Summary
由于基于 Fürster 共振能量转移 （FRET） 传感器的固有的低信号与噪声比 （SNR），CAMP 信号的测量一直具有挑战性，尤其是在三个空间维度方面。在这里，我们描述了一个高光谱FRET成像和分析方法，允许测量三个空间尺寸的CAMP分布。
Abstract
循环AMP是第二个信使，参与广泛的细胞和生理活动。一些研究表明，cAMP 信号是分隔的，隔间化有助于 cAMP 信号通路中的信号特异性。基于Fürster共振能量转移（FRET）的生物传感器的发展，进一步增强了测量和可视化细胞中CAMP信号的能力。但是，这些测量通常局限于两个空间维度，这可能导致对数据的误解。迄今为止，由于使用本身信号与噪声比 （SNR） 较低的 FRET 传感器的技术限制，在三个空间维度（x、y 和 z）中对 CAMP 信号的测量非常有限。此外，由于光谱相声、信号强度有限和自发光等一系列因素，传统的基于滤波器的成像方法通常对精确测量局部子细胞区域的 CAMP 信号无效。为了克服这些限制，并允许基于FRET的生物传感器与多个荧光素一起使用，我们开发了高光谱FRET成像和分析方法，为计算FRET效率提供光谱特异性，并能够将FRET信号与混淆的自发光和/或来自其他荧光标签的信号隔离开来。在这里，我们介绍了实施高光谱FRET成像的方法，以及需要构建一个适当的光谱库，既不采样不足，也不采样过采，以执行光谱未混合。虽然我们提出了测量肺微血管内皮细胞（PMVECs）中三维CAMP分布的方法，但这种方法可用于研究CAMP在一系列细胞类型的空间分布。
Introduction
环腺苷单磷酸盐（cAMP）是参与关键细胞和生理过程的第二个信使，包括细胞分裂、钙的涌入、基因转录和信号转导。越来越多的证据表明，细胞中存在cAMP隔间，通过这些隔间可以达到1、2、3、4、5、6、7的信号特异性。直到最近，CAMP分隔断是根据不同的G耦合受体激动剂8，9，10，11诱导的独特的生理或细胞效应推断的。最近，基于FRET的荧光成像探测器为直接测量和观察12、13、14细胞中的CAMP信号提供了新的方法。
Fürster共振能量转移（FRET）是一种物理现象，当分子接近15、16时，能量转移以非辐射的方式发生在供体和接受分子之间。随着基于FRET的荧光指标的发展，这种物理现象已用于生物应用，研究蛋白质-蛋白质相互作用17，蛋白质共定位18，Ca+2信号19，基因表达20，细胞分裂21和环核苷酸信号。基于FRET的cAMP指标通常包括一个CAMP结合域，一个捐赠者氟和一个接受荧光22。例如，H188 cAMP 传感器12，22用于此方法包括从 Epac 获得的 cAMP 结合域，夹在绿松石（捐赠者）和金星（接受者）荧光之间。在基础条件下（未绑定），绿松石和金星处于一个方向，因此FRET发生在萤管之间。将 cAMP 与绑定域结合后，会发生构象变化，使绿松石和金星分开，导致 FRET 减少。
基于 FRET 的成像方法为研究细胞内的 cAMP 信号提供了一个很有前途的工具。然而，目前的基于FRET的微观成像技术往往只部分成功达到足够的信号强度，以测量具有亚细胞空间清晰度的FRET。这是由于几个因素，包括许多FRET记者的信号强度有限，准确量化FRET效率变化所需的高精度，以及存在混淆因素，如细胞自发光23，24。结果往往是受弱 SNR 困扰的 FRET 图像，使得 FRET 的子细胞变化的可视化变得非常困难。此外，空间定位 CAMP 信号的调查几乎只在两个空间维度中执行，轴向 CAMP 分布很少被视为25。这可能是因为低 SNR 妨碍了在三个空间维度中测量和可视化 cAMP 梯度的能力。为了克服使用低SNR的FRET传感器的限制，我们采用了高光谱成像和分析方法，在单个细胞25、26、27中测量FRET。
美国宇航局开发了超光谱成像方法，以区分卫星图像28、29中存在的地球物体。此后，这些技术被翻译成荧光显微镜场30，几个商业共聚焦显微镜系统提供光谱探测器。在传统的（非光谱）荧光成像中，样品使用带通滤镜或激光线激发，并且使用第二个带通滤波器收集发射，通常选择以匹配荧光的峰值发射波长。相比之下，高光谱成像方法寻求以特定波长间隔对荧光发射26、31、32或激发33、34的完整光谱剖面进行采样。在我们之前的研究中，我们发现，与传统的基于过滤器的FRET成像技术相比，高光谱成像和分析方法可以改善细胞中FRET信号的量化。在这里，我们提出了一种执行 4 维（x、y、z 和 +）高光谱 FRET 成像和分析的方法，以测量和可视化三个空间维度的 cAMP 分布。这些方法使单细胞25中激动剂诱导的CAMP空间梯度可视化。有趣的是，根据激动剂的不同，CAMP梯度在细胞中可能很明显。此处提供的方法利用不均匀背景和细胞自发光的光谱解密，以提高 FRET 测量的准确性。虽然这种方法在使用 cAMP FRET 生物传感器的肺微血管内皮细胞 （PMVECs） 中得到了证明，但该方法可以很容易地修改，用于替代 FRET 记者或替代细胞系。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
该协议遵循南阿拉巴马大学机构动物护理和使用委员会批准的程序。
1. 细胞、样品和试剂成像准备
- 孤立大鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs），如前所述35。
注：细胞被隔离和培养的细胞培养核心在南阿拉巴马大学，移动，AL在100毫米细胞培养菜。 - 种子分离PMVECs在25毫米圆形玻璃盖片上，并让他们在37°C的孵化器中生长，直到细胞达到至少80%的汇流（至少24小时）。
注：细胞和细胞类型可能因研究而异，因此应遵循细胞特异性细胞培养程序来播种和生长细胞。这些研究中使用的细胞播种和培养方案可作为名为"补充File_Cell培养和转化"的文件中的补充信息。 - 具有 FRET 生物传感器的转染 PMVEC，并在 37 °C 下孵育 48 小时。
注：转染 PMVEC 的协议也描述在名为"补充File_Cell文化和传播"的补充信息文件中。 - 在成像当天，在水浴中将泰罗德的缓冲温度加热至37°C。
注：泰洛德的缓冲区由 145 m M NaCl、4 mM KCl、10 mM HEPES、10 mM 葡萄糖、1 mM MgCl2和 1 mM CaCl2组成 - 将含有受感染细胞的覆盖唇安装到细胞室中，用安装垫片固定顶部以防止泄漏。
- 使用精细的任务擦拭擦拭覆盖唇的底部，以清洁任何多余的介质或粘附细胞。
- 在细胞室中加入 800 μL 的工作缓冲器和 4 μL 的 5 mM 核标签，轻轻摇动 5 至 10 秒。
注：在细胞室中安装的盖片中添加缓冲或试剂溶液时，请务必在细胞室的侧面轻轻添加溶液，以免排出粘附细胞。将 4 μL 的 5 mM 核标签添加到 800 μL 的缓冲器中，使核标签最终浓度达到 25 μM。对于松散粘附的细胞，如 HEK293 细胞，先将核标签和缓冲器混合在小瓶中，然后添加到安装在细胞室中的覆盖唇中。这将防止将细胞从盖唇上抬起来。 - 用铝箔盖住细胞室，防止光线照射，在室温下孵育10分钟。
- 试剂制备：将 1 μL 的 50 mM 福斯科林添加到 199 μL 的缓冲。当添加到用 800 μL 缓冲器制备的细胞中时，这将产生 50 μM 的福斯科林的最终浓度。1 μL 的 DMSO 在 199 μL 的缓冲也应准备用作车辆控制。
注：在这些研究中，福斯科林被用作腺基环酶活化剂，以刺激cAMP生产。如果需要，这种方法可以很容易地修改，允许使用替代试剂治疗，以刺激或抑制腺基环酶，磷酸酯酶等。
2. 图像采集
- 使用配备光谱探测器的共聚焦显微镜。
注：此处概述的所有图像采集步骤均使用市售的尼康 A1R 显微镜系统开发。如果使用替代光谱显微镜，可能需要调整这些步骤。确保所有设备在实验开始前至少 30 分钟打开，以达到稳定的运行条件。 - 选择60倍水浸入目标，并添加一滴水的目标。
注：对于高分辨率活细胞成像，建议使用高数值孔径目标。请参阅材料列表，了解有关这些研究中使用的目标的信息。 - 将加载的细胞室（从第 1.7 步开始）放在显微镜阶段。
- 通过调整显微镜右侧的滤芯，选择设置的 DFT（DAPI/FITC/TRITC）滤镜。
- 使用目镜在荧光宽场模式下操作显微镜，以选择包含表达 cAMP FRET 传感器的细胞的视野。
注：确保选定细胞中供体或接受者发射峰值波长的 FRET 信号的平均强度至少为 100 强度单位（A.U.），或至少是无表达细胞区域基线信号的 4 倍。这可以使用 NIS 元素软件中可用的频谱配置文件查看器进行确认。当寻找信号良好的细胞时，建议丢弃过于明亮的细胞（它们可能会受到损害）。 - 打开 NIS 软件，切换到共焦模式，解锁激光联锁按钮并单击Live。
- 使用焦点旋钮通过查看屏幕上的预览来聚焦于单元格。
- 如下文所述，软件中的配置设备、采集和 z 堆栈设置。
- 获取设置：
注：相机和设备采集设置可以使用以前获得的图像进行应用。打开图像，右键单击并选择 重复使用相机设置。- 打开 A1 设置菜单，检查对应于 405 nm 和 561 nm 激光线的框，选择 SD 用于光谱探测器，选择 10 个分辨率和 31 个通道。
注：A1 设置菜单显示为 A1 Plus 设置窗口左上角的小齿轮图标。405纳米激光用于供体激发，561纳米激光用于核标签激发。 - 通过选择起始和端波长值来设置波长范围 （410 或 730 nm）。
- 单击 A1 设置菜单中的装箱/跳过图标，然后选择编号为 15 的框，然后单击 A1 设置菜单上的 "确定 "。
注：这是要移除对应于 561 nm 激发激光的波长通道（这通常是第 15波 长通道）。重要的是不要使用这个波长带来避免人为的低信号，这可能会产生光谱伪影。该频段的信号较低，因为机械手指覆盖了探测器元件，以保护其免受激光伤害。 - 将 405 nm 和 561 nm 激光的激光强度分别设置为 8% 和 2%，Si Hv（探测器增益）为 149，针孔半径为 2.4 通风磁盘单元 （AU）。
注：激光强度可能需要根据仪器的年龄和激光的状况进行调整。如果调整不同样品或实验组之间的激光强度，则保持激光强度的相同比例（例如，8：2）非常重要。此外，重要的是要选择激光强度不是那么亮，以创建快速光出血。应调整探测器增益，以最大限度地提高信号强度，同时最大限度地减少探测器的噪音。在这些研究中，使用了149个增益。选择 2.4 AU 的针孔大小作为在获取具有足够信号与噪声比 （SNR） 的图像和保持光学分割（共聚焦）之间的平衡。针孔大小的增加会增加 SNR，但会降低焦度。 - 将扫描速度设置为每秒 0.25 光谱帧，选择对应于单向扫描方向的图标，输入 4 进行计数，并设置 1024 x 1024 用于扫描大小。
注意：FRET 信号较弱，通常需要缓慢的扫描速度。使用 0.25 的扫描速度，在 +3 分钟内完成光谱 z 堆栈的采集。扫描速度可以根据使用的氟化物增加或降低。例如，对于像 eGFP 这样的更亮的荧光素，可以使用更快的扫描速度（2 帧/秒）。计数下输入的数字对应于平均值 4 的帧值，这有助于在图像采集期间降低噪音。对于非常稳定的样品，如果时间不是限制因素，可以使用更高的平均值（最多 16 个）来获取具有改进 SNR 的图像。
- 打开 A1 设置菜单，检查对应于 405 nm 和 561 nm 激光线的框，选择 SD 用于光谱探测器，选择 10 个分辨率和 31 个通道。
- 定义 z 堆栈采集参数：
注：步骤 2.10 中输入的值可能需要调整，以适应荧光标签结合或浓度、标签类型、使用的标签数量、细胞线以及可能影响细胞标记密度和/或细胞自发光的样品制备的其他变化的变化。在调整采集参数时，应注意实现足够的 SNR，同时最大限度地减少光出血。此外，在配置光谱 FRET 检测时，应小心以确保参数在所有治疗组中均有效。建议对每个治疗组进行试验，并设置建议的参数设置，以确保 SNR 足够，并最大限度地减少光出血。- 通过单击 查看 → 收购控制 → ND 收购，打开 ND 收购窗口。
- 输入路径/目的地和文件名，以保存弹出窗口上的 ND 文件。
- 检查与 z 系列对应的框。
- 点击 A1 加设置窗口 中的实时。 这将打开一个实时观看窗口。
- 调整显微镜上的对焦旋钮以选择单元格顶部，然后单击 ND 采集窗口中的 Top 以将当前位置设置为顶部。
注：建议将焦点稍微放在细胞顶部上方，以确保所有细胞都以 z 系列进行采样。 - 调整显微镜上的聚焦旋钮，选择单元格底部，然后单击 ND 采集窗口中的 底部 ，将当前位置设置为底部。
注意：将焦点稍微放在细胞底部以下，以确保对所有细胞进行采样。 - 输入 1 μm 的步进大小，为 z 扫描方向选择顶部底部， 然后单击 ND 采集窗口以获取 z 堆栈。
注：步数大小决定将根据顶部和底部位置（即所走的距离）获得的 z 切片数量。选择 1 μm 步幅大小作为成像速度、z 轴采样和光漂烁之间的折中。使用 2.4 AU 的共聚焦针孔直径和 60 倍水浸入目标，使光学节厚度达到 1.73 μm。因此，1 μm 的步数尺寸略低于 Nyquist 采样标准，但这是为减少获取 z 堆栈所需的时间而做出的妥协。对于速度不重要的非常稳定的样品，可以使用较小的 Z 轴步和可能较小的共焦针孔直径来增加 z 轴分辨率。底部顶部应产生类似的结果，并可用于评估 z 扫描期间可能发生的任何光出血效果。
- 如果可用，则设置完美对焦系统 （PFS）：
注：PFS 允许系统补偿图像采集过程中焦距的波动。以下步骤可用于设置 PFS，这些步骤可能因尼康 A1R 版本和使用的 NIS 元素版本而略有不同。- 突出显示ND采集窗口中范围图标定义的对称模式。
- 打开显微镜前表面的 PFS 按钮（确保位于样品阶段下方部分的二色镜旋钮处于"in"）。
- 使用 PFS 偏移控制器前面的旋钮重新定义顶部（逆时针旋转）和底部（顺时针旋转）。
- 通过单击 ND 采集窗口上的"相对"来定义相对 Z 位置/z 深度。
- 单击显微镜前表面的内存，以便软件记住相对 Z 深度。
- z 堆栈采集完成后，使用移液器轻轻添加所需的试剂（福斯科林或车辆控制），等待 10 分钟。
注：轻轻加入试剂，以免干扰细胞或移动显微镜XY阶段内细胞室的位置：在随后的实时视图或图像中验证试剂添加过程中视场未发生移动是有帮助的。10 分钟的等待时间是福斯科林治疗生效。如果采用替代疗法，可能需要调整等待时间。 - 10 分钟后，更改文件名并单击 ND 采集窗口中的 运行 。
- 重复步骤 2.11 = 2.13 如上文所述，至少 5 个覆盖唇，以便实现足够的统计分析结果（每个治疗组 n=5 = 福斯科林和车辆控制）。
- 准备样品和样品空白，以构建光谱库，并使用步骤 2.9 和 2.10 中概述的类似采集设置获取光谱图像。
3. 图像分析
注：这些图像将用于构建一个光谱库，其中包含研究中所有个体最终成员的纯光谱。如果使用不同的荧光素，光谱库中的末端成员可能会因研究而异。在名为"补充File_Spectral库"的补充信息文件中提供了构建光谱库的详细程序。在这里，我们描述向.tiff文件、线性光谱未混合、FRET 效率测量、三维重建和 cAMP 水平估计的输出数据。图像分析可以使用不同的图像分析和编程平台进行，如图像J、Python、MATLAB 或 CellProfiler。在这些研究中，使用了 MATLAB 脚本。
- 出口图像数据：
- 创建与在步骤 2.13 和 2.14 中获取的光谱 z 堆栈图像对应的相同文件名的新文件夹。
注：为导出数据概述的以下步骤特定于 NIS 元素 AR 版本 4.30.01。这些步骤可能因软件版本而略有不同。 - 单击 "文件"，这将打开一个文件窗口。浏览并选择在步骤 2.12 中获取的光谱图像文件，然后单击 "打开"。
- 文件加载后，单击 文件→ 进出口→ 出口 ND 文档。
- 在弹出窗口上：浏览并选择步骤 3.1.1 创建的文件夹，选择文件类型标记的图像格式 （TIF），然后 为每个通道选择单个图像 并 保持位深度。
注：文件前缀将预生成：为了方便起见，更改此值。索引顺序将根据所选通道而变化，并应显示"z、c"，以便根据 z 切片位置第一和第波长波段编号第二进行索引。确保与 应用 LUT 或 插入叠加 或 使用点名称 对应的框未选择。 - 单击 "导出" 将 tiff 文件导出到目的地文件夹，作为单个 tiff 文件。
- 重复步骤 3.1.2 - 3.1.5 以导出第 2.13 步中获取的光谱图像文件。
- 创建与在步骤 2.13 和 2.14 中获取的光谱 z 堆栈图像对应的相同文件名的新文件夹。
- 线性光谱未混合：
- 打开编程软件。
注：在南阿拉巴马大学生物成像和生物系统网站上（资源选项卡（https://www.southalabama.edu/centers/bioimaging/resources.html）下，自定义开发的编程脚本以解混原始光谱图像。 - 打开标有"线性解密.m"的文件，单击编辑器工具栏中的 运行 按钮。
- 浏览并选择包含 NIS 元素软件生成的导出 *.tif 文件序列的文件夹。
- 单击 "确定 "继续，这将打开一个名为 波长和 Z 切片的新窗口。
- 将第 3.2.4 步中选择的文件夹中的第一个文件（无 z 切片和通道号）的文件名复制并粘贴到标有"输入图像名称"的对话框的第一步。
- 进入第二步标记为"输入波长波段数"的通道数，在第三步标记为"输入 Z 切片数"的 Z 切片数量，然后单击 "确定"。
注：如果对采集设置（如调整波长范围或波长步幅大小）进行更改，波长波段的数目可能会发生变化。Z 切片的数量也可能根据细胞的高度而变化。 - 浏览并选择在弹出窗口中称为"波长.mat"的波长文件，该窗口标有"选择波长信息文件"，然后单击 打开。
- 浏览并选择新弹出窗口中的"Library.mat"文件，该窗口标有"选择光谱库文件"，单击 打开 并等待切片的解密完成。
注：Library.mat 文件是包含每个末端成员荧光片的纯光谱以及细胞自发光和背景光谱签名的文件。在这种情况下，最终成员氟包括绿松石、金星和DRAQ5。背景光谱特征包括细胞或矩阵自发光、覆盖唇荧光和覆盖唇衍射。波长.mat 文件是包含用于获取光谱图像的波长通道信息的文件。生物成像和生物系统网站上提供一个示例库文件和波长文件（请参阅 3.2.1 下的注释）。有关如何生成光谱库和波长文件的更多信息，请参阅名为"补充File_Spectral库"的补充信息文件。与每个 z 切片对应的未混合图像将被保存到在步骤 3.2.3 中选择的文件夹内的未混合过程中创建的称为"未混合"的文件夹中。
- 打开编程软件。
- FRET 效率计算：
- 打开名为"多FRRCF.m"的编程脚本，单击 "运行"。
注：此编程文件可从南阿拉巴马大学生物成像和生物系统网站（参见第 3.2.1 步下的注释）。 - 输入实验试验的数量，在名为"有多少文件夹要遗物"的弹出式对话框中进行分析，然后单击 "确定"。
注：每个实验的图像数据应保存在单独的未混合图像文件夹中。此步骤仅允许分析代码在多个文件夹上循环，作为节省时间的步骤。 - 浏览并选择未混合的文件夹，然后单击 "确定"。
注："浏览文件夹"弹出窗口打开的次数取决于前一步"要遗留的文件夹数量"对话框中输入的次数。一个接一个地浏览和选择文件夹。 - 在新的弹出窗口上，将以下信息输入相应的框：缩放因子为 12.4，阈值为 5.6、X、Y 和 Z 频率分别为 5、5 和 1，平滑算法为高斯。
注：缩放因子以像素/μm 表示，将用于将 Z 方向采样扩展到 XY 方向。缩放因子来自图像像素大小，该尺寸通常作为大多数共聚焦显微镜系统的图像中的元数据提供。例如，如果图像是以 0.08 μm/像素间距获得的，则缩放系数应为 12.5 像素/μm。阈值将用于对图像进行阈值并生成单元格的二进制掩码。我们根据图像供体/接受者强度创建了最佳值列表。如果图像具有明亮的供体/接受强度和较低的背景，则使用 4.5 作为阈值，对于只有中等供体/接受强度和/或更高背景的图像，值在 5.6 到 6.5 之间，对于具有低于背景的捐赠者/接受者强度的图像，则使用 7.5 或更高值。频率值对应于在随后的步骤中执行切片的像素数间隔。例如，如果 XY 方向的单元格深度为 17 μm，步进尺寸为 1 μm，缩放系数为 12.5 像素/μm，则 3 维图像数据集的深度将重新采样为 212 像素（Z 方向）。根据输入的 Z 频率值（例如 1 像素），从图像数据集顶部开始重新切片，然后以 1 像素向下的增量向下移动。这会导致 212 张遗物图像。如果为 Z 频率输入了较大的频率值区间，则生成的遗物图像将更少。遗留图像在随后的步骤中保存。 - 单击 运行 并等待所有 FRET 测量和遗物执行。
注：在父目录内创建一个单独的文件夹，将可保存遗留的灰度 FRET 效率图像和彩色（应用彩色图）FRET 效率图像。例如，所有在 X 方向 （YZ 平面） 中遗留的灰度和彩色图 FRET 图像都保存在称为"Resliced_XFRET"的文件夹中。 - 重复分析与类似的设置的所有实验 - 前后的福斯科林治疗和车辆控制。
注：第 3.3 节中提及的步骤描述了自定义 FRET 分析编程脚本要输入的值，以生成三维 FRET 图像数据。但是，此脚本在运行时执行多个操作，包括：加载图像数据、创建图像堆栈、平滑、FRET 效率计算、创建和应用单元格边框面罩、三维图像重建、在指定间隔（频率）处重新切片 3 维图像、应用颜色图可视化 FRET 更改以及将已遗留的图像数据保存到同一目录。其他详细信息已作为注释包含在程序脚本中。
- 打开名为"多FRRCF.m"的编程脚本，单击 "运行"。
4. 将 FRET 效率映射到 cAMP 级别
- 打开名为"Mapping_FRET Efficiency_to_cAMP_concentration.m"的编程文件，单击主窗口 运行 。
注：该文件可在生物图像和生物系统网站上找到（请参阅 3.2.1 下注释）。此文件读取灰度 FRET 效率图像，并根据特征曲线将其转换为 cAMP 级别。此特征曲线使用文献15、36中记录的 cAMP--FRET 关系，该关系由 Hill 方程（下图所示的第三个方程）描述。然而，在完整的细胞中的Kd探针是很难估计的，我们已经假设它是1μM在我们的计算。因此，结果显示为 Kd的函数。（即[cAMP] = x* Kd）。用于测量 FRET 效率并将 FRET 映射到 cAMP 级别的方程如下所示：
E 是 FRET 效率的位置，明显和d明显分别是接受方和捐赠者图像的未混合像素强度。
Qa和Qd是接受者和捐赠者的量子产量。请注意，当k+的方程包含在 FRET 效率方程中时，Qa和 Q d取消，k=是一个校正因子：
是捐赠者和接受者的灭绝系数，在捐赠者激发波长，i（405nm）。 
E 是 FRET 效率和 KD = 分离常数 = 1 μM。 - 导航并选择第一个灰度度 FRET 图像（保存在步骤 3.3.5 中），然后单击"确定"。
- 打开 FRET/cAMP 图像，以检查 CAMP 信号在三维的分布。
是捐赠者和接受者的灭绝系数，在捐赠者激发波长，i（405nm）。 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
本协议描述了使用高光谱 FRET 成像和分析方法测量活细胞中三个空间维度的 cAMP 梯度。生成这些结果涉及几个关键步骤，在分析和量化数据时需要仔细注意这些步骤。这些关键步骤包括构建适当的光谱库、背景光谱未混合、识别细胞边框的阈值以及 FRET 效率计算。 图1 说明了测量活细胞中FRET效率和cAMP水平所涉及的所有步骤的示意图流。如果执行得当，这些成像和分析步骤将允许测量 FRET 效率和估计 CAMP 空间梯度在细胞中的 3 个维度，同时考虑不均匀的背景信号。
图2描绘了在基线条件下（图2A）和福斯科林治疗10分钟后使用尼康A1R共聚焦显微镜获得的假彩色原始高光谱图像数据的三维视图。请注意，类似的探测器和系统参数用于获取处理前后的图像堆栈，以保持定量分析的一致性。还要注意，在计算 FRET 效率之前，此图像中 FRET 的变化并不明显，因为这纯粹是原始数据的可视化。
需要具有所有最终成员纯光谱的光谱库，以进一步分析原始光谱图像数据。构建适当的光谱库是确保适当测量 FRET 效率的关键步骤之一。图3展示了一个包含末端成员纯光谱的光谱库的建设（在这些当前的研究中，最终成员是绿松石、金星和DRAQ5）。为了测量FRET的效率，重要的是使用1：1的样本来获取绿松石和金星的光谱。在这里，我们提供了一种方法，接受者氟化物是完全光毁，允许光谱签名的捐赠者和接受者与1：1的骨科测量获得（图3A-F）。此外，应用激光之间的线性功率关系（补充图1）来计算接受光谱的强度，如果使用捐赠者激发激光激发，在这种情况下，绿松石405纳米（图3G）。这确保了当 FRET 用单个 405 nm 激光线激发时，未混合的供体和接收方信号在绝对强度上具有可比性。使用标有核染料的非转染细胞DRAQ5（图3H）获得DRAQ5的纯谱（图3I）。结合捐赠者的光谱，绿松石（图3F），接受者，金星（图3G）和DRAQ5（图3I），一个3组分库被创建（图3J）。
样品中也可能存在来自荧光标签以外的来源的信号。为了说明这一点，在未标记的细胞样本中识别了三个不同的光谱特征，其峰值为 424 nm、504 nm 和 574 nm。我们相信，这些光谱特征对应于覆盖唇反射和细胞基质或细胞自发光。 图4 描绘了这三个背景光谱签名的来源。请务必注意，这些信号在样本中分布不均匀，因此不能简单地减去。但是，将这些信号的光谱特征添加到光谱库，并使用线性解密来分离信号，这为在计算 FRET 效率之前从供体和接受方信号中删除这些混淆信号提供了一种方法。为此，在三组分光谱库中增加了三个背景光谱签名，形成了一个新的 6 组分库，由供体（绿松石）、接受者（维纳斯）、DRAQ5 和三个背景光谱签名组成。
编写了自定义编程脚本，将光谱图像数据拆分为各个端子，并编写了单独的脚本以执行后续的 FRET 效率计算。线性光谱未混合（图5所示）使用6组分光谱库执行。轴向图像堆栈中的每一片（也称为 z 堆栈）执行了取消混合（指图 5A中原始光谱图像数据的三维可视化）。这导致每个端端成员的单独未混合图像，z 堆栈中的每个 z 切片（图 5C+E，未显示背景未混合图像）。如果需要，未混合的信号可能是假彩色的可视化，每个未混合信号的颜色不同（图5F-H）。
图 6 说明了 FRET 效率计算中涉及的步骤，以及将 FRET 效率映射到 cAMP 级别的步骤。使用平滑的未混合供体和接受方图像生成 FRET 效率图像。使用未混合的供体、接受方和核图像获得二元掩码图像。该掩码应用于 FRET 效率图像，以从单元格外的像素中删除贡献。虽然单个 z 切片中的未混合图像用于 FRET 效率测量的图形演示，但这些计算是在 3 维图像堆栈中的每个切片上执行的。然后，三维 FRET 图像数据集被遗留在三个正交平面上，以可视化不同方向的 CAMP 信号的空间梯度。
可视化激动剂引起的 FRET 效率和 cAMP 水平变化
上述步骤提供了一种方法，用于计算三个空间维度中的高光谱图像数据中的 FRET 效率和 cAMP 水平。这些步骤可用于细胞制剂治疗前后与化合物，引起cAMP反应，如福斯科林。在这里，我们提供了一个例子，使用这种方法观察使用50μM福斯科林治疗后PMVECs中FRET和cAMP分布的变化。 图 7 说明了从尖顶到基底的不同 XY 平面切片（z 切片）中 FRET 效率和 cAMP 水平的变化，从而可以比较基线条件（在福斯科林治疗之前）和治疗后 10 分钟。在这个说明性的例子中，FRET效率下降（列1和图 7中的3）后，福斯科林治疗，与CAMP水平增加（列2和图 7第4）。观察到单个 XY 平面内 cAMP 的空间变异最小。然而，轴向（从轴向到基底）cAMP空间梯度被观察到，可以推测，通过注意到尖峰切片有更深的红色（表明更高的cAMP水平通过颜色查找表应用）比基底切片后福斯科林治疗（列4在 图7）。轴向 FRET 或 cAMP 分布通常可以更好地利用从两个矫形空间平面获得的图像进行可视化：图 8 描绘了 YZ 平面中的 FRET 效率和 cAMP 水平（列 1 和 2）和福斯科林处理后 10 分钟（列 3 和 4），而 补充图 2 描绘了 XZ 平面中的 FRET 效率和 cAMP 水平变化。这些结果证明了从三维高光谱图像数据中测量 FRET 和估计 cAMP 水平的可行性，也证明了可视化 FRET 或 cAMP 轴向分布的重要性。虽然超出了本方法论论文的范围，但可能是环核苷酸的轴向空间分布有助于循环核苷酸信号通路中的特异性。
在执行上述方法时，必须仔细检查步骤的准确性，并运行适当的实验和车辆控制，以确保 FRET（和相应的 cAMP） 变化是由于供体和接收信号的实际变化，而不是成像伪影。例如，需要考虑的重要步骤包括：
使用包含所有所需光谱组件的适当光谱库
如前所述，来自细胞自发光、沉积基质或覆盖唇反射光（激发-发射流经）的背景信号可能有重大贡献。 图 9 代表一个示例数据集，说明当使用 3 组件（绿松石、金星和 DRAQ5）库拆解光谱数据时，背景信号保留在图像中。相比之下，当使用更完整（和适当的）6 组分光谱库时，背景信号被有效地删除。
使用最佳阈值生成单元格面罩
在我们进行的许多实验中，背景信号强度大约是原始光谱图像数据中存在 FRET 信号强度的 50-60%（即，在可视化未处理的光谱图像数据时，FRET 信号的峰值仅比周围背景信号高 2 倍）。因此，使用阈值获取二进制掩码的背景信号与前景信号分离是一个敏感步骤，必须仔细执行以避免分析伪影。 图10 说明了用于细胞分割以创建细胞二进制面罩的不同阈值值的影响。低阈值可能包括背景信号作为表达单元格的一部分。另一方面，过高的阈值可能排除在低表达细胞或低供体-接受信号的细胞区域（细胞非常薄的部分或可能具有较低区域浓度的 FRET 探针的部分）中测量 FRET。
选择具有供体/接受者信号强度的转染细胞≥背景信号
图 11 说明了一个示例数据集，其中从使用 6 组分光谱库获得的未混合图像中测量 FRET 效率和相应水平，以便进行线性光谱解密。尽管使用 6 组分库来解密光谱图像数据，并选择创建细胞边框和核掩蔽的高阈值，但 FRET 效率图像仍然容易在细胞基底一侧附近产生高背景噪声信号。在这种情况下，背景噪声的存在是由于选择的单元格只是弱表达FRET探针，捐赠者-接受者信号强度大致等于背景信号强度，即使在未混合之后。因此，除了应用上述复杂的分析步骤外，在采集过程中选择具有足够表达 FRET 探头和相应足够 FRET 信号（至少等于或高于噪声信号）的单元格也很重要，以确保高质量的结果。
图1：流程图，使用高光谱FRET成像和分析，描绘了在三个空间维度中涉及FRET效率和水平测量的步骤。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：从细胞和周围非表达细胞（红色）表达cAMP FRET报告（绿色）和核的细胞的三维可视化。使用尼康 A1R 光谱共聚焦显微镜获得的原始光谱图像数据根据波长被假色，并使用 NIS 元素软件可视化为 3 个维度。A） 基线和 B 处的三维图像数据）在 50 μM 福斯科林处理后 10 分钟。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：在研究中建造一个包含荧光标签纯光谱的光谱库（遥感领域称为最终成员）。A） 表达FRET生物传感器在405纳米激发（供体激发）下获得的细胞的假彩色图像。B） 与 FRET 信号对应的频谱：在图像 A 上绘制了 4 个不同的兴趣区域 （ROI），该图像由红色、黄色、蓝色和绿色矩形显示。每个所选投资回报率的平均强度被输出。这 4 个 ROI 的平均强度是以每个发射波长绘制的。光谱的发射峰值对应于供体（绿松石）和接受者（金星）荧光。C） 表达 FRET 生物传感器的细胞的假彩色图像，以 488 nm 激发（接受者激发）获得。D） 平均频谱估计为 B 中从 C 中的几个 ROI（与 A 中相同的区域）中解释，排放峰值仅由接受者决定。E） 在接受氟化物被514纳米照射后，以405纳米激发获得的表达FRET生物传感器的细胞的假彩色图像。F） 平均频谱估计为B，从E（与A相同的区域）的几个投资回报率中解释，排放峰值只由于供体。请注意，与原始 FRET 信号相比，捐赠者的强度在 F 中增加，这表明接受者发生光出血后，捐赠者的兴奋导致直接的捐赠者排放。G） 接受光谱，如使用 405 nm 激发获得，则如预期的那样。这是利用事实估计的，405纳米和488纳米激发激光器具有线性反应，可以使用光谱仪和集成球体（补充图1）和金星的波长依赖灭绝系数来描述。因此，在488纳米激发处获得的金星光谱可以转换成金星光谱，如果在405纳米激发H）获得，则可以预期到用核标签DRAQ5标记的细胞的假彩色图像。I） 来自 H. J） 几个感兴趣区域的平均光谱） 由此产生的光谱库，包含捐赠者和 DRAQ5 的正常纯光谱以及接受方的激发波长/更正光谱。请注意，绿松石和金星光谱被正常化为合并绿松石和金星光谱数据的最大值，而DRAQ5只是根据峰值发射波长值正常化为统一。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：已识别背景光谱特征并包含到光谱库中，以说明在不混合过程中的背景荧光信号。A、B） 在描述样本空白（无标记覆盖唇）时观察到两个背景荧光光谱特征。这些光谱特征是根据峰值波长命名的-一个在424纳米（从覆盖层荧光）和另一个在504纳米（可能来自反射或背部散射）。C） 在分析未标记的细胞时，观察到第三个背景光谱特征，峰值发射波长为 574 nm，可能来自细胞自发光或底层基质的荧光。D） 从图像 A、B 和 C 中提取的背景光谱。这三个背景光谱被添加到现有的3组分库（图3J），以开发一个6组分光谱库。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：使用用于背景信号的6组分光谱库进行线性光谱解密。A） 原始光谱图像数据作为轴向 z 堆栈获取。B） 用于线性非混合原始光谱数据的 6 组分光谱库。C、D 和 E） DRAQ5、绿松石和金星的灰度未混合图像分别由线性光谱未混合产生。F、G 和 H） 分别对 DRAQ5、绿松石和金星的假彩色未混合图像。还计算了背景信号的未混合图像（此处未显示的数据，因为只有荧光标签才对本方法感兴趣 - 请参阅 Annamdevula中的图 4等，以示未混合的背景信号25）。请单击此处查看此图的较大版本。
图 6： 流程图，从未混合的光谱图像数据中描述计算 FRET 和 cAMP 水平时所涉及的步骤。A） 代表未混合的捐赠者形象，绿松石。B） 代表接受者金星的未混合图像。C） 代表核未混合图像，DRAQ5。D） 二元细胞掩蔽由阈值未混合的供体/接受者总结图像生成。E） 对核图像应用阈值，以创建核的二进制掩码。F） 像素明智的 FRET 效率是从未混合的供体和接受者图像中计算出来的。G） 从细胞边框和核面罩中创建复合二进制面罩。H） 蒙面FRET效率图像：复合细胞掩蔽应用于FRET效率图像，以排除细胞外和细胞核内的非特定FRET信号。I） 将色图应用于蒙面 FRET 效率图像，以便更好地可视化 FRET 的空间变化。J） 从 FRET 效率图像中估算的 cAMP 级别图像。K） 彩色图用于更好地可视化 cAMP 中的空间变化。右侧显示的彩条用于可视化 FRET 效率（顶部面板）和 cAMP 水平（下面板）。此图中显示的图像表示单个轴 Z 切片，但此图中描述的分析操作在整个轴向 z 堆栈上执行。 请单击此处查看此图的较大版本。
图7：福斯科林诱导的FRET效率和CAP空间梯度可视化在PMVEC。XY平面图像是通过在轴向 （Z） 方向从轴向到细胞的基底一侧的三维重建 FRET 和 cAMP 图像数据进行切片生成的。显示五个连续 XY 切片。列 1 和 3 分别表示基线和治疗后 10 分钟的 FRET 效率，分别使用 50 μM 福斯科林。列 2 和 4 表示基线水平和福斯科林治疗后 10 分钟。色条用于将色图的变化与 FRET 效率（顶部）和 cAMP 级别（底部）联系起来。第 2 列和第 4 列图像上显示的白线用于生成此选定行中的 cAMP 信号的强度配置文件（线扫描配置文件）。从基线（蓝色轮廓）和福斯科林治疗（绿色轮廓）细胞中切片获得的强度配置文件图演示了 CAMP 信号在整个线扫描的空间分布。刻度条表示 20 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。
图8：福斯科林诱导的FRET效率和CAMP空间梯度可视化轴向。YZ 平面图像是通过在横向 （X） 方向（从细胞的左侧到右侧）中对三维重建的 FRET 和 cAMP 图像数据进行切片生成的。列 1 和 3 分别表示基线和 50 μM 福斯科林治疗后 10 分钟的 FRET 效率。列 2 和 4 表示基线和福斯科林治疗后 10 分钟的 cAMP 水平。右侧的色条用于将色图的变化与 FRET 效率（顶部）和 cAMP 级别（底部）联系起来。 请单击此处查看此图的较大版本。
图9：比较使用3组分或6组分光谱库计算FRET和cAMP水平图像的有效性。使用 3 组分库计算的图像中观察到了非特定的背景信号，该库没有考虑背景光谱签名。在 50 μM 福斯科林治疗（列 2）后，细胞基底一侧附近的图像尤其如此。相比之下，使用包含背景光谱签名的 6 组分库时，背景信号工件被有效地删除，从而提高了分割单元格和分析 FRET 和 cAMP 信号的能力。 请单击此处查看此图的较大版本。
图10：如果不选择适当的阈值来描绘细胞和核边界，可以引入图像分析伪影。未混合的供体和接受者图像用于创建具有三种不同阈值的掩码：0.35（列 1 作为 2）、0.65（列 3 和 4）和 0.9（列 5 和 6）。列 1、3 和 5 在基线上显示 FRET 效率。列 2、4 和 6 显示 FRET 效率在 50 μM 福斯科林治疗后 10 分钟。选择一个过低的阈值会导致部分背景或细胞外区域被包含在细胞中进行分析，而选择过高的阈值会导致部分单元格丢失（与列 3-4 相比，请参阅列 4-5 中的 apical 切片）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图11：即使背景在创建二进制掩码期间未混音并选择适当的阈值，背景信号人工制品仍可能持续存在。第 1 列显示基准线和列 2 中的代表性尖峰、中间和基底切片，在 50 μM 福斯科林处理后 10 分钟内显示相同的切片。尽管使用 6 组分库进行解密，用于考虑背景信号，并利用较高的阈值 0.85 进行二进制面罩生成，但背景区域仍被确定为细胞的一部分，尤其是在与福斯科林一起治疗后。如果发生这种情况，一个可能的解释可能是，选择一个表达微弱的 FRET 记者的细胞进行成像。 请单击此处查看此图的较大版本。
补充图1：测量激光线强度作为软件中激光设置的功能。 将光纤耦合光谱仪和集成球体校准为 NIST 可追踪灯，以测量 405 nm 激光线和 488 nm 激光线的激光强度。A） 在显微镜阶段测量的光子总数与 405 nm 激光的不同激光强度相对应。B） 在显微镜阶段测量的光子总数，对应于 488 nm 激光的不同激光强度。在显微镜阶段测量的两种激光均观察到激光强度的线性响应。线性趋势线是合适的，每个激光线的趋势线方程用于计算接受光谱，如果兴奋与405nm激光线（捐赠者激发）预期。 请点击这里下载此图。
补充图2：福斯科林诱导的FRET效率和轴向可视化的CAMP空间梯度。 XZ 平面图像是通过在横向 （Y） 方向（从细胞前后）中切片 3 维重建的 FRET 和 cAMP 图像数据生成的。列 1 和 3 分别表示基线和 50 μM 福斯科林治疗后 10 分钟的 FRET 效率。列 2 和 4 表示基线和福斯科林治疗后 10 分钟的 cAMP 水平。右侧的色条用于将色图的变化与 FRET 效率（顶部）和 cAMP 级别（底部）联系起来。与YZ平面（图8）显示的结果类似，FRET 效率和 cAMP 水平的基底空间梯度可可视化为单个 YZ 切片顶部到底部的颜色变化，无论是在基线条件（列 1-2 中的任何给定切片）还是在 50 μM 福斯科林处理（列 3-4）之后。 请点击这里下载此图。
补充文件。请点击这里下载这些文件。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FRET生物传感器的研制使单细胞环核苷酸信号的测量和可视化，对13、22、37、38等亚细胞信号事件的可视化大有可为。然而，使用FRET生物传感器存在一些局限性，包括许多荧光蛋白基FRET记者的低信号到噪声特性，以及FRET记者的弱透射或表达效率（这在某些细胞系中可能特别具有挑战性，如PMVECs）23、24。弱表达荧光蛋白的成像，结合比率测量FRET计算，往往导致计算的FRET效率的高度不确定性或波动。为了提高FRET测量的可靠性，我们和其他人以前已经证明使用高光谱成像和分析来测量FRET信号，并减少荧光标签和自发光效应之间的荧光信号的相声或出血26，31，32，39。由于信号强度的限制，这些光谱FRET研究直到最近才被限制为两个（X和Y）空间维度。因此，他们提供了细胞内FRET变化的单片视图。
在最近的研究中，我们注意到FRET（和相应的cAMP水平）似乎不仅在XY平面上，而且在XZ和YZ平面25之间分布。此处描述的超光谱 FRET 成像方法扩展了我们可视化和测量 FRET 和环核苷酸 （cAMP） 变化成三个空间维度的能力，为评估信号分隔化开辟了新的可能性。这种 4 维（X、Y、Z 和 +）高光谱成像和分析方法允许在三个空间维度中测量和可视化 cAMP 梯度，同时考虑不均匀的背景信号。在这里，我们已经演示了如何通过福斯科林诱导的 cAMP 空间梯度示例来实现此方法。在治疗后图像数据中，可以观察到从细胞的尖顶到基底侧（图7和图8）的cAMP空间梯度。与福斯科林治疗后产生的CAMP似乎没有达到细胞结（图7和图8）。
在利用此处描述的方法时，必须考虑背景和自动发光信号的不同来源，以便准确估计 FRET 效率。线性解密提供了一个潜在的途径来计算独特的背景光谱，如果他们的签名不同于感兴趣的荧光探针。特别是，线性解密比标准背景减法更适合分离背景和自动荧光信号。40，41，42在此示例中，根据签名的峰值发射波长测量并分配了三个不同的光谱特征：424 nm 背景光谱（可能来自覆盖唇荧光）、504 nm 背景光谱（可能是反射光或反向散射光）和 574 nm 背景光谱（可能是由于细胞或细胞基质自发光）。为了说明未能解释这些签名的影响，创建了两个光谱库，并比较了未混合的图像。首先，创建了一个光谱库，其中仅包含样品中的荧光标签，绿松石、金星和 DRAQ5，并标记为 3 组分库。其次，创建了一个光谱库，其中还包含三个背景光谱签名，并标记了 6 个组分的库。如上所示，与 6 组分库（背景未混合）进行混音允许删除背景信号，而与 3 组分库进行混音则不允许（图 9）。在以前的工作中，我们已经表明，使用同时显示荧光标签和背景签名的光谱库时，与线性解密相关的根平均方形误差 （RMSE） 会减少。需要注意的是，背景荧光的轴向分布通常不均匀，因此，简单的背景减法无法校正图像数据。因此，需要光谱未混合方法来提供准确的背景去除和可靠的 FRET 测量。
在获取光谱图像时，必须优化系统参数以选择最佳的系统和摄像机设置。总体目标应该是优化 SNR，同时最大限度地减少获取时间并防止光出血。43 因此，在优化成像系统时，通常需要空间、时间和光谱分辨率之间的折衷。在这些研究中，为系统和相机设置（包括针孔大小、激光功率、扫描速度、扫描大小和帧平均值）选择了最佳值，如协议部分所述。利用这些设置，空间采样为 80 nm/像素，每光谱 z 堆栈的时间采样为 +3 分钟（+10 秒/XY 图像），光谱采样为 10 nm 间隔，光谱采样的间隔可以忽略不计的或最小的光模糊度。
为了确保对FRET效率的准确估计，有必要测量捐赠者和接受者光谱，如预期的那样，以1：1的测量和相同的激发波长（图3）。绿松石和金星光谱与绿松石峰值发射波长正常化。使用这个光谱库估计的FRET效率产生的值与文献12，22中报告的值相似。通常，库中的末端成员光谱会正常化为统一。但是，要准确计算 FRET 效率，必须获取供体光谱（即等位浓度或 1：1 的测量结果，并引用相同的激发波长）。除了使用结构适当的库外，还涉及适当估计 FRET 效率和避免分析人工制品的几个步骤。其中包括选择具有足够信号强度的表达单元格（图11），在估计FRET效率之前对未混合图像进行平滑（本示例中应用了高斯模糊），使用适当的阈值创建掩码（图10），以及使用供体和接受者的消亡系数（补充File_Spectral库）估算校正因子。当遵循这些步骤时，FRET 效率和底层 cAMP 水平的三维分布可以在单个单元中精确可视化。
使用目标FRET生物传感器13，37，局部CPMP信号估计为双空间维度。但是，将 FRET 探头定位到特定的子细胞隔间（例如等离子膜或脂质筏）通常会导致探针的局部浓度增加。这可能导致由于分子间或双分子 FRET 引入测量器件。此外，这里和安南德沃拉 et.al 2018年提出的结果，Cytometry A25证明了从可溶性或目标探头对FRET进行三维测量的重要性。
尽管在三个空间维度中测量 cAMP 信号很重要，但这种方法也有局限性。限制最大的限制是所需的长获取时间 - 每个光谱 z 堆栈大约 3 分钟。此采集速率排除了使用此方法检测细胞中准稳定状态 cAMP 分布以外的任何情况。这就是说，所展示的结果表明，将准稳定状态三维（x、y、z）cAMP测量作为标准2维（x，y）测量的关键补充的重要性。将来，将标记的蛋白质和细胞结构纳入实验设计将是有趣的。仔细选择用于标记蛋白质（和/或结构）的荧光素，可以评估标记蛋白和FRET的三维分布，而不会额外损失获取速度。这反过来又允许在三个空间维度上测量标记蛋白附近的局部 CAMP 信号和 cAMP 信号，从而为目标 cAMP 探针提供重要的实验补充，并进一步扩大活细胞中三维 cAMP 分布的超光谱测量效用。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Leavesley博士和Rich博士披露了一家初创公司SpectraCyte的财务利益，该公司的成立是为了将光谱成像技术商业化。但是，本协议中描述的所有程序都是使用与 SpectraCyte 有限责任公司无关的商用产品进行的。
Acknowledgments
作者感谢Kees Jalink博士（荷兰癌症研究所和荷兰阿姆斯特丹范利乌文霍克高级显微镜中心）为我们提供了H188 cAMP FRET生物传感器和肯尼·特里恩（南阿拉巴马大学工程学院）的技术帮助，以减少运行我们自定义开发的编程脚本所花的时间。
作者要感谢资金来源：美国心脏协会（16PRE27130004），国家科学基金会：（1725937） NIH， S100D020149， S10RR027535， R01HL058506， P01HL066299）.）
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Attofluor Cell Chamber | Invitrogen | A7816 | Attofluor contains steel cell chambers and a rubber O-ring. Cell chamber holds the coverslip and O-ring provides a lock in mechanism to hold the buffer in cell chamber with out leakage |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Solvent used to prepare stock solution forskolin. |
| DRAQ5 Fluoroscent Probe Solution | Thermo Scientific | 62252 | Nuclear label |
| Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Contains nutrients and growth factors for the cells to grow and divide in the culture dishes. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F6178 | Growth factor suppliment that is added to culture medium, DMEM |
| Forskolin | Sigma | F3917 | Adenyly cyclase activator. |
| H188 Cyclic AMP FRET biosensor | Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink | Gift | Plasmid encoding Turquoise (donor fluorophore), Venus (acceptor fluorophore), and binding domain obtained from Epac. |
| Image J | image.net | Free download | Another image processing platform used to extact spectral information and image processing. |
| Integrating Sphere | Ocean Optics | FOIS-1 | Used to measure illumination intensity of the laser line at different laser intensities (?). |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Invitrogen | 23017-015 | Coverslips are coated with laminin and this helps in cell attachment, growth and motility of the cell. |
| Lipofectamine 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000-015 | Transfection reagent used to transfect cells with H188 FRET biosensor |
| MATLAB | Mathworks | R2019a | Image processing operations (linear unmixing and FRET efficiency calculations) are performed by writing custom programs in MATLAB programming environment |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon Instruments | Nikon A1R | Spectral image acquisition is performed using confocal microscope. |
| Nikon Elements Software | Nikon Instruments | Software dongle | used to export and handle nd2 image files (multidimensional image files) that are aquired using Nikon A1R |
| NIST-Traceable Calibration Lamp | Ocean Optics | LS-1-CAL-INT | A lamp with a known spectrum for use as a standard |
| PBS pH 7.4 (1X) | Gibco | 10010-023 | coomonly used buffer suring cell culture |
| Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs) | In house - Cell culture core, Univeristy of South Alabama | Isolated from Rat pulmonary microvasculature | PMVECs form inner lining of a blood vessel. |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | antibiotics are added to culture medum to prevent contamination of the cells. |
| Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides | Clay Adams | 3010 | Microscope slides used for cell fixation |
| ProLong Diamond Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36961 | If samples are fixed using antifade mountant, then the later protects fluoroscent dyes and chromophores from fading. |
| Spectrometer | Ocean Optics | QE65000 | Used to measure spectral response of the light source (?) |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 | Digests the protein-protein bond between the cell and cell matrix and helps to disscociate and lift the cells during cell plating. |
| Tyrodes Buffer | Made in-house | Made in-house | Tyrodes buffer is used to make working solutions and to maintain cells in aqueous solution during image acquisition. |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3506 | Laminin coated coverslips are placed in 6-well culture dish (one coverlisps/well). Cells along with medium is added into each well. |
| 25 mm Round Microscope Cover Slips | Fisher Scientific | 12545102 | Cells were grown on round glass coverslips |
| 60X Ojective | Nikon Instruments | Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 | water immersion and commonly used objective for cells |
References
- Corbin, J. D., Sugden, P. H., Lincoln, T. M., Keely, S. L. Compartmentalization of adenosine 3':5'-monophosphate and adenosine 3':5'-monophosphate-dependent protein kinase in heart tissue. The Journal of Biological Chemistry. 252, 3854-3861 (1977).
- Terrin, A., et al. PGE1 stimulation of HEK293 cells generates multiple contiguous domains with different [cAMP]: role of compartmentalized phosphodiesterases. The Journal of Cell Biology. 175, 441-451 (2006).
- Bacskai, B. J., et al. Spatially resolved dynamics of cAMP and protein kinase A subunits in Aplysia sensory neurons. Science. 260, 222-226 (1993).
- Iancu, R. V., Ramamurthy, G., Harvey, R. D. Spatial and temporal aspects of cAMP signalling in cardiac myocytes. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 35, 1343-1348 (2008).
- Brunton, L. L., Hayes, J. S., Mayer, S. E. Functional compartmentation of cyclic AMP and protein kinase in heart. Advances in Cyclic Nucleotide Research. 14, 391-397 (1981).
- Hohl, C. M., Li, Q. Compartmentation of cAMP in adult canine ventricular myocytes. Relation to single-cell free Ca2+ transients. Circulation Research. 69, 1369-1379 (1991).
- Rich, T. C., et al. A uniform extracellular stimulus triggers distinct cAMP signals in different compartments of a simple cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 13049-13054 (2001).
- Sayner, S. L., Alexeyev, M., Dessauer, C. W., Stevens, T. Soluble adenylyl cyclase reveals the significance of cAMP compartmentation on pulmonary microvascular endothelial cell barrier. Circulation Research. 98, 675-681 (2006).
- Rich, T. C., Tse, T. E., Rohan, J. G., Schaack, J., Karpen, J. W. In vivo assessment of local phosphodiesterase activity using tailored cyclic nucleotide-gated channels as cAMP sensors. The Journal of General Physiology. 118, 63-78 (2001).
- Blackman, B. E., et al. PDE4D and PDE4B function in distinct subcellular compartments in mouse embryonic fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 286, 12590-12601 (2011).
- Sayner, S. L., et al. Paradoxical cAMP-induced lung endothelial hyperpermeability revealed by Pseudomonas aeruginosa ExoY. Circulation Research. 95, 196-203 (2004).
- Klarenbeek, J., Jalink, K. Detecting cAMP with an EPAC-based FRET sensor in single living cells. Methods in Molecular Biology. 1071, 49-58 (2014).
- Surdo, N. C., et al. FRET biosensor uncovers cAMP nano-domains at β-adrenergic targets that dictate precise tuning of cardiac contractility. Nature Communications. 8, 15031 (2017).
- Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Reports. 5, 1176-1180 (2004).
- Vogel, S. S., Thaler, C., Koushik, S. V. Fanciful FRET. Science's STKE. 2006, (2006).
- Clegg, R. M. The History of FRET: From conception through the labors of birth. Reviews in Fluorescence. 3, (2006).
- Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-224 (2006).
- Manzella-Lapeira, J., Brzostowski, J. A. Imaging protein-protein interactions by Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy in live cells. Current Protocols in Protein Science. 93, 58 (2018).
- Cooper, D. M. F., Mons, N., Karpen, J. W. Adenylyl cyclases and the interaction between calcium and cAMP signalling. Nature. 374, 421-424 (1995).
- Sassone-Corsi, P. Coupling gene expression to cAMP signalling: role of CREB and CREM. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 30, 27-38 (1998).
- Rebhun, L. I. Cyclic nucleotides, calcium, and cell division. International Review of Cytology. 49, 1-54 (1977).
- Klarenbeek, J., Goedhart, J., Van Batenburg, A., Groenewald, D., Jalink, K. Fourth-generation Epac-based FRET sensors for cAMP feature exceptional brightness, photostability and dynamic range: characterization of dedicated sensors for FLIM, for ratiometry and with high affinity. PLOS ONE. 10, 0122513 (2015).
- Leavesley, S. J., Rich, T. C. FRET: signals hidden within the noise. Cytometry Part A. 85, 918-920 (2014).
- Rich, T. C., Webb, K. J., Leavesley, S. J. Can we decipher the information content contained within cyclic nucleotide signals. The Journal of General Physiology. 143, 17-27 (2014).
- Annamdevula, N. S., et al. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
- Leavesley, S. J., Britain, A. L., Cichon, L. K., Nikolaev, V. O., Rich, T. C. Assessing FRET using spectral techniques. Cytometry Part A. 83, 898-912 (2013).
- Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming limitations of FRET measurements. Cytometry Part A. 89, 325-327 (2016).
- Fink, D. J. Monitoring Earcths Resources from Space. Technology Review. 75, 32-41 (1973).
- Goetz, A. F. H., Vane, G., Solomon, J. E., Rock, B. N. Imaging Spectrometry for Earth Remote Sensing. Science. 228, 1147-1153 (1985).
- Bücherl, C. A., Bader, A., Westphal, A. H., Laptenok, S. P., Borst, J. W. FRET-FLIM applications in plant systems. Protoplasma. 251, 383-394 (2014).
- Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. Journal of Microscopy. 228, 139-152 (2007).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Letters. 531, 245-249 (2002).
- Griswold, J. R., Annamdevula, N., Deal, J., Rich, T., Leavesley, S. Estimating FRET Efficiency using Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging. Biophysical Journal. 112, 586 (2017).
- Favreau, P. F., et al. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19, 046010 (2014).
- King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvascular Research. 67, 139-151 (2004).
- Thaler, C., Koushik, S. V., Blank, P. S., Vogel, S. S. Quantitative multiphoton spectral imaging and its use for measuring resonance energy transfer. Biophysical Journal. 89, 2736-2749 (2005).
- Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Frontiers in Pharmacology. 9, 332 (2018).
- Johnstone, T. B., Agarwal, S. R., Harvey, R. D., Ostrom, R. S. cAMP signaling compartmentation: Adenylyl cyclases as anchors of dynamic signaling complexes. Mol Pharmacol. , (2017).
- Zhang, J., Li, H., Chai, L., Zhang, L., Qu, J., Chen, T. Quantitative FRET measurement using emission-spectral unmixing with independent excitation crosstalk correction. Journal of Microscopy. 257, 104-116 (2015).
- Zhang, J., Lin, F., Chai, L., Wei, L., Chen, T. IIem-spFRET: improved Iem-spFRET method for robust FRET measurement. Journal of Biomedical Optics. 21, 105003 (2016).
- Levy, S., et al. SpRET: highly sensitive and reliable spectral measurement of absolute FRET efficiency. Microscopy and Microanalysis. 17, 176-190 (2011).
- West, S. J., et al. Hyperspectral Measurements Allow Separation of FRET Signals from Non-Uniform Background Fluorescence. Biophysical Journal. 112, 453 (2017).
- Annamdevula, N. S., et al. An approach for characterizing and comparing hyperspectral microscopy systems. Sensors. 13, Basel. 9267-9293 (2013).
