Summary
Protokollen er utviklet for effektivt å trekke ut intakte histoner fra sorghumbladmaterialer for profilering av histone post-translational modifikasjoner som kan tjene som potensielle epigenetiske markører for å hjelpe engineering tørkebestandige avlinger.
Abstract
Histoner tilhører en familie av høyt bevarte proteiner i eukaryoter. De pakker DNA i nukleosomer som funksjonelle enheter av kromatin. Post-translational modifikasjoner (PTMs) av histoner, som er svært dynamiske og kan legges til eller fjernes av enzymer, spille kritiske roller i å regulere genuttrykk. I planter er epigenetiske faktorer, inkludert histone-PTMer, relatert til deres adaptive respons på miljøet. Å forstå molekylære mekanismer for epigenetisk kontroll kan gi enestående muligheter for innovative bioingeniørløsninger. Her beskriver vi en protokoll for å isolere kjernene og rense histoner fra sorghum bladvev. De ekstraherte histonene kan analyseres i sine intakte former ved topp-ned massespektrometri (MS) kombinert med online omvendt fase (RP) flytende kromatografi (LC). Kombinasjoner og stoichiometry av flere PTMer på samme histone proteoform kan lett identifiseres. I tillegg kan histone hale klipping oppdages ved hjelp av den øverste ned LC-MS arbeidsflyten, og dermed gir den globale PTM-profilen til kjernehtoner (H4, H2A, H2B, H3). Vi har brukt denne protokollen tidligere for å profilere histone-PTMer fra sorghum bladvev samlet inn fra en storstilt feltstudie, med sikte på å identifisere epigenetiske markører for tørkemotstand. Protokollen kan potensielt tilpasses og optimaliseres for kromatin immunoprecipitation-sekvensering (ChIP-seq), eller for å studere histone PTMs i lignende planter.
Introduction
Den økende alvorlighetsgraden og hyppigheten av tørke forventes å påvirke produktiviteten avkornavlinger 1,2. Sorghum er en kornmat og energiavling kjent for sin eksepsjonelle evne til å tåle vannbegrensendeforhold 3,4. Vi forfølger mekanistisk forståelse av samspillet mellom tørkestress, planteutvikling og epigenetikk av sorghum [Sorghum bicolor (L.) Moench] planter. Vårt tidligere arbeid har vist sterke forbindelser mellom plante- og jordsonosfæremikrobiom i tørkeakklimatisering og respons påmolekylært nivå 5,6,7. Denne forskningen vil bane vei for å utnytte epigenetisk teknikk i å tilpasse avlinger til fremtidige klimascenarier. Som en del av arbeidet med å forstå epigenetikk, tar vi sikte på å studere proteinmarkører som påvirker genuttrykket i planteorganismen.
Histoner tilhører en svært bevart familie av proteiner i eukaryoter som pakker DNA i nukleosomer som grunnleggende enheter av kromatin. Post-translational modifikasjoner (PTMs) av histoner er dynamisk regulert for å kontrollere kromatin struktur og påvirke genuttrykk. Som andre epigenetiske faktorer, inkludert DNA-metylering, spiller histone-PTMer viktige roller i mange biologiskeprosesser 8,9. Antistoffbaserte analyser som vestlige flekker har blitt mye brukt til å identifisere og kvantifisere histone PTMer. I tillegg kan samspillet mellom histone-PTMer og DNA effektivt undersøkes av Kromatinimmunoprecipitation – sekvensering (ChIP-seq)10. I ChIP-seq er kromatin med spesifikk målrettet histone PTM beriket av antistoffer mot den spesifikke PTM. Deretter kan DNA-fragmentene frigjøres fra beriket kromatin og sekvensert. Regioner av gener som samhandler med målrettet histone PTM avsløres. Men alle disse eksperimentene er sterkt avhengige av antistoffer av høy kvalitet. For noen histonevarianter/homologer eller kombinasjoner av PTMer kan utvikling av robuste antistoffer være ekstremt utfordrende (spesielt for flere PTMer). I tillegg kan antistoffer bare utvikles hvis den målrettede histone PTM er kjent. 11 Derfor er det nødvendig med alternative metoder for ikke-målrettede, globale profilering av histone-PTMer.
Massespektrometri (MS) er en komplementær metode for å karakterisere histone-PTMer, inkludert ukjente PTMer som antistoffer ikke er tilgjengeligefor 11,12. Den veletablerte "bottom-up" MS arbeidsflyten bruker proteaser til å fordøye proteiner i små peptider før flytende kromatografi (LC) separasjon og MS-deteksjon. Fordi histoner har et stort antall grunnleggende rester (lysin og arginin), trypsin fordøyelsen (protease spesifikk for lysin og arginin) i standard nedenfra og opp arbeidsflyt kutter proteinene i svært korte peptider. De korte peptidene er teknisk vanskelige å analysere av standard LC-MS, og bevarer ikke informasjonen om tilkobling og stoichiometry av flere PTMer. Bruk av andre enzymer eller kjemisk merking for å blokkere lysiner genererer lengre peptider som er mer egnet for karakterisering av histone PTMs13,14.
Alternativt kan fordøyelsestrinnet utelates helt. I denne "top-down" tilnærming, intakt protein ioner er introdusert i MS ved elektrospray ionisering (ESI) etter online LC separasjon, noe som gir ioner av intakt histone proteoformer. I tillegg kan ioner (det vil si proteoformer) av interesse isoleres og fragmenteres i massespektrometeret for å gi sekvensionene for identifikasjon og PTM-lokalisering. Derfor har top-down MS fordelen til å bevare proteoform-nivå informasjon og fange tilkobling av flere PTMer og terminal avkortinger på samme proteoform15,16. Top-down eksperimenter kan også gi kvantitativ informasjon og gi innsikt av biomarkører på intakt protein nivå17. Her beskriver vi en protokoll for å trekke ut histone fra sorghumblad og analysere de intakte histonene ved å topp-ned LC-MS.
Eksempeldataene som vises i figur 1 og figur 2 er fra sorghumblad samlet inn i uke 2 etter planting. Selv om variasjon av utbytte forventes, er denne protokollen generelt agnostisk til bestemte utvalgsforhold. Den samme protokollen har blitt brukt til sorghum plantebladvev samlet fra 2, 3, 5, 8, 9 og 10 uker etter planting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Klargjøring av sorghum bladmateriale
MERK: Sorghum plantene ble dyrket i jord i feltet i Parlier, CA.
- Samle sorghum blader fra planter i 50 ml sentrifuge rør og umiddelbart fryse røret i flytende nitrogen. Samle bladvev ved å rive av den tredje og fjerde fullt dukket blad fra den primære tiller.
Merk: Du finner flere detaljer om felttilstand, utvalgsvekst og samling i den publiserte rapporten18. - Grind blader med flytende nitrogen og umiddelbart overføre til en sentrifuge rør.
- Oppbevar jordbladet ved -80 °C til bruk. Ta ca 4 g kryo-malt bladpulver for histonanalyse av hver prøve.
2. Klargjøring av buffere og materialer (3–4 timer)
MERK: De høye konsentrasjonsløsningene kan gjøres på forhånd og lagres til bruk. Men alle arbeidsbuffere må gjøres friske på utvinningsdagen (ved fortynning fra lager og blanding med annet innhold) og plasseres på is under prosessen. Hele forsøket skal utføres ved 4 °C med mindre annet er anbefalt.
- Forbered 2,5 M sukrose ved å oppløse 42,8 g sukrose (342,30 g/mol) i 15 ml sterilt vann på varmeplaten i en glassbeholder med kontinuerlig omrøring. Ta opp volumet til 50 ml når sukrose er oppløst helt. Oppbevar sukrose i 4 °C til bruk.
- Forbered 1 M Tris pH 8 ved å oppløse 1,576 g Tris HCl i 10 ml H2O i et 15 ml sentrifugerør. Juster pH med NaOH til 8 og sjekk med pH-papir. Oppbevar den ved 4 °C til den er brukt.
- Forbered 1 M Dithiothreitol (DTT) ved å veie 231 mg DTT (154,25 g/mol) og oppløse den i 1,5 ml sterilt vann. DTT må gjøres frisk eller bruke lagrede frosne aliquots.
- (Valgfritt) Forbered de ekstra hemmerne ved å blande tre forskjellige salter. Forbered 18,38 mg natrium orthovanadate (183,91 g/mol) i 1 ml sterilt vann, og klargjør deretter separat natrium butyrat ved å tilsette 11,008 mg natrium butyrat (110,09 g/mol) i 1 ml sterilt vann. Forbered det endelige saltet ved å tilsette 4.199 mg natriumfluorid (41,99 g/mol) i 1 ml vann. Bland de tre saltløsningene sammen i like volum som lagerløsning for "ekstra inhibitorer" (33 mM av hvert av de tre kjemikaliene).
MERK: Natrium vanadate polymeriserer ved konsentrasjoner høyere enn 0,1 mM under nøytral pH. Det anbefales å aktivere natrium vanadate å depolymerize det for maksimal effekt etter publiserte protokoller19. Alternativt er aktivert natrium vanadate kommersielt tilgjengelig. Her ble natrium vanadate ikke aktivert med vilje, slik at effekten ikke blir redusert. Aktivert natrium vanadate er ikke testet for denne protokollen ennå. - Forbered 1 M mgcl2 ved å oppløse 0,952 g vannfri magnesiumklorid (95,2 g/mol) i 10 ml H2O i et 15 ml sentrifugerør. Oppbevares 1 M MgCl2 ved 4 °C til bruk.
- Forbered 10% (v / v) Triton X-100 ved å blande 53,5 g Triton X-100 med 35 ml sterilt vann, ta opp til 50 ml vann og oppbevar den ved romtemperatur.
- Forbered 5 % Guanidine buffer pH7 (referert til som "Gdn buffer") som vil bli brukt til å balsamere harpiksen minst over natten – klargjør 0,1 M kaliumhydrogenfosfatdibasisk (K2HPO4) ved å veie 870 mg K2HPO4 og oppløses i 50 ml sterilt vann og oppbevares ved 4 °C.
- Vei 0,7 g guanidinhydroklorid og oppløses i 0,1 M K2HPO4 til et endelig volum på 14 ml. Juster pH til 7 ved å sjekke med pH-papir.
- Bløtlegg den tørre svake kationutvekslingen (WCX) harpiks i 5 % Guanidin-buffer pH 7 over natten. Fjern supernatanten og fyll på med fersk 5% Gdn buffer og suge den igjen over natten for å la harpiksen helt likevekt (til supernatanten har samme pH som den opprinnelige bufferen).
- Før du starter eksperimentet i neste avsnitt, må du blande reagensene for å lage EB1-, EB2A- og EB2B-buffer basert på tabell 1. Tilsett alle hemmere og DTT friske like før bruk.
| Reagenser | Lagerkonsentrasjon | EB1 Inn | EB2A Inn | EB2B Leilighet |
| Volum (ml) | Volum (ml) | Volum (ml) | ||
| Sukrose | 2,5 millioner | 4.4 | 1.25 | 0.5 |
| Tris HCl pH8 | 1 M (andre personer) | 0.25 | 0.125 | 0.05 |
| Dtt | 1 M (andre personer) | 0.125 | 0.0625 | 0.025 |
| H2O | 20.225 | 9.6875 | 4.375 | |
| proteasehemmer (PI) tablett | 0.5 pille | 0.5 pille | 0.5 pille | |
| Ytterligere hemmere (valgfritt) | 33mM (andre personer) | 0.25 | 0.125 | 0.05 |
| MgCl2 Leilighet | 1 M (andre personer) | 0.125 | 0.05 | |
| Triton X100 | 10% | 1.25 | ||
| Samlet volum | 25 ml | 12,5 ml | 5 ml | |
Tabell 1: Sammensetning for ekstraksjonsbuffere (EB).
- Lag Nuclei Lysis Buffer (NLB) basert på tabell 2. Forbered NLB på forhånd og oppbevares ved 4 °C til bruk. Tilsett PI tabletter frisk like før bruk på 1x (0,5 tablett per 5 ml). Se tabell 2 for bestemte volumer.
| Nlb | Lagerkonsentrasjon | Volum (ml) |
| Nacl | 5M (andre personer) | 0.4 |
| Tris HCl pH8 | 1 M (andre personer) | 0.05 |
| Triton X100 | 10% | 0.5 |
| Edta | 0,5 millioner | 0.2 |
| H2O | 3.85 | |
| PI tabletter | 0.5 pille | |
| Ytterligere hemmere (valgfritt) | 33mM (andre personer) | 0.05 |
| Samlet volum | 5 ml |
Tabell 2: Sammensetning for kjernelysbufferen (NLB).
3. Nuclei isolasjon prosedyre
MERK: Det anbefales å utføre trinn 3.1–3.3 av den første dagen (2–3 timer), lagre kjernene i NLB-bufferen ved -80 °C og gjenoppta neste dag (eller senere) for proteinrensing (4 timer). Kjernene isolasjon trinnene i denne protokollen ble tilpasset fra en sorghum ChIP-seq protokoll som brukes ved Joint Genome Institute. Ytterligere vasker og sukrose gradient separasjon kan være nødvendig for å sikre kjerner renhet for ChIP-seq applikasjoner.
- Filtrering av rusk (~ 0,5 h)
- Vei jordbladpulver ~ 4 g, slik at det forblir frosset ved å plassere på tørris eller flytende nitrogen til den er klar til bruk.
- Tilsett proteasehemmertabletter til EB1 i en endelig konsentrasjon på 0,2x (0,5 tablett for 25 ml per prøve). Bruk en miniatyr plast pestle eller en pipette tips for å pre-knuse tabletter i en mikrocentrifuge rør før du legger til buffere for å hjelpe til med oppløsning av tabletten i bufferen. For å unngå materialtap, legg til PI-nettbrettet og soniker bufferen for å oppløse tabletten.
- Tilsett 20 ml EB1 til det frosne bladpulveret, virvle forsiktig og bland dem til pulveret er helt suspendert. Fortsett å blande forsiktig i ~ 10 min.
- Filtrer gjennom mesh 100, skyll det filtrerte materialet to ganger med 2 ml EB1 hver gang.
MERK: Både filtratet og det filtrerte avfallet skal være grønt. Hvis sporing ved hjelp av et mikroskop, bør man kunne se intakte kjerner og intakte kloroplaster i filtratet på dette punktet. Flertallet av store rusk bør være fraværende / utarmet. Bland fargestoffer som metylenblå med prøve. Kjerner kan lett observeres som ~3–5 μm diameter mørk blå/aquamarine kuler når visualiseres ved hjelp av et mål på 20x, 40x og/eller 100x. I forhold til kjerner er kloroplaster like i størrelse, men grønnaktig i farge og ofte mer oval i form. Vacuoles ligner også på kjerner i størrelse og form, men de vil ikke lett ta opp Metylen blå fargestoff. - Sentrifuger det kombinerte filtratet på 3000 x g i 10 min ved 4 °C i en svingende bøtterotor til pelletrester og store subcellulære organeller, inkludert kjerner og kloroplaster.
MERK: Det anbefales å klargjøre EB2A under dette spinnet (se trinn 3.2.1). - Dekanter det overnaturlige, vær forsiktig med å ikke forstyrre pelleten.
MERK: Siden det ennå ikke er lagt til vaskemiddel, skal pelleten forbli intens grønn og supernatanten skal på det meste være blek grønn/gul.
- Lysis av ikke-målorganeller (~0,5 h)
- Forbered EB2A ved å legge proteasehemmere til en endelig konsentrasjon på 0,4x (0,5 tablett per 12,5 ml EB2A).
- Resuspend pellet fra trinn 3.1.6 i 5 ml EB2A og inkubere på is i 10 min med mild blanding.
MERK: Vaskemiddelkonsentrasjonen må optimaliseres for å fortrinnsvis lyse intakte celler og kloroplaster, men ikke kjerner. Mengden som kreves kan variere mellom organismer. Det anbefales å se etter lysis av kloroplaster og oppbevaring av intakte kjerner under mikroskop. - Sentrifuge ved 2100 x g i 15 min ved 4 °C i en svingende bøtterotor til pelletrusk og kjerner.
MERK: På dette stadiet bør supernatanten være intenst grønn, og pelleten skal være mye mindre grønn enn observert i de forrige stadiene på grunn av lysis av kloroplaster og klorofyll slippe ut i cytosolen. - Dekanter det overnaturlige, vær forsiktig med å ikke forstyrre pelleten.
- Isolering av kjerner fra gjenværende cytoplasmatiske forurensninger (~ 0,5 h)
- Forbered EB2B ved å legge proteasehemmere til en endelig konsentrasjon på 1x (0,5 tablett per 5 ml EB2B).
- Resuspend råolje kjernefysisk pellet fra trinn 3.2.3 i 2 ml EB2B.
MERK: EB2B inneholder ikke Triton X-100, så det skal ikke forekomme noe ekstra lysis på dette tidspunktet. - Sentrifuge ved 2100 x g i 15 min ved 4 °C i en svingende bøtterotor til pelletrusk og kjerner.
MERK: Små organeller og cytoplasmatiske komponenter bør ikke pellet, så de bør forbli i det overnaturlige. - Dekanter det overnaturlige, vær forsiktig med å ikke forstyrre pelleten.
- Resuspend pellet ved hjelp av 250 μL NLB (tilsett 0,5 proteasehemmer tablett frisk for 5 ml).
MERK: Målet er å gjenbruke kjernene i et minimum av NLB uten betydelig materialtap. Fordi NLB er veldig viskøs og pellets inneholder en stor mengde uoppløselig rusk, er det svært vanskelig å pipette og har en tendens til å klamre seg til innsiden av pipettespisser. Av denne grunn anbefales det å gjenbruke den samme pipettespissen når det er mulig. Hvis du er opptatt av restmateriale i en pipettespiss, bare heng pipetten fra en hylle eller et stativ i ~ 1 min for å tillate tyngdekraften å samle materiale ved åpningen av spissen. Ikke aggressivt pipette for å gjenbruke pellets. Bruk i stedet pipettespissen som rørestang til det pelleterte materialet kan aspireres inn i pipettespissen. det er helt greit for store pellet klumper å bo på dette stadiet så lenge det kan trekkes inn i en pipettespiss. - Vortex 15 s ved maks for å homogenisere og delvis gjenbruke materialet. Sonicate i 5 min ved 4 °C, og oppbevares deretter ved -80 °C.
MERK: For påfølgende trinn må du huske på at den totale mengden NLB som er lagt til, er 250 μL, men det totale tilsynelatende volumet av prøven kan være opptil dobbelt så mye på grunn av uoppløselig rusk. Prøven er frosset og tint for å bistå i lysis av kjerner.
- Kjerner lysis og histonekstraksjon (~4 h)
- Tilsett 750 μL med 5 % Gdn-buffer i den tinte prøven. Sonicate i 15 min ved 4 °C.
- Overfør prøven til et enkelt 2 ml rør og spinn 10 000 x g i 10 min ved 4 °C.
MERK: Det overnaturlige vil sannsynligvis se grønt ut. Følgende kromatografi trinn bør fjerne de fleste pigmenter fra proteinet. - Mens du venter på trinn 3.4.1 og 3.4.2, forberede kolonnen for ion utveksling kromatografi rydde opp. Skyll kromatografikolonnen med 2 ml acetonitril og 4 ml vann for å minimere kontaminering på overflaten.
- Legg 200 ~ 300 μL WCX harpiks (pre-betinget med 5% Gdn buffer) på kromatografikolonnen. La harpiksen slå seg til ro. Vask fire ganger med 1 ml 5 % Gdn buffer. Hold røret og søylen på is resten av rensetrinnene.
- Sett kromatografikolonnen på et 2 ml oppsamlingsrør. Legg supernatanten fra trinn 3.4.2 sakte på harpikssengen uten å forstyrre harpiksen (prøv å sakte falle fra siden av rørene). La løsningen strømme gjennom av tyngdekraften. Etter hvert som løsningen strømmer gjennom, laster du eluenten tilbake til toppen av kolonnen 6–8 ganger for å tillate maksimal binding til harpiksen. Deretter kaster du eluent.
- Legg 2 ml 5 % Gdnbuffer for å vaske ikke-histonproteiner av kolonnen. Kast eluent.
- Elute histoner med 1 ml 20% Gdn buffer. Samle eluent, som inneholder histonproteiner.
- Bruk 3 kDa molecular weight cut off (MWCO) spin filter (0,5 ml) til å avsalte eluent fra trinn 3.4.6. Før bruk må du laste 500 μL vaskemiddel (0,2 % maursyre i 3 % ACN) og snurre det ned to ganger for å rengjøre filteret.
MERK: Det anbefales å begynne å vaske MWCO-filteret mens du utfører harpikskromatografiskrittene for å spare tid. Følgende spinnfiltertrinn tar ~3–4 timer. - Første belastning 500 μL histoneksempel, spinn på 14 000 x g i ~25 min for å redusere volumet ned til ~100 μL. Deretter laster du ytterligere 400 μL prøve og spinner på 14 000 x g igjen i ~25 min. Legg den endelige 100 μL prøven, skyll prøverøret med 300 μL vaskevæske og legg oppløsningsvæsken inn i filteret. Spinn på 14 000 x g igjen i ~25 min.
- Legg 400 μL vaskemiddel, spinn på 14, 000 x g i ~ 25 min for å redusere volumet til ~ 100 μL eller mindre. Hver syklus reduserer saltkonsentrasjonen med en femtedel. Gjenta for ytterligere tre sykluser for å bringe guanidin konsentrasjon til ~ 0,01%. Snu filteret til et rent oppsamlingsrør og spinn på 1000 x g i 2 min. Lagre den rensede histonprøven ved -20 °C eller -80 °C for analyse.
MERK: Det anbefales å spinne lenger (30–40 min) i siste trinn for å minimere prøvevolumet for å oppnå høyere konsentrasjon. Volumet skal kunne gå ned til 50–70 μL.
4. Massespektrometri av rensede histoner
- Datainnhenting av flytende kromatografi (LC-MS)
- Estimer proteinkonsentrasjon ved bicinchoninsyre (BCA) analyse etter produsentens protokoll.
MERK: BCA kan bare gi et estimat av total proteinkonsentrasjon, men ikke kvaliteten på histonrensing. Hvis MS instrumentering ikke er lett tilgjengelig for å sjekke kvaliteten på histone rensing, kan vestlige blot brukes. Omvendt fase LC kombinert med 210 nm ultrafiolett absorbansdeteksjon som beskrevet i vår forrige rapport kan også brukes20. Kromatrammet kan sammenlignes med en kjent standard for kontroll av prøvekvaliteten. Imidlertid kan forskjellige organismer ha forskjellige elution profiler. Derfor anbefales det å bruke histonestandarder fra lignende organismer sterkt. - Koble til en C18 omvendt fase (RP) analytisk kolonne (f.eks. 3 μm 300 Å, kolonne indre diameter 75 μm, ytre diameter 360 μm, lengde 70 cm) og en C18 fellekolonne (f.eks. 3,6 μm, kolonne indre diameter 150 μm, ytre diameter 360 μm, lengde 5cm) til et dual-pumpe nanoflow flytende kromatografisystem (f.eks Waters NanoAcquity). De binære løsemidlene er A: 0,1% maursyre i vann, og B: 0,1% maursyre i acetonitril.
MERK: Det doble pumpelcset inkluderer en vaskepumpe og en gradientpumpe. Begge pumpene går gjennom to trinn i hver analyse – et fangststadium etterfulgt av det analytiske stadiet. I fangststadiet strømmer vaskepumpen inn i fellesøylen, og gradientpumpen strømmer inn i den analytiske kolonnen. I analysestadiet er fellekolonnen kombinert med den analytiske kolonnen, og gradientpumpen strømmer inn i begge kolonnene. Vaskepumpen går deretter til avfallet. - Overlappingstrinn: Konfigurer LC-metoden for første belastning på 1–2 μg histoneprøve på fellekolonnen. Avsalt prøven ved vaskepumpen ved 3 μL/min 5 % oppløsningsvæske B i 10 min. Sett den analytiske pumpen på 0,3 μL/min 5 % oppløsningsvæske B for likevekt.
- Analytisk stadium: Sett gradientpumpen (0,3 μL/min) til å starte på fra 5 % B og rampe til 30 % ved 15 min. Deretter øker til 41% B ved 100 min før en høy organisk vask opp til 95% B på slutten.
MERK: Graderingen kan optimaliseres avhengig av de ulike oppbevaringsprofilene på individuelle kolonner. Vanligvis elutnærer histoner rundt 30%-40% B på de angitte LC-forholdene. Lengre graderinger kan brukes til å øke antall MS2-spektra for å fange opp flere histoneproteoformer. - Definer dataavhengig oppkjøpsmetode på en høyoppløselig MS (f.eks. Thermo Orbitrap Fusion Lumos eller lignende) med elektronoverføringsdissosiasjonsevne (ETD). Bruk intakt proteinmodus og utfør alle nødvendige kalibreringer som foreslått av produsenten. Kritiske parametere er beskrevet nedenfor. Disse vil være spesifikke for instrumentet som brukes.
- MS1: skanneområde 600–2000 m/z, oppløsning 120k (ved m/z 200), 4 mikroskanninger, AGC-mål 1E6, maks injeksjon 50 ms.
- MS2: oppløsning 120k; 1 mikroskanne; AGC mål 1E6; dataavhengig MS/MS: vekslende ETD (25 ms reaksjonstid, maksimal injeksjonstid 500 ms) og kollisjonsdissosiasjon med høyere energi (HCD, 28 % normalisert kollisjonsenergi med ±5 % trappet energi, maks injeksjonstid 100 ms); isolasjonsvindu på 0,6 Da; prioritet på høyeste ladestater.
- Dynamisk ekskludering: 120 s tidsvindu, ±0.7 Da massevindu. Ekskluder ladestater som er lavere enn 5 og ubestemte ladestater.
- Kjør noen injeksjoner av peptid eller histone standarder på nye kolonner for å likevekt og sjekke systemet, før du kjører de faktiske prøvene. For å kjøre et stort antall prøver, legg til korte emner eller vasker mellom prøvene for å minimere overførbare. La kolonnene likevekt i 15–20 min ved startbetingelsen (5 % løsningsmiddel B) før neste prøve.
MERK: Lengre LC-graderinger og høyere maksimal injeksjonstid for MS2 kan forbedre spektralkvaliteten for å identifisere flere histoneproteoformer.
- Estimer proteinkonsentrasjon ved bicinchoninsyre (BCA) analyse etter produsentens protokoll.
- LC-MS databehandling og proteoform identifikasjon
- Få (sorghum) proteinsekvensen i FASTA-format fra JGI (https://genome.jgi.doe.gov) eller UniProt (https://www.uniprot.org/).
- Bruk MSConvert21 (http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtml) til å konvertere instrumentets rådatafiler (*.raw) til mzML-format.
- Last ned TopPIC suite22 (http://proteomics.informatics.iupui.edu/software/toppic/) for databehandling. Programmet kan kjøres i enten kommandolinjen eller gjennom det grafiske grensesnittet.
- Bruk TopFD i TopPIC-pakken til å dekonvolutere spektra fra mzML-filen fra trinn 4.2.2. Standardparameterne kan brukes. Men "forløpervinduet" (-w) må reduseres til 1 m /z fordi et smalt isolasjonsvindu brukes.
- Bruk TopPIC i TopPIC-pakken til å identifisere proteoformer. De fleste standardparameterne kan brukes. Sett spektrum- og proteoform cutoff-typen til FDR (falsk oppdagelsesfrekvens) og sett cutoff-verdien til 0,01 (1 % FDR) eller etter ønske. Sett "proteoform feiltoleranse" til 5 (Dalton). Last inn FASTA-filen fra trinn 4.2.1 og filen "*_ms2.msalign" fra trinn 4.2.4. Deretter starter du søket.
MERK: Innstillingen "proteoform feiltoleranse" kombinerer proteoformer med lignende masser (± 5 Da) som én. Dette bidrar til å redusere redundans i proteoformtellingene. Det bør imidlertid brukes med forsiktighet fordi stor toleranse vil fusjonere proteoformer med små eller ingen masseforskjeller. Denne parameteren er bare tilgjengelig i TopPIC versjon 1.3 eller nyere. - De identifiserte proteoformene kan undersøkes i "*_proteoform.csv"-filen eller visualiseres ved hjelp av Topview-modulen under mappen "*_html" i utdataene.
- Proteoformlisten som genereres fra trinnene ovenfor ved hjelp av TopPIC, kommenterer histone-PTMene som masseskift. For å lokalisere individuelle PTMer må en endringsliste inkluderes. Detaljert beskrivelse finner du i TopPIC-håndboken. Alternativt kan du gå videre til neste trinn for å utføre en komplementær dataanalyse ved hjelp av Informed-Proteomics-pakken23 (https://github.com/PNNL-Comp-Mass-Spec/Informed-Proteomics).
- Følg instruksjonene og bruk PbfGen-modulen til å konvertere instrumentets rådata til en PBF-fil. Deretter dekonvoluterer MS1-dataene ved hjelp av ProMex-modulen for å sende ut en ms1ft-fil (funksjonsliste representerer hver funksjon en unik kombinasjon av masse- og oppbevaringstid).
- Lag en fokusert FASTA for informed-proteomics ved hjelp av den identifiserte proteinlisten fra TopPIC i trinn 4.2.6.
MERK: Å søke i hele genomet ved hjelp av Informed-Proteomics med stort antall variable PTMer kan være ekstremt treg og kan føre til krasj. Derfor anbefales det å redusere størrelsen på FASTA ved bare å inkludere målproteinene. - Opprett en målrettet endringsliste for å søke etter histone-PTMer etter formatet i eksempelfilen. De vanlige PTMs å inkludere er: Lysin acetylering, lysin mono-metylering, lysin di-metylering, lysin tri-metylering, serine / trein / tyrosin fosforylering, protein N-terminal acetylering, metionin / cystein oksidasjon. For sorghum bør protein N-terminal monometylering, dimetylering og trimetylering tilsettes.
MERK: Informed-Proteomics ser bare etter PTMer som er angitt i listen. Hvis uspesifiserte PTMer finnes, kan proteoformen ikke identifiseres, eller kan feilidentifiseres til andre proteoformer. PTM-listen bør imidlertid holdes så kort som mulig for å minimere søketiden. - Utfør MSPathFinder-modulen for å identifisere proteoformer ved hjelp av filene fra trinn 4.2.8, den fokuserte FASTA fra trinn 4.2.9 og endringslisten fra trinn 4.2.10. Standardparameterne kan brukes.
- Resultatene kan visualiseres i LcMsSpectator ved å laste inn alle resultatfilene.
MERK: Andre bioinformatikkverktøy er tilgjengelige for behandling og visualisering av topp-ned-data, hver med sine egnestyrker 24,25,26,27,28. Sorghum og mange andre organismer har begrenset kjent informasjon om histone PTMs i databasen. Bruk TopPIC først til å identifisere masseskift fra PTMer. Denne analysen kan lett oppdage både kjente og ukjente PTMer. Deretter kan de oppdagede PTMs søkes på en målrettet måte enten ved å spesifisere en PTM-liste i TopPIC, eller med andre komplementære verktøy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter protokollen kan histonene trekkes ut og identifiseres ved hjelp av LC-MS-analysen. Rådata og bearbeidede resultater er tilgjengelige på MassIVE (https://massive.ucsd.edu/) via tiltredelse: MSV000085770. Basert på TopPIC-resultatene fra det representative utvalget (også tilgjengelig fra MassIVE), identifiserte vi 303 histoneproteoformer (106 H2A, 72 H2B, 103 H3 og 22 H4 proteoformer). Samtidige ribosomale proteoformer har også blitt oppdaget, vanligvis eluting tidlig i LC. De består vanligvis av ~ 20% av de identifiserte proteoformene, men overlapper ikke med histone proteoformene som eluting i det senere stadiet av LC-gradienten. Resultatene kan enkelt visualiseres med de nyeste TopPIC- eller Informed-Proteomics-pakkene. For demonstrasjon vil vi fokusere på datavisualiseringen ved hjelp av Informed-Proteomics-pakken, som kan brukes til å laste inn rå MS-filer direkte og manuelt undersøke proteoformidentifikasjoner. Vær oppmerksom på at begge programvarepakkene bruker forskjellige algoritmer og parametere. De rapporterte antall proteoformene vil ikke være identiske. Vi anbefaler at du rapporterer proteoformtellingene fra TopPIC fordi det er mer konservativt, og det anser ukjente PTMer. Informed-Proteomics-pakken har integrert databehandling og visualisering for enkel manuell validering. For organismer med godt kommenterte PC-er anbefaler vi ProSightPC24 for beste lokalisering av nettstedet. Kombinere resultatene ved hjelp av flere verktøy kan øke antall og tillit til proteoform identifikasjoner.
Etter behandling av dataene med Informed-Proteomics, kan LC-MS-funksjonskartet visualiseres i LcMsSpectator, som viser dekonvoluterte proteinmassene mot LC-oppbevaringstiden. Ved å klikke på de identifiserte proteoformene i programvaren, vil den tilknyttede funksjonen bli uthevet med et lite grønt rektangel i funksjonskartet. Store histonproteiner bør ses i bestemte regioner på kartet, noe som indikerer eksperimentets suksess. Figur 1a viser et representativt LC-MS-funksjonskart over intakte histoner. Histoneproteformer i full lengde er uthevet i de stiplede boksene. De fleste proteoformer som oppdages, kan trygt identifiseres ved hjelp av MS2-data.
Figur 1b viser zoomen i regionen med H2A- og H2B-proteoformer. De fleste av dem har N-terminal modifikasjoner av 42 Da. Denne nominelle massen tilsvarer enten trimetylering (42,05 Da) eller acetylering (42,01 Da), som vanligvis ses for histoner. Deres nøyaktige masser varierer bare med 0,04 Da og er vanskelig å skille på intakt proteinnivå (~ 2 ppm). I høyoppløselig MS2 spektra kan PTMs enkelt differensieres og bekreftes på grunn av den nedre massen av fragmentene29. I tillegg har H2A og H2B histoner flere homologer med svært lignende sekvenser som nevnt av de forskjellige UniProt-tiltredelsesnumrene i figur 1b. Igjen kan LC-MS-analyse med høy oppløsning lett identifisere og differensiere dem. To typer H2Aer ble identifisert for sorghum histoner. De 16 kDa H2A histoner i figur 1b har utvidet terminal haler i de ikke-konserverte områdene av histoner. En annen gruppe H2A histoner uten de utvidede haler (14 kDa) kan sees i figur 1c.
For H4 histoner ble N-terminal acetylering identifisert som den store PTM. Ytterligere lysin acetyler og metionin oksidasjoner kan også observeres bare ved å undersøke masseforskjellene av funksjonene i figur 1d. Vi observerte også en ukjent endring av 112,9 Da i tillegg til N-terminal acetylering (funksjonen over "3Ac" i figur 1d). Dette er sannsynligvis noen ukjente adducts fra reagensen som brukes i preparatet. Vi har tidligere oppdaget sulfationtillegg på H4, som kan tilskrives restsalter kombinert med høy grunnhet av histonproteiner. For H3 ble to proteinsekvenser identifisert H3.3 og H3.2 (figur 1e). Selv om disse to proteinsekvensene varierer med bare 4 rester (32, 42, 88 og 91), kan de fortsatt enkelt skilles i LC-MS basert på separasjon i både dimensjoner, masse og oppbevaringstid. H3 proteiner er sterkt modifisert av varierende grad av metylering og acetylering. Den høye graden av modifikasjon kan enkelt visualiseres av de tette, parallelle linjene i funksjonskartet, som er 14 Da fra hverandre. Imidlertid har tre metyleringsgrupper (14 * 3 Da) lik nominell masse til en acetylering (42 Da). Fordi disse PTMs ikke lett kan løses på intakt proteinnivå, de er referert til som "metylekvivalenter" (det vil si multipler av 14 Da; en acetylering tilsvarer tre metylekvivalenter). I figur 1eer H3 proteoformer merket i form av metylekvivalenter basert på deres intakte masse. På grunn av begrenset oppløsning av RPLC-separasjonen, er mange forskjellige H3-proteoformer sannsynligvis samtidig eluting og fragmentert i samme spektrum. Metoden som presenteres her vil bare identifisere de mest tallrike kombinasjonene av metylering og acetylering som illustrert i figur 2. For mer omfattende karakterisering av H3 er mer målrettet analyse fortsatt nødvendig30,31.
Figur 1: LC-MS-funksjonskart på intakte histoner hentet fra sorghume blader. Figuren viser LC oppbevaringstid (i minutter) vs. molekylær masse for alle oppdagede proteoformer. Loggen overflod er vist av fargeskalaen ved siden av det øverste kartet (logg 10 overflod). (a)De store histonetoppene er merket av de stiplede boksene. De fleste funksjonene utenfor boksene er avkortet histoner og ribosomale proteiner. Zoom inn visninger for hver gruppe histoner: (b) H2B og 16 kDa H2A, (c) H3, (d) 14 kDa H2A og (e) H3. UniProt-tiltredelsesnumrene er notert sammen med hver funksjon, etterfulgt av oppdagede PTMer. "Ac", "meg", "+O" indikerer henholdsvis acetylering, metylering og oksidasjon. I (b)merkes to avkortede H2A C5YZA9-proteoformer, som hadde en eller to C-terminal alanin klippet (vist som -A*, og -AA*). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Et representativt eksempel på proteoformidentifikasjon vises i figur 2 ved hjelp av MSPathfinder og visualisert i LcMsSpectator. Fragmenteringsspekteret i figur 2a ble generert ved hjelp av ETD, som gir c- og z-typeioner langs proteinets ryggrad. HCD for samme forløper kan brukes til å validere identifikasjonen, men HCD gir vanligvis begrenset sekvensdekning20. Forløperionene i forrige og neste MS1-spektra er vist i figur 2b,c, med sine matchende isotoptopper uthevet i lilla. Sekvensdekningskartet i Figur 2d kan bidra til å lokalisere eventuelle PTMer. En høy konfidensidentifikasjon bør ha de fleste fragmentene matchet, forløperion matchet og god sekvensdekning for å bidra til å lokalisere PTMer. I dette eksemplet ble en H3.2-proteoform identifisert med to PTMer – dimetylering på K9 og metylering på K27. Etter samme metode kan andre proteoformer med forskjellige PTMer og terminalavkortinger valideres manuelt.
Figur 2: Representativt eksempel på en identifisert histone H3.2 proteoform. H3.2 preteoform med sitt (a) ETD-spektrum,(b) forløperion i forrige MS1-spektrum, (c) forløperion i neste MS1-spektrum, og (d) sekvensdekningskart. C ionene fra N-terminus er merket i cyan, og z ionene fra C-terminus er i rosa. To PTMer ble identifisert og uthevet i gult i (d) med sine masseskift kommentert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Kvantitativ sammenligning av de oppdagede histoneproteoformene kan avsløre potensielle epigenetiske markører. Vi har brukt denne protokollen tidligere til 48 sorghumprøver samlet inn fra feltet ("ytterligere hemmere" ble ikke brukt i denne studien)29. To forskjellige genotyper av sorghum ble sammenlignet som svar på pre-blomstring eller etterblomstrende tørke. Ved å sammenligne den relative overfloden av proteoformene, oppdaget vi noen interessante endringer av avkortede histoneproteoformer som er spesifikke for prøveforhold som vist i figur 3. C-terminal avkorting av H4 ble observert bare i uke 3 og 9 for noen av prøvene (Figur 3a,b). For H3.2 var N-terminal avkortede proteoformer generelt mer rikelig i uke 10 (figur 3c,d). C-terminal avkortet H3.2 har derimot en tendens til å bli sett i tidligere tidspunkter (figur 3c). Enda viktigere, de to genotypene reagerte ikke på nøyaktig samme måte. H4 C-terminalen avkortet proteoformer var betydelig mer rikelig i BTx642 enn i RTx430 (figur 3b). Slike data avslører potensielle epigenetiske markører for planteutvikling og stresstoleranse som kan testes videre med andre teknikker.
Figur 3: Kvantitativ sammenligning av histone proteoformer. (a)Varmekart av histone H4 proteoformer på tvers av ulike prøver. For hver proteoform ble overfloden hentet fra ned-ned MS-data normalisert til summen av alle identifiserte H4-proteoformer i hver analyse, noe som gir den "relative overfloden". Verdiene ble deretter skalert til maksimalt hver rad for bedre å vise endringene i lav overflod proteoformer. Den skalerte relative overfloden er merket i fargetasten nederst på varmekartet. Vekstforhold er notert på den horisontale aksen (Pre: pre-blomstrende tørke, Post: etter blomstring tørke). Tre repliker er gruppert sammen og er adskilt av svarte vertikale striper fra andre forhold. For prøver merket med stjerner ble bare tekniske replikere anskaffet. Proteoformer er representert på den vertikale aksen, i formatet "startrester - sluttrester: masse; antatt modifikasjon". (b)Relativ overflod tomten av avkortet H4 proteoformer 2-99 (proteoformer uthevet i fet skrift i (a) er oppsummert) på forskjellige forhold. Nøkkelen til symbolene vises i forklaringen øverst til høyre. Fylte prikker midt i feilfeltene er gjennomsnittsverdiene. (c)Varmekart for H3.2 proteoformer og (d) overflod tomt for alle identifiserte N-terminal avkortet H3.2 er vist i samme format som for H4. Proteoformer mindre enn 8 kDa i (c) ble utelatt for enkelhet. N-terminalen og C-terminalen avkortet H3.2 proteoforms viste ulike svar på tvers av vekstforholdene. Gjengitt med tillatelse fra ELSEVIER fra ref.29. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den presenterte protokollen beskriver hvordan man trekker ut histoner fra sorghumbladprøver (eller mer generelt planteblad). Gjennomsnittlig histoneutbytte forventes å være 2–20 μg per 4–5 g sorghum bladmateriale. Materialene er tilstrekkelig rene for nedstrøms histoneanalyse av LC-MS (for det meste histoner med ~ 20% ribosomal proteinforurensning). Lavere avkastning kan oppnås på grunn av prøvevariasjoner, eller potensielle feilhåndtering/feil i hele protokollen. Opprettholde integriteten til kjernene før kjernene lysis trinn er kritisk; Derfor bør aggressiv vortexing og pipettering unngås før du legger til NLB. I tillegg kan tap av kjerner oppstå når du fjerner supernativa fra pellets. Det må tas hensyn til å ikke forstyrre pellets ved pipettering. Triton X-100 konsentrasjonen på 1% ble optimalisert for å selektivt lyse de ikke-målrettede organeller, men ikke kjernene (trinn 3.2). Optimal vaskemiddelkonsentrasjon for annet vev eller organismer kan være forskjellig og må være eksperimentelt bestemt. Fargeendring av det overnaturive under filtreringsprosessen kan indikere potensielle problemer som ineffektiv frigjøring av kloroplast eller utilstrekkelig sliping av blad. Hvis mulig, bruk et mikroskop for å se etter lysis av kloroplaster og oppbevaring av intakte kjerner etter hvert trinn for å optimalisere protokollen ytterligere (spesielt hvis du endrer protokollen for andre vev eller planter). Denne protokollen har bare blitt testet med sorghum bladvev. Det fungerer ikke for sorghum rotvev sannsynligvis på grunn av forstyrrelser fra jord. Søknad til andre plantebladvev har ikke blitt testet og søknad til ulike planter kan trenge ytterligere optimalisering. For å tilpasse kjerneiiisolasjonsprotokollen for ChIP-seq-applikasjoner anbefales det å redusere cykikikidetetthet etter trinn 3.3.4 (før bruk av NLB) for å redusere cytoplasmatisk kontaminering. På grunn av de omfattende oppryddingstrinnene forventes det ikke at små mengder gjenværende ikke-kjernematerialer vil forårsake betydelig interferens for histonanalyse i LC-MS og kan stå igjen med pelleten.
Flere innledende studier mislyktes ved bruk av kommersielle tabletter av fosfatasehemmere (f.eks. PhosSTOP). Det overnaturlige i trinn 3.1.6 syntes å være intens grønn når tablettene ble brukt i ekstraksjonsbufferen. Det endelige ekstraktet viste lavt antall identifiserte histoner. Vi mistenker at de proprietære ingrediensene i tablettene kan ha forårsaket kjernelys før trinn 3.4, noe som reduserer det totale histoneutbyttet. En annen mulig årsak til svikt er inkompatibiliteten til ingrediensene i histonrensingstrinnet med ioneutvekslingsharpiksen (trinn 3.4). Vi har brukt denne protokollen til konsekvent å trekke ut høy renhet histoner for påfølgende LC-MS over 150 prøver. I gjennomsnitt var vi i stand til å oppnå høyere utbytte uten å bruke "ekstra inhibitorer" (upubliserte data). Derfor anbefales det å forsiktig teste nye inhibitorer når du endrer eller tilpasser denne protokollen til andre formål. Hvis fosforylering ikke er av interesse, kan fosfatasehemmerne utelates i ekstraksjonsbufferne.
Trinnene i 3.4 kan ta 3-4 timer eller mer. Det anbefales å bryte protokollen om 2 dager – frys kjernepelleten fra trinn 3.3 og utføre rensingen på dag 2 (eller senere). Fryse-tine syklusen kan delvis hjelpe kjerner lysis. MWCO-filtertrinnene (3.4.7) kan være svært tidkrevende, men kan enkelt skaleres opp ved å forberede flere prøver parallelt. Ikke tilsett proteasehemmertablettene i trinn 3.4. Mange kommersielle tabletter inneholder polymerer (f.eks. polyetenlykol) som fyllstoffer, noe som vil forstyrre LC-MS-analysen. På dette trinnet, de fleste andre proteiner bør ha blitt fjernet eller denaturert, så enzymhemmere er ikke kritiske. Det er imidlertid fortsatt nødvendig å holde prøvene ved 4 °C eller frosset for å minimere nedbrytning.
Etter denne protokollen kan histoner med hell trekkes ut fra sorghume blader. Histone PTMs kan karakteriseres med LC-MS. Metoden kan potensielt brukes på store studier for å sammenligne histone-PTMer mellom ulike biologiske prøver (f.eks. forskjellige genotyper, planter dyrket under forskjellige forhold, etc.) som vist ved eksempeldataene i figur 3. Databehandling krever imidlertid fortsatt omfattende manuell analyse for sikker tildeling av proteoformer, spesielt for uventede (eller nye) PTMer. Nye utviklinger innen bioinformatikkverktøy forventes å automatisere arbeidsflyten og øke gjennomstrømningen betydelig for store studier. En annen begrensning er at den øverste ned MS-metoden, for øyeblikket, ikke lett kan skille mange proteoformer av hypermodifisert H3 (f.eks. flere steder med mono / di / tri-metlylation og acetylering). Enkeltdimensjonen reversert fase LC kan ikke helt skille de forskjellige H3 proteoformene. Derfor vil MS2-spektra av H3 vanligvis inneholde fragmenter fra flere proteoformer og kan ikke enkelt og trygt dekonvolverteres. Kombinere top-down med nedenfra og ned metoder30,32,33 kan være spesielt gunstig for karakterisering av histone H3. Alternativt kan flerdimensjonal separasjon vurderes for å forbedre dybden av ned-ned MS34,35,36.
Histone PTM profilering av LC-MS muliggjør oppdagelse av nye epigenetiske markører for å designe kromatinmodifikatorer og forbedre motstandskraften til planter til alvorlige miljøforhold. En pilotstudie ved hjelp av sorghum fra to sorter og dyrket under tørkeforhold i feltet indikerte at selektiv histone terminal klipping i blad kan være relatert til tørke akklimatisering og planteutvikling29. De identifiserte histonemarkørene kan tjene som mål ved komplementære teknikker som ChIP-seq. Omfattende forståelse av epigenetiske faktorer oppnådd fra disse komplementære teknikkene ville være uunnværlig for å konstruere innovative løsninger på avlinger som svar på miljøendringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Vi takker Ronald Moore og Thomas Fillmore for å ha hjulpet til med massespektrometrieksperimenter, og Matthew Monroe for datadeponering. Denne forskningen ble finansiert av tilskudd fra US Department of Energy (DOE) Biological and Environmental Research gjennom Epigenetic Control of Drought Response i Sorghum (EPICON) prosjektet under prisnummer DE-SC0014081, fra det amerikanske landbruksdepartementet (USDA; CRIS 2030-21430-008-00D), og gjennom Joint BioEnergy Institute (JBEI), et anlegg sponset av DOE (Contract DE-AC02-05CH11231) mellom Lawrence Berkeley National Laboratory og DOE. Forskningen ble utført ved hjelp av Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) (grid.436923.9), en DOE Office of Science User Facility sponset av Office of Biological and Environmental Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4L | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-5G | |
| EDTA, 500mM Solution, pH 8.0 | EMD Millipore Corp | 324504-500mL | |
| Formic Acid | Thermo Scientific | 28905 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma | G3272-100G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| Potassium phosphate, dibasic | Sigma | P3786-100G | |
| Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tablets | Roche | 5892791001 | |
| Sodium butyrate | Sigma | 303410-5G | Used for histone deacetylase inhibitor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S1888 | |
| Sodium Fluoride | Sigma | S7020-100G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 450243-10G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sucrose | Sigma | S7903-5KG | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 g | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-100ML | |
| Weak cation exchange resin, mesh 100-200 analytical (BioRex70) | Bio-Rad | 142-5842 | |
| Disposables | |||
| Chromatography column (Bio-Spin) | BIO-RAD | 732-6008 | |
| Mesh 100 filter cloth | Millipore Sigma | NY1H09000 | This is part of the Sigma kit (catalog # CELLYTPN1) for plant nuclei extraction. Similar filters with the same mesh size can be used. |
| Micropipette tips (P20, P200, P1000) | Sigma | ||
| Tube, 50mL/15mL, Centrifuge, Conical | Genesee Scientific | 28-103 | |
| Tube, Microcentrifuge, 1.5/2 mL | Sigma | ||
| Equipment | |||
| Analytical Balance | Fisher Scientific | 01-912-401 | |
| Beakers (50mL – 2L) | |||
| Microcentrifuge with cooling | Fisher Scientific | 13-690-006 | |
| Micropipettes | |||
| Swinging-bucket centrifuge with cooling | Fisher Scientific | ||
| Vortex | Fisher Scientific | 50-728-002 | |
| Water bath Sonicator | Fisher Scientific | 15-336-120 |
References
- Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D., Basra, S. M. A. Plant drought stress: Effects, mechanisms and management. Agronomy for Sustainable Development. , 153-188 (2009).
- Dai, A. Drought under global warming: a review. Wiley Interdisciplinary Reviews: Climate Change. 2 (1), 45-65 (2011).
- Rooney, W. L., Blumenthal, J., Bean, B., Mullet, J. E. Designing sorghum as a dedicated bioenergy feedstock. Biofuels, Bioproducts and Biorefining. 1 (2), 147-157 (2007).
- Mullet, J. E., Klein, R. R., Klein, P. E. Sorghum bicolor - an important species for comparative grass genomics and a source of beneficial genes for agriculture. Current Opinion in Plant Biology. 5 (2), 118-121 (2002).
- Xu, L., et al. Drought delays development of the sorghum root microbiome and enriches for monoderm bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4284-4293 (2018).
- Gao, C., et al. Strong succession in arbuscular mycorrhizal fungal communities. ISME Journal. 13 (1), 214-226 (2019).
- Gao, C., et al. Fungal community assembly in drought-stressed sorghum shows stochasticity, selection, and universal ecological dynamics. Nature Communications. 11 (1), (2020).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
- Yuan, L., Liu, X., Luo, M., Yang, S., Wu, K. Involvement of histone modifications in plant abiotic stress responses. Journal of Integrative Plant Biology. 55 (10), 892-901 (2013).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews. Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
- Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. Quantitative proteomic analysis of histone modifications. Chemical Reviews. 115 (6), 2376-2418 (2015).
- Moradian, A., Kalli, A., Sweredoski, M. J., Hess, S. The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).
- Sidoli, S., Garcia, B. A. Characterization of individual histone posttranslational modifications and their combinatorial patterns by mass spectrometry-based proteomics strategies. Methods in Molecular Biology. 1528, Clifton, N.J. 121-148 (2017).
- Maile, T. M., et al. Mass spectrometric quantification of histone post-translational modifications by a hybrid chemical labeling method. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 1148-1158 (2015).
- Dang, X., et al. The first pilot project of the consortium for top-down proteomics: a status report. Proteomics. 14 (10), 1130-1140 (2014).
- Schaffer, L. V., et al. Identification and quantification of proteoforms by mass spectrometry. Proteomics. 19 (10), 1800361 (2019).
- Cupp-Sutton, K. A., Wu, S. High-throughput quantitative top-down proteomics. Molecular Omics. , (2020).
- Varoquaux, N., et al. Transcriptomic analysis of field-droughted sorghum from seedling to maturity reveals biotic and metabolic responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 27124 (2019).
- Gordon, J. A. Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor. Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).
- Zhou, M., et al. Profiling changes in histone post-translational modifications by top-down mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1507, Clifton, N.J. 153-168 (2017).
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Kou, Q., Xun, L., Liu, X. TopPIC: a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization. Bioinformatics (Ocford, England). 32 (22), (2016).
- Park, J., et al. Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics. Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).
- LeDuc, R. D., et al. The C-Score: a bayesian framework to sharply improve proteoform scoring in high-throughput top down proteomics. Journal of Proteome Research. 13 (7), 3231-3240 (2014).
- Fornelli, L., et al. Advancing top-down analysis of the human proteome using a benchtop quadrupole-orbitrap mass spectrometer. Journal of Proteome Research. 16 (2), 609-618 (2017).
- Sun, R. X., et al. pTop 1.0: A high-accuracy and high-efficiency search engine for intact protein identification. Analytical Chemistry. 88 (6), 3082-3090 (2016).
- Xiao, K., Yu, F., Tian, Z. Top-down protein identification using isotopic envelope fingerprinting. Journal of Proteomics. 152, 41-47 (2017).
- Cai, W., et al. MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (2), 703-714 (2016).
- Zhou, M., et al. Top-down mass spectrometry of histone modifications in sorghum reveals potential epigenetic markers for drought acclimation. Methods. , San Diego, Calif. (2019).
- Garcia, B. A., Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Pervasive combinatorial modification of histone H3 in human cells. Nature Methods. 4 (6), 487-489 (2007).
- Zheng, Y., et al. Unabridged analysis of human histone H3 by differential top-down mass spectrometry reveals hypermethylated proteoforms from MMSET/NSD2 overexpression. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (3), 776-790 (2016).
- Garcia, B. A., et al. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).
- Holt, M. V., Wang, T., Young, N. L. One-pot quantitative top- and middle-down analysis of GluC-digested histone H4. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2514-2525 (2019).
- Tian, Z., et al. Enhanced top-down characterization of histone post-translational modifications. Genome Biology. 13 (10), (2012).
- Wang, Z., Ma, H., Smith, K., Wu, S. Two-dimensional separation using high-pH and low-pH reversed phase liquid chromatography for top-down proteomics. International Journal of Mass Spectrometry. 427, 43-51 (2018).
- Gargano, A. F. G., et al. Increasing the separation capacity of intact histone proteoforms chromatography coupling online weak cation exchange-HILIC to reversed phase LC UVPD-HRMS. Journal of Proteome Research. 17 (11), 3791-3800 (2018).
