Summary
该方案的制定是为了有效地从高梁叶材料中提取完整的组织结石，用于分析结石转化后的修饰，这些修饰可以作为潜在的表观遗传标记，以帮助工程抗旱作物。
Abstract
石质属于真核生物中高度保存的蛋白质家族。他们把DNA包装成核糖体作为染色质的功能单位。分子的转化后修改（PTM）具有高度的动态性，可以通过酶添加或去除，在调节基因表达方面发挥着关键作用。在植物中，表观遗传因素，包括层石PTM，与它们对环境的适应反应有关。了解表观遗传控制的分子机制可以为创新的生物工程解决方案带来前所未有的机遇。在这里，我们描述了一个从高梁叶组织中分离核和纯化组织色调的协议。提取的组织结石可以通过自上而下的质谱（MS）加上在线反相（RP）液体色谱（LC）以完整的形式进行分析。可以很容易地识别同一组蛋白上多个 PTM 的组合和形态学。此外，还可使用自上而下的 LC-MS 工作流检测石材尾部剪报，从而产生核心结石（H4、H2A、H2B、H3）的全球 PTM 轮廓。我们以前曾将此协议应用于从大规模实地研究中收集的高梁叶组织中分析平石 PTM，旨在识别抗旱的表观遗传标记。该方案有可能被调整和优化为色素免疫沉淀测序（ChIP-seq），或研究类似植物中的平石PTM。
Introduction
干旱的严重程度和频率的增加预计将影响谷物作物的产量1，2。高梁是一种谷物食品和能源作物，以其抗水限水的特殊能力而闻名于世。我们正在对干旱压力、植物发育和高梁（高梁双色（L.）莫恩奇植物的表观遗传学之间的相互作用进行机械理解。我们先前的工作已经证明植物和里佐圈微生物群在干旱适应和分子水平5，6，7的反应之间有很强的联系。这项研究将为利用表观遗传学工程使作物适应未来的气候情景铺平道路。作为理解表观遗传学努力的一部分，我们的目标是研究影响植物生物体内基因表达的蛋白质标记。
组蛋白属于真核生物中高度保存的蛋白质家族，将DNA包装成核糖体作为染色质的基本单位。组蛋白的转化后修改 （PTM） 受到动态调节，以控制色素结构并影响基因表达。像其他表观遗传因素，包括DNA甲基化，石质PTM在许多生物过程8，9起着重要的作用。基于抗体的检测，如西方污点，已被广泛用于识别和量化石斑点。此外，通过色素免疫沉淀——测序（ChIP-seq）10，可以有效地探究组织PTM和DNA的相互作用。在 ChIP-seq 中，具有特定靶向层蛋白 PTM 的色素通过针对该特定 PTM 的抗体而富含。然后，DNA片段可以从富集的染色质中释放并测序。与靶向层石PTM相互作用的基因区域被揭示出来。然而，所有这些实验严重依赖高质量的抗体。对于一些类结石变异/同源或PTM组合，开发强健的抗体可能极具挑战性（尤其是对于多个PTM）。此外，只有当已知目标的石块PTM时，才能开发抗体。11因此，需要采用非目标的全球平石 PTM 分析的替代方法。
质谱学 （MS） 是一种补充方法，用于描述平石 PTM 的特征，包括未知的 PTM，其中抗体不可用11，12。在液相色谱 （LC） 分离和 MS 检测之前，成熟的"自下而上"MS 工作流使用蛋白酶将蛋白质消化成小肽。由于类固酮有大量基本残留物（赖氨酸和精氨酸），标准自下而上的工作流程中的丁普辛消化（赖氨酸和精氨酸特有的蛋白酶）将蛋白质切成非常短的肽。短肽在技术上很难通过标准LC-MS进行分析，并且不保存有关多个PTM的连接性和口感学的信息。使用其他酶或化学标签来阻止赖氨酸产生更长的肽，更适合组别石PTM13，14的特征。
或者，消化步骤可以完全省略。在这种"自上而下"的方法中，完整的蛋白质离子在在线LC分离后通过电喷电离（ESI）引入MS，产生完整的石蛋白形成体的离子。此外，在质谱仪中可以分离和分割感兴趣的离子（即蛋白状体），以产生用于识别和PTM定位的序列离子。因此，自上而下的MS具有保存蛋白突起级信息和捕获多个PTM和终端截断的连接性在同一蛋白回形15，16的优势。自上而下的实验也可以提供定量信息，并提供完整的蛋白质水平17的生物标志物的见解。在这里，我们描述了一个从高梁叶中提取石块并通过自上而下LC-MS分析完整发音的协议。
图 1 和图 2中显示的示例数据来自种植后第 2 周收集的高梁叶。 虽然预期产量会有所变化，但此协议通常对特定的样本条件不可知。同样的协议已经成功地用于高梁植物叶组织收集从种植后2，3，5，8，9和10周。
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Protocol
1. 准备高梁叶材料
注：高梁植物生长在加州帕利尔的土壤中。
- 将植物中的高梁叶收集到50mL离心管中，并立即将管子冷冻在液氮中。通过从主耕种机中撕下第三和第四完全脱落的叶子来收集叶组织。
注：有关现场状况、样本生长和收集的更多详细信息，请在已发布的报告18中找到。 - 用液氮磨叶，并立即转移到离心管。
- 将地叶存放在-80°C，直到使用。取约4克低温地面叶粉，对每个样品进行石块分析。
2. 准备缓冲区和材料 （3-4 小时）
注：高浓度库存解决方案可提前制作并存储至使用。但所有工作缓冲区必须在提取当天（通过稀释库存和与其他内容混合）进行新鲜处理，并在此过程中放置在冰上。除非另有建议，否则整个实验应在4°C下进行。
- 将42.8克蔗糖（342.30克/摩尔）溶解在玻璃容器中加热板上的15毫升无菌水中，在加热板中溶解42.8克蔗糖，从而准备2.5 M蔗糖。一旦蔗糖完全溶解，将体积调高至50 mL。将蔗糖储存在4°C中直到使用。
- 在 15 mL 离心管中溶解 10 mL H2O 中的 1.576 克三叶草 HCL，制备 1 M 特里斯 pH 8。调整pH值与NaOH到8，并检查与pH纸。将其存储在4°C，直到使用。
- 通过称重 231 毫克 DTT（154.25 克/摩尔）并溶解在 1.5 mL 无菌水中，准备 1 M 二甲醇 （DTT）。DTT必须进行新鲜或使用存储的冷冻别名。
- （可选）混合三种不同的盐来准备额外的抑制剂。在1mL无菌水中准备18.38毫克矫形钠（183.91克/摩尔），然后在1mL无菌水中加入11.008毫克丁酸钠（110.09克/摩尔）单独准备丁酸钠。在1mL水中加入4.199毫克氟化钠（41.99克/摩尔），准备最后的盐。将三种盐溶液以等量混合在一起，作为"额外抑制剂"（三种化学品各33立方米）的库存溶液。
注：中性pH值下浓度高于0.1米的瓦纳达酸钠聚合物。建议在已公布的协议19后，激活瓦纳达酸钠，使其去聚合，以达到最大效力。或者，激活的瓦纳达特钠在商业上可用。在此，凡纳达酸钠不是故意激活的，因此功效不会降低。活性瓦纳达特钠尚未为本协议进行测试。 - 在 15 mL 离心管中的 H2 O 10 mL 中溶解 0.952 克无水氯化镁（95.2 克/摩尔），准备 1 M2。在4°C存储1 M MgCl2 直到使用。
- 通过将 53.5 克的 Triton X-100 与 35 mL 的无菌水混合，准备 10% （v/v） Triton X-100，将水带到 50 mL，并在室温下储存。
- 准备5%的瓜尼丁缓冲液pH7（称为"Gdn缓冲区"），用于调节树脂至少过夜 - 准备0.1 M钾磷酸二基 （K2HPO4），重量 870 毫克 K2HPO4 和溶解在 50 mL 的无菌水和存储在 4 °C.
- 重量 0.7 克盐酸瓜尼丁，溶解在 0.1 M K2HPO4 中，最终体积为 14 mL。通过检查pH纸将pH调整为7。
- 浸泡干弱 cation 交换 （WCX） 树脂在 5% 瓜尼丁缓冲 pH 7 过夜。取出超纳坦并重新填充新鲜的 5% Gdn 缓冲区，并再次浸泡过夜，让树脂完全平衡（直到超纳坦具有与原始缓冲区相同的 pH 值）。
- 在下一节开始实验之前，将试剂混合，使EB1、EB2A和EB2B缓冲基于 表1。在使用前添加所有抑制剂和DTT新鲜。
| 试剂 | 库存集中度 | EB1 | EB2A | EB2B |
| 卷 （mL） | 卷 （mL） | 卷 （mL） | ||
| 蔗糖 | 250万 | 4.4 | 1.25 | 0.5 |
| 特里斯 Hcl ph8 | 1米 | 0.25 | 0.125 | 0.05 |
| 德特 | 1米 | 0.125 | 0.0625 | 0.025 |
| H2O | 20.225 | 9.6875 | 4.375 | |
| 蛋白酶抑制剂 （PI） 平板电脑 | 0.5 丸 | 0.5 丸 | 0.5 丸 | |
| 其他抑制剂（可选） | 3300万米 | 0.25 | 0.125 | 0.05 |
| MgCl2 | 1米 | 0.125 | 0.05 | |
| 特里顿 X100 | 10% | 1.25 | ||
| 整体体积 | 25 mL | 12.5 mL | 5 mL | |
表1：提取缓冲区（EBs）的成分。
- 根据表 2制作核裂解缓冲区 （NLB）。提前准备NLB并在4°C存储，直至使用。在使用前以 1 倍（每 5 mL 0.5 片）添加新鲜 PI 平板电脑。有关特定卷，请参阅表 2。
| Nlb | 库存集中度 | 卷 （mL） |
| Nacl | 5米 | 0.4 |
| 特里斯 Hcl ph8 | 1米 | 0.05 |
| 特里顿 X100 | 10% | 0.5 |
| Edta | 50万 | 0.2 |
| H2O | 3.85 | |
| PI平板电脑 | 0.5 丸 | |
| 其他抑制剂（可选） | 3300万米 | 0.05 |
| 整体体积 | 5 mL |
表2：核裂解缓冲区（NLB）的组成。
3. 核隔离程序
注：建议执行第一天（2~3小时）的步骤3.1-3.3，将NLB缓冲区中的核保存在-80°C，第二天（或更晚）恢复蛋白质纯化（4小时）。此协议中的核分离步骤与联合基因组研究所使用的高梁ChIP-seq协议进行了调整。可能需要额外的洗涤和蔗糖梯度分离，以确保ChIP-seq应用的核纯度。
- 碎片过滤 （~0.5 小时）
- 称地叶粉~4克，确保它通过放置在干冰或液氮上保持冷冻，直到准备使用。
- 将蛋白酶抑制剂片添加到EB1中，最终浓度为0.2倍（每份样品25mL的0.5片）。在加入缓冲区之前，先使用微型塑料纠缠或移液器尖端在微中心管中预先粉碎片剂，以帮助溶解缓冲液中的片剂。为了防止材料丢失，添加 PI 平板电脑并使缓冲区声波化以溶解平板电脑。
- 将 EB1 的 20 mL 添加到冷冻的地面叶粉中，轻轻旋涡并混合，直到粉末完全悬浮。保持轻轻混合~10分钟。
- 通过网格 100 过滤，每次用 2 mL 的 EB1 冲洗过滤材料两次。
注意：过滤和过滤的碎屑都应该是绿色的。如果使用显微镜进行跟踪，此时应该能够看到过滤酸盐中完整的核和完整的叶绿体。大多数大型碎片应不存在/耗尽。将甲基蓝色等染料与样品混合。当使用 20 倍、40 倍和/或 100 倍的目标进行可视化时，Nuclei 很容易被观测到直径为 ±3-5μm 的深蓝色/海蓝宝石球体。相对于核，叶绿体的大小相似，但颜色呈绿色，通常形状更椭圆形。在尺寸和形状上也与核相似，但它们不会轻易地接受甲基蓝染料。 - 将联合过滤液在 3，000 x g 下，在 4 °C 下在摆动桶转子中持续 10 分钟，以颗粒碎片和大型亚细胞器，包括核和叶绿体。
注：建议在此旋转期间准备EB2A（见步骤3.2.1）。 - 减少超细，小心不要打扰颗粒。
注：由于尚未添加洗涤剂，颗粒应保持强烈的绿色，超纳坦最多应为淡绿色/黄色。
- 非目标细胞器的裂解 （~0.5 h）
- 通过将蛋白酶抑制剂添加到 0.4 倍（每 12.5 mL EB2A 0.5 片）的最终浓度中，准备 EB2A。
- 在EB2A的5mL中将颗粒从步骤3.1.6中重新悬生，并在冰上孵育10分钟，轻轻混合。
注：洗涤剂浓度需要优化，以优先解洗完好的细胞和叶绿体，而不是核。所需数量可能因生物体而异。建议检查叶绿体的裂解和显微镜下完整核的保留情况。 - 离心机在 2，100 x g 15 分钟， 在 4 °C 在摆动桶转子到颗粒碎片和核。
注：在这个阶段，超纳坦应该是强烈的绿色，颗粒应该比前一阶段观察到的要少得多的绿色，因为叶绿体和叶绿素释放到细胞溶胶中。 - 减少超细，小心不要打扰颗粒。
- 将核与剩余的细胞质污染物分离（~0.5小时）
- 通过将蛋白酶抑制剂添加到最终浓度为 1x（每 5 mL EB2B 0.5 片）中，制备 EB2B。
- 在EB2B的2mL中从步骤3.2.3中重新暂停粗核颗粒。
注：EB2B不包含三顿X-100，因此此时不应发生其他裂解。 - 离心机在 2，100 x g 15 分钟， 在 4 °C 在摆动桶转子到颗粒碎片和核。
注：小细胞器和细胞质成分不应颗粒状，因此它们应保持在超强状态。 - 减少超细，小心不要打扰颗粒。
- 使用 250 μL 的 NLB 重新悬生颗粒（添加 0.5 蛋白酶抑制剂片剂新鲜 5 毫升）。
注：目标是在不出现重大物质损失的情况下，将核重新悬留到最低数量的NLB中。由于 NLB 非常粘稠，颗粒中含有大量不溶性碎屑，因此很难使用移液器，并且倾向于粘在移液器尖端的内部。因此，建议尽可能重复使用相同的移液器尖端。如果涉及移液器尖端中的残留材料，只需将移液器挂在架子或架子上约 1 分钟，即可让重力在尖端打开时收集材料。不要积极使用移液器来重新悬念颗粒。相反，使用移液器尖作为搅拌棒，直到颗粒状材料可以吸进移液器尖端。即，大颗粒团保持在这个阶段是完全可以的，只要它可以被吸引到移液器尖端。 - 漩涡 15 s 最多去同质化和部分重新悬念材料。在4°C下声波5分钟，然后在-80°C存储。
注意：对于后续步骤，请记住，添加的 NLB 总量为 250 μL，但由于不溶性碎屑，样品的总表观体积可能高达两倍。样品被冷冻和解冻，以帮助核裂解。
- 核裂解和石块萃取 （~4 小时）
- 将 750 μL 的 5% Gdn 缓冲区添加到解冻的样品中。在4°C下声波15分钟。
- 将样品转移到一个2mL管中，在4°C下旋转10，000 x g 10分钟。
注意：超长者可能看起来是绿色的。以下色谱步骤应从蛋白质中去除大部分色素。 - 在等待步骤 3.4.1 和 3.4.2 时，为离子交换色谱清理准备柱。用2mL的丙酮和4mL的水冲洗色谱柱，以尽量减少表面的污染。
- 将 200~300 μL 的 WCX 树脂（预制为 5% Gdn 缓冲区）加载到色谱柱上。让树脂安定下来。用1 mL的5%Gdn缓冲区清洗4次。将管子和柱子放在冰上，以保持其余净化步骤。
- 将色谱列放在 2 mL 收集管上。将超纳坦剂从步骤 3.4.2 缓慢地加载到树脂床上，而不会干扰树脂（尝试从管子侧面慢慢掉落）。让解决方案通过重力流过。当溶液流过时，将埃卢埃特加载回柱的顶部 6-8 次，以便最大限度绑定到树脂上。然后，丢弃精灵。
- 加载 2 mL 的 5% Gdn 缓冲区， 以洗掉柱子上的非石蛋白。丢弃精灵。
- 带1 mL 20%Gdn缓冲的埃卢特石质。收集含有石蛋白的精英。
- 使用 3 kDa 分子重量切断 （MWCO） 旋转滤波器 （0.5 mL） 从步骤 3.4.6 中去盐。使用前，加载 500μL 洗涤溶剂（3% ACN 中 0.2% 的氨酸），然后旋转两次以清洁过滤器。
注：建议在执行树脂色谱仪步骤以节省时间时开始清洗 MWCO 过滤器。以下旋转滤镜步骤需要~3-4小时。 - 首次加载 500μL 的石板样品，以 14，000 x g 旋转约 25 分钟，将体积降低到 +100 μL。然后再加载 400 μL 的样品，并在 14，000 x g 下再次旋转约 25 分钟。加载最终的 100 μL 样品，用 300 μL 洗涤溶剂冲洗样品管，并将溶剂加载到过滤器中。在14，000 x g 再次旋转约25分钟。
- 装载 400 μL 洗涤溶剂，以 14，000 x g 旋转约 25 分钟，将体积降至 +100 μL 或更少。每个周期将盐浓度降低五分之一。重复三个周期，使瓜尼丁浓度达到~0.01%。将过滤器倒转到干净的收集管中，以 1，000 x g 旋转 2 分钟。将纯化的平石样品保存在 -20 °C 或 -80 °C 以供分析。
注：建议在最后一步旋转更长时间（30-40分钟），以尽量减少样本量以获得更高的浓度。音量应该可以下降到50-70μL。
4. 纯化结石的质谱
- 液相色谱质谱（LC-MS）数据采集
- 根据制造商的协议，通过双霉素酸 （BCA） 检测估计蛋白质浓度。
注：BCA只能提供蛋白质总浓度的估计值，但不能提供平石净化的质量。如果 MS 仪器不易用于检查组织石净化的质量，则可以使用西污点。逆相LC加上我们先前报告中描述的210nm紫外线吸收检测，也可以使用20。色谱可以与检查样品质量的已知标准进行比较。然而，不同的生物体可以有不同的特征。因此，强烈建议使用类似生物的组石标准。 - 连接 C18 逆相 （RP） 分析列（例如，3 μm 300+ ， 柱内径75μm，外径360μm，长度70厘米）和C18陷阱柱（如3.6 μm，柱内径150μm，外径360μm，长度5cm）到双泵纳米流液相色谱系统（如沃特斯纳米光度）。二元溶剂为水中酸A：0.1%，丙酮酸A：0.1%。
注：双泵LC包括洗涤泵和梯度泵。两个泵在每个分析中都经历两个阶段——一个捕获阶段，然后是分析阶段。在捕获阶段，洗涤泵流入陷阱列，梯度泵流入分析柱。在分析阶段，陷阱列与分析列耦合，梯度泵流入两个柱。然后，洗涤泵进入废物。 - 捕获阶段：设置 LC 方法，首先将 1-2 μg 的石板样本加载到陷阱柱上。用洗涤泵将样品以 3 μL/min 5% 溶剂 B 脱盐 10 分钟。将分析泵设置为 0.3 μL/min 5% 溶剂 B 以实现均衡。
- 分析阶段：将梯度泵（0.3 μL/min）设置为从 5% B 开始，在 15 分钟内从坡度到 30%。然后，在高有机洗涤前 100 分钟增加到 41% B，最后达到 95% B。
注：梯度可以根据单个列上的不同保留配置文件进行优化。通常，在指定的LC条件下，全长同音在30%-40%B左右。更长的梯度可用于增加MS2光谱的数量，以捕获更多的石蛋白石。 - 在具有电子传输分离 （ETD） 功能的高分辨率 MS（例如热轨道轨道轨道融合 Lumos 或类似）上设置数据依赖采集方法。使用完整的蛋白质模式，并执行制造商建议的所有必要的校准。关键参数如下所述。这些将特定于所使用的仪器。
- MS1：扫描范围600-2，000m/z，分辨率120k（ 在m/z 200），4微扫描，AGC目标1E6，最大注射50毫秒。
- MS2：分辨率120k：1 微扫描;AGC 目标 1E6;数据依赖 MS/MS：交替 ETD（25 毫秒反应时间，最大喷射时间 500 毫秒）和高能碰撞分离（HCD，28% 规范化碰撞能量，带±5% 阶梯能量，最大喷射时间 100 毫秒）：隔离窗口0.6大：最高收费状态的优先级。
- 动态排除：120年代时间窗口，±0.7大质量窗口。不包括低于 5 的收费状态和未确定的收费状态。
- 在新柱子上运行几针肽或石板标准，以平衡和检查系统，然后运行实际样品。要运行大量的样品，在样品之间添加短空白或清洗，以尽量减少结下。在下一个样品之前，让柱子在起始状态（5% 溶剂 B）下平衡 15-20 分钟。
注：MS2 的LC梯度更长，最大注射时间更长，可以提高光谱质量，以识别更多的平石蛋白石。
- 根据制造商的协议，通过双霉素酸 （BCA） 检测估计蛋白质浓度。
- LC-MS 数据处理和蛋白形识别
- 从 JGI （https://genome.jgi.doe.gov） 或 UniProt （https://www.uniprot.org/） 获得 FASTA 格式的 （高梁） 蛋白质序列。
- 使用 MSConvert21（http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtml） 将文书原始数据文件（*.raw）转换为 mzML 格式。
- 下载 TopPIC 套件22 （http://proteomics.informatics.iupui.edu/software/toppic/） 进行数据处理。程序可以在命令行中运行或通过图形界面运行。
- 使用 TopPIC 套件中的 TopFD 从步骤 4.2.2 中去除 mzML 文件中的光谱。可以使用默认参数。但是，"前体窗口"（-w）需要减少到1米/时，因为使用了狭窄的隔离窗口。
- 使用 TopPIC 在 TopPIC 套件中识别蛋白组。大多数默认参数都可以使用。将频谱和蛋白状截断类型设置为 FDR（错误发现速率），并将截止值设置为 0.01 （1% FDR）或根据需要。将"蛋白畸形错误容差"设置为 5（道尔顿）。从步骤 4.2.1 加载 FASTA 文件，从步骤 4.2.4 加载"*_ms2.ms对齐"文件。然后开始搜索。
注："蛋白畸形错误容差"设置将结合蛋白形态与类似的质量（± 5 Da）为一体。这有助于减少蛋白形态计数中的冗余。然而，它应该谨慎使用，因为大容差将合并蛋白形成体与小或没有质量差异。此参数仅适用于 TopPIC 版本 1.3 或更晚。 - 标识的蛋白组形式可以在"*_proteoform.csv"文件中检查，也可以使用输出的"*_html"文件夹下的 Topview 模块进行可视化。
- 使用 TopPIC 从上述步骤生成的蛋白形成列表会随着质量变化而注释平板 PTM。为了本地化单个 PTM，必须包含修改列表。详细描述可在 TopPIC 手册中找到。或者，继续下一步，使用"知情-质子学"包23（https://github.com/PNNL-Comp-Mass-Spec/Informed-Proteomics） 进行补充数据分析。
- 按照说明操作，使用 PbfGen 模块将仪器原始数据转换为 PBF 文件。然后使用 ProMex 模块解密 MS1 数据以输出 ms1ft 文件（功能列表，每个功能都表示质量和保留时间的独特组合）。
- 使用第 4.2.6 步 TopPIC 中标识的蛋白质列表，为信息蛋白质组学创建一个重点的 FASTA。
注：使用具有大量可变PTM的知情蛋白经济学搜索整个基因组可能非常缓慢，并可能导致崩溃。因此，建议仅包括目标蛋白质来减少FASTA的大小。 - 创建一个有针对性的修改列表，以按照示例文件中的格式搜索希石 PTM。常见的PTM包括：赖氨酸乙酰化、赖氨酸单甲基化、赖氨酸二甲基化、赖氨酸三甲基化、血清素/三甲基化、血清素/酪氨酸磷酸化、蛋白质N-终端乙酰化、甲基氨酸/西施泰因氧化。对于高梁，应添加蛋白质N端单甲基化、二甲基化和三酯化。
注：知情的蛋白经济学仅查找列表中指定的PTM。如果存在未指明的 PTM，则可能无法识别蛋白形成，也可能被错误地识别为其他蛋白状体。但是，PTM 列表应尽可能短，以最大限度地减少搜索时间。 - 执行 MSPathFinder 模块，使用步骤 4.2.8 中的文件识别蛋白组，从步骤 4.2.9 执行聚焦 FASTA，从步骤 4.2.10 中识别修改列表。可以使用默认参数。
- 结果可以通过加载所有结果文件在 LcMs 观众中可视化。
注：其他生物信息学工具可用于处理和可视化自上而下的数据，每个工具都有自己的优势24，25，26，27，28。高梁和许多其他生物在数据库中关于组石PTM的已知信息有限。首先使用 TopPIC 来识别来自 PTM 的质量变化。此分析可以很容易地发现已知和未知的 PTM。然后，可以通过在 TopPIC 中指定 PTM 列表或其他辅助工具，以有针对性的方式搜索检测到的 PTM。
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Representative Results
按照协议，可以通过LC-MS分析提取和识别组织音。原始数据和处理结果可在 MassIVE （https://massive.ucsd.edu/） 通过加入获得： MSV000085770。根据来自代表性样本的 TopPIC 结果（也可从 MassIVE 获得），我们确定了 303 个组蛋白蛋白（106 H2A、72 H2B、103 H3 和 22 个 H4 蛋白石）。还检测到共同纯化的核糖体蛋白形成物，通常在LC早期排出。它们通常由已识别的蛋白形成物的 20% 组成，但不会与 LC 梯度后期的组蛋白蛋白形式重叠。使用最新的 TopPIC 或信息质学包，可以轻松地可视化结果。为进行演示，我们将使用"知情-蛋白经济学"包专注于数据可视化，该包可用于直接加载原始 MS 文件并手动检查蛋白状物识别。请注意，两个软件包都使用不同的算法和参数。所报告的蛋白状体数量不会相同。我们建议从 TopPIC 报告蛋白仿计数，因为它更保守，并且它确实考虑未知的 PTM。 知情-蛋白组学包具有集成的数据处理和可视化，便于手动验证。对于具有良好注释的 PTM 的生物体，我们推荐 ProSightPC24 进行最佳站点定位。使用多种工具结合结果可以增加蛋白形成识别的数量和信心。
在使用知情蛋白质组学处理数据后，LC-MS 功能图可在 LcMs 观察器中可视化，该地图可根据 LC 保留时间显示分散的蛋白质质量。通过单击软件中标识的蛋白格式，相关功能将在功能图中用一个小的绿色矩形突出显示。主要的石蛋白应在地图的特定区域看到，这表明实验的成功。 图1a 显示了一个具有代表性的LC-MS功能图，其色调完好无损。在破折号框中突出显示全长石蛋白石。使用 MS2 数据可以自信地识别检测到的大多数蛋白形成。
图 1b 显示了 H2A 和 H2B 蛋白形成区域的放大。其中大多数具有42 Da的N端修改。这个名义质量对应于三酯化（42.05 Da）或乙酰化（42.01 Da），这是常见的组织结石。它们的准确质量仅相差0.04 Da，很难在完整的蛋白质水平（~2ppm）中分化。在高分辨率MS2 光谱中，由于碎片29的质量较低，PTM很容易区分和确认。此外，H2A 和 H2B 组织音具有多个同源词，序列非常相似，如 图 1b中不同的 UniProt 加入编号所指出。同样，高分辨率LC-MS分析可以很容易地识别和区分它们。确定了高梁组织酮的两种H2A类型。 图 1b 中的 16 kDa H2A 发音在石质的非保存区域扩展了终端尾部。另一组没有延长尾巴的H2A组酮（14 kDa）可以在 图1c中看到。
对于H4形体，N端乙酰化被确定为主要的PTM。额外的乙酰氨酸和甲氨酸氧化也可以通过检查图1d中特征的质量差异来观察。我们还观察到，除了 N 端乙酰化（图 1d 中的"3Ac"上方的功能）之外，还有112.9Da 的未知修改。这可能是从准备中使用的试剂的一些未知的adgent。我们以前在H4上检测到硫酸盐离子adducts，这可能归因于残留的盐和高基质的希石蛋白。对于H3，确定了两个蛋白质序列H3.3和H3.2（图1e）。虽然这两个蛋白质序列仅在 4 个残留物（32、42、88 和 91）上有所不同，但基于两个尺寸、质量和保留时间的分离，它们仍然可以在 LC-MS 中轻松区分。H3蛋白通过不同程度的甲基化和乙酰化进行大量改性。功能图中的密集平行线（相距 14 Da）可轻松地可视化高修饰度。然而，三个甲基化组（14*3 Da）具有与一个乙酰化（42 Da）相等的名义质量。由于这些PTM不能在完整的蛋白质水平下轻松解决，它们被称为"甲基当量"（即14 Da的倍数;一个乙酰化等于3个甲基当量）。在图1e中，H3蛋白形成物根据其完好的质量以甲基等价物的形式标记。由于RPLC分离的分辨率有限，许多不同的H3蛋白形成可能在同一频谱中共同分离和分散。这里介绍的方法将只识别甲基化和乙酰化最丰富的组合，如图2所示。要对H3进行更全面的定性分析，还需要30、31进行更有针对性的分析。
图1：从高梁叶中提取的完整石质上的LC-MS功能图。该图显示了LC保留时间（在几分钟内）与所有检测到的蛋白组的分子质量。日志丰度由顶部地图旁边的色阶显示（日志 10 丰度）。（a） 主要的石板山峰由破折号的盒子标记。盒子外的大部分特征是截断的石质和核糖体蛋白。每组组组的放大视图：（b） H2B 和 16 kDa H2A ，（c） H3 ，（d） 14 kDa H2A ， 和（e） H3 。UniProt 加入编号在每个功能旁边注明，然后是检测到的 PTM。 "Ac"、"me"、"+O" 分别表示乙酰化、甲基化和氧化。在（b）中，两个截断的 H2A C5YZA9 蛋白形成体被标记，其中一个或两个 C 端丙氨酸被剪切（显示为 -A*和-AA*）。 请点击这里查看此数字的较大版本。
使用 MSPathfinder 在 图 2 中显示了蛋白畸形识别的代表性示例，并在 LcMs 观众中可视化。 图 2a 中的碎裂光谱是使用 ETD 生成的，ETD 沿蛋白质骨干产生 c 型和 z 型离子。同一前体的 HCD 可用于验证识别，但 HCD 通常提供有限的序列覆盖20。前一个和下一个MS1光谱的前体离子显示在 图2b，c中，其匹配的同位素峰值以紫色突出显示。 图 2d 中的序列覆盖图可以帮助本地化任何可能的 PTM。高置信度识别应匹配大多数片段、前体离子匹配和良好的序列覆盖，以帮助本地化 PTM。在此示例中，H3.2 蛋白形成被识别为两个 PTM -K9 上的二甲基化和 K27 上的甲基化。按照相同的方法，可以手动验证具有不同 PTM 和终端截断的其他蛋白状物。
图2：已识别的结石H3.2蛋白的代表性示例。H3.2 前身及其（a）ETD 频谱（b）上一个 MS1 频谱的前体离子、下一个 MS1 频谱中的（c）前体离子和（d）序列覆盖图。N 总站的 c 离子以青色标记，C 终点站的 z 离子为粉红色。两个PTM被识别出来，并以黄色突出显示（d），其质量变化被注释。 请点击这里查看此数字的较大版本。
检测到的石蛋白的定量比较可以揭示潜在的表观遗传标记。我们以前曾将此协议应用于从该领域采集的48个高梁样本（本研究未使用"附加抑制剂"）29。对高梁的两种不同基因类型进行了比较，以应对开花前或开花后的干旱。通过比较蛋白形成体的相对丰度，我们发现了一些有趣的变化截断的石蛋白，是特定于样本条件如 图3所示。仅在第3周和第9周观察到H4的C端截断（图3a，b）。对于H3.2，N端截断的蛋白形成通常在第10周（图3c，d）更为丰富。相比之下，C 端截断 H3.2 往往出现在早期时间点（图 3c）中。更重要的是，这两种基因型的反应并不完全相同。H4 C端截断的蛋白形成在BTx642中比在RTx430（图3b）中更为丰富。这些数据揭示了植物发育的潜在表观遗传标志物和应力耐受性，可以用其他技术进一步测试。
图3：平石蛋白形成的定量比较。（a） 不同样本的平石H4蛋白形成热图。对于每个蛋白形成，从自上而下的MS数据中提取的丰度被规范化为每个分析中所有已识别的H4蛋白形成物的总和，从而产生"相对丰度"。然后将值缩放到每行的最大值，以更好地显示低丰度蛋白形态的变化。缩放的相对丰度表示在热图底部的色键中。生长条件在水平轴上注明（前：开花前干旱，后：开花后干旱）。三个复制品被分组在一起，由黑色垂直条纹与其他条件分开。对于标有星号的样品，只获得技术复制品。在垂直轴上以"起始残留物-结束残留物：质量：质量"的形式表示原状物：假定修改"。（b） 在不同条件下，截断的H4蛋白形成物2-99（以粗体突出显示的蛋白状物（a）的相对丰度图。符号的键显示在右上角的传说中。错误栏中间的填充点是平均值。（c） H3.2 蛋白石的热图和（d） 所有已识别的 N 端截断 H3.2 的丰度图以与 H4 相同的格式显示。小于 8 kDa 的蛋白形成物（c）因简单性而被省略。N 端和 C 端截断 H3.2 蛋白形成体在整个生长条件下表现出不同的响应。转载从埃尔塞维尔从参考29.请点击这里查看此数字的较大版本。
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Discussion
所提交的协议描述了如何从高梁叶（或更普遍的植物叶）样本中提取组织素。平均石材产量预计为每4-5克高梁叶材料2-20微克。这些材料足够纯净，用于LC-MS（主要是带~20%核糖体蛋白污染的组织石）的下游结石分析。由于样本变化或整个协议中可能处理不当/失败，可能会获得较低的产量。在核裂解步骤之前保持核的完整性至关重要：因此，在添加 NLB 之前，应避免攻击性涡流和管道。此外，从颗粒中取出超能剂时，核可能会丢失。在吹笛时，必须小心不要破坏颗粒。1%的Triton X-100浓度被优化，有选择地对非目标细胞体进行解洗，而不是核（步骤3.2）。其他组织或生物的最佳洗涤剂浓度可能不同，需要进行实验确定。过滤过程中超纳坦剂的颜色变化可能表明潜在的问题，如叶绿体释放效率低下或叶子研磨不足。如果可能，请使用显微镜检查叶绿体的裂解情况，并在每一步后保留完整的核，以进一步优化协议（特别是如果修改其他组织或植物的协议）。此协议仅使用高梁叶组织进行测试。它不适用于高梁根组织可能由于土壤的干扰。其他植物叶组织的应用尚未测试，应用于不同的植物可能需要额外的优化。为了适应ChIP-seq应用的核隔离方案，建议在步骤3.3.4（使用NLB之前）后进行额外的蔗糖梯度密度分离，以减少细胞质污染。由于广泛的清理步骤，少量的残余非核材料预计不会对LC-MS中的石块分析造成重大干扰，并且可能留下颗粒。
使用磷酸酶抑制剂的商业片剂（例如磷酸酯）时，几次初步试验都失败了。当片剂用于提取缓冲区时，步骤 3.1.6 中的超纳坦似乎是强烈的绿色。最后的提取物显示，已识别的结石数量很少。我们怀疑片剂中的专有成分可能在第 3.4 步之前导致核裂解，从而降低了整体石材产量。失败的另一个可能原因是平石净化步骤中的成分与离子交换树脂（步骤 3.4）不兼容。我们已使用此协议为后续的 LC-MS 超过 150 个样品持续提取高纯度组织音。平均而言，我们无需使用"附加抑制剂"（未公布的数据）就能获得更高的收益。因此，建议在修改或调整此协议以用于其他目的时谨慎测试新的抑制剂。如果磷酸化不感兴趣，磷酸酶抑制剂可以在提取缓冲液中省略。
3.4 中的步骤可能需要 3-4 小时或更多。建议在2天内打破协议，将核颗粒从步骤3.3冻结，并在第2天（或更晚）进行净化。冷冻-解冻周期可能部分帮助核裂解。MWCO 筛选步骤 （3.4.7） 可能非常耗时，但可以通过并行准备多个示例轻松扩展。不要在步骤 3.4 中添加蛋白酶抑制剂片剂。许多商用片剂含有聚合物（如聚乙二醇）作为填充物，这将干扰LC-MS分析。在这一步中，大多数其他蛋白质应该已经去除或去自然，所以酶抑制剂并不关键。但是，仍有必要将样品保持在 4 °C 或冷冻，以尽量减少退化。
按照此协议，可以成功地从高梁叶中提取石质。希斯通 PTM 可与 LC-MS 一起描述。如图3中的示例数据所示，该方法可用于比较不同生物样本（如不同的基因型、在不同条件下生长的植物等）之间的组石PTM的大规模研究。但是，数据处理仍然需要广泛的人工分析，以自信地分配蛋白样体，尤其是对于意外（或新颖的）PTM。预计生物信息学工具的新发展将实现工作流程自动化，并显著提高大规模研究的吞吐量。另一个限制是，自上而下的MS方法，目前，不能轻易区分许多超修饰H3的蛋白状物（例如，单/di/三甲酸化和乙酰化的多个位点）。单维反向相 LC 不能完全分离不同的 H3 蛋白形成。因此，H3 的 MS2 光谱通常包含多个蛋白形的片段，并且不容易和自信地分离。自上而下与自下而上或中下相结合的方法30，32，33可以特别有利于表石H3的定性。或者，多维分离可以考虑提高自上而下MS34，35，36的深度。
LC-MS 的 Histone PTM 分析能够发现用于设计染色质修饰剂的新型表观遗传标记，并提高植物对严重环境条件的复原力。一项利用高梁从两个品种和生长在干旱条件下的试验研究表明，选择性结石终端剪在叶子可能与干旱适应和植物发育有关29。已识别的结石标记可以通过ChIP-seq等辅助技术作为目标。全面了解这些补充技术获得的表观遗传因素对于为应对环境变化而为作物设计创新解决方案是必不可少的。
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Disclosures
没有。
Acknowledgments
我们感谢罗纳德·摩尔和托马斯·菲尔莫尔帮助进行质谱学实验，感谢马修·梦露的数据沉积。这项研究由美国能源部（DOE）生物和环境研究资助，通过高梁（EPICON）的表观遗传控制抗旱项目，获得美国农业部（USDA）颁发的编号为DE-SC0014081的奖项：CRIS 2030-21430-008-00D），并通过联合生物能源研究所（JBEI），由能源部（DE-AC02-05CH11231）赞助的设施劳伦斯伯克利国家实验室和能源部。这项研究是利用环境分子科学实验室（EMSL）（网格.436923.9）进行的，该实验室是由生物和环境研究办公室赞助的能源部科学用户设施办公室。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4L | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-5G | |
| EDTA, 500mM Solution, pH 8.0 | EMD Millipore Corp | 324504-500mL | |
| Formic Acid | Thermo Scientific | 28905 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma | G3272-100G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| Potassium phosphate, dibasic | Sigma | P3786-100G | |
| Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tablets | Roche | 5892791001 | |
| Sodium butyrate | Sigma | 303410-5G | Used for histone deacetylase inhibitor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S1888 | |
| Sodium Fluoride | Sigma | S7020-100G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 450243-10G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sucrose | Sigma | S7903-5KG | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 g | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-100ML | |
| Weak cation exchange resin, mesh 100-200 analytical (BioRex70) | Bio-Rad | 142-5842 | |
| Disposables | |||
| Chromatography column (Bio-Spin) | BIO-RAD | 732-6008 | |
| Mesh 100 filter cloth | Millipore Sigma | NY1H09000 | This is part of the Sigma kit (catalog # CELLYTPN1) for plant nuclei extraction. Similar filters with the same mesh size can be used. |
| Micropipette tips (P20, P200, P1000) | Sigma | ||
| Tube, 50mL/15mL, Centrifuge, Conical | Genesee Scientific | 28-103 | |
| Tube, Microcentrifuge, 1.5/2 mL | Sigma | ||
| Equipment | |||
| Analytical Balance | Fisher Scientific | 01-912-401 | |
| Beakers (50mL – 2L) | |||
| Microcentrifuge with cooling | Fisher Scientific | 13-690-006 | |
| Micropipettes | |||
| Swinging-bucket centrifuge with cooling | Fisher Scientific | ||
| Vortex | Fisher Scientific | 50-728-002 | |
| Water bath Sonicator | Fisher Scientific | 15-336-120 |
References
- Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D., Basra, S. M. A. Plant drought stress: Effects, mechanisms and management. Agronomy for Sustainable Development. , 153-188 (2009).
- Dai, A. Drought under global warming: a review. Wiley Interdisciplinary Reviews: Climate Change. 2 (1), 45-65 (2011).
- Rooney, W. L., Blumenthal, J., Bean, B., Mullet, J. E. Designing sorghum as a dedicated bioenergy feedstock. Biofuels, Bioproducts and Biorefining. 1 (2), 147-157 (2007).
- Mullet, J. E., Klein, R. R., Klein, P. E. Sorghum bicolor - an important species for comparative grass genomics and a source of beneficial genes for agriculture. Current Opinion in Plant Biology. 5 (2), 118-121 (2002).
- Xu, L., et al. Drought delays development of the sorghum root microbiome and enriches for monoderm bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4284-4293 (2018).
- Gao, C., et al. Strong succession in arbuscular mycorrhizal fungal communities. ISME Journal. 13 (1), 214-226 (2019).
- Gao, C., et al. Fungal community assembly in drought-stressed sorghum shows stochasticity, selection, and universal ecological dynamics. Nature Communications. 11 (1), (2020).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
- Yuan, L., Liu, X., Luo, M., Yang, S., Wu, K. Involvement of histone modifications in plant abiotic stress responses. Journal of Integrative Plant Biology. 55 (10), 892-901 (2013).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews. Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
- Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. Quantitative proteomic analysis of histone modifications. Chemical Reviews. 115 (6), 2376-2418 (2015).
- Moradian, A., Kalli, A., Sweredoski, M. J., Hess, S. The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).
- Sidoli, S., Garcia, B. A. Characterization of individual histone posttranslational modifications and their combinatorial patterns by mass spectrometry-based proteomics strategies. Methods in Molecular Biology. 1528, Clifton, N.J. 121-148 (2017).
- Maile, T. M., et al. Mass spectrometric quantification of histone post-translational modifications by a hybrid chemical labeling method. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 1148-1158 (2015).
- Dang, X., et al. The first pilot project of the consortium for top-down proteomics: a status report. Proteomics. 14 (10), 1130-1140 (2014).
- Schaffer, L. V., et al. Identification and quantification of proteoforms by mass spectrometry. Proteomics. 19 (10), 1800361 (2019).
- Cupp-Sutton, K. A., Wu, S. High-throughput quantitative top-down proteomics. Molecular Omics. , (2020).
- Varoquaux, N., et al. Transcriptomic analysis of field-droughted sorghum from seedling to maturity reveals biotic and metabolic responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 27124 (2019).
- Gordon, J. A. Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor. Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).
- Zhou, M., et al. Profiling changes in histone post-translational modifications by top-down mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1507, Clifton, N.J. 153-168 (2017).
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Kou, Q., Xun, L., Liu, X. TopPIC: a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization. Bioinformatics (Ocford, England). 32 (22), (2016).
- Park, J., et al. Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics. Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).
- LeDuc, R. D., et al. The C-Score: a bayesian framework to sharply improve proteoform scoring in high-throughput top down proteomics. Journal of Proteome Research. 13 (7), 3231-3240 (2014).
- Fornelli, L., et al. Advancing top-down analysis of the human proteome using a benchtop quadrupole-orbitrap mass spectrometer. Journal of Proteome Research. 16 (2), 609-618 (2017).
- Sun, R. X., et al. pTop 1.0: A high-accuracy and high-efficiency search engine for intact protein identification. Analytical Chemistry. 88 (6), 3082-3090 (2016).
- Xiao, K., Yu, F., Tian, Z. Top-down protein identification using isotopic envelope fingerprinting. Journal of Proteomics. 152, 41-47 (2017).
- Cai, W., et al. MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (2), 703-714 (2016).
- Zhou, M., et al. Top-down mass spectrometry of histone modifications in sorghum reveals potential epigenetic markers for drought acclimation. Methods. , San Diego, Calif. (2019).
- Garcia, B. A., Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Pervasive combinatorial modification of histone H3 in human cells. Nature Methods. 4 (6), 487-489 (2007).
- Zheng, Y., et al. Unabridged analysis of human histone H3 by differential top-down mass spectrometry reveals hypermethylated proteoforms from MMSET/NSD2 overexpression. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (3), 776-790 (2016).
- Garcia, B. A., et al. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).
- Holt, M. V., Wang, T., Young, N. L. One-pot quantitative top- and middle-down analysis of GluC-digested histone H4. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2514-2525 (2019).
- Tian, Z., et al. Enhanced top-down characterization of histone post-translational modifications. Genome Biology. 13 (10), (2012).
- Wang, Z., Ma, H., Smith, K., Wu, S. Two-dimensional separation using high-pH and low-pH reversed phase liquid chromatography for top-down proteomics. International Journal of Mass Spectrometry. 427, 43-51 (2018).
- Gargano, A. F. G., et al. Increasing the separation capacity of intact histone proteoforms chromatography coupling online weak cation exchange-HILIC to reversed phase LC UVPD-HRMS. Journal of Proteome Research. 17 (11), 3791-3800 (2018).
