoform scoring in high-throughput top down proteomics. Journal of Proteome Research. 13 (7), 3231-3240 (2014).
- Fornelli, L., et al. Advancing top-down analysis of the human proteome using a benchtop quadrupole-orbitrap mass spectrometer. Journal of Proteome Research. 16 (2), 609-618 (2017).
- Sun, R. X., et al. pTop 1.0: A high-accuracy and high-efficiency search engine for intact protein identification. Analytical Chemistry. 88 (6), 3082-3090 (2016).
- Xiao, K., Yu, F., Tian, Z. Top-down protein identification using isotopic envelope fingerprinting. Journal of Proteomics. 152, 41-47 (2017).
- Cai, W., et al. MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (2), 703-714 (2016).
- Zhou, M., et al. Top-down mass spectrometry of histone modifications in sorghum reveals potential epigenetic markers for drought acclimation. Methods. , San Diego, Calif. (2019).
- Garcia, B. A., Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Pervasive combinatorial modification of histone H3 in human cells. Nature Methods. 4 (6), 487-489 (2007).
- Zheng, Y., et al. Unabridged analysis of human histone H3 by differential top-down mass spectrometry reveals hypermethylated proteoforms from MMSET/NSD2 overexpression. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (3), 776-790 (2016).
- Garcia, B. A., et al. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).
- Holt, M. V., Wang, T., Young, N. L. One-pot quantitative top- and middle-down analysis of GluC-digested histone H4. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2514-2525 (2019).
- Tian, Z., et al. Enhanced top-down characterization of histone post-translational modifications. Genome Biology. 13 (10), (2012).
- Wang, Z., Ma, H., Smith, K., Wu, S. Two-dimensional separation using high-pH and low-pH reversed phase liquid chromatography for top-down proteomics. International Journal of Mass Spectrometry. 427, 43-51 (2018).
- Gargano, A. F. G., et al. Increasing the separation capacity of intact histone proteoforms chromatography coupling online weak cation exchange-HILIC to reversed phase LC UVPD-HRMS. Journal of Proteome Research. 17 (11), 3791-3800 (2018).
