本方案旨在从高粱叶片材料中有效提取完整组蛋白，用于分析组蛋白翻译后修饰，这些修饰可作为潜在的表观遗传标记，有助于培育抗旱作物。
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本文内容
摘要
摘要
组蛋白属于真核生物中高度保守的一类蛋白质，可将DNA包装成染色质的功能单位——核小体。组蛋白的翻译后修饰（PTMs）具有高度动态性，可由特定酶类进行添加或去除，在基因表达调控中发挥关键作用。在植物中，表观遗传因素（包括组蛋白PTMs）与其对环境的适应性响应密切相关。深入理解表观遗传调控的分子机制，将为创新性的生物工程解决方案带来前所未有的机遇。本文介绍一种从高粱叶片组织中分离细胞核并纯化组蛋白的实验方案。所提取的组蛋白可通过在线反相（RP）液相色谱（LC）耦合的自上而下质谱（MS）技术，以完整形式进行分析。该方法可有效鉴定同一组蛋白蛋白形式上多种PTMs的组合模式及化学计量关系。此外，利用自上而下的LC-MS工作流程还可检测组蛋白尾部的剪切现象，从而获得核心组蛋白（H4、H2A、H2B、H3）的全局PTM谱。我们此前已应用该方案对来自大规模田间试验的高粱叶片组织进行组蛋白PTM谱型分析，旨在鉴定与抗旱性相关的表观遗传标记。该方案还可进一步调整和优化，用于染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）或类似植物中组蛋白PTMs的研究。
引言
干旱的严重程度和发生频率日益增加，预计将影响谷类作物的产量1,2。高粱是一种重要的谷类粮食和能源作物，以其在缺水条件下出色的耐受能力而著称3,4。我们正致力于深入理解干旱胁迫、植物发育与高粱[Sorghum bicolor (L.) Moench]表观遗传学之间相互作用的分子机制。我们先前的研究已证明，在干旱适应及分子水平响应过程中，植物与其根际微生物组之间存在密切关联5,6,7。该研究将为利用表观遗传工程使作物适应未来气候条件开辟道路。作为表观遗传学研究的一部分，我们的目标是探究影响植物体内基因表达的蛋白质标记物。
组蛋白属于真核生物中高度保守的一类蛋白质，能够将DNA包装成核小体，作为染色质的基本结构单位。组蛋白的翻译后修饰（PTMs）受到动态调控，以控制染色质结构并影响基因表达。与其他表观遗传因子（如DNA甲基化）类似，组蛋白PTMs在多种生物学过程中发挥重要作用8,....
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方案
1. 准备高粱叶片材料
注意：高粱植株于加利福尼亚州帕尔利耶的田间土壤中种植。
- 将高粱叶片采集到50 mL离心管中，并立即用液氮速冻离心管。采集主分蘖上第三和第四片完全展开的叶片组织。
注意：有关田间条件、样品生长和采集的更多细节，请参见已发表的报告18。 - 用液氮研磨叶片，并立即转移至离心管中。
- 将研磨后的叶片粉末储存于-80 °C，待用。每个样品取约4 g冷冻研磨的叶片粉末用于组蛋白分析。
2. 缓冲液与材料的准备（3–4 小时）
注意：高浓度储存液可预先配制并保存至使用。但所有工作缓冲液必须在提取当天新鲜配制（通过将储存液稀释并与其他组分混合），并在操作过程中置于冰上。除非另有建议，整个实验应在 4 °C 下进行。
- 在玻璃容器中，将 42.8 g 蔗糖（342.30 g/mol）溶于 15 mL 无菌水中，置于加热板上持续搅拌并加热。待蔗糖完全溶解后，加水定容至 50 mL。将蔗糖溶液储存于 4 °C，待用。
- 在 15 mL 离心管中，将 1.576 g Tris HCl 溶于 10 mL H2O 中，配制 1 M Tris pH 8 溶液。用 NaOH 调节....
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结果
根据该方案，可使用液相色谱-质谱（LC-MS）分析提取并鉴定组蛋白。原始数据和处理后的结果可通过登录号 MSV000085770 在 MassIVE（https://massive.ucsd.edu/）获取。基于代表性样本的 TopPIC 分析结果（也可从 MassIVE 获取），我们共鉴定出 303 种组蛋白蛋白形式（包括 106 种 H2A、72 种 H2B、103 种 H3 和 22 种 H4 蛋白形式）。同时检测到共纯化的核糖体蛋白形式，通常在液相色谱早期洗脱。它们通常占已鉴定蛋白形式的约 20%，但不与液相色谱梯度后期洗脱的组蛋白蛋白形式重叠。结果可使用最新的 TopPIC 或 Informed-Proteomics 软件包轻松可视化。为便于演示，我们将重点介绍使用 Informed-Proteomics 软件包进行数据可视化，该软件包可直接加载原始质谱文件，并支持手动检查蛋白形式的鉴定结果。请注意，这两个软件包采用不同的算法和参数，因此报告的蛋白形式数量不会完全相同。我们建议报告来自 TopPIC 的蛋白形式数量，因其更为保守，且能够考虑未知的翻译后修饰（PTMs）。Informed-Proteomics 软件包集成了数据处.......
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讨论
本方案描述了如何从高粱叶片（或更广泛地说，植物叶片）样品中提取组蛋白。每4–5 g高粱叶片材料预计可获得2–20 µg的组蛋白。所得材料纯度足以用于后续的LC-MS组蛋白分析（主要为组蛋白，约含20%核糖体蛋白污染）。由于样品差异或操作过程中可能的失误或失败，产量可能较低。在细胞核裂解步骤之前维持细胞核的完整性至关重要；因此，在加入NLB之前应避免剧烈涡旋和移液。此外，在从沉淀中去除上清液时可能发生细胞核损失。移液时必须小心，避免破坏沉淀。1% Triton X-100的浓度经过优化，可选择性裂解非靶向细胞器而保持细胞核完整（步骤3.2）。其他组织或生物体的最适去垢剂浓度可能不同，需通过实验确定。过滤过程中上清液颜色变化可能提示存在问题，例如叶绿体释放不充分或叶片研磨不充分。如有可能，建议使用显微镜在每一步骤后检查叶绿体是否裂解以及完整细胞核是否保留，以进一步优化该方案（特别是在将方案修改用于其他组织或植物时）。本方案仅在高粱叶片组织中进行过测试。由于土壤干扰，该方法不适用于高粱根组织。该方案尚未在其他植物叶片组织中测试，应用于不同植物时可能需要额外优化。若要将细胞核分离方案用于ChIP-seq应用，建议在步骤3.3.4之后（使用NLB.......
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致谢
感谢 Ronald Moore 和 Thomas Fillmore 在质谱实验方面的协助，以及 Matthew Monroe 在数据提交方面的工作。本研究由美国能源部（DOE）生物与环境研究项目通过“高粱干旱响应的表观遗传调控”（EPICON）项目（资助号 DE-SC0014081）、美国农业部（USDA；CRIS 2030-21430-008-00D）以及联合生物能源研究所（JBEI）提供资助。JBEI 是由美国能源部资助（合同号 DE-AC02-05CH11231）的劳伦斯伯克利国家实验室与美国能源部之间的合作机构。本研究在环境分子科学实验室（EMSL）（grid.436923.9）开展，EMSL 是美国能源部科学办公室下属的用户设施，由生物与环境研究办公室资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙腈 | Fisher Chemical | A955-4L | |
| 二硫苏糖醇（DTT） | Sigma | 43815-5G | |
| EDTA，500 mM 溶液，pH 8.0 | EMD Millipore Corp | 324504-500mL | |
| 甲酸 | Thermo Scientific | 28905 | |
| 盐酸胍 | Sigma | G3272-100G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| 磷酸氢二钾 | Sigma | P3786-100G | |
| 蛋白酶抑制剂混合物，cOmplete 片剂 | Roche | 5892791001 | |
| 丁酸钠 | Sigma | 303410-5G | 用作组蛋白去乙酰化酶抑制剂 |
| 氯化钠（NaCl） | Sigma | S1888 | |
| 氟化钠 | Sigma | S7020-100G | 用作磷酸酶抑制剂 |
| 正钒酸钠 | Sigma | 450243-10G | 用作磷酸酶抑制剂 |
| 蔗糖 | Sigma | S7903-5KG | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 g | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-100ML | |
| 弱阳离子交换树脂，100–200 目分析级（BioRex70） | Bio-Rad | 142-5842 | |
| 一次性耗材 | |||
| 层析柱（Bio-Spin） | BIO-RAD | 732-6008 | |
| 100 目滤布 | Millipore Sigma | NY1H09000 | 此为 Sigma 植物细胞核提取试剂盒（目录号 CELLYTPN1）的组成部分。可使用相同孔径的类似滤膜。 |
| 微量移液器吸头（P20、P200、P1000） | Sigma | ||
| 离心管，50 mL / 15 mL，锥形 | Genesee Scientific | 28-103 | |
| 微量离心管，1.5 / 2 mL | Sigma | ||
| 仪器设备 | |||
| 分析天平 | Fisher Scientific | 01-912-401 | |
| 烧杯（50 mL – 2 L） | |||
| 带冷却功能的微量离心机 | Fisher Scientific | 13-690-006 | |
| 微量移液器 | |||
| 带冷却功能的摆动转子离心机 | Fisher Scientific | ||
| 涡旋振荡器 | Fisher Scientific | 50-728-002 | |
| 水浴超声仪 | Fisher Scientific | 15-336-120 |
参考文献
- Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D., Basra, S. M. A. Plant drought stress: Effects, mechanisms and management. Agronomy for Sustainable Development. , 153-188 (2009).
- Dai, A. Drought under global warming: a review. Wiley Interdisciplinary Reviews: Clim....
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重印与许可
