Summary
Il protocollo è stato sviluppato per estrarre efficacemente istoni intatti dai materiali fogliari di sorgo per la profilazione di modifiche post-tras trasunzionali istone che possono servire come potenziali marcatori epigenetici per aiutare le colture resistenti alla siccità ingegneristica.
Abstract
Gli istoni appartengono a una famiglia di proteine altamente conservate negli eucarioti. Impacchettano il DNA in nucleosomi come unità funzionali di cromatina. Le modifiche post-trascizionali (PTM) degli istoni, che sono altamente dinamiche e possono essere aggiunte o rimosse dagli enzimi, svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione dell'espressione genica. Nelle piante, i fattori epigenetici, comprese le PTT istono, sono correlati alle loro risposte adattive all'ambiente. Comprendere i meccanismi molecolari del controllo epigenetico può portare opportunità senza precedenti per soluzioni innovative di bioingegneria. Qui descriviamo un protocollo per isolare i nuclei e purificare gli istoni dal tessuto fogliare di sorgo. Gli istone estratti possono essere analizzati nelle loro forme intatte mediante spettrometria di massa dall'alto verso il basso (MS) accoppiata con cromatografia liquida in fase inversa (RP) online (LC). Le combinazioni e la stechiometria di più PTM sullo stesso proteoforma istono possono essere facilmente identificate. Inoltre, il ritaglio della coda istonale può essere rilevato utilizzando il flusso di lavoro LC-MS dall'alto verso il basso, producendo così il profilo PTM globale degli istoni principali (H4, H2A, H2B, H3). Abbiamo applicato questo protocollo in precedenza per profilare le PLOM istone dal tessuto fogliare di sorgo raccolte da uno studio sul campo su larga scala, volto a identificare marcatori epigenetici di resistenza alla siccità. Il protocollo potrebbe potenzialmente essere adattato e ottimizzato per il sequenziamento dell'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP-seq), o per lo studio delle PTM istonali in piante simili.
Introduction
Si prevede che la crescente gravità e frequenza della siccità influirà sulla produttività delle colturecerealicole 1,2. Il sorgo è una coltura alimentare ed energetica di cereali nota per la sua eccezionale capacità di resistere alle condizioni di limitazionedell'acqua 3,4. Stiamo perseguendo la comprensione meccanicistica dell'interazione tra stress da siccità, sviluppo delle piante ed epigenetica delle piante disorgo [Sorgo bicolore (L.) Moench]. Il nostro precedente lavoro ha dimostrato forti connessioni tra microbioma vegetale e rizosfera nell'acclimatazione della siccità e risposte alivello molecolare 5,6,7. Questa ricerca spianerà la strada all'utilizzo dell'ingegneria epigenetica per adattare le colture ai futuri scenari climatici. Come parte degli sforzi per comprendere l'epigenetica, miriamo a studiare marcatori proteici che hanno un impatto sull'espressione genica all'interno dell'organismo vegetale.
Gli istoni appartengono a una famiglia altamente conservata di proteine negli eucarioti che confezionano il DNA in nucleosomi come unità fondamentali di cromatina. Le modifiche post-tras traslazione (PTM) degli istoni sono regolate dinamicamente per controllare la struttura della cromatina e influenzare l'espressione genica. Come altri fattori epigenetici, tra cui la metilazione del DNA, le PTM istono svolgono ruoli importanti in molti processibiologici 8,9. Test a base di anticorpi come le macchie occidentali sono stati ampiamente utilizzati per identificare e quantificare le PTT istonali. Inoltre, l'interazione delle PTM istonali e del DNA può essere efficacemente sondata dall'immunoprecipitazione della cromatina - sequenziamento (ChIP-seq)10. In ChIP-seq, la cromatina con PTM istonale mirato specifico è arricchita da anticorpi contro quel PTM specifico. Quindi, i frammenti di DNA possono essere rilasciati dalla cromatina arricchita e sequenziati. Vengono rivelate regioni di geni che interagiscono con la PTM istono mirata. Tuttavia, tutti questi esperimenti si basano fortemente su anticorpi di alta qualità. Per alcune varianti/omologhi istoni o combinazioni di PTM, lo sviluppo di anticorpi robusti può essere estremamente impegnativo (specialmente per più PTM). Inoltre, gli anticorpi possono essere sviluppati solo se è noto il PTM istonale mirato. 11 Pertanto, sono necessari metodi alternativi per una profilazione globale non mirata delle PTM istone.
La spettrometria di massa (SM) è un metodo complementare per caratterizzare le PTT istonali, comprese le PTM sconosciute per lequali non sono disponibili anticorpi 11,12. Il consolidato flusso di lavoro MS "bottom-up" utilizza le proteasi per digerire le proteine in piccoli peptidi prima della separazione della cromatografia liquida (LC) e del rilevamento della SM. Poiché gli istoni hanno un gran numero di residui di base (lisina e arginina), la digestione della tripsina (proteasi specifica della lisina e dell'arginina) nel flusso di lavoro standard dal basso verso l'alto taglia le proteine in peptidi molto brevi. I peptidi brevi sono tecnicamente difficili da analizzare per standard LC-MS e non conservano le informazioni sulla connettività e la stechiometria di più PTM. L'uso di altri enzimi o etichettatura chimica per bloccare le lisina genera peptidi più lunghi che sono più adatti per la caratterizzazione delle PTT istono13,14.
In alternativa, il passaggio di digestione può essere completamente omesso. In questo approccio "top-down", gli ioni proteici intatti vengono introdotti nella SM mediante ionizzazione elettrospray (ESI) dopo la separazione LC online, producendo ioni delle proteoforme istone intatte. Inoltre, gli ioni (cioè le proteoforme) di interesse possono essere isolati e frammentati nello spettrometro di massa per produrre gli ioni di sequenza per l'identificazione e la localizzazione della PTM. Pertanto, l'MS dall'alto verso il basso ha il vantaggio di preservare le informazioni a livello di proteoforma e acquisire la connettività di più PTM e troncazioni terminali sullo stesso proteoforma15,16. Gli esperimenti dall'alto verso il basso possono anche fornire informazioni quantitative e offrire approfondimenti sui biomarcatori al livello proteicointatto 17. Nel presente documento, descriviamo un protocollo per estrarre l'istono dalla foglia di sorgo e analizzare gli istoni intatti dall'alto verso il basso LC-MS.
I dati di esempio riportati nella figura 1 e nella figura 2 provengono dalla foglia di sorgo raccolta alla settimana 2 dopo la semina. Sebbene sia prevista una variazione della resa, questo protocollo è generalmente indipendente da specifiche condizioni di campionamento. Lo stesso protocollo è stato utilizzato con successo per il tessuto fogliare vegetale di sorgo raccolto da 2, 3, 5, 8, 9 e 10 settimane dopo la semina.
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Protocol
1. Preparazione del materiale fogliare di sorgo
NOTA: Le piante di sorgo sono state coltivate nel suolo del settore a Parlier, CA.
- Raccogliere le foglie di sorgo dalle piante in tubi di centrifuga da 50 ml e congelare immediatamente il tubo in azoto liquido. Raccogli il tessuto fogliare strappando la terza e la quarta foglia completamente emersa dal timone primario.
NOTA: Ulteriori dettagli sulle condizioni del campo, sulla crescita del campione e sulla raccolta sono disponibili nel reportpubblicato 18. - Macinare le foglie con azoto liquido e trasferire immediatamente in un tubo di centrifuga.
- Conservare la foglia di terra a -80 °C fino all'uso. Prendi circa 4 g di polvere di foglie crio-macinate per l'analisi istono di ogni campione.
2. Preparazione di tamponi e materiali (3-4 h)
NOTA: Le soluzioni stock ad alta concentrazione possono essere realizzate in anticipo e conservate fino all'uso. Ma tutti i tamponi di lavoro devono essere resi freschi il giorno dell'estrazione (diluizione dal magazzino e miscelazione con altri contenuti) e devono essere posti sul ghiaccio durante il processo. L'intero esperimento deve essere eseguito a 4 °C, salvo diversa indicazione.
- Preparare il saccarosio di 2,5 M sciogliendo 42,8 g di saccarosio (342,30 g/mol) in 15 mL di acqua sterile su piastra termica in un contenitore di vetro con agitazione continua. Portare il volume a 50 mL una volta che il saccarosio si è completamente sciolto. Conservare il saccarosio in 4 °C fino all'uso.
- Preparare 1 M Tris pH 8 sciogliendo 1.576 g di Tris HCl in 10 mL di H2O in un tubo di centrifuga da 15 ml. Regolare il pH con NaOH a 8 e controllare con carta pH. Conservarlo a 4 °C fino all'uso.
- Preparare 1 M Ditiothreitol (DTT) pesando 231 mg di DTT (154,25 g/mol) e scioglierlo in acqua sterile da 1,5 mL. DTT deve essere reso fresco o utilizzare aliquote congelate immagazzinate.
- (Facoltativo) Preparare gli inibitori aggiuntivi mescolando tre diversi sali. Preparare 18,38 mg di ortovanato di sodio (183,91 g/mol) in 1 mL di acqua sterile, quindi preparare separatamente il butyrato di sodio aggiungendo 11,008 mg di butirato di sodio (110,09 g/mol) in 1 mL di acqua sterile. Preparare il sale finale aggiungendo 4,199 mg di fluoruro di sodio (41,99 g/mol) in 1 mL di acqua. Mescolare le tre soluzioni di sale insieme in volume uguale come soluzione stock per "inibitori aggiuntivi" (33 mM di ciascuna delle tre sostanze chimiche).
NOTA: Il vanadate di sodio polimerizza a concentrazioni superiori a 0,1 mM sotto pH neutro. Si consiglia di attivare il vanadate di sodio per depolimerizzarlo per la massima efficacia a seguito dei protocollipubblicati 19. In alternativa, il vanadato di sodio attivato è disponibile in commercio. In questo caso, il vanadate di sodio non è stato attivato intenzionalmente, quindi l'efficacia non si riduce. Il vanadate di sodio attivato non è ancora stato testato per questo protocollo. - Preparare 1 M di MgCl2 sciogliendo 0,952 g di cloruro di magnesio anidro (95,2 g/mol) in 10 ml di H2O in un tubo di centrifuga da 15 ml. Conservare 1 M MgCl2 a 4 °C fino all'uso.
- Preparare il 10% (v/v) Triton X-100 mescolando 53,5 g di Tritone X-100 con 35 mL di acqua sterile, portare fino a 50 mL con acqua e conservarlo a temperatura ambiente.
- Preparare il 5% di guanidina tampone pH7 (indicato come "tampone Gdn") che verrà utilizzato per condizionare la resina almeno durante la notte – preparare 0,1 M di dibasico di fosfato di idrogeno di potassio (K2HPO4)pesando 870 mg di K2HPO4 e sciogliendolo in 50 mL di acqua sterile e conservare a 4 °C.
- Pesare 0,7 g di cloridrato di guanidina e sciogliere in 0,1 M K2HPO4 ad un volume finale di 14 mL. Regolare il pH a 7 controllando con carta pH.
- Immergere la resina a secco a debole scambio di cationi (WCX) nel 5% di guanidina tampone pH 7 durante la notte. Rimuovere il supernatante e ricaricare con un tampone fresco del 5% di Gdn e immergerlo di nuovo durante la notte per lasciare che la resina equilibra completamente (fino a quando il supernatante non ha lo stesso pH del tampone originale).
- Prima di iniziare l'esperimento nella sezione successiva, mescolare i reagenti per creare il buffer EB1, EB2A ed EB2B basato sulla tabella 1. Aggiungere tutti gli inibitori e DTT freschi poco prima dell'uso.
| Reagenti | Concentrazione di scorte | EB1 | EB2A | EB2B |
| Volume (mL) | Volume (mL) | Volume (mL) | ||
| Saccarosio | 2,5 milioni di ecu | 4.4 | 1.25 | 0.5 |
| Tris HCl pH8 | 1M | 0.25 | 0.125 | 0.05 |
| Dtt | 1M | 0.125 | 0.0625 | 0.025 |
| H2O | 20.225 | 9.6875 | 4.375 | |
| compressa inibitore della proteasi (PI) | 0,5 pillola | 0,5 pillola | 0,5 pillola | |
| Inibitori aggiuntivi (facoltativo) | 33mM | 0.25 | 0.125 | 0.05 |
| MgCl2 | 1M | 0.125 | 0.05 | |
| Tritone X100 | 10% | 1.25 | ||
| Volume complessivo | 25 mL | 12,5 mL | 5 mL | |
Tabella 1: Composizione dei tamponi di estrazione (RB).
- Rendere il buffer di analisi dei nuclei (NLB) basato sulla tabella 2. Preparare bilanciamento carico di rete in anticipo e conservare a 4 °C fino all'uso. Aggiungere compresse PI fresche poco prima dell'uso a 1x (0,5 compresse per 5 mL). Cfr. tabella 2 per volumi specifici.
| Nlb | Concentrazione di scorte | Volume (mL) |
| Nacl | 5M | 0.4 |
| Tris HCl pH8 | 1M | 0.05 |
| Tritone X100 | 10% | 0.5 |
| Edta | 0,5 milioni di ecu | 0.2 |
| H2O | 3.85 | |
| Tablet PI | 0,5 pillola | |
| Inibitori aggiuntivi (facoltativo) | 33mM | 0.05 |
| Volume complessivo | 5 mL |
Tabella 2: Composizione della tampone di analisi dei nuclei (NLB).
3. Procedura di isolamento dei nuclei
NOTA: Si consiglia di eseguire i passaggi 3.1–3.3 del primo giorno (2-3 h), salvare i nuclei in tampone NLB a -80 °C e riprendere il giorno successivo (o più tardi) per la purificazione delle proteine (4 h). Le fasi di isolamento dei nuclei in questo protocollo sono state adattate da un protocollo ChIP-seq di sorgo utilizzato presso il Joint Genome Institute. Possono essere necessari lavaggi aggiuntivi e separazione del gradiente di saccarosio per garantire la purezza dei nuclei per le applicazioni chIP-seq.
- Filtrazione dei detriti (~0,5 h)
- Pesare la polvere di foglie macinate ~ 4 g, assicurando che rimanga congelata posizionando sul ghiaccio secco o sull'azoto liquido fino a quando non è pronto per l'uso.
- Aggiungere compresse inibitorie della proteasi a EB1 a una concentrazione finale di 0,2x (0,5 compresse per 25 mL per campione). Utilizzare un pestello di plastica in miniatura o una punta di pipetta per pre-schiacciare le compresse in un tubo di microcentrifugo prima di aggiungere ai tamponi per aiutare nella dissoluzione della compressa nel tampone. Per evitare la perdita di materiale, aggiungere la compressa PI e sonicare il buffer per sciogliere la compressa.
- Aggiungere 20 mL di EB1 alla polvere di foglie macinate congelate, delicatamente vortice e mescolarli fino a quando la polvere non è completamente sospesa. Continuare a mescolare delicatamente per ~ 10 minuti.
- Filtrare attraverso la rete 100, risciacquando il materiale filtrato due volte con 2 mL di EB1 ogni volta.
NOTA: Sia il filtrato che i detriti filtrati devono essere verdi. Se si traccia utilizzando un microscopio, si dovrebbe essere in grado di vedere nuclei intatti e cloroplasti intatti nel filtrato a questo punto. La maggior parte dei detriti di grandi dimensioni dovrebbe essere assente / impoverita. Mescolare coloranti come il blu di metilene con il campione. I nuclei sono facilmente osservabili come sfere blu scuro/acquamarina di circa 3-5 μm di diametro quando vengono visualizzati usando un obiettivo 20x, 40x e/o 100x. Rispetto ai nuclei, i cloroplasti sono di dimensioni simili, ma di colore verdastro e spesso di forma più ovale. I vacuoli sono anche simili ai nuclei per dimensioni e forma, ma non prenderanno prontamente il colorante blu di metilene. - Centrifugare il filtrato combinato a 3.000 x g per 10 min a 4 °C in un rotore a secchio oscillante per pellet debris e grandi organelli subcellulari, inclusi nuclei e cloroplasti.
NOTA: Si consiglia di preparare EB2A durante questo giro (vedere il passaggio 3.2.1). - Decantare il supernatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet.
NOTA: Poiché non è stato ancora aggiunto alcun detergente, il pellet deve rimanere verde intenso e il supernatante deve essere, al massimo, verde pallido / giallo.
- Llisi degli organelli non bersaglio (~0,5 h)
- Preparare EB2A aggiungendo inibitori della proteasi a una concentrazione finale di 0,4x (0,5 compresse per 12,5 mL EB2A).
- Rimorsi il pellet dal passo 3.1.6 in 5 mL di EB2A e incubare sul ghiaccio per 10 minuti con miscelazione delicata.
NOTA: La concentrazione di detergenti deve essere ottimizzata per lyse preferenzialmente cellule intatte e cloroplasti ma non nuclei. La quantità richiesta può variare tra gli organismi. Si raccomanda di verificare la lisi dei cloroplasti e la ritenzione di nuclei intatti al microscopio. - Centrifuga a 2.100 x g per 15 min a 4 °C in un rotore a secchio oscillante per pellet detriti e nuclei.
NOTA: In questa fase, il supernatante dovrebbe essere intensamente verde e il pellet dovrebbe essere molto meno verde di quanto osservato nelle fasi precedenti a causa dellalisi dei cloroplasti e del rilascio di clorofilla nel citosol. - Decantare il supernatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet.
- Isolamento dei nuclei dai contaminanti citoplasmatici rimanenti (~0,5 h)
- Preparare EB2B aggiungendo inibitori della proteasi a una concentrazione finale di 1x (0,5 compresse per 5 mL EB2B).
- Resuspend pellet nucleare grezzo dalla fase 3.2.3 in 2 mL di EB2B.
NOTA: EB2B non contiene Tritone X-100, quindi a questo punto non dovrebbe verificarsi alcunalisi aggiuntiva. - Centrifuga a 2.100 x g per 15 min a 4 °C in un rotore a secchio oscillante per pellet detriti e nuclei.
NOTA: Piccoli organelli e componenti citoplasmatici non devono pellet, quindi dovrebbero rimanere nel supernatante. - Decantare il supernatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet.
- Rimescolare il pellet utilizzando 250 μL di NLB (aggiungere 0,5 compressa inibitore della proteasi fresca per 5 mL).
NOTA: L'obiettivo è quello di rimosocciare i nuclei in una quantità minima di NLB senza perdite materiali significative. Poiché nlb è molto viscoso e il pellet contiene una grande quantità di detriti insolubili, è molto difficile pipettare e tende ad aggrapparsi all'interno delle punte delle pipette. Per questo motivo, si consiglia di riutilizzare la stessa punta della pipetta quando possibile. Se si tratta di materiale residuo in una punta di pipetta, è sufficiente appendere la pipetta da un ripiano o da un rack per ~ 1 minuto per consentire alla gravità di raccogliere il materiale all'apertura della punta. Non pipettare aggressivamente per rimorsi i pellet. Utilizzare invece la punta della pipetta come asta di agitazione fino a quando il materiale pelletato non può essere aspirato nella punta della pipetta. vale a dire, va benissimo che grandi grumi di pellet rimangano in questa fase purché possano essere disegnati in una punta di pipetta. - Vortice 15 s al massimo per omogeneizzare e resospensare parzialmente il materiale. Sonicare per 5 minuti a 4 °C, quindi conservare a -80 °C.
NOTA: Per i passaggi successivi, tenere presente che la quantità totale di BILANCIAMENTO carico di rete aggiunto è di 250 μL, ma il volume apparente totale del campione può essere fino al doppio a causa di detriti insolubili. Il campione viene congelato e scongelato per facilitare la lisi dei nuclei.
- Lisi dei nuclei ed estrazione dell'istone (~4 h)
- Aggiungere 750 μL di tampone Gdn al 5% di tampone di scongelato. Sonicare per 15 minuti a 4 °C.
- Trasferire il campione in un singolo tubo da 2 ml e girare 10.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
NOTA: Il supernatante probabilmente avrà un aspetto verde. I seguenti passaggi di cromatografia dovrebbero rimuovere la maggior parte dei pigmenti dalla proteina. - In attesa dei gradini 3.4.1 e 3.4.2, preparare la colonna per la pulizia della cromatografia a scambio ionico. Risciacquare la colonna cromatografica con 2 mL di acetonitrile e 4 mL di acqua per ridurre al minimo la contaminazione in superficie.
- Caricare 200~300 μL di resina WCX (precondidenne con tampone Gdn al 5%) sulla colonna cromatografica. Lascia depositare la resina. Lavare quattro volte con 1 mL di tampone Gdn al 5%. Tenere il tubo e la colonna sul ghiaccio per il resto dei passaggi di purificazione.
- Metti la colonna cromatografica su un tubo di raccolta da 2 ml. Caricare lentamente il supernatante dal passaggio 3.4.2 sul letto di resina senza interrompere la resina (provare a cadere lentamente dal lato dei tubi). Lascia che la soluzione fluisa per gravità. Mentre la soluzione scorre, caricare l'eluente nella parte superiore della colonna 6-8 volte per consentire il massimo legame con la resina. Quindi, scartare l'eluente.
- Caricare 2 mL di tampone Gdn al 5% per lavare le proteine non istone dalla colonna. Scartare l'eluente.
- Elute istoni con 1 mL 20% Gdn buffer. Raccogli l'eluente, che contiene proteine istono.
- Utilizzare il filtro di spin mwco (3 kDa molecular weight cut off) (0,5 mL) per disaltare l'eluente dal passo 3.4.6. Prima dell'uso, caricare 500 μL di solvente da lavaggio (0,2% di acido formico nel 3% di ACN) e farlo girare due volte per pulire il filtro.
NOTA: Si consiglia di iniziare a lavare il filtro MWCO durante l'esecuzione dei passaggi di cromatografia della resina per risparmiare tempo. I seguenti passaggi del filtro di rotazione fanno ~3-4 h. - Primo carico 500 μL di campione di istono, girare a 14.000 x g per ~25 min per ridurre il volume fino a ~100 μL. Quindi caricare altri 400 μL di campione e girare di nuovo a 14.000 x g per ~ 25 minuti. Caricare gli ultimi 100 μL del campione, sciacquare il tubo del campione con solvente da lavaggio da 300 μL e caricare il solvente nel filtro. Gira di nuovo a 14.000 x g per ~ 25 minuti.
- Caricare 400 μL di solvente da lavaggio, girare a 14.000 x g per ~25 min per ridurre il volume a ~100 μL o meno. Ogni ciclo riduce la concentrazione di sale di un quinto. Ripetere per altri tre cicli per portare la concentrazione di guanidina a ~0,01%. Invertire il filtro in un tubo di raccolta pulito e ruotare a 1.000 x g per 2 minuti. Salvare il campione di istone purificato a -20 °C o -80 °C per l'analisi.
NOTA: Si consiglia di ruotare più a lungo (30-40 min) all'ultimo passaggio per ridurre al minimo il volume del campione per ottenere una concentrazione più elevata. Il volume dovrebbe essere in grado di scendere a 50-70 μL.
4. Spettrometria di massa degli istoni purificati
- Acquisizione dati spettrometria di massa cromatografica liquida (LC-MS)
- Stimare la concentrazione proteica mediante saggio di acido bicinchoninico (BCA) seguendo il protocollo del produttore.
NOTA: BCA può fornire solo una stima della concentrazione totale di proteine, ma non la qualità della purificazione dell'istone. Se la strumentazione MS non è prontamente disponibile per controllare la qualità della purificazione dell'istone, è possibile utilizzare la macchia occidentale. LC in fase invertita abbinato al rilevamento dell'assorbanza ultravioletta di 210 nm come descritto nel nostro rapporto precedente può essere utilizzatoanche 20. Il cromatogramma può essere confrontato con uno standard noto per il controllo della qualità del campione. Tuttavia, organismi diversi possono avere diversi profili di eluizione. Pertanto, è altamente raccomandato l'uso di standard istoni di organismi simili. - Collegare una colonna analitica a fase invertita C18 (RP) (ad esempio, 3 μm 300 Å, colonna diametro interno 75 μm, diametro esterno 360 μm, lunghezza 70 cm) e una colonna trappola C18 (ad esempio, 3,6 μm, diametro interno della colonna 150 μm, diametro esterno 360 μm, lunghezza 5 cm) a un sistema di cromatografia liquida a nanoflusso a doppia pompa (ad esempio, Waters NanoAcquity). I solventi binari sono A: 0,1% acido formico in acqua, e B: 0,1% acido formico in acetonitrile.
NOTA: La doppia pompa LC include una pompa di lavaggio e una pompa a gradiente. Entrambe le pompe passano attraverso due fasi di ciascuna analisi: una fase di cattura seguita dalla fase analitica. Nella fase di intrappolamento, la pompa di lavaggio fluisce nella colonna trappola e la pompa gradiente fluisce nella colonna analitica. Nella fase analitica, la colonna trap è accoppiata con la colonna analitica e la pompa gradiente fluisce in entrambe le colonne. La pompa di lavaggio va quindi ai rifiuti. - Fase di abbondanza: impostare il metodo LC per caricare prima 1-2 μg di campione di istone sulla colonna trap. Essiccare il campione dalla pompa di lavaggio a 3 μL/min 5% di solvente B per 10 min. Impostare la pompa analitica a 0,3 μL/min 5% di solvente B per l'equilibrazione.
- Fase analitica: impostare la pompa di gradiente (0,3 μL/min) per iniziare dal 5% B e dalla rampa al 30% a 15 minuti. Quindi, aumentare al 41% B a 100 min prima di un lavaggio organico elevato fino al 95% B alla fine.
NOTA: la sfumatura può essere ottimizzata a seconda dei diversi profili di ritenzione sulle singole colonne. In genere, gli istoni a figura intera elutano circa il 30%-40% B nelle condizioni LC specificate. Gradienti più lunghi possono essere usati per aumentare il numero di spettri MS2 per catturare più proteoforme istono. - Impostare un metodo di acquisizione dipendente dai dati su una SM ad alta risoluzione (ad esempio, Thermo Orbitrap Fusion Lumos o simili) con capacità etd (Electron Transfer Dissociation). Utilizzare la modalità proteina intatta ed eseguire tutte le calibrazioni necessarie come suggerito dal produttore. I parametri critici sono descritti di seguito. Questi saranno specifici per lo strumento utilizzato.
- MS1: intervallo di scansione 600-2.000 m/z, risoluzione 120k (a m/z 200), 4 microscan, obiettivo AGC 1E6, iniezione massima 50 ms.
- MS2: risoluzione 120k; 1 microscan; Obiettivo AGC 1E6; MS/MS dipendente dai dati: ETD alternato (tempo di reazione di 25 ms, tempo massimo di iniezione 500 ms) e dissociazione collisionale ad alta energia (HCD, 28% di energia di collisione normalizzata con energia a gradini del ±5%, tempo massimo di iniezione 100 ms); finestra di isolamento di 0,6 Da; priorità sugli stati di carica più elevati.
- Esclusione dinamica: finestra di tempo di 120 s, ± di massa da 0,7 Da. Escludere gli stati di addebito inferiori a 5 e gli stati di carica indeterminati.
- Eseguire alcune iniezioni di peptide o standard istono su nuove colonne per equilibrare e controllare il sistema, prima di eseguire i campioni effettivi. Per eseguire un gran numero di campioni, aggiungere brevi spazi vuoti o lavaggi tra i campioni per ridurre al minimo il riporto. Lasciare che le colonne equilibrano per 15-20 min alla condizione iniziale (5% solvente B) prima del campione successivo.
NOTA: Gradienti LC più lunghi e tempi di iniezione massima più elevati per MS2 possono migliorare la qualità spettrale per identificare più proteoforme istono.
- Stimare la concentrazione proteica mediante saggio di acido bicinchoninico (BCA) seguendo il protocollo del produttore.
- Elaborazione dei dati LC-MS e identificazione proteoforme
- Ottenere la sequenza proteica (sorgo) in formato FASTA da JGI (https://genome.jgi.doe.gov) o UniProt (https://www.uniprot.org/).
- Utilizzate MSConvert21 (http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtml) per convertire i file di dati grezzi dello strumento (*.raw) in formato mzML.
- Scarica toppic suite22 (http://proteomics.informatics.iupui.edu/software/toppic/) per l'elaborazione dei dati. Il programma può essere eseguito sia nella riga di comando che attraverso l'interfaccia grafica.
- Utilizzare TopFD nella suite TopPIC per deconvolutare gli spettri dal file mzML dal passaggio 4.2.2. È possibile utilizzare i parametri predefiniti. Ma la "finestra precursore" (-w) deve essere ridotta a 1 m/z perché viene utilizzata una stretta finestra di isolamento.
- Utilizzare TopPIC nella suite TopPIC per identificare i proteoformi. È possibile utilizzare la maggior parte dei parametri predefiniti. Impostare il tipo di taglio dello spettro e del proteoforma su FDR (false discovery rate) e impostare il valore di cutoff su 0,01 (1% FDR) o come desiderato. Impostare la "tolleranza di errore proteoforme" su 5 (Dalton). Caricare il file FASTA dal passaggio 4.2.1 e il file "*_ms2.msalign" dal passaggio 4.2.4. Quindi avviare la ricerca.
NOTA: L'impostazione "tolleranza di errore proteoforma" combinerà proteoforme con masse simili (± 5 Da) come una sola. Ciò aiuta a ridurre la ridondanza nel conteggio dei proteoformi. Tuttavia, dovrebbe essere usato con cautela perché una grande tolleranza unirà proteoforme con piccole o nessuna differenza di massa. Questo parametro è disponibile solo in TopPIC versione 1.3 o successiva. - I proteoformi identificati possono essere esaminati nel file "*_proteoform.csv" o visualizzati utilizzando il modulo Topview nella cartella "*_html" dell'output.
- L'elenco delle proteoforme generato dai passaggi precedenti utilizzando TopPIC annota le PTM istono come spostamenti di massa. Per localizzare le singole PTM, è necessario includere un elenco di modifiche. Una descrizione dettagliata è disponibile nel manuale TopPIC. In alternativa, procedere al passaggio successivo per eseguire un'analisi complementare dei dati utilizzando il pacchetto Informed-Proteomics23 (https://github.com/PNNL-Comp-Mass-Spec/Informed-Proteomics).
- Seguire le istruzioni e utilizzare il modulo PbfGen per convertire i dati grezzi dello strumento in un file PBF. Quindi deconvolutare i dati MS1 utilizzando il modulo ProMex per generare un file ms1ft (elenco di funzionalità, ogni feature rappresenta una combinazione univoca di tempo di massa e conservazione).
- Creare un FASTA mirato per la proteomica informata utilizzando l'elenco delle proteine identificato da TopPIC nel passaggio 4.2.6.
NOTA: La ricerca dell'intero genoma utilizzando la proteomica informata con un gran numero di PTM variabili può essere estremamente lenta e causare arresti anomali. Pertanto, si consiglia di ridurre le dimensioni di FASTA includendo solo le proteine bersaglio. - Creare un elenco di modifiche di destinazione per cercare le PTT istoni seguendo il formato nel file di esempio. Le PTM comuni da includere sono: acetilazione della lisina, mono-metilazione della lisina, dimetilazione della lisina, trimetilazione della lisina, fosforilazione serina/treonina/tirosina, acetilazione N-terminale proteica, ossidazione metinina/cisteina. Per il sorgo, devono essere aggiunte la monometilazione n-terminale proteica, la dimetilazione e la trimetilazione.
NOTA: Informed-Proteomics cerca solo le PTT specificate nell'elenco. Se sono presenti PTM non specificate, il proteoforma potrebbe non essere identificato o essere erroneamente identificato con altre proteoforme. Tuttavia, l'elenco PTM deve essere mantenuto il più breve possibile per ridurre al minimo il tempo di ricerca. - Eseguire il modulo MSPathFinder per identificare i proteoform utilizzando i file del passaggio 4.2.8, il FASTA focalizzato del passaggio 4.2.9 e l'elenco delle modifiche del passaggio 4.2.10. È possibile utilizzare i parametri predefiniti.
- I risultati possono essere visualizzati in LcMsSpectator caricando tutti i file dei risultati.
NOTA: Altri strumenti di bioinformatica sono disponibili per l'elaborazione e la visualizzazione dei dati top-down, ognuno con i propripunti di forza 24,25,26,27,28. Il sorgo e molti altri organismi hanno informazioni note limitate sulle PTT istono nel database. Utilizzare prima TopPIC per identificare i turni di massa dalle PTM. Questa analisi può facilmente scoprire PTM conosciute e sconosciute. Quindi, le PTM rilevate possono essere cercate in modo mirato specificando un elenco PTM in TopPIC o con altri strumenti complementari.
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Representative Results
Seguendo il protocollo, gli istoni possono essere estratti e identificati utilizzando l'analisi LC-MS. I dati grezzi e i risultati elaborati sono disponibili presso MassIVE (https://massive.ucsd.edu/) tramite l'adesione: MSV000085770. Sulla base dei risultati TopPIC del campione rappresentativo (disponibile anche da MassIVE), abbiamo identificato 303 proteoforme istone (106 proteoforme H2A, 72 H2B, 103 H3 e 22 proteoforme H4). Sono state rilevate anche proteoforme ribosomiali co-purificate, tipicamente eluizzanti all'inizio della LC. Di solito consistono di ~20% delle proteoforme identificate, ma non si sovrappongono con le proteoforme istone che eluivano nella fase successiva del gradiente LC. I risultati possono essere facilmente visualizzabili con gli ultimi pacchetti TopPIC o Informed-Proteomics. Per la dimostrazione, ci concentreremo sulla visualizzazione dei dati utilizzando il pacchetto Informed-Proteomics, che può essere utilizzato per caricare direttamente file MS non elaborati ed esaminare manualmente le identificazioni proteoformi. Si prega di notare che entrambi i pacchetti software utilizzano algoritmi e parametri diversi. Il numero di proteoforme riportato non sarà identico. È consigliabile segnalare i conteggi dei proteoformi da TopPIC perché è più conservativo e considera le PTM sconosciute. Il pacchetto Informed-Proteomics ha integrato l'elaborazione e la visualizzazione dei dati per una facile convalida manuale. Per gli organismi con PTM ben annotate, consigliamo ProSightPC24 per la migliore localizzazione del sito. Combinare i risultati utilizzando più strumenti può aumentare il numero e la fiducia delle identificazioni proteoformi.
Dopo aver elato i dati con La proteomica informata, la mappa delle funzionalità LC-MS può essere visualizzata in LcMsSpectator, che visualizza le masse proteiche deconvolute rispetto al tempo di ritenzione LC. Cliccando sui proteoformi identificati nel software, la funzione associata verrà evidenziata con un piccolo rettangolo verde nella mappa delle funzionalità. Le principali proteine istone dovrebbero essere viste in specifiche regioni della mappa, il che indica il successo dell'esperimento. La figura 1a mostra una mappa rappresentativa delle caratteristiche LC-MS degli istoni intatti. Le proteoforme istografiche a figura intera sono evidenziate nelle caselle tratteggiate. La maggior parte dei proteoformi rilevati può essere identificata con sicurezza utilizzandoi dati MS 2.
La figura 1b mostra lo zoom nella regione con proteoforme H2A e H2B. La maggior parte di loro ha modifiche n-terminali di 42 Da. Questa massa nominale corrisponde alla trimetilazione (42,05 Da) o all'acetilazione (42,01 Da), che sono comunemente osservate per gli istoni. Le loro masse accurate differiscono solo di 0,04 Da e sono difficili da differenziare a livello proteico intatto (~ 2 ppm). Negli spettri MS2 ad alta risoluzione, le PTT possono essere facilmente differenziate e confermate a causa della massa inferiore dei frammenti29. Inoltre, gli istoni H2A e H2B hanno omologi multipli con sequenze molto simili, come notato dai diversi numeri di adesione di UniProt nella figura 1b. Ancora una volta, l'analisi LC-MS ad alta risoluzione può identificarli e differenziarli facilmente. Sono stati identificati due tipi di H2A per gli istoni di sorgo. Gli istoni H2A da 16 kDa nella Figura 1b hanno lunghe code terminali nelle regioni non conservate degli istoni. Un altro gruppo di istoni H2A senza code estese (14 kDa) può essere visto nella figura 1c.
Per gli istoni H4, l'acetilazione N-terminale è stata identificata come il principale PTM. Ulteriori acetilazioni di lysina e ossidazioni di metonina possono anche essere osservate semplicemente esaminando le differenze di massa delle caratteristiche nella figura 1d. Abbiamo anche osservato una modifica sconosciuta di 112,9 Da in aggiunta all'acetilazione N-terminale (la caratteristica sopra "3Ac" nella figura 1d). Questo è probabilmente alcuni addotti sconosciuti dal reagente utilizzato nella preparazione. Abbiamo precedentemente rilevato addotti di ioni solfati su H4, che possono essere attribuiti a sali residui combinati con un'elevata basicità delle proteine istone. Per H3 sono state identificate due sequenze proteiche H3.3 e H3.2 (Figura 1e). Sebbene queste due sequenze proteiche differiscano a soli 4 residui (32, 42, 88 e 91), possono ancora essere facilmente distinte in LC-MS in base alla separazione in entrambe le dimensioni, massa e tempo di ritenzione. Le proteine H3 sono pesantemente modificate da vari gradi di metilazione e acetilazione. L'alto grado di modifica può essere facilmente visualizzato dalle linee dense e parallele nella mappa delle caratteristiche, distanti 14 Da. Tuttavia, tre gruppi di metilazione (14*3 Da) hanno la massa nominale uguale a un'acetilazione (42 Da). Poiché queste PTM non possono essere facilmente risolte a livello proteico intatto, sono indicate come "equivalenti metile" (cioè multipli di 14 Da; un'acetilazione equivale a tre equivalenti metile). Nella figura 1e, le proteoforme H3 sono etichettate sotto forma di equivalenti metile in base alla loro massa intatta. A causa della limitata risoluzione della separazione RPLC, molte diverse proteoforme H3 sono probabilmente co-eluibili e frammentate nello stesso spettro. Il metodo qui presentato identificherà solo le combinazioni più abbondanti di metilazione e acetilazione, come illustrato nella figura 2. Per una caratterizzazione più completa di H3, è ancora necessaria un'analisi piùmirata 30,31.
Figura 1: Mappa delle caratteristiche LC-MS sugli istoni intatti estratti dalle foglie di sorgo. La figura mostra il tempo di ritenzione LC (in minuti) rispetto alla massa molecolare per tutte le proteoforme rilevate. L'abbondanza del log è mostrata dalla scala dei colori accanto alla mappa superiore (log 10 abbondanza). (a) Le principali cime istone sono etichettate dalle scatole tratteggiate. La maggior parte delle caratteristiche al di fuori delle scatole sono istoni troncati e proteine ribosomiche. Viste zoom-in per ciascun gruppo di istoni: (b) H2B e 16 kDa H2A, (c) H3, (d) 14 kDa H2A e (e) H3. I numeri di adesione di UniProt sono annotati insieme a ciascuna funzionalità, seguiti da PTM rilevate. "Ac", "me", "+O" indicano rispettivamente acetilazione, metilazione e ossidazione. In (b), vengono etichettate due proteoforme H2A C5YZA9 troncate, con una o due alanine del terminale C ritagliate (mostrate come -A*, e -AA*). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Un esempio rappresentativo di identificazione proteoforma è illustrato nella figura 2 utilizzando MSPathfinder e visualizzato in LcMsSpectator. Lo spettro di frammentazione nella figura 2a è stato generato usando ETD, che produce ioni di tipo c e z lungo la dorsale proteica. L'HCD dello stesso precursore può essere utilizzato per convalidare l'identificazione, ma l'HCD fornisce generalmente una copertura di sequenzalimitata 20. Gli ioni precursori negli spettri MS1 precedenti e successivi sono mostrati nella figura 2b.c, con i loro picchi isotopici abbinati evidenziati in viola. La mappa di copertura della sequenza nella figura 2d può aiutare a localizzare eventuali PTM. Un'identificazione ad alta confidenza dovrebbe avere la maggior parte dei frammenti abbinati, lo ione precursore abbinato e una buona copertura delle sequenze per aiutare a localizzare le PTM. In questo esempio, un proteoforma H3.2 è stato identificato con due PTM: la dimetilazione su K9 e la metilazione su K27. Seguendo lo stesso metodo, altre proteoforme con PTM e troncazioni terminali diverse possono essere convalidate manualmente.
Figura 2: Esempio rappresentativo di proteoforma H3.2 istono identificato. H3.2 preteoforme con il suo (a) spettro ETD, (b) ione precursore nel precedente spettro MS1, (c) ione precursore nel prossimo spettro MS1 e (d) mappa di copertura della sequenza. Gli ioni c dell'N-terminale sono etichettati in ciano, e gli ioni z del C-terminale sono in rosa. Due PTM sono state identificate ed evidenziate in giallo in (d) con i loro turni di massa annotati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Il confronto quantitativo delle proteoforme istono rilevate può rivelare potenziali marcatori epigenetici. Abbiamo applicato questo protocollo in precedenza a 48 campioni di sorgo raccolti dal campo ("inibitori aggiuntivi" non sono stati utilizzati in questo studio)29. Due diversi genotipi di sorgo sono stati confrontati in risposta a siccità pre-fioritura o post-fioritura. Confrontando l'abbondanza relativa delle proteoforme, abbiamo scoperto alcuni interessanti cambiamenti di proteoforme istono troncate specifiche delle condizioni del campione, come mostrato nella figura 3. Il troncamento C-terminale dell'H4 è stato osservato solo nelle settimane 3 e 9 per alcuni campioni (figura 3a,b). Per H3.2, le proteoforme troncate N-terminale erano generalmente più abbondanti nella settimana 10(figura 3c,d). Al contrario, il terminale C troncato H3.2 tende ad essere visto nei punti di tempo precedenti (Figura 3c). Ancora più importante, i due genotipi non hanno risposto esattamente allo stesso modo. I proteoformi troncati del terminale C H4 erano significativamente più abbondanti in BTx642 che in RTx430 (Figura 3b). Tali dati rivelano potenziali marcatori epigenetici di sviluppo delle piante e tolleranza allo stress che possono essere ulteriormente testati con altre tecniche.
Figura 3: Confronto quantitativo delle proteoforme istono. (a) Mappa termica delle proteoforme H4 istono su campioni diversi. Per ogni proteoforma, l'abbondanza estratta dai dati MS dall'alto verso il basso è stata normalizzata alla somma di tutte le proteoforme H4 identificate in ogni analisi, producendo la "abbondanza relativa". I valori sono stati quindi scalati al massimo di ogni riga per mostrare meglio i cambiamenti nelle proteoforme a bassa abbondanza. L'abbondanza relativa in scala è denotata nella chiave di colore nella parte inferiore della mappa termica. Le condizioni di crescita sono notata sull'asse orizzontale (Pre: siccità pre-fioritura, Post: siccità post-fioritura). Tre repliche sono raggruppate e sono separate da strisce verticali nere da altre condizioni. Per i campioni etichettati con asterischi, sono state acquisite solo repliche tecniche. Le proteoforme sono rappresentate sull'asse verticale, nel formato "residuo iniziale – residuo finale: massa; modifica putativa". (b) Vengono riassunti i proteoformi H4 troncati 2-99 (le proteoforme evidenziate in grassetto in( a) sono riassunte) in condizioni diverse. La chiave dei simboli viene visualizzata nella legenda nell'angolo in alto a destra. I punti riempiti al centro delle barre di errore sono i valori medi. e) La mappa termica delle proteoforme H3.2 e( d) il grafico di abbondanza per tutti gli H3.2 troncati N-terminale identificati sono indicati nello stesso formato di quelli dell'H4. Le proteoforme più piccole di 8 kDa in (e) sono state omesse per semplicità. Le proteoforme H3.2 troncate N-terminale e C-terminale hanno mostrato risposte diverse in tutte le condizioni di crescita. Ristampato con l'autorizzazione di ELSEVIER dalrif. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo presentato descrive come estrarre gli istoni da campioni di foglie di sorgo (o più in generale foglie vegetali). La resa media dell'istone dovrebbe essere di 2-20 μg per 4-5 g di materiale fogliare di sorgo. I materiali sono sufficientemente puri per l'analisi dell'istone a valle da parte di LC-MS (per lo più istoni con contaminazione da proteine ribosomiali ~20%). È possibile ottenere una resa inferiore a causa di variazioni del campione o potenziali errori di gestione/guasti in tutto il protocollo. Mantenere l'integrità dei nuclei prima della fase di analisi dei nuclei è fondamentale; pertanto, il vortice aggressivo e la pipettazione devono essere evitati prima di aggiungere Bilanciamento carico di rete. Inoltre, la perdita di nuclei può verificarsi quando si rimuovono i supernatanti dai pellet. Si deve fare attenzione a non interrompere il pellet durante la pipettazione. La concentrazione di Triton X-100 dell'1% è stata ottimizzata per lyse selettivamente gli organelli non mirati ma non i nuclei (fase 3.2). La concentrazione ottimale di detergenti per altri tessuti o organismi può essere diversa e deve essere determinata sperimentalmente. Il cambiamento di colore del supernatante durante il processo di filtrazione potrebbe indicare potenziali problemi come il rilascio inefficiente di cloroplasto o la macinazione insufficiente della foglia. Se possibile, utilizzare un microscopio per verificare la lisi dei cloroplasti e la ritenzione di nuclei intatti dopo ogni passaggio per ottimizzare ulteriormente il protocollo (specialmente se si modifica il protocollo per altri tessuti o piante). Questo protocollo è stato testato solo con tessuto fogliare di sorgo. Non funziona per il tessuto radicale di sorgo probabilmente a causa dell'interferenza dal suolo. L'applicazione ad altri tessuti fogliari vegetali non è stata testata e l'applicazione a diverse piante potrebbe richiedere un'ulteriore ottimizzazione. Per adattare il protocollo di isolamento dei nuclei per le applicazioni ChIP-seq, si consiglia un'ulteriore separazione della densità del gradiente di saccarosio dopo il passaggio 3.3.4 (prima di utilizzare NLB) per ridurre la contaminazione citoplasmatica. A causa delle ampie fasi di pulizia, non ci si aspetta che piccole quantità di materiali residui non nucleici causino interferenze significative per l'analisi dell'istone in LC-MS e possano essere lasciate con il pellet.
Diversi studi iniziali non sono riusciti quando si utilizzano compresse commerciali di inibitori della fosfatasi (ad esempio, PhosSTOP). Il supernatante del passaggio 3.1.6 sembrava essere verde intenso quando le compresse sono state utilizzate nel tampone di estrazione. L'estratto finale mostrava un basso numero di istoni identificati. Sospettiamo che gli ingredienti proprietari nelle compresse possano aver causato la lisi dei nuclei prima della fase 3.4, riducendo la resa complessiva dell'istono. Un altro possibile motivo di guasto è l'incompatibilità degli ingredienti nella fase di purificazione dell'istone con la resina scambiata di ioni (fase 3.4). Abbiamo utilizzato questo protocollo per estrarre costantemente istoni ad alta purezza per successivi campioni LC-MS su 150. In media, siamo stati in grado di ottenere una resa più elevata senza utilizzare gli "inibitori aggiuntivi" (dati inediti). Pertanto, si consiglia di testare con cautela nuovi inibitori quando si modifica o si adatta questo protocollo per altri scopi. Se la fosforilazione non è di interesse, gli inibitori della fosfatasi possono essere omessi nei tamponi di estrazione.
I passaggi in 3.4 possono richiedere 3-4 ore o più. Si consiglia di rompere il protocollo in 2 giorni: congelare il pellet dei nuclei dal passaggio 3.3 ed eseguire la purificazione il giorno 2 (o più tardi). Il ciclo di congelamento-disgelo può aiutare parzialmente la lisi dei nuclei. I passaggi del filtro MWCO (3.4.7) possono richiedere molto tempo, ma possono essere facilmente scalati preparando più campioni in parallelo. Non aggiungere le compresse inibitorie della proteasi nel passaggio 3.4. Molte compresse commerciali contengono polimeri (ad esempio, glicole polietilene) come riempitivi, che interferiranno con l'analisi LC-MS. In questo passaggio, la maggior parte delle altre proteine avrebbe dovuto essere rimossa o denaturata, quindi gli inibitori enzimatici non sono critici. Tuttavia, è ancora necessario mantenere i campioni a 4 °C o congelati per ridurre al minimo la degradazione.
Seguendo questo protocollo, gli istoni possono essere estratti con successo dalle foglie di sorgo. Le PTM istono possono essere caratterizzate con LC-MS. Il metodo può essere potenzialmente applicato a studi su larga scala per il confronto delle PTM istono tra diversi campioni biologici (ad esempio, genotipi diversi, piante coltivate in condizioni diverse, ecc.), come dimostrano i dati di esempio riportati nella figura 3. Tuttavia, l'elaborazione dei dati richiede ancora un'analisi manuale approfondita per l'assegnazione sicura di proteoforme, specialmente per PTM impreviste (o nuove). Si prevede che i nuovi sviluppi negli strumenti di bioinformatica automatizzeranno il flusso di lavoro e aumenteranno significativamente la produttività degli studi su larga scala. Un'altra limitazione è che il metodo MS dall'alto verso il basso, attualmente, non può facilmente differenziare molte proteoforme di H3 iper-modificato (ad esempio, più siti di mono/di/tri-metilazione e acetilazione). La singola dimensione in fase invertita LC non può separare completamente le diverse proteoforme H3. Pertanto, gli spettri MS2 di H3 contengono in genere frammenti di proteoforme multiple e non possono essere facilmente e con sicurezza deconvoluti. La combinazione dall'alto verso il basso con metodi bottom-up o middle-down30,32,33 può essere particolarmente utile per la caratterizzazione dell'istono H3. In alternativa, la separazione multidimensionale può essere considerata per migliorare la profondità dell'MS dall'alto verso ilbasso34,35,36.
La profilazione di Histone PTM da parte di LC-MS consente la scoperta di nuovi marcatori epigenetici per la progettazione di modificatori di cromatina e migliorare la resilienza delle piante a gravi condizioni ambientali. Uno studio pilota sull'uso del sorgo di due cultivar e coltivato in condizioni di siccità sul campo ha indicato che il ritaglio terminale istono selettivo in foglia può essere correlato all'acclimatazione alla siccità e allo sviluppo dellepiante 29. I marcatori istoni identificati possono servire come bersagli con tecniche complementari come chIP-seq. Una comprensione completa dei fattori epigenetici ottenuti da queste tecniche complementari sarebbe indispensabile per progettare soluzioni innovative alle colture in risposta ai cambiamenti ambientali.
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Disclosures
Nessuno.
Acknowledgments
Ringraziamo Ronald Moore e Thomas Fillmore per aver aiutato con gli esperimenti di spettrometria di massa e Matthew Monroe per la deposizione dei dati. Questa ricerca è stata finanziata da sovvenzioni del Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti (DOE) Biological and Environmental Research attraverso il progetto Epigenetic Control of Drought Response in Sorghum (EPICON) con il numero di premio DE-SC0014081, del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti (USDA; CRIS 2030-21430-008-00D), e attraverso il Joint BioEnergy Institute (JBEI), una struttura sponsorizzata da DOE (Contract DE-AC02-05CH11231) tra Lawrence Berkeley National Laboratory e DOE. La ricerca è stata eseguita utilizzando l'Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) (grid.436923.9), un DOE Office of Science User Facility sponsorizzato dall'Office of Biological and Environmental Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4L | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-5G | |
| EDTA, 500mM Solution, pH 8.0 | EMD Millipore Corp | 324504-500mL | |
| Formic Acid | Thermo Scientific | 28905 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma | G3272-100G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| Potassium phosphate, dibasic | Sigma | P3786-100G | |
| Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tablets | Roche | 5892791001 | |
| Sodium butyrate | Sigma | 303410-5G | Used for histone deacetylase inhibitor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S1888 | |
| Sodium Fluoride | Sigma | S7020-100G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 450243-10G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sucrose | Sigma | S7903-5KG | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 g | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-100ML | |
| Weak cation exchange resin, mesh 100-200 analytical (BioRex70) | Bio-Rad | 142-5842 | |
| Disposables | |||
| Chromatography column (Bio-Spin) | BIO-RAD | 732-6008 | |
| Mesh 100 filter cloth | Millipore Sigma | NY1H09000 | This is part of the Sigma kit (catalog # CELLYTPN1) for plant nuclei extraction. Similar filters with the same mesh size can be used. |
| Micropipette tips (P20, P200, P1000) | Sigma | ||
| Tube, 50mL/15mL, Centrifuge, Conical | Genesee Scientific | 28-103 | |
| Tube, Microcentrifuge, 1.5/2 mL | Sigma | ||
| Equipment | |||
| Analytical Balance | Fisher Scientific | 01-912-401 | |
| Beakers (50mL – 2L) | |||
| Microcentrifuge with cooling | Fisher Scientific | 13-690-006 | |
| Micropipettes | |||
| Swinging-bucket centrifuge with cooling | Fisher Scientific | ||
| Vortex | Fisher Scientific | 50-728-002 | |
| Water bath Sonicator | Fisher Scientific | 15-336-120 |
References
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