使用四维（x, y, z 和 λ）高光谱FRET成像与分析技术测量活细胞中三维cAMP分布

摘要

由于基于 Förster 共振能量转移（FRET）的传感器本身信噪比（SNR）较低，cAMP 信号的测量一直具有挑战性，尤其是在三维空间中。本文介绍了一种高光谱 FRET 成像与分析方法，可实现三维空间内 cAMP 分布的测量。

摘要

环磷酸腺苷（cAMP）是一种参与多种细胞和生理活动的第二信使。多项研究表明，cAMP信号具有区室化特征，而这种区室化有助于cAMP信号通路中的信号特异性。基于 Förster 共振能量转移（FRET）的生物传感器的发展，增强了在细胞内测量和可视化cAMP信号的能力。然而，这些测量通常局限于二维空间，可能导致数据的误读。迄今为止，由于FRET传感器本身信噪比（SNR）较低的技术限制，对cAMP信号在三维空间（x、y和z）中的测量仍极为有限。此外，传统的基于滤光片的成像方法在准确测量局部亚细胞区域的cAMP信号时往往效果不佳，原因包括光谱串扰、信号强度有限以及自发荧光等多种因素。为了克服这些局限性，并使基于FRET的生物传感器能够与多种荧光团联合使用，我们开发了高光谱FRET成像与分析方法，该方法通过光谱特异性计算FRET效率，并能够将FRET信号与干扰性的自发荧光和/或额外荧光标记物的信号在光谱上分离。本文介绍了实施高光谱FRET成像的方法，以及构建适当光谱库的必要性——该光谱库既不能欠采样，也不能过采样，以实现准确的光谱解混。尽管本文以肺微血管内皮细胞（PMVECs）中三维cAMP分布的测量为例展示该方法，但该方法也可用于研究多种细胞类型中cAMP的空间分布。

引言

环磷酸腺苷（cAMP）是一种第二信使，参与多种关键的细胞和生理过程，包括细胞分裂、钙离子内流、基因转录和信号转导。越来越多的证据表明，细胞内存在cAMP区室化结构，从而实现信号传导的特异性^{1,2,3,4,5,6,7}。直到最近，cAMP的区室化现象主要是根据不同的G蛋白偶联受体激动剂所诱导的特异性生理或细胞效应间接推断得出的^8,9,10,11。近年来，基于荧光共振能量转移（FRET）的荧光成像探针为直接测量和观察细胞内cAMP信号提供了新的方法^12,13,

方案

本方案遵循美国南阿拉巴马大学机构动物护理和使用委员会批准的程序。

1. 成像用细胞、样品和试剂的准备

1. 按照先前所述方法分离大鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）³⁵。
   注意：细胞由美国阿拉巴马州莫比尔市南阿拉巴马大学细胞培养核心实验室分离并培养于100 mm细胞培养皿中。
2. 将分离的PMVECs接种于25 mm圆形玻璃盖玻片上，并在37 °C培养箱中培养至细胞融合度至少达到80%（至少24小时）。
   注意：不同研究中所用细胞及其类型可能有所不同，因此应遵循特定细胞的培养程序进行接种和培养。本研究所用的细胞接种与培养方案详见名为“Supplemental File_Cell Culture and Transfection”的补充文件。
3. 用FRET生物传感器转染PMVECs，并在37 °C下孵育48小时。
   注意：PMVECs的转染方案也在名为“Supplemental File_Cell Culture and Transfection”的补充信息文件中有详细描述。
4. 成像当天，将Tyrode缓冲液置于水浴中预热至37 °C。
   注意：Tyrode缓冲液的成分为145 mM NaCl、4 mM KCl、10 mM HEPES、10 mM葡萄糖、1 mM MgCl₂和1 mM CaCl_2<....

结果

本方案描述了利用高光谱FRET成像与分析方法，在活细胞中三维空间内测量cAMP梯度的技术。获得这些结果涉及若干关键步骤，在数据分析与定量过程中需格外注意。这些关键步骤包括构建适当的光谱库、背景光谱解混、设定阈值以识别细胞边界，以及FRET效率的计算。图1展示了在活细胞中测量FRET效率和cAMP水平所涉及各步骤的示意图流程。若操作得当，这些成像与分析步骤将能够在考虑非均匀背景信号的前提下，实现对单个细胞内三维空间中FRET效率的测量及cAMP空间梯度的估算。

图2展示了使用尼康A1R共聚焦显微镜在基础条件下（图2A）以及佛司可林处理后10分钟（图2B）获取的伪彩原始高光谱图像数据的三维视图。请注意，为保持定量分析的一致性，处理前后图像堆栈的采集均采用了相似的探测器和系统参数。还需注意，该图像中FRET的变化并不明显，因为这仅仅是计算FRET效率之.......

讨论

FRET生物传感器的发展使得单细胞内环核苷酸信号的测量和可视化成为可能，并在亚细胞水平信号事件的可视化方面展现出巨大潜力^13,22,37,38。然而，FRET生物传感器的应用仍存在若干局限性，包括许多基于荧光蛋白的FRET报告分子信噪比较低，以及FRET报告分子转染效率或表达效率较弱（这在某些细胞系中可能尤为突出，例如PMVECs）^23,24。弱表达的荧光蛋白成像结合比率法FRET计算，常常导致所计算的FRET效率具有较高的不确定性或波动性。为了提高FRET测量的可靠性，我们及其他研究者此前已证明，可采用高光谱成像与分析技术来检测FRET信号，并减少荧光标记之间以及自发荧光效应引起的串扰或荧光渗漏^26,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Attofluor 细胞培养腔室	Invitrogen	A7816	Attofluor 包含钢制细胞腔室和橡胶 O 型圈。细胞腔室用于固定盖玻片，O 型圈则提供密封机制，防止缓冲液在腔室内泄漏
二甲基亚砜（DMSO）	Fisher Scientific	BP231-100	用于配制佛司可林储备液的溶剂
DRAQ5 荧光探针溶液	Thermo Scientific	62252	细胞核染色剂
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Gibco	11965-092	含有细胞在培养皿中生长和分裂所需的营养物质和生长因子
胎牛血清（FBS）	Sigma	F6178	添加至培养基 DMEM 中的生长因子补充物
佛司可林	Sigma	F3917	腺苷酸环化酶激活剂
H188 环磷酸腺苷 FRET 生物传感器	Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink	赠品	质粒编码青色荧光蛋白（供体荧光基团）、Venus（受体荧光基团）以及来自 Epac 的结合域
Image J	image.net	免费下载	另一种用于提取光谱信息和图像处理的图像处理平台
积分球	Ocean Optics	FOIS-1	用于测量不同激光强度下激光谱线的照明强度（？）
小鼠层粘连蛋白，天然	Invitrogen	23017-015	盖玻片经层粘连蛋白包被，有助于细胞的贴附、生长和运动
Lipofectamine 3000 转染试剂盒	Invitrogen	L3000-015	用于将 H188 FRET 生物传感器转染入细胞的转染试剂
MATLAB	Mathworks	R2019a	图像处理操作（线性解混和 FRET 效率计算）通过在 MATLAB 编程环境中编写自定义程序完成
Nikon A1R 共聚焦显微镜	Nikon Instruments	Nikon A1R	使用共聚焦显微镜进行光谱图像采集
Nikon Elements 软件	Nikon Instruments	软件加密狗	用于导出和处理使用 Nikon A1R 获取的 nd2 图像文件（多维图像文件）
NIST 可追溯校准灯	Ocean Optics	LS-1-CAL-INT	具有已知光谱的光源标准灯
PBS pH 7.4 (1X)	Gibco	10010-023	细胞培养过程中常用的缓冲液
肺微血管内皮细胞（PMVECs）	本实验室 - 南阿拉巴马大学细胞培养中心	从小鼠肺微血管分离获得	PMVECs 构成血管的内层衬里
青霉素-链霉素（10,000 U/ml）	Gibco	15140-122	向培养基中添加抗生素以防止细胞污染
预清洁 Gold Seal 显微载玻片	Clay Adams	3010	用于细胞固定的显微载玻片
ProLong Diamond 抗荧光淬灭封片剂	Invitrogen	P36961	若使用抗荧光淬灭封片剂对样品进行固定，则该封片剂可保护荧光染料和发色团免于褪色
光谱仪	Ocean Optics	QE65000	用于测量光源的光谱响应（？）
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）	Gibco	25200-056	消化细胞与细胞外基质之间的蛋白质-蛋白质键，有助于在细胞接种过程中使细胞解离并脱落
台氏缓冲液	本实验室配制	本实验室配制	台氏缓冲液用于配制工作液，并在图像采集期间维持细胞处于水溶液环境中
6 孔细胞培养板	Corning	3506	将经层粘连蛋白包被的盖玻片置于 6 孔培养板中（每孔一片盖玻片），向每个孔中加入细胞及培养基
25 mm 圆形显微盖玻片	Fisher Scientific	12545102	细胞在圆形玻璃盖玻片上培养
60X 物镜	Nikon Instruments	Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27	水浸物镜，常用于细胞成像