Summary
이 프로토콜은 엔지니어링 가뭄 내성 작물을 돕기 위해 잠재적 후성 유전학 마커역할을 할 수 있는 번역 후 변형 후 프로파일링을 위해 사탕수잎 재료로부터 손상되지 않은 히스톤을 효과적으로 추출하기 위해 개발되었습니다.
Abstract
히스톤은 진핵생물에 있는 고도로 보존된 단백질의 가족에 속합니다. 그(것)들은 크로마틴의 기능적인 단위로 뉴클레오소좀으로 DNA를 포장합니다. 매우 역동적이고 효소에 의해 추가되거나 제거될 수 있는 히스톤의 번역 후 변형(PTM)은 유전자 발현 조절에 중요한 역할을 합니다. 식물에서, 후성 유전학 요인, histone PTM을 포함 하 여, 환경에 그들의 적응 응답과 관련. 후성 유전학 적 제어의 분자 메커니즘을 이해하면 혁신적인 생명 공학 솔루션에 전례없는 기회를 가져올 수 있습니다. 본명, 우리는 핵을 분리하고 사탕수수 잎 조직에서 히스톤을 정화하는 프로토콜을 설명합니다. 추출된 히스톤은 온라인 반전 단계(RP) 액체 크로마토그래피(LC)와 결합된 하향식 질량 분석법(MS)에 의해 온전한 형태로 분석될 수 있다. 동일한 히스톤 프로테오폼에 여러 PTM의 조합 과 스토이치오메트리를 쉽게 식별할 수 있다. 또한, 히스톤 테일 클리핑은 하향식 LC-MS 워크플로우를 이용하여 검출될 수 있으므로 코어 히스톤(H4, H2A, H2B, H3)의 글로벌 PTM 프로파일을 산출할 수 있다. 우리는 가뭄 저항의 후성 유전학 마커를 확인하기 위한 대규모 필드 연구 결과에서 집합된 사탕잎 조직에서 히스톤 PTM을 프로파일링하기 위하여 이전에 이 프로토콜을 적용했습니다. 이 프로토콜은 잠재적으로 크롬마틴 면역 침전 시퀀싱(ChIP-seq)에 맞게 조정되고 최적화될 수 있으며, 유사한 식물에서 그의 음색 PTM을 연구할 수 있습니다.
Introduction
가뭄의 심각도와 빈도가 증가하면 시리얼 작물1,2의생산성에 영향을 미칠 것으로 예상됩니다. 수쿰은3,4의수중제한조건을 견딜 수 있는 뛰어난 능력으로 유명한 시리얼 식품 및 에너지 작물입니다. 우리는 가뭄 스트레스, 식물 개발 및 사탕수수의 후성 유전학 사이의 상호 작용에 대한 기계적 이해를 추구하고 있습니다 [수줌 바이 컬러 (L.) Moench] 식물. 우리의 이전 작품은 가뭄 적응과 분자수준5,6,7에서반응에 식물과 뿌리 부피 미생물군유전체 사이의 강한 연결을 입증했다. 이 연구는 미래의 기후 시나리오에 작물을 적응에 후성 유전학 공학을 활용하기위한 길을 열 것입니다. 후성유전학을 이해하는 노력의 일환으로, 우리는 식물 유기체 내의 유전자 발현에 영향을 미치는 단백질 마커를 연구하는 것을 목표로 합니다.
히스톤은 크로마틴의 기본 단위로 뉴클레오소로 DNA를 포장하는 진핵생물에 있는 단백질의 높게 보존된 가족에 속합니다. 히스톤의 번역 후 변형(PTM)은 크로마틴 구조를 제어하고 유전자 발현에 영향을 미치기 위해 동적으로 조절됩니다. DNA 메틸화를 포함한 다른 후성 유전학 적 요인과 마찬가지로, 그의 톤 PTM은 많은 생물학적 과정에서 중요한 역할을합니다8,9. 서양 얼룩과 같은 항체 기반 의 소는 널리 그의 톤 PTM을 식별하고 정량화하는 데 사용되어 왔다. 또한, 히스톤 PTM 및 DNA의 상호작용은 크로마틴 면역 침전- 시퀀싱(ChIP-seq)10에의해 효과적으로 조사될 수 있다. ChIP-seq에서, 특정 표적 히스톤 PTM을 가진 크로마틴은 특정 PTM에 대하여 항체에 의해 풍부하게 된다. 이어서, DNA 단편은 농축 된 크로마틴에서 방출되고 시퀀스될 수 있다. 표적 히스톤 PTM과 상호 작용하는 유전자의 영역이 드러난다. 그러나 이러한 모든 실험은 고품질 항체에 크게 의존합니다. 일부 히스톤 변이체/동형학 또는 PTM의 조합의 경우 강력한 항체의 개발은 매우 어려울 수 있습니다(특히 여러 PTM의 경우). 또한, 항체는 표적 히스톤 PTM이 공지되는 경우에만 개발될 수 있다. 11 따라서, 그의 톤 PTM의 표적, 글로벌 프로파일링을위한 대체 방법이 필요합니다.
질량 분광법(MS)은 항체를 사용할 수 없는 알 수 없는 PTM을 포함하여 히스톤 PTM을 특성화하는 보완적인방법이다. 잘 확립된 "상향식" MS 워크플로우는 프로테아제스를 사용하여 액체 크로마토그래피(LC) 분리 및 MS 검출 전에 단백질을 작은 펩타이드로 소화합니다. 히스톤에는 많은 수의 기본 잔류물(리신 과 아르기닌)이 있기 때문에 표준 상향식 워크플로우에서 트립신 소화(리신 및 아르기닌에 특화된 프로테아제)는 단백질을 매우 짧은 펩타이드로 절단합니다. 짧은 펩타이드는 기술적으로 표준 LC-MS에 의해 분석하기 어렵고, 다중 PTM의 연결성 및 스토이치오메트리에 대한 정보를 보존하지 않는다. 다른 효소 또는 리신을 차단하기 위한 화학 라벨링을 사용하면 히스톤 PTMs13,14의특성화에 더 적합한 더 긴 펩티드를 생성한다.
또는 소화 단계를 완전히 생략할 수 있습니다. 이러한 "하향식" 접근법에서, 온전한 단백질 이온은 온라인 LC 분리 후 전기분무분화(ESI)에 의해 MS에 도입되어, 그대로 히스톤 프로테오폼의 이온을 산출한다. 또한, 관심의 이온(즉, 프로테오폼)은 질량 분광계에서 분리및 단편화되어 식별 및 PTM 국소화를 위한 서열 이온을 산출할 수 있다. 따라서 하향식 MS는 프로테오폼 수준의 정보를 보존하고 동일한프로테오폼(15,16)에서다중 PTM 및 단말 절단의 연결을 캡처할 수 있는 장점이 있다. 하향식 실험은 또한 정량적 정보를 제공하고 그대로 단백질 수준17에서바이오마커에 대한 통찰력을 제공할 수 있다. 본 명세서에서는 사탕수수 잎에서 히스톤을 추출하고 하향식 LC-MS로 손상되지 않은 히스톤을 분석하는 프로토콜을 설명합니다.
도 1 과 도 2에 표시된 예제 데이터는 심기 후 2 주차에 수집 된 사탕잎에서 수집됩니다. 수율의 변화가 예상되지만 이 프로토콜은 일반적으로 특정 샘플 조건에 불가지론적입니다. 동일한 프로토콜은 심기 후 2, 3, 5, 8, 9 및 10 주에서 수집 된 사탕 수 식물 잎 조직에 성공적으로 사용되었습니다.
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Protocol
1. 사탕수수 잎 소재 준비
참고 : 사탕수수 식물은 칼리어, 캘리포니아에있는 필드에 토양에서 재배되었다.
- 식물에서 수중 잎을 50mL 원심분리기 튜브로 수집하고 즉시 액체 질소로 튜브를 얼릴 수 있습니다. 제 3 및 네 번째 완전히 출현 한 잎을 1 차 경작기에서 떼어 내며 잎 조직을 수집하십시오.
참고: 현장 상태, 샘플 증가 및 수집에 대한 자세한 내용은 게시된 보고서18에서찾을 수 있습니다. - 액체 질소로 잎을 갈아서 원심분리기 튜브로 즉시 옮깁니다.
- 사용할 때까지 -80 °C에 접지 잎을 저장합니다. 각 샘플의 히스톤 분석을 위해 저온 분쇄 잎 분말 약 4 g을 섭취하십시오.
2. 버퍼 및 재료 준비 (3-4 시간)
참고: 고농도 재고 솔루션은 미리 만들어 사용할 때까지 저장할 수 있습니다. 그러나 모든 작업 버퍼는 추출 당일 (재고 희석 및 다른 내용과 혼합하여) 신선하게 만들어져야하며 공정 중에 얼음위에 두어야합니다. 그렇지 않으면 권장하지 않는 한 전체 실험은 4 °C에서 수행되어야합니다.
- 연속 교반이 있는 유리 용기에 열판에 멸균수 15mL에 42.8g의 자당(342.30 g/mol)을 용해시켜 2.5M 자당을 준비한다. 자당이 완전히 녹으면 볼륨을 50mL로 끌어 올릴 수 있습니다. 사용 전까지 자당을 4°C로 보관하십시오.
- 15mL 원심분리기 튜브에서 H2O의 10mL에서 1.576 g의 Tris HCl을 용해하여 1M Tris pH 8을 준비하십시오. NaOH로 pH를 8으로 조정하고 pH 용지로 확인하십시오. 사용할 때까지 4 °C에 보관하십시오.
- DTT(154.25 g/mol)의 231 mg을 계량하여 1.5mL 멸균수로 용해시킴으로써 1M 디티오트리톨(DTT)을 준비한다. DTT는 신선하게 만들거나 저장된 냉동 알리쿼트를 사용해야 합니다.
- (선택 사항) 세 가지 다른 염을 혼합 하여 추가 억제제준비. 1mL의 멸균수에 18.38 mg의 나트륨 오르토바나다테(183.91 g/mol)를 준비한 다음, 11.008 mg의 나트륨 부티레이트(110.09 g/mol)를 멸균수 1mL에 추가하여 별도로 나트륨 부티라테를 준비합니다. 4.199 mg의 불소 나트륨(41.99 g/mol)을 1mL의 물에 추가하여 최종 소금을 준비합니다. "추가 억제제"(3개의 화학 물질의 각각 33mM)에 대한 스톡 솔루션과 같은 부피로 3개의 염액을 함께 혼합합니다.
참고: 바나다테 나트륨은 중립 pH 하에서 0.1 mM 이상의 농도로 중합합니다. 게시된프로토콜(19)에따라 최대 효능을 위해 비합화를 위해 바나다테 나트륨을 활성화하는 것이 좋습니다. 또는 활성성 바나다테 나트륨이 시판됩니다. 본명, 바나다테 나트륨은 의도적으로 활성화되지 않았기 때문에 효능이 감소되지 않는다. 활성 나트륨 바나다테는 아직이 프로토콜에 대한 테스트되지 않았습니다. - 15mL 원심분리기 튜브에서 H2 O의 10mL에서 무수성 마그네슘 염화물(95.2 g/mol)의 0.952 g를 용해시켜 MgCl2M1M을 준비한다. 사용 전까지 4°C에서 1M MgCl2를 보관하십시오.
- 트리톤 X-100 53.5g과 멸균수 35mL를 혼합하여 10% (v/v) 트리톤 X-100을 준비하여 최대 50mL의 물을 물로 가져와 실온에 보관하십시오.
- 5% 구아니딘 버퍼 pH7("Gdn 버퍼"라고 함)을 준비하여 적어도 하룻밤 동안 수지를 조절하는 데 사용될 수 있도록 -K2HPO4의 870 mg의 무게로 0.1 M 칼륨 수소 인산염 디베이직(K2 HPO4)을준비하고 50mL의 멸균수 및 저장물에서 4°C로 용해한다.
- 구아니딘 염산염 의 0.7 g의 무게와 14 mL의 최종 부피0.1 M K2HPO4에 용해. pH 용지로 확인하여 pH를 7으로 조정합니다.
- 건조 약한 양이온 교환(WCX) 수지(WCX)를 하룻밤 사이에 5% Guanidine 버퍼 pH 7에 담급니다. 상체를 제거하고 신선한 5 % Gdn 버퍼로 리필하고 수지가 완전히 평형 할 수 있도록 하룻밤 다시 담가 (상체가 원래 버퍼와 동일한 pH를 할 때까지).
- 다음 섹션에서 실험을 시작하기 전에 시약을 혼합하여 표 1을기반으로 EB1, EB2A 및 EB2B 버퍼를 만듭니다. 사용하기 직전에 모든 억제제와 DTT를 신선하게 추가합니다.
| 시약 | 재고 농도 | EB1 | EB2A | EB2B |
| 볼륨(mL) | 볼륨(mL) | 볼륨(mL) | ||
| 자당 | 2.5M | 4.4 | 1.25 | 0.5 |
| 트리스 HCl pH8 | 1M | 0.25 | 0.125 | 0.05 |
| Dtt | 1M | 0.125 | 0.0625 | 0.025 |
| H2O | 20.225 | 9.6875 | 4.375 | |
| 프로테아제 억제제(PI) 정제 | 0.5 알약 | 0.5 알약 | 0.5 알약 | |
| 추가 억제제(선택 사항) | 33mM | 0.25 | 0.125 | 0.05 |
| MgCl2 | 1M | 0.125 | 0.05 | |
| 트리톤 X100 | 10% | 1.25 | ||
| 전체 볼륨 | 25 mL | 12.5 mL | 5 mL | |
표 1: 추출 버퍼(EB)용 조성물입니다.
- 표 2를기준으로 핵 리시스 버퍼(NLB)를 만듭니다. NLB를 미리 준비하고 사용전까지 4°C에 보관하십시오. 1x(5mL당 0.5정)에서 사용하기 직전에 신선한 PI 정제를 추가합니다. 특정 볼륨에 대한 표 2를 참조하십시오.
| Nlb | 재고 농도 | 볼륨(mL) |
| Nacl | 5M | 0.4 |
| 트리스 HCl pH8 | 1M | 0.05 |
| 트리톤 X100 | 10% | 0.5 |
| Edta | 0.5M | 0.2 |
| H2O | 3.85 | |
| PI 정제 | 0.5 알약 | |
| 추가 억제제(선택 사항) | 33mM | 0.05 |
| 전체 볼륨 | 5 mL |
표 2: 핵 용해 완충제(NLB)에 대한 조성.
3. 핵 분리 절차
참고: 첫날(2-3h)의 3.1-3.3단계를 수행하고, NLB 버퍼에서 핵을 -80°C에서 저장하고 단백질 정화(4h)를 위해 다음 날(또는 그 이후)을 재개하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜의 핵 절연 단계는 합동 게놈 연구소에서 사용되는 sorghum ChIP-seq 프로토콜에서 적응되었다. ChIP-seq 응용을 위한 핵 순도를 보장하기 위해 추가 세차 및 자당 그라데이션 분리가 필요할 수 있다.
- 파편 여과 (~0.5h)
- 지면 잎 분말 ~4 g의 무게는 사용 준비가 될 때까지 드라이 아이스 또는 액체 질소에 배치하여 냉동 상태를 유지합니다.
- EB1에 프로테아제 억제제 정제를 0.2배(샘플당 25mL의 경우 0.5정)에 추가합니다. 버퍼내 정제의 용해에 도움이 되는 버퍼에 추가하기 전에 소형 플라스틱 유봉 또는 파이펫 팁을 사용하여 미세원심분리기 튜브에서 정제를 미리 분쇄하십시오. 재료 손실을 방지하기 위해 PI 태블릿을 추가하고 버퍼를 초음파 처리하여 태블릿을 용해합니다.
- 얼어 붙은 갈은 잎 분말에 EB1 20 mL을 넣고 부드럽게 소용돌이쳐 파우더가 완전히 중단 될 때까지 섞습니다. ~10분 동안 부드럽게 섞어 주세요.
- 메쉬(100)를 걸러내고, 여과된 물질을 EB12mL로 두 번 헹구는 다.
참고: 여과된 이물질과 여과된 이물질 모두 녹색이어야 합니다. 현미경을 사용하여 추적하는 경우, 이 시점에서 여과에 있는 그대로 핵및 손상되지 않은 엽록체를 볼 수 있어야 합니다. 큰 파편의 대부분은 결석 / 고갈되어야한다. 메틸렌 블루와 같은 염료를 샘플과 혼합합니다. 핵은 20배, 40배 및/또는 100x 목표를 사용하여 시각화할 때 ~3-5 μm 직경의 다크 블루/아쿠아마린 구체로 쉽게 관찰할 수 있습니다. 핵에 비해 엽록소는 크기가 비슷하지만 색상이 녹색이며 종종 모양이 더 타원형입니다. 바쿠올레스는 크기와 모양의 핵과유사하지만 메틸렌 블루 염료를 쉽게 차지하지는 않습니다. - 원심분리기는 3,000 x g에서 4°C에서 10분 동안 핵및 엽록체를 포함한 펠릿 파편 및 큰 세포세포 세포기관에 결합된 여과를 형성한다.
참고: 이 스핀 중에 EB2A를 준비하는 것이 좋습니다(3.2.1 단계 참조). - 펠릿을 방해하지 않도록 주의하여 상류제를 장식합니다.
참고: 세제가 아직 추가되지 않은 경우 펠릿은 강렬한 녹색으로 유지되어야 하며, 주체는 대부분 옅은 녹색/노란색이어야 합니다.
- 비표적 세포기관의 용해(~0.5h)
- 최종 농도0.4배(12.5mL EB2A당 0.5정)에 프로테아제 억제제를 첨가하여 EB2A를 준비한다.
- EB2A 5mL에서 3.1.6 단계에서 펠릿을 다시 중단하고 부드러운 믹싱으로 10 분 동안 얼음에 배양하십시오.
참고: 세제 농도는 그대로 있는 세포와 엽록래를 선호하지만 핵은 사용하지 않도록 최적화되어야 합니다. 필요한 양은 유기체마다 다를 수 있습니다. 엽록소의 용해와 현미경의 밑에 온전한 핵의 보존을 확인하는 것이 좋습니다. - 펠트 이물질과 핵을 위한 스윙 버킷 로터에서 4°C에서 15분 동안 2,100 x g의 원심분리기.
참고: 이 단계에서, 상체는 강렬하게 녹색이어야 하고, 펠릿은 엽록소와 엽록소의 용해로 인해 사이토솔로 방출되기 때문에 이전 단계에서 관찰된 것보다 훨씬 적은 녹색이어야 합니다. - 펠릿을 방해하지 않도록 주의하여 상류제를 장식합니다.
- 남은 세포질 오염 물질로부터 핵의 분리 (~0.5h)
- 최종 농도 1x(5mL EB2B당 0.5정)에 프로테아제 억제제를 추가하여 EB2B를 준비한다.
- EB2B의 2mL에서 3.2.3 단계에서 원유 핵 펠릿을 재중단합니다.
참고: EB2B에는 Triton X-100이 포함되어 있지 않으므로 이 시점에서 추가 용해가 발생하지 않아야 합니다. - 펠트 이물질과 핵을 위한 스윙 버킷 로터에서 4°C에서 15분 동안 2,100 x g의 원심분리기.
참고: 작은 세포기관과 세포질 성분은 펠릿을 해서는 안 되므로 상퍼에 남아 있어야 합니다. - 펠릿을 방해하지 않도록 주의하여 상류제를 장식합니다.
- NLB의 250 μL을 사용하여 펠릿을 다시 중단하십시오 (5mL에 대해 0.5 프로테아제 억제제 정제를 새로 추가하십시오).
참고: 목표는 상당한 물질적 손실 없이 최소 량의 NLB로 핵을 재중단하는 것입니다. NLB는 매우 점성이 있고 펠릿은 많은 양의 불용성 파편을 함유하고 있기 때문에 파이펫이 매우 어렵고 파이펫 팁 의 내부에 집착하는 경향이 있습니다. 이러한 이유로 가능하면 동일한 파이펫 팁을 다시 사용하는 것이 좋습니다. 파이펫 팁의 잔류 재료와 관련된 경우, 단순히 중력이 팁의 개구부에서 재료를 수집 할 수 있도록 ~ 1 분 동안 선반이나 랙에서 파이펫을 걸어. 펠릿을 다시 중단하기 위해 적극적으로 파이펫을 사용하지 마십시오. 대신, 펠릿 재료가 파이펫 팁에 흡류 될 수있을 때까지 파이펫 팁을 교반 봉으로 사용합니다. 즉, 파이펫 팁에 그려질 수 있는 한 큰 펠릿 덩어리가 이 단계에 머무르는 것은 완벽합니다. - 최대 15s의 소용돌이가 균질화되고 부분적으로 재보습한다. 4 °C에서 5 분 동안 초음파 처리 한 다음 -80 ° C에 보관하십시오.
참고: 후속 단계의 경우 추가된 NLB의 총 양은 250 μL이지만 불용성 파편으로 인해 시료의 총 명백한 부피가 최대 두 배까지 될 수 있습니다. 샘플은 핵의 리시스를 돕기 위해 동결 및 해동된다.
- 핵 리시스 및 히스톤 추출 (~4h)
- 해동된 샘플에 5% Gdn 버퍼의 750 μL을 추가합니다. 4 °C에서 15 분 동안 초음파 처리하십시오.
- 샘플을 단일 2mL 튜브로 옮기고 4°C에서 10분 동안 10,000x g를 회전시합니다.
참고: 상체는 녹색으로 보일 가능성이 높습니다. 다음 크로마토그래피 단계는 단백질에서 안료의 대부분을 제거해야합니다. - 3.4.1 및 3.4.2 단계를 기다리는 동안 이온 교환 크로마토그래피를 위해 열을 준비하십시오. 표면에 오염을 최소화하기 위해 2 mL의 아세토나이트 및 4 mL의 물로 크로마토그래피 컬럼을 헹구십시오.
- 크롬 토그래피 컬럼에 WCX 수지의 200~300 μL(5% Gdn 버퍼로 사전 조절)을 로드합니다. 수지정착을 합시다. 5% Gdn 버퍼의 1mL로 4번 세척하십시오. 나머지 정화 단계에 대해 튜브와 컬럼을 얼음 위에 보관하십시오.
- 크로마토그래피 컬럼을 2mL 수집 튜브에 놓습니다. 수지 (튜브의 측면에서 천천히 떨어 뜨리십시오)를 방해하지 않고 3.4.2 단계에서 상체를 수지 침대에 천천히적입니다. 용액이 중력에 의해 흐르도록 하십시오. 용액이 흐르면서 용액을 열 의 맨 위로 6-8번 로드하여 수지에 최대 바인딩을 허용합니다. 그런 다음 용광을 버리십시오.
- 2 mL의 5% Gdn 버퍼를 적재하여 비히스톤 단백질을 컬럼에서 씻어내도록 합니다. 용광을 버리십시오.
- 1 mL 20 % Gdn 버퍼와 엘루트 히스톤. 히스톤 단백질이 함유된 용액을 수집합니다.
- 3kDa 분자량 차단(MWCO) 스핀 필터(0.5mL)를 사용하여 3.4.6단계에서 용액을 탈염합니다. 사용하기 전에 500 μL 세척 용매 (0.2 % 포믹 산 3 % ACN)를 적재하고 필터를 청소하기 위해 두 번 회전하십시오.
참고: 시간을 절약하기 위해 수지 크로마토그래피 단계를 수행하면서 MWCO 필터를 세척하는 것이 좋습니다. 다음 스핀 필터 단계는 ~3-4h를 수행합니다. - 히스톤 샘플의 첫 번째 하중 500 μL은 14,000 x g에서 ~25분 동안 회전하여 부피를 ~100 μL로 줄입니다. 그런 다음 또 다른 400 μL의 시료를 로드하고 14,000 x g에서 다시 ~25 분 동안 회전합니다. 시료의 최종 100 μL을 로드하고, 300 μL 세척 용매로 샘플 튜브를 헹굴하고 용매를 필터에 적재합니다. ~25 분 동안 다시 14,000 x g에서 회전합니다.
- 적재 400 μL 세척 용매, 14, 000 x g에서 ~ 25 분 동안 회전하여 부피를 ~ 100 μL 이하로 줄입니다. 각 주기는 소금 농도를 1/5로 감소시킵니다. 구아니딘 농도를 ~0.01%로 가져오기 위해 또 다른 3사이클을 반복합니다. 필터를 깨끗한 수집 튜브로 되돌리고 1,000 x g에서 2분 동안 회전합니다. 정제된 히스톤 샘플을 -20°C 또는 -80°C에서 저장하여 분석을 위해 한다.
참고: 더 높은 농도를 얻기 위해 샘플 볼륨을 최소화하기 위해 마지막 단계에서 더 이상(30~40분)을 회전하는 것이 좋습니다. 부피는 50-70 μL로 내려갈 수 있어야 합니다.
4. 정화된 히스톤의 질량 분광법
- 액체 크로마토그래피 질량 분석법 (LC-MS) 데이터 수집
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 Bicinchoninic acid (BCA) 분석에 의해 단백질 농도추정.
참고: BCA는 총 단백질 농도의 추정만 제공할 수 있지만, 히스톤 정제의 품질은 아닙니다. MS 계측이 쉽게 사용할 수없는 경우 히스톤 정제의 품질을 확인하기 위해, 서쪽 얼룩을 사용할 수 있습니다. 이전 보고서에 설명된 바와 같이 210nm 자외선 흡수성 검출과 결합된 반전 위상 LC도20개도사용할 수 있다. 크로마토그램은 샘플 품질을 확인하기 위한 알려진 표준과 비교할 수 있습니다. 그러나, 다른 유기체는 다른 용출 단면도가 있을 수 있습니다. 따라서 유사한 유기체로부터의 히스톤 표준을 사용하는 것이 좋습니다. - C18 반전 위상(RP) 분석 열을 연결합니다(예: 3 μm 300 Å, 기둥 내경 75 μm, 외경 360 μm, 길이 70cm) 및 C18 트랩 컬럼(예: 3.6 μm, 기둥 내경 150 μm, 외경 360 μm, 길이 5cm)을 이중 펌프 나노플로우 액체 크로마토그래피 시스템(e.g., NanoAc)에 한다. 이진 용매는 A: 물에서 0.1% 포믹산, B: 0.1% 아세토닐릴산의 포믹산.
참고: 듀얼 펌프 LC에는 워시 펌프와 그라데이션 펌프가 포함되어 있습니다. 두 펌프모두 각 분석에서 두 단계를 거치며 트래핑 스테이지와 분석 스테이지가 뒤따릅니다. 트래핑 단계에서 는 워시 펌프가 트랩 기둥으로 흐르고 그라데이션 펌프는 분석 열로 흐릅니다. 분석 단계에서 트랩 열은 분석 열과 결합되고 그라데이션 펌프는 두 열로 흐릅니다. 그런 다음 세척 펌프는 폐기물로 이동합니다. - 트래핑 스테이지: LC 메서드를 설정하여 히스톤 샘플의 1-2 μg를 트랩 열에 먼저 로드합니다. 세척 펌프에 의해 시료를 3 μL/min 5% 용매 B에서 10분 동안 탈염합니다. 분석 펌프를 0.3 μL/min 5% 용매 B로 설정하여 평형을 확인합니다.
- 분석 단계: 그라데이션 펌프(0.3 μL/min)를 설정하여 5% B에서 시작하고 경사로를 15분에 30%로 설정합니다. 이어서, 끝에 95%B까지 높은 유기 세척 전에 100분에서 41%B로 증가합니다.
참고: 그라데이션은 개별 열의 다른 보존 프로파일에 따라 최적화할 수 있습니다. 일반적으로 전체 길이 의 히스톤은 지정된 LC 조건에서 약 30 %-40 % B를 엘누트합니다. 더 긴 그라데이션을 사용하여 MS2 스펙트럼의 수를 늘려 더 많은 히스톤 프로테오폼을 캡처할 수 있습니다. - 전자 전달 해리(ETD) 기능을 사용하여 고해상도 MS(예: 열 궤도랩 퓨전 루모스 또는 이와 유사한)에 데이터 의존적 획득 방법을 설정합니다. 그대로 단백질 모드를 사용하고 제조업체에서 제안한 모든 필요한 교정을 수행합니다. 중요 매개 변수는 아래에 설명되어 있습니다. 이는 사용되는 계측기와 관련이 있습니다.
- MS1: 스캔 범위 600-2,000 m/z, 해상도 120k (m/z 200), 4 마이크로 스캔, AGC 대상 1E6, 최대 주입 50 ms.
- MS2: 해상도 120k; 1 현미경; AGC 표적 1E6; 데이터 종속 MS/MS: 교대로 ETD (25 ms 반응 시간, 최대 주입 시간 500 ms) 및 고에너지 충돌 해리 (HCD, 28% 정상화 된 충돌 에너지와 ±5% 단계적 에너지, 최대 주입 시간 100 ms); 0.6 Da의 격리 창; 최고 요금 상태의 우선 순위.
- 동적 제외: 120의 시간 창, ±0.7 Da 질량 창. 5개 이하의 충전 상태및 미정 충전 상태를 제외합니다.
- 실제 샘플을 실행하기 전에 시스템을 평형화하고 확인하기 위해 새로운 컬럼에서 펩타이드 또는 히스톤 표준의 몇 가지 주사를 실행합니다. 많은 수의 샘플을 실행하려면 샘플 사이에 짧은 공백이나 세체를 추가하여 이월을 최소화합니다. 다음 샘플 앞에 열이 시작 조건(5% 용매 B)에서 15-20분 동안 평형화하도록 합니다.
참고: LC 그라데이션이 길어지고 MS2의 최대 분사 시간이 길어지면 더 많은 히스톤 프로테오폼을 식별하기 위한 스펙트럼 품질을 향상시킬 수 있습니다.
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 Bicinchoninic acid (BCA) 분석에 의해 단백질 농도추정.
- LC-MS 데이터 처리 및 프로테오폼 식별
- JGI(https://genome.jgi.doe.gov) 또는 UniProt(https://www.uniprot.org/)로부터 FASTA 형식으로 (수줌) 단백질 서열을 획득한다.
- MSConvert21(http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtml)을 사용하여 계측기 원시 데이터 파일(*.raw)을 mzML 형식으로 변환합니다.
- 데이터 처리를 위해 TopPIC 제품군 22(http://proteomics.informatics.iupui.edu/software/toppic/)를 다운로드하십시오. 프로그램은 명령줄 또는 그래픽 인터페이스를 통해 실행할 수 있습니다.
- TopPIC 제품군에서 TopFD를 사용하여 4.2.2 단계에서 mzML 파일의 스펙트럼을 제거합니다. 기본 매개 변수를 사용할 수 있습니다. 그러나 좁은 격리 창을 사용하므로 "전구체 창"(-w)을 1m/z로 줄여야 합니다.
- TopPIC 제품군에서 TopPIC를 사용하여 프로테오폼을 식별합니다. 대부분의 기본 매개 변수를 사용할 수 있습니다. 스펙트럼 및 프로테오폼 컷오프 유형을 FDR(거짓 검색률)으로 설정하고 컷오프 값을 0.01(1% FDR) 또는 원하는 대로 설정합니다. "프로테오폼 오차 허용 오차"를 5(달튼)로 설정합니다. 4.2.1 단계에서 FASTA 파일을 로드하고 4.2.4 단계에서 "*_ms2.msalign" 파일을 로드합니다. 그런 다음 검색을 시작합니다.
참고: "프로테오폼 오류 허용 오차" 설정은 프로테오폼과 유사한 질량(± 5Da)을 하나로 결합합니다. 이렇게 하면 프로테오폼 수의 중복성을 줄일 수 있습니다. 그러나 큰 공차가 proteoforms를 작거나 질량 차이가 없는 병합하기 때문에 주의해서 사용해야 합니다. 이 매개 변수는 TopPIC 버전 1.3 이상에서만 사용할 수 있습니다. - 확인된 프로테오폼은 "*_proteoform.csv" 파일에서 검사하거나 출력의 "*_html" 폴더 아래의 Topview 모듈을 사용하여 시각화할 수 있습니다.
- TopPIC를 사용하여 위의 단계에서 생성된 프로테오폼 목록은 질량 이동으로 히스톤 PTM에 음표를 음표합니다. 개별 PTM을 지역화하려면 수정 목록을 포함해야 합니다. 자세한 설명은 TopPIC 설명서에서 찾을 수 있습니다. 또는 다음 단계로 진행하여 정보-프로테오믹스패키지(23)를 사용하여 상호 보완적인 데이터 분석을 수행한다(https://github.com/PNNL-Comp-Mass-Spec/Informed-Proteomics).
- 지침을 따르고 PbfGen 모듈을 사용하여 계측기 원시 데이터를 PBF 파일로 변환합니다. 그런 다음 ProMex 모듈을 사용하여 MS1 데이터를 사용하여 ms1ft 파일을 출력합니다(기능 목록, 각 기능은 질량 및 유지 시간의 고유한 조합을 나타냅니다).
- 4.2.6 단계에서 TopPIC에서 확인된 단백질 목록을 사용하여 정보 프로테오믹스에 초점을 맞춘 FASTA를 만듭니다.
참고: 많은 수의 가변 PTM을 가진 정보-프로테오믹스를 사용하여 전체 게놈을 검색하는 것은 매우 느려질 수 있으며 충돌을 일으킬 수 있습니다. 따라서, 표적 단백질만을 포함시킴으로써 FASTA의 크기를 줄이는 것이 좋습니다. - 예제 파일의 형식에 따라 HIStone PTM을 검색하기 위해 대상 수정 목록을 만듭니다. 포함 할 일반적인 PTM은 다음과 같습니다: 리신 아세틸화, lysine 디 메틸화, 리신 트라이 메틸화, 세린 / threonine / 티로신 인스포릴레이션, 단백질 N-말단 아세틸레이션, 메티온틴 / 시스테인 산화. 사탕수수의 경우 단백질 N 단말 모노 메틸화, 디 메틸화 및 트리메틸화를 첨가해야 합니다.
참고: 정보 프로테오믹스는 목록에 지정된 PTM만 찾습니다. 지정되지 않은 PTM이 있는 경우 프로테오폼이 식별되지 않거나 다른 프로테오폼으로 잘못 식별될 수 있습니다. 그러나 검색 시간을 최소화하기 위해 PTM 목록을 가능한 한 짧게 유지해야 합니다. - MSPathFinder 모듈을 실행하여 4.2.8 단계, 4.2.9 단계에서 포커스된 FASTA 및 4.2.10 단계에서의 수정 목록을 사용하여 프로테오폼을 식별합니다. 기본 매개 변수를 사용할 수 있습니다.
- 결과는 모든 결과 파일을 로드하여 LcMsSpectator에서 시각화할 수 있습니다.
참고: 다른 생물정보학 도구는 하향식 데이터를 처리하고 시각화할 수 있으며, 각각24,25,26,27,28의고유한 강점을 가지고 있습니다. Sorghum 및 다른 많은 유기체는 데이터베이스에 있는 histone PTM에 관하여 알려진 정보를 제한했습니다. TopPIC를 먼저 사용하여 PTM에서 질량 이동을 식별합니다. 이 분석은 알려진 PTM과 알려지지 않은 PTM을 쉽게 발견할 수 있습니다. 그런 다음 검색된 PTM은 TopPIC에 PTM 목록을 지정하거나 다른 보완 도구를 사용하여 대상 방식으로 검색할 수 있습니다.
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Representative Results
프로토콜에 따라, 히스톤은 LC-MS 분석을 사용하여 추출 및 식별될 수 있다. 원시 데이터 및 처리된 결과는 액세스를 통해 MassIVE(https://massive.ucsd.edu/)에서 사용할 수 있습니다: MSV0000085770. 대표 샘플(MassIVE에서도 사용 가능)의 TopPIC 결과를 바탕으로 303개의 히스톤 프로테오폼(106 H2A, 72 H2B, 103 H3 및 22 H4 프로테오폼)을 확인했습니다. 공동 정제 리보소말 프로테오폼도 검출되었으며, 일반적으로 LC초기에 발례한다. 그들은 일반적으로 식별 된 프로테오폼의 ~20 %로 구성되지만 LC 그라데이션의 후반 단계에서 용출하는 히스톤 프로테오폼과 겹치지 않습니다. 결과는 최신 TopPIC 또는 정보 프로테오믹스 패키지로 쉽게 시각화할 수 있습니다. 데모를 위해 원시 MS 파일을 직접 로드하고 프로테오폼 식별을 수동으로 검사하는 데 사용할 수 있는 정보-Proteomics 패키지를 사용하여 데이터 시각화에 중점을 둡니다. 두 소프트웨어 패키지 모두 서로 다른 알고리즘과 매개 변수를 사용합니다. 보고된 프로테오폼 의 수는 동일하지 않습니다. 더 보수적이기 때문에 TopPIC에서 프로테오폼 수를 보고하는 것이 좋습니다. 잘 인음이 많은 PTM을 가진 유기체의 경우, 최고의 사이트 현지화를 위해 ProSightPC24를 권장합니다. 여러 도구를 사용하여 결과를 결합하면 프로테오폼 식별의 수와 신뢰도가 높아질 수 있습니다.
정보-프로테오믹스로 데이터를 처리한 후 LC-MS 피처 맵은 LC 보존 시간에 대비한 데온볼루트 단백질 질량을 표시하는 LcMsSpectator에서 시각화할 수 있습니다. 소프트웨어에서 식별된 프로테오폼을 클릭하면 피처 맵에 작은 녹색 사각형으로 연결된 기능이 강조 표시됩니다. 주요 히스톤 단백질은 실험의 성공을 나타내는 지도의 특정 영역에서 볼 수 있어야 합니다. 도 1a는 손상되지 않은 히스톤의 대표적인 LC-MS 피처 맵을 나타낸다. 전체 길이의 히스톤 프로테오폼이 파선 된 상자에 강조 표시됩니다. 검출된 대부분의 프로테오폼은 MS2 데이터를 사용하여 자신있게 식별할 수 있습니다.
도 1b는 H2A 및 H2B 프로테오폼을 통해 영역의 확대/축소를 나타낸다. 그들 대부분은 42 Da의 N 단자 개조가 있습니다. 이 명목 질량은 일반적으로 히스톤에 대해 볼 수있는 트리메틸레이션 (42.05 Da) 또는 아세틸화 (42.01 Da)에 해당합니다. 정확한 질량은 0.04 Da에 의해서만 다르며 그대로 단백질 수준(~2ppm)에서 분화하기 어렵습니다. 고해상도 MS2 스펙트럼에서, PTM은단편(29)의낮은 질량 때문에 쉽게 분화되고 확인할 수 있다. 또한, H2A 및 H2B 히스톤은 도 1b의다른 UniProt 가입 번호에 의해 언급된 바와 같이 매우 유사한 시퀀스를 가진 여러 개의 동형로그를 가지고 있다. 고해상도 LC-MS 분석은 이를 쉽게 식별하고 차별화할 수 있습니다. H2A의 두 가지 유형은 사탕 수수 히스톤에 대해 확인되었다. 도 1b의 16 kDa H2A 히스톤은 비보존 된 히스톤 영역에서 터미널 꼬리를 확장했습니다. 확장 된 꼬리 (14 kDa)가없는 H2A 히스톤의 또 다른 그룹은 도 1c에서볼 수 있습니다.
H4 히스톤의 경우, N단 염분은 주요 PTM으로 확인되었다. 추가 리신 아세틸화 및 메티오닌 산화는 도 1d의특징의 질량 차이를 검사하여 간단하게 관찰될 수 있다. 또한 N단 말단 아세틸화(도 1d의 "3Ac"위의 기능)에 더하여 112.9 Da의 알 수 없는 수정을 관찰하였다. 이것은 아마도 준비에 사용되는 시약에서 몇 가지 알 수없는 광고입니다. 우리는 이전에 H4에 황산 이온 부관을 검출했습니다, 이는 히스톤 단백질의 높은 기초와 결합된 잔류 염에 기인할 지도 모릅니다. H3의 경우, 2개의 단백질 서열이 H3.3및 H3.2(도 1e)를 확인하였다. 이 두 단백질 서열은 4잔류(32, 42, 88 및 91)에서만 다르지만, 두 차원, 질량 및 유지 시간 모두에서 분리를 기반으로 LC-MS에서 쉽게 구별할 수 있습니다. H3 단백질은 메틸화 및 아세틸화의 다양한 정도에 의해 크게 변형됩니다. 높은 수준의 수정은 14Da 떨어져 있는 피처 맵의 조밀한 평행선으로 쉽게 시각화할 수 있습니다. 그러나, 3개의 메틸화 군(14*3 Da)은 1개의 아세틸화(42 Da)에 동일한 명목 질량을 가지고 있다. 이러한 PTM은 그대로 단백질 수준에서 쉽게 해결할 수 없기 때문에 "메틸 등가물"(즉, 14 Da의 배수; 1개의 아세틸화는 3개의 메틸 등가물)로 지칭됩니다. 도 1e에서,H3 프로테오폼은 그대로 질량에 기초하여 메틸 등가물의 형태로 표시된다. RPLC 분리의 제한된 해상도로 인해 많은 다른 H3 프로테오폼이 동일한 스펙트럼에서 동례화되고 단편화될 가능성이 높습니다. 여기에 제시된 방법은 도 2에도시된 바와 같이 메틸화와 아세틸화의 가장 풍부한 조합을 식별할 수 있다. H3의 보다 포괄적인 특성화를 위해서는 더 많은 표적 분석이 여전히30,31이필요합니다.
그림 1: 사탕수수 잎에서 추출한 그대로 의기양양한 히스톤에 대한 LC-MS 피처 맵. 이 수치는 검출된 모든 프로테오폼에 대한 LC 보유 시간(분)과 분자 질량을 나타낸다. 로그 풍부는 상단 맵 옆의 색상 축척(로그 10 풍부)에 의해 표시됩니다. (a)주요 히스톤 봉우리에는 파선된 상자가 표시됩니다. 상자 밖의 대부분의 특징은 잘린 히스톤과 리보소말 단백질입니다. 각 히스톤 그룹에 대한 확대보기:(b)H2B 및 16 kDa H2A,(c)H3,(d)14 kDa H2A,(e)H3. UniProt 가입 번호는 각 기능과 함께 지적되며, 그 다음에 감지된 PTM. "Ac", "me", "+O"는 각각 아세틸화, 메틸화 및 산화를 나타냅니다. 에서(b),두 개의 잘린 H2A C5YZA9 proteoforms는 하나 또는 두 개의 C 단말 알라닌 클리핑했다 (-A *, 및 -AA *로 표시)가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
프로테오폼 식별의 대표적인 예는 MSPathfinder를 사용하여 도 2에 표시되고 LcMsSpectator에서 시각화됩니다. 도 2a의 단편화 스펙트럼은 ETD를 사용하여 생성되었으며, 이는 단백질 백본을 따라 c 및 z 유형 이온을 산출한다. 동일한 전구체의 HCD를 사용하여 식별을 검증할 수 있지만 HCD는 일반적으로 제한된 시퀀스커버리지(20)를제공합니다. 이전 및 다음 MS1 스펙트럼의 전구체 이온은 그림 2b,c에표시되며 일치하는 동위원소 봉우리가 보라색으로 강조 표시됩니다. 그림 2d의 시퀀스 커버리지 맵은 가능한 PTM을 현지화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 신뢰도가 높은 식별은 대부분의 조각이 일치하고, 전구체 이온이 일치하며, PTM을 지역화하는 데 도움이 되는 좋은 시퀀스 커버리지를 가져야 합니다. 이 예에서, H3.2 프로테오폼은 K9의 디메틸화와 K27의 메틸화라는 두 개의 PTM로 확인되었다. 동일한 방법에 따라 다른 PTM 및 터미널 잘림이 있는 다른 프로테오폼의 유효성을 수동으로 검증할 수 있습니다.
그림 2: 식별된 히스톤 H3.2 프로테오폼의 대표적인 예. H3.2 preteoform의(a)ETD 스펙트럼,(b)이전 MS1 스펙트럼에서 전구체 이온,(c)다음 MS1 스펙트럼에서 전구체 이온,(d)서열 커버리지 맵. N-종기의 c 이온은 시안으로 표시되고 C-종기의 z 이온은 분홍색으로 표시됩니다. 두 개의 PTM이 노란색(d)으로확인되고 강조 표시되었으며 질량 변화가 추가되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
검출된 히스톤 프로테오폼의 정량적 비교는 잠재적 후성유전학 적 마커를 드러낼 수 있다. 우리는 이전에 이 프로토콜을 현장에서 채취한 48개의 사탕수수 샘플("추가 억제제")에적용하였다(29). 사탕수수의 두 개의 다른 유전자형은 사전 꽃 또는 포스트 꽃 가뭄에 대한 응답으로 비교되었다. 프로테오폼의 상대적 풍부를 비교하여 도 3에 도시된 바와 같이 샘플 조건에 특정한 잘린 히스톤 프로테오폼의 몇 가지 흥미로운 변화를 발견했습니다. C-말단 절단은 일부 시료(도3a,b)에대해 주 3 및 9주에서만 관찰되었다. H3.2의 경우, N단자 잘린 프로테오폼은 일반적으로 10주차(도3c,d)에더 풍부하였다. 반면, C-단말이 잘린 H3.2는 이전 시간점(도3c)에서볼 수 있는 경향이 있다. 더 중요한 것은, 두 유전자형은 똑같은 방식으로 반응하지 않았다는 것입니다. H4 C-단말 잘린 프로테오폼은 BTx642에서 RTx430(도3b)보다훨씬 더 풍부하였다. 이러한 데이터는 다른 기술로 더 테스트 할 수있는 식물 개발 및 스트레스 내성의 잠재적 후성 유전학 마커를 보여줍니다.
그림 3: 히스톤 프로테오폼의 정량적 비교. (a)히스톤 H4 의 히트맵은 다른 샘플에 걸쳐 프로테오폼을 형성한다. 각 프로테오폼에 대해, 하향식 MS 데이터로부터 추출된 풍부도는 각 분석에서 확인된 모든 H4 프로테오폼의 합으로 정규화되어 "상대적 풍부"를 산출했다. 그런 다음 값이 각 행의 최대값으로 조정되어 낮은 풍부 프로테오폼의 변화를 더 잘 보여 주도록 했습니다. 스케일링된 상대적 풍부는 히트맵 하단의 색상 키에 표시됩니다. 성장 조건은 수평 축에 주목된다 (사전 : 사전 꽃 가뭄, 포스트 : 포스트 꽃 후 가뭄). 세 개의 복제본은 함께 그룹화되며 다른 조건과 검은색 세로 줄무늬로 구분됩니다. 별표로 표시된 샘플의 경우 기술 복제만 획득했습니다. 프로테오폼은 수직 축에 표현되며, "시작 잔류물– 종료 잔류물: 질량; "퍼팅 수정". (b)다른 조건에서 잘린 H4 프로테오폼 2-99의 상대적 풍부 플롯(굵게 강조표시된 프로테오폼)이 합산된다. 기호의 키는 오른쪽 상단 모서리의 범례에 표시됩니다. 오류 막대 중간에 채워진 점은 평균 값입니다. (c)H3.2 프로테오폼의 히트맵및(d)식별된 모든 N단말 절단H3.2에 대한 풍요로운 플롯은 H4용것과 동일한 형식으로 도시된다. 8kDa(c)보다 작은 프로테오폼은 단순하게 생략되었다. N 단말과 C-터미널잘린 H3.2 프로테오폼은 성장 조건에 걸쳐 다른 반응을 보였다. 심판에서 엘스비어의 허가하에 재인쇄.29. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
제시된 프로토콜은 사탕수수 잎(또는 일반적으로 식물 잎) 샘플에서 히스톤을 추출하는 방법을 설명합니다. 평균 히스톤 수율은 4-5g 의 사탕수수 잎 재료당 2-20 μg가 될 것으로 예상됩니다. 재료는 LC-MS에 의한 하류 히스톤 분석에 대해 충분히 순수합니다 (대부분 - 20 % 리보솜 단백질 오염이있는 히스톤). 샘플 변형 또는 프로토콜 전체의 잠재적 인 오류 처리 / 오류로 인해 낮은 수율을 얻을 수 있습니다. 핵 리시스 단계 전에 핵의 무결성을 유지하는 것은 중요합니다. 따라서 NLB를 추가하기 전에 공격적인 소용돌이 및 파이펫팅을 피해야 합니다. 또한, 펠릿으로부터 초중자를 제거할 때 핵의 손실이 발생할 수 있다. 파이프를 할 때 펠릿을 방해하지 않도록주의해야합니다. 트리톤 X-100 농도는 1%로 비표적 소기관을 선택적으로 리세이크하도록 최적화되었지만 핵(step 3.2)은 아니다. 다른 조직 또는 유기체에 대한 최적의 세제 농도는 다를 수 있으며 실험적으로 결정될 필요가 있습니다. 여과 과정에서 상체의 색상 변경은 엽록소의 비효율적인 방출 또는 잎의 분쇄와 같은 잠재적인 문제를 나타낼 수 있습니다. 가능하면 현미경을 사용하여 각 단계 후 엽록체의 용하 및 그대로 핵 보유를 확인하여 프로토콜을 더욱 최적화하십시오(특히 다른 조직이나 식물에 대한 프로토콜을 수정하는 경우). 이 프로토콜은 사탕수수 잎 조직으로만 테스트되었습니다. 그것은 토양에서 간섭으로 인해 가능성이 사탕수수 루트 조직에 대 한 작동 하지 않습니다. 다른 식물 잎 조직에 대한 응용 프로그램은 테스트되지 않았으며 다른 식물에 대한 응용 프로그램은 추가 최적화가 필요할 수 있습니다. ChIP-seq 응용 프로그램에 대한 핵 절연 프로토콜을 적용하기 위해, 단계 3.3.4 (NLB를 사용하기 전에) 후 추가 자당 그라데이션 밀도 분리는 세포질 오염을 감소시키는 것이 좋습니다. 광범위한 정화 단계로 인해 소량의 잔류 비 핵 물질은 LC-MS에서 그의 음색 분석에 상당한 간섭을 일으키지 않을 것으로 예상되며 펠릿으로 남을 수 있습니다.
여러 초기 시험 은 인산염 억제제의 상용 정제를 사용할 때 실패 (예를 들어, 포스STOP). 3.1.6 단계의 상체는 정제가 추출 버퍼에 사용될 때 강렬한 녹색으로 나타났다. 최종 추출물은 확인된 히스톤의 수가 적어 보였다. 우리는 정제의 독점적 인 성분이 3.4 단계 전에 핵 리시스를 일으켰을 수 있다고 의심하여 전체 히스톤 수율을 줄입니다. 고장의 또 다른 가능한 이유는 이온 교환 수지 (단계 3.4)와 히스톤 정제 단계에서 성분의 비호환성이다. 우리는 지속적으로 150 샘플 이상 후속 LC-MS에 대한 고순도 히스톤을 추출하기 위해이 프로토콜을 사용했다. 평균적으로, 우리는 "추가 억제제"(미공개 데이터)를 사용하지 않고 더 높은 수율을 얻을 수 있었습니다. 따라서 다른 목적을 위해 이 프로토콜을 수정하거나 조정할 때 새로운 억제제를 신중하게 테스트하는 것이 좋습니다. 인산화가 관심이 없는 경우, 인산억제제는 추출 버퍼에서 생략될 수 있다.
3.4의 단계는 3-4 시간 이상을 취할 수 있습니다. 2일 이내에 프로토콜을 깨는 것이 좋습니다 - 3.3 단계에서 핵 펠릿을 동결하고 2일째(또는 그 이후)에 정화를 수행하는 것이 좋습니다. 동결 해동 주기는 부분적으로 핵 용해에 도움이 될 수 있다. MWCO 필터 단계(3.4.7)는 매우 시간이 많이 소요될 수 있지만 여러 샘플을 병렬로 준비하여 쉽게 확장할 수 있습니다. 3.4 단계에서 프로테아제 억제제 정제를 첨가하지 마십시오. 많은 상용 정제는 LC-MS 분석을 방해하는 필러로서 폴리머(예: 폴리에테네 글리콜)를 함유하고 있습니다. 이 단계에서, 대부분의 다른 단백질은 제거되거나 변성되어야 하므로 효소 억제제는 중요하지 않습니다. 그러나, 여전히 분해를 최소화하기 위해 샘플을 4°C 또는 냉동 상태로 유지해야 합니다.
이 프로토콜에 따라, 히스톤은 사탕 수잎에서 성공적으로 추출할 수 있습니다. 히스톤 PTM은 LC-MS를 특징으로 할 수 있습니다. 이 방법은 도 3의예 데이터에 의해 도시된 바와 같이 상이한 생물학적 샘플(예를 들어, 다른 유전형, 식물 등)과 히스톤 PTM을 비교하기 위한 대규모 연구에 잠재적으로 적용될 수 있다. 그러나 데이터 처리는 특히 예기치 않은(또는 신규) PTM의 경우 프로테오폼을 자신 있게 할당하기 위한 광범위한 수동 분석이 필요합니다. 생물 정보학 도구의 새로운 개발은 워크 플로우를 자동화하고 대규모 연구의 처리량을 크게 증가시킬 것으로 예상됩니다. 또 다른 제한사항은 하향식 MS 방법, 현재, 쉽게 하이퍼 변형 H3의 많은 proteoforms를 구별 할 수 없다는 것입니다 (예를 들어, 모노 / 디 / 트라이 메틀라화 및 아세틸화의 여러 사이트). 단일 차원 반전 위상 LC는 다른 H3 프로테오폼을 완전히 분리할 수 없습니다. 따라서 H3의 MS2 스펙트럼은 일반적으로 여러 프로테오폼의 조각을 포함하며 쉽고 자신있게 해독할 수 없습니다. 하향식 또는 중간 다운방법(30,32,33)과 하향식을 결합하면 히스톤 H3의 특성화에 특히 도움이 될 수 있습니다. 대안적으로, 다차원 분리는 하향식MS34,35,36의깊이를 향상시키는 것으로 간주될 수 있다.
LC-MS의 Histone PTM 프로파일링은 크로마틴 수정자를 설계하기 위한 새로운 후성 유전학 마커를 발견하고 식물의 탄력성을 심각한 환경 조건으로 개선할 수 있습니다. 두 품종에서 수수와 현장에서 가뭄 조건에서 재배 된 수건을 사용하여 파일럿 연구는 잎에 선택적 히스톤 말단 클리핑 가뭄 적응 및 식물 개발(29)과관련이있을 수 있음을 나타냈다. 확인된 히스톤 마커는 ChIP-seq와 같은 보완적인 기술에 의해 표적으로 작용할 수 있다. 이러한 보완 적인 기술에서 얻은 후성 유전학 요인에 대 한 포괄적인 이해 환경 변화에 대 한 응답으로 작물에 혁신적인 솔루션을 엔지니어링 에 대 한 필수 불가결 한 것입니다.
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Disclosures
없음.
Acknowledgments
우리는 대량 분광 실험에 도움을 준 로널드 무어와 토마스 필모어, 그리고 매튜 먼로에게 데이터 증착을 해준 것에 감사드립니다. 이 연구는 미국 농무부(USDA)의 수상 번호 DE-SC0014081에 따라 수쿰(EPICON) 프로젝트에서 가뭄 대응의 후성유전학 적 통제를 통해 미국 에너지부 (DOE) 생물 및 환경 연구의 보조금에 의해 지원되었다; CRIS 2030-21430-008-00D, 그리고 공동 바이오 에너지 연구소 (JBEI)를 통해, 로렌스 버클리 국립 연구소와 DOE 사이의 DOE (계약 DE-AC02-05CH11231)가 후원하는 시설. 이 연구는 생물환경연구실이 후원하는 과학사용자 시설 DOE 사무소인 환경 분자 과학 연구소(EMSL)(grid.436923.9)를 사용하여 수행되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4L | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-5G | |
| EDTA, 500mM Solution, pH 8.0 | EMD Millipore Corp | 324504-500mL | |
| Formic Acid | Thermo Scientific | 28905 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma | G3272-100G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| Potassium phosphate, dibasic | Sigma | P3786-100G | |
| Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tablets | Roche | 5892791001 | |
| Sodium butyrate | Sigma | 303410-5G | Used for histone deacetylase inhibitor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S1888 | |
| Sodium Fluoride | Sigma | S7020-100G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 450243-10G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sucrose | Sigma | S7903-5KG | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 g | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-100ML | |
| Weak cation exchange resin, mesh 100-200 analytical (BioRex70) | Bio-Rad | 142-5842 | |
| Disposables | |||
| Chromatography column (Bio-Spin) | BIO-RAD | 732-6008 | |
| Mesh 100 filter cloth | Millipore Sigma | NY1H09000 | This is part of the Sigma kit (catalog # CELLYTPN1) for plant nuclei extraction. Similar filters with the same mesh size can be used. |
| Micropipette tips (P20, P200, P1000) | Sigma | ||
| Tube, 50mL/15mL, Centrifuge, Conical | Genesee Scientific | 28-103 | |
| Tube, Microcentrifuge, 1.5/2 mL | Sigma | ||
| Equipment | |||
| Analytical Balance | Fisher Scientific | 01-912-401 | |
| Beakers (50mL – 2L) | |||
| Microcentrifuge with cooling | Fisher Scientific | 13-690-006 | |
| Micropipettes | |||
| Swinging-bucket centrifuge with cooling | Fisher Scientific | ||
| Vortex | Fisher Scientific | 50-728-002 | |
| Water bath Sonicator | Fisher Scientific | 15-336-120 |
References
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