Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

זריעת תאים Stepwise על פיגומים Tessellated ללמוד כלי דם מונבטים

Published: January 14, 2021 doi: 10.3791/61995
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Faculty of Biomedical Engineering, Technion, 2Department of Chemical Engineering and Biointerfaces Institute, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

רקמות מהונדסות מסתמכות במידה רבה על רשתות כלי דם נאותות כדי לספק חומרים מזינים וגזים חיוניים ולהסיר פסולת מטבולית. בעבודה זו, פרוטוקול זריעה צעד אחר צעד של תאי אנדותל ותאי תמיכה יוצר רשתות כלי דם מאורגנות מאוד בפלטפורמת תפוקה גבוהה לחקר התנהגות כלי שיט מתפתחת בסביבה תלת-ממדית מבוקרת.

Abstract

מערכת הלב וכלי הדם היא שחקן מפתח בפיזיולוגיה האנושית, מתן הזנה לרוב הרקמות בגוף; כלי שיט נמצאים בגדלים שונים, מבנים, פנוטיפים וביצועים בהתאם לכל רקמה מפוזרת ספציפית. תחום הנדסת הרקמות, שמטרתו לתקן או להחליף רקמות גוף פגומות או חסרות, מסתמך על אנגיוגנזה מבוקרת כדי ליצור כלי דם נאות בתוך הרקמות המהונדסות. ללא מערכת כלי דם, מבנים מהונדסים עבים לא ניתן להזנה מספקת, אשר עלול לגרום למוות תאים, תחריט לקוי, ובסופו של דבר כישלון. לכן, הבנה ושליטה על ההתנהגות של כלי דם מהונדסים היא אתגר יוצא דופן בתחום. עבודה זו מציגה מערכת תפוקה גבוהה המאפשרת יצירת רשתות כלי שיט מאורגנות וחוזרות על עצמן לחקר התנהגות כלי שיט בסביבת פיגומים תלת-ממדית. פרוטוקול זריעה דו-שלבי זה מראה כי כלי שיט בתוך המערכת מגיבים לטופוגרפיית הפיגומים, ומציגים התנהגויות נבטים ייחודיות בהתאם לגיאומטריית התא שבה שוכנים כלי השיט. התוצאות המתקבלות והבנה ממערכת תפוקה גבוהה זו ניתן ליישם על מנת ליידע טוב יותר 3D ביו מודפס עיצובים מבנה פיגומים, שבו ייצור של גיאומטריות 3D שונות לא ניתן להעריך במהירות בעת שימוש בהדפסה 3D כבסיס לסביבות ביולוגיות תאיות. יתר על כן, ההבנה ממערכת תפוקה גבוהה זו עשויה להיות מנוצלת לשיפור סינון תרופות מהיר, ההתפתחות המהירה של מודלים של תרבויות משותפות, וחקירת גירויים מכניים על היווצרות כלי דם כדי להעמיק את הידע של מערכת כלי הדם.

Introduction

תחום הנדסת הרקמות מתקדם במהירות לקראת ייצור מבנים מהונדסים להחלפת איברים ורקמות חסרים או פגומים1. עם זאת, מבנים מתפקדים במלואם טרם הושגו, בין השאר, שכן יצירת רשתות כלי דם תפעוליות להזנת רקמות נותרה אתגר יוצא מן הכלל. ללא כלי דם נאותים, רקמות מהונדסות מוגבלות להובלת דיפוזיה פסיבית של חמצן וחומרים מזינים, מה שמגביל את עובי הרקמה המקסימלית בת קיימא למגבלת הדיפוזיה, כ -200 מיקרומטר2. עוביים כאלה אינם מתאימים לתיקון פגמים ברקמות גדולות או לייצור איברים מלא, מה שהופך את נוכחותה של רשת כלי דם תפקודית למאפיין חובה לרקמות פונקציונליות ומושתלות3.

מערכת כלי הדם מורכבת ממגוון רחב של כלי דם, בגדלים שונים, פנוטיפים וארגון, הקשורים קשר הדוק לרקמה המארחת. הבנת ההתנהגות, התגובה והחלטות ההגירה המתבצעות על ידי כלי השיט המתפתחים והנבטיים יכולה להורות על שילובם ברקמות מהונדסות4. נכון לעכשיו, הגישה הנפוצה ביותר ליצירת רשתות כלי דם במבחנה היא שילוב תאי אנדותל (ECs) עם תאי תמיכה (SCs, עם היכולת להבדיל לתאי ציור קיר), זרע בתוך מיקרו-סביבה תלת מימדית. סביבה זו מספקת רמזים כימיים ופיזיים כדי לאפשר לתאים לצרף, להתרבות ולהרכיב את עצמם לרשתות כלישיט 2,5,6,7,8. כאשר הם מתרבתים במשותף, SCs מפרישים חלבונים מטריצה חוץ-תאית (ECM) תוך מתן תמיכה מכנית למחשבים האלקטרוניים, היוצרים את המבנים הצינוריים. יתר על כן, אינטראקציה צולבת בין שני סוגי התאים לקדם tubulogenesis, כלי נבט והגירה, בנוסף התבגרות SCs ובידול לתוך α חלקה שריר actin-ביטוי (αSMA) תאים ציורי קיר4. פיתוח רשת כלי השיט נחקר בדרך כלל בסביבות תלת מימדיות שנוצרו באמצעות הידרוג'לים, פיגומים פולימריים נקבוביים, או שילוב שלהם. האפשרות השנייה מספקת באותה מידה סביבה ידידותית לתאים ואת התמיכה המכנית הנדרשת הן עבור התאים והן עבור ECM9.

כמות גדולה של עבודה בוצעה כדי לחקור את התפתחות כלי הדם, כולל שיתוף culturing התאים על הידרוג'לים10, הידרוג'לים-פיגומים שילובים11,12, פלטפורמות 2D, והתקנים microfluidic13. עם זאת, הידרוג'לים יכולים להיות מעוותים בקלות על ידי הכוחות המופעלים על ידי התא14, בעוד מערכות דו-צדדיות ומיקרופלואידיות אינן מצליחות ליצור מחדש סביבה קרובה יותר לטבע כדי להשיג תגובה נוספת15,16. הבנת האופן שבו כלי שיט יוצרים מגיבים לסביבתם יכולה לספק תובנה קריטית שעשויה לאפשר ייצור סביבות מהונדסות עם היכולת להדריך את פיתוח כלי השיט באופן צפוי. הבנת תופעות היווצרות כלי דם היא קריטית במיוחד כדי לשמור על קצב עם הופעתה המהירה של טכניקות ייצור בקנה מידה תת-מיקרון, כגון סטריאוליטוגרפיה, ליתוגרפיה הקרנה דיגיטלית, ייצור ממשק נוזלי מתמשך, 3D להמיס אלקטרו jetwriting, פתרון מבוסס 3D אלקטרו סילון כתיבה, וטכניקות bioprinting המתעוררים17,18,19,20,21. יישור השליטה של טכניקות micromanufacturing אלה עם הבנה מעמיקה של ביולוגיה של כלי הדם הוא המפתח ליצירת כלי דם מהונדס מתאים עבור רקמת היעד.

כאן, אנו מציגים מערכת תלת מימדית כדי לחקור את התגובה של כלי להרכיב ונבטים חדשים לגיאומטריית הפיגומים שמסביב, תוך התבוננות במקור הנבטים שלהם ובנדידההבאה 22. על ידי שימוש בפיגומים תלת-ממדיים עם גיאומטריות תאים עם סלקציה, וטכניקת זריעה דו-שלבית, הצלחנו ליצור רשתות כלי דם מאורגנות מאוד בצורה ברורה וקלה לניתוח. הגיאומטריות הממוקדות מספקות מערכת תפוקה גבוהה עם יחידות בודדות המכילות כלי שיט המגיבים לסביבתם המקומית. באמצעות מחשבים אלקטרוניים צבעוניים, עקבנו אחר מקורות היווצרות נבטים ודפוסי העברה עוקבים, בקורלציה לגיאומטריית התא ולמיקום SCs22.

למרות שהפרוטוקול המוצע הוכן לנתח את ההשפעות של רמזים גיאומטריים על התנהגות כלי הדם, ניתן להרחיב גישה זו וליישם אותה על מגוון יישומים חדשים. הפיגום המוצף והרשתות הניתנות להדפסה בקלות מאפשרים ניתוח פשוט של אינטראקציה בין ECs ו- SCs שונים, תוספת של תאי איברים ספציפיים והאינטראקציה שלהם עם רשתות כלי הדם, השפעת סמים על רשתות כלי דם ועוד. תוצאות המערכת המוצעות שלנו מאוד תכליתי של ייצור ועיבוד פשוטים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ייצור פיגומים טסליים

הערה: פוטוליטוגרפיה היא טכניקה נפוצה הדורשת ציוד מיוחד השוכן בדרך כלל בתוך מתקן ננו-פשיעה / מעבדה. השיטה שנקבעה בפרוטוקול זה הוכללה ככל האפשר עבור הקהל; עם זאת, ייתכן שיהיה צורך בשינויים קלים בהליכים בהתאם לציוד הזמין לקורא. אנו ממליצים לבצע הליכים אלה בחדר נקי במתקן nanofabrication כדי להבטיח את איכות התהליך הגבוהה ביותר. לפני תחילת, לקבל גישה מיישר מסכה (או כמה UV-חשיפה להגדיר), מעיל ספין, צלחות חמות, תחנת כביסה ממס, photomask, מנקה פלזמה. הממסים והכימיקלים המשמשים בהליך הם מסוכנים, אז בבקשה לקחת את הטיפול העליון כדי למנוע כל חשיפה כימית. בעת עיצוב הפוטומסק, זהה אילו ופלים ופוטומסקים בגודל סיליקון תואמים למעיל הספין ומיושר המסכות. בנוסף, הפוטורסיסט הממוקם לכיוון הקצוות של רקיק הסיליקון הוא בדרך כלל מעוות מטיפול; לפיכך, להפוך את העיצובים לכיוון האזור המרכזי של הוופל.

  1. הכינו פיגומים בטכניקת פוטוליטוגרפיה עם הגיאומטריה הנבחרת המעניינת.
    1. לפני ציפוי ספין, לנקות את רקיק סיליקון. זה יכול להיעשות עם ניקוי פלזמה או טכניקה מבוססת ממס. אם ניקוי פלזמה, בצע את נוהל הפעולה הסטנדרטי של המכשיר לקבלת פרטים תפעוליים. מרססים בגז חנקן דחוס ובודקים את הוופל כדי לוודא שהוא נקי מפסולת לפני ציפוי ספין. רקיק זה ישמש כמצע שעליו נוצרים הפיגומים.
      הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, התחל עם רקיק טרי. וופלים ניתן להשתמש מחדש אבל צריך להיות חופשי של photoresist הישן, פגמים פני השטח ופסולת. כדאי להשתמש בפינצטה לטיפול.
    2. מרכזים רקיק סיליקון על צ'אק מעיל הספין באמצעות מדריך. בקצרה לסובב את הוופל כדי להבטיח שהוא כבר מרוכז כראוי על צ'אק, להתאים לפי הצורך עד מרוכז כראוי. זה חייב להיעשות בכל פעם ופל ממוקם על מעיל ספין. לוותר 1-4 מ"ל של מגיב ההמראה על הוופל (זה יהיה תלוי בגודל של הוופל). כ 2 מ"ל של ריאגנט להרים עובד היטב עבור רקיק 4 אינץ '.
      1. הגדר מהירות התפשטות של ספין-קווילר במהירות של 500 סל"ד למשך 5 שניות, ואת מהירות הסיבוב ל- 1000 סל"ד למשך 30 שניות ולאחר מכן סובב את מגיב ההמראה. בדוק את הוופל כדי לוודא שיש לו ציפוי אחיד על פני הוופל. כל פסולת שנותרה על הוופל תהיה מאוד ברורה בשלב זה. כל הפיגומים באזור עם פסולת צפויים להיות בלתי שמיש. לאחר ציפוי ספין, מעבירים לצלחת חמה ואופים במשך דקה אחת ב-200 מעלות צלזיוס.
    3. חזור על השלב הקודם פעמיים נוספות עבור סך של שלושה ציפויים.
    4. ספין-ציפוי ריאגנט מצופה רקיק סיליקון עם SU-8 2050 photoresist עד קבלת עובי של כ 100 מיקרומטר.
      1. לוותר 1 מ"ל של התנגדות על כל 25 מ"מ של קוטר מצע.
        הערה: היזהר להימנע בועות תוך כדי לשפוך את ההתנגדות. עבור SU-8 2050, לשפוך בערך עיגול בקוטר 2 אינץ', בעת שימוש רקיק סיליקון 4 אינץ' עובד היטב.
      2. ספין מעיל SU-8 2050. להפיץ במהירות של 500 סל"ד במשך 5 שניות, ואחריו מהירות ספין בין 1700 ל 1800 סל"ד כדי להשיג כ 100 מיקרומטר עובי.
      3. אופציונלי: לאחר סיבוב, להשאיר את הוופלים מצופים ספין כדי de-gas לילה על משטח מפלס מוגן מפני אור לפני האפייה מראש. זה עשוי לעזור להיפטר להתנגד של כל בועות ולאפשר פגמים להתיישר.
        הערה: עובי ההתנגדות בפועל והפיגומים הנובעים מכך עשויים להשתנות בהתאם לשגיאת המשתמש ולפרמטרים של הציוד. לכן, יש לאמת את עובי הפיגומים מאוחר יותר, בשלב 1.6. לשנות נהלי ציפוי ספין בהתאם כדי להשיג את העובי הרצוי.
    5. לפני החשיפה, אופים מראש את הוופלים ב 65 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ולאחר מכן 95 מעלות צלזיוס במשך 40-50 דקות. לפני החשיפה, בדוק את פני השטח של ההתנגדות על ידי לחיצה על הקצה עם זוג פינצטה כדי לוודא שהוא כבר לא דביק / צמיג. זה מועיל למשוך את הוופל של הצלחת החמה ולאפשר לו להתקרר במשך 0.5-1 דקות לפני הערכת דביקות.
      הערה: זמני הרמפה בטמפרטורה איטית (חימום וקירור) עשויים לסייע במניעת עיוות הפיגומים.
  2. לחשוף את photoresist לאור UV (350-400 ננומטר) באמצעות פוטומסק עם אנרגיית חשיפה של 215-240 mJ / cm2 עבור עובי להתנגד של 85 - 110 מיקרומטר. עיין בהנחיות יצרן פוטורסיסטיות למתאמים מומלצים של עובי אנרגיה לחשיפה.
    1. ודא שהחשיפה מכוילת כראוי כך שהאנרגיה מאומתת. התאם את זמן החשיפה לפי הצורך כדי להשיג את אנרגיית החשיפה הרצויה. יתר על כן, מיישרי מסכות עשויים לאפשר מצבי חשיפה שונים: מגע ואקום, מגע קשה, מגע רך ומגע קרבה (מונחים ספציפיים עשויים להשתנות). בדרך כלל, אלה ישפיעו על הרזולוציה ועל יישור התכונות. המחברים השתמשו בדרך כלל במצב "מגע קשה".
    2. עבור תכונות קטנות או שכבות מרובות, כאשר היישור יהיה חשוב, שקול מצבי חשיפה והליכי יישור מסיכה בזהירות רבה יותר. הקפד לשקול את גובה ההתנגדות בעת התאמת ערך העובי. עיין בהליכי ההפעלה הרגילים של מיישר המסיכה לקבלת פרטי פעולה.
      הערה: עיצוב הפוטומסק יקבע את גודל הפיגומים, הגיאומטריה של התא ומספר הפיגומים המתקבלים לכל אצווה. השימוש בזכוכית קשה או פוטומסק קוורץ יניב את הרזולוציה הגבוהה ביותר; עם זאת, פוטומסק סרט שקוף פולימר רך בדרך כלל יכול לשמש עבור גדלי תכונות גדולים אלה (>10 מיקרומטר). השימוש בסרט פוטומסק עלול להוביל לתכונות טופוגרפיות לאורך ציר z של נקבוביות הפיגום כתוצאה מרזולוציה תכונה ירודה יותר. זה יכול להשפיע על התנהגות התא. ודא שהפתרון הרצוי מתייעץ עם מי שמייצר את הפוטומסק כדי להבטיח שהרזולוציה הרצויה תושג.
  3. אופים את הוופל מיד לאחר החשיפה UV ב 65 מעלות צלזיוס במשך 2-5 דקות ולאחר מכן ב 95 מעלות צלזיוס במשך 8-10 דקות.
  4. פתח את הפיגומים כדי להסיר התנגדות לא מפותחת.
    1. לטבול את הפיגומים באמצעות נפח נמוך של פתרון מפתחים SU-8 במשך 7-10 דקות כדי להמיס כל התנגדות מפותחת.
    2. יש לשטוף עם אלכוהול איזופרופיל (IPA).
    3. רקיק יבש עם חנקן דחוס.
      הערה: היזהר במהלך שלב 1.4 לא לגרום לשחרור מוקדם של הפיגומים. כמויות נמוכות של מפתחים וטיפול עדין נחוצים כדי להשיג זאת.
  5. לאחר הפיתוח, קשה לאפות את הוופלים ב 150 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
    הערה: לאחר אפייה קשה, כיבוי הלוחית כדי לאפשר לוופלים להתקרר לאט מאוד עשוי להיות יתרון במניעת עיוות / קרלינג של הפיגומים הסופיים.
  6. אופציונלי: בעקבות האפייה הקשה ולפני ההמראה, להעריך את עובי הפיגומים מאז הפיגומים עדיין צריך להיות דבק בעדינות על פני השטח של הוופל. עבור הליך זה, פרופיל מגע עובד היטב; עם זאת, ניתן היה צורך בכל שיטה מתאימה.
  7. הרם את הפיגומים מהוופל.
    1. הטביעו את הפיגומים במפתח SU-8 כדי לגרום להם להרים מיד את הוופל. אם הפיגומים אינם מורמים, דחפו בעדינות את הפיגומים עם זוג פינצטה.
    2. הסר מפתח עודף.
    3. מעבירים את הפיגומים למיכל חדש ושקעים באלכוהול איזופרופיל. שטף ב- IPA למשך 6 פעמים לפחות כדי להבטיח שכל המפתחים הוסרו.
  8. האוויר מייבש את הפיגומים למשך שבוע לפחות לפני השימוש.

2. ציפוי פיברונקטין פיגומים

  1. לחיטוי, יש לטבול את הפיגומים ב-70% אתנול (v/v) למשך 15 דקות לפחות, ולשטוף פעמיים מלוחים עם אגירת פוספט (PBS) לפני השימוש.
    התראה: הפיגומים SU-8 הם שבריריים ויכולים להישבר בקלות. הטיפול מומלץ באמצעות מלקחיים קהים ומעוגלים, ויש לטפל בהם בזהירות מירבית. טיפול קל יותר יכול להיות מושגת על ידי שקיעת הפיגומים בנוזל, כדי למנוע אינטראקציות אלקטרוסטטיות בין הפיגומים לבין פני השטח.
  2. הכן דילול של 50 מיקרוגרם / מ"ל של פיברונקטין אנושי ב- PBS ולכסות את הפיגומים על ידי ספיגת חלבון.
    1. יש לערבב 1.5 מיקרו-ל' של תמיסת מלאי פיברונקטין (1 מ"ג/מ"ל) עם 28.5 מיקרו-μL של PBS לכל פיגום שיש לזרוע. רצוי, להכין רק דילול אחד fibronectin לשמש עבור כל הפיגומים, כדי למנוע שגיאות pipetting.
      1. עבור 10 פיגומים, לערבב 15 μL של פתרון פיברונקטין מלאי ב 285 μL של PBS, בהיקף כולל של 300 μL של 50 מיקרוגרם / מ"ל דילול פיברונקטין.
    2. מניחים את הפיגומים בדלילות על גבי משטח הידרופובי (כלומר, תרבות ללא רקמות (nonTC) 10 ס"מ צלחת) ומכסים כל פיגום עם 30 μL של דילול fibronectin מוכן בשלב 2.2.1.
      התראה: ודאו שאין בועות לכודות בתאי הפיגומים. אם בועות נמצאות, ניתן להסיר אותן על ידי טלטול עדין של הפיגום בתוך הטיפה או הצינור הקל.
    3. החלף את מכסה הצלחת והנח את הפיגומים המכוסים בפיברונקטין באינקובטור עם 37 מעלות צלזיוס ולחות של 100% למשך שעה לפחות.
    4. לאחר הדגירה, לשטוף קלות את הפיגומים PBS כדי להסיר שרידים fibronectin. ניתן לשמור את הפיגומים ב-PBS ב-4 מעלות צלזיוס עד שבוע לפני השימוש.

3. תאי אנדותל זורעים

  1. הכן מדיום EC על ידי ערבוב המדיום הבסיסי עם רכיבי הערכה הבינונית כתב שלה, כולל פתרון אנטיביוטי (עט / סטרפטוקוקוס), סרום שור עוברי (FBS), ותוספי צמיחת תאי אנדותל, כפי שצוין על ידי היצרן.
  2. הפוך תא אנדותל מיקרו-וסקולרי שומן אנושי (HAMEC) השעיה במדיום EC עם ריכוז של 4 x 106 תאים / מ"ל.
    הערה: הדמיה בזמן אמת יכולה להתבצע אם תאי האנדותל המשמשים מודבקים בעבר כדי לבטא חלבון פלואורסצנטי, או מוכתמים מראש באמצעות צבע קרום ציטופלסמי לא רעיל (המכונה עוד יותר ECs).
  3. בעזרת מלקחיים, מניחים פיגום אחד מצופה פיברונקטין לבאר על צלחת 24 באר שאינהTC.
  4. מכסים כל פיגום עם 25 טיפות μL של השעיית HAMEC. היזהר לא לתת את ההשעיה לזרום הרחק הפיגום, שכן הוא יכול לעכב הידבקות התא.
  5. שים את המכסה על הצלחת ומניחים אותו באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו 100% לחות. תן דגירה במשך מינימום של 60 דקות ומקסימום של 90 דקות.
    הערה: במהלך הדגירה, הנחת הצלחת על שייקר מסלולית בתוך החממה משפרת את חיבור התא על קירות הפיגום. שייקר מסלולית צריך להיות מוגדר לא יותר מ 5 סל"ד.
  6. לאחר הדגירה, למלא כל באר עם 700 μL של מדיום EC באמצעות פיפטה.
    הערה: צפו לראות ECs בתחתית הבאר, שכן חלק מהתאים אינם מתחברים לפיגום ונופלים דרך חללי הפיגום.
  7. דגירה פיגומים אנדותל עד מפגש EC ניתן לראות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית על קירות הפיגום (בעת שימוש ECs שכותרתו), או במשך 3 ימים (בעת שימוש ECs שאינם מסומנים), אשר מספק מספיק זמן כדי להשיג מפגש EC. לשנות את המדיום כל יומיים.

4. תמיכה בזריעת תאים ותרבות משותפת

  1. הכן תאי גזע עיסת שיניים (DPSC) בינוני (DPSCm) על ידי ערבוב 500 מ"ל של בינוני הנשר שונה של Dulbecco גלוקוז נמוך (DMEM גלוקוז נמוך), 57.5 מ"ל של FBS, 5.75 מ"ל של חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), 5.75 מ"ל של גלוטמקס ו-5.75 מ"ל של תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין-ניסטטין.
  2. העבר את הפיגומים שעברו אנדותל לצלחת חדשה שאינה 24 בארות של TC כדי להשליך ECs המחוברים לתחתית הבארות באמצעות מלקחיים.
    1. השלך את כל המדיה מהצלחת הנוכחית באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, או יניקת ואקום. היזהר לא להחיל ואקום ישר על הפיגום.
    2. מניחים פיגום אחד לבאר, רצוי במרכז הבאר, כדי למנוע ריצת נוזל לכיוון הקירות עקב השפעות מתח פני השטח. יבש את האזור המקיף את הפיגום עם ואקום קל אך הימנע ייבוש מלא של הפיגום.
  3. הכינו השעיית DPSC בתמיסת פיברין טרום ג'ל.
    1. לדלל פתרונות מלאי תרומבין ופיברינוגן עם PBS עד להשגת ריכוז סופי של 5 U /mL ו 15 מ"ג / מ"ל, בהתאמה.
    2. הכן השעיה 8 x10 6 DPSC / mL בדילול תרומבין 5 U / mL ולהפיץ eppendorfs בודדים 12.5 μL של ההשעיה כאמור לכל פיגום להיות זרע.
    3. הגדר פיפטה μL 5-50 (או דומה) ל 12.5 μL ולמלא אותו עם 15 מ"ג / מ"ל פיברינוגן פתרון.
    4. מבלי להסיר את הקצה, הגדר את פיפטה ל 25 μL. החומר בקצה צריך לעלות ולהשאיר נפח ריק לכיוון פתיחת הקצה.
    5. לחץ לאט על כפתור הכועף עד שהנוזל מגיע לפתיחת הקצה אך אינו דולף החוצה. החזק את הוכנה במצב זה ולשים את הקצה לתוך אחד הצינורות microcentrifuge המכילים את התאים המתלים תרומבין, לוודא את הקצה הוא במגע עם הנוזל.
      התראה: הצלבת הפיברין תתחיל מיד לאחר שהטרומבין והפברינוגן יבואו במגע. השלב הבא צריך להיעשות במהירות.
    6. שחרר בעדינות את לחצן הכועף ומשוך את המתלה של התא לקצה. ביסודיות לערבב את שני החומרים, הימנעות היווצרות בועה.
  4. מחלקים במהירות את החומרים המעורבים על גבי פיגום אנדותל. חזור על השלבים הקודמים עבור כל פיגום, הקפד תמיד לשנות טיפים בין שימושים כדי למנוע היווצרות ג'ל פיברין בלתי צפוי בתוך הקצה.
  5. החלף את מכסה הצלחת ודגר את הפיגומים ב 37 °C (60 °F), 5% CO2 ו 100% לחות במשך 30 דקות.
  6. לאחר הדגירה, מלאו כל באר ב-1 מ"ל של 1:1 DPSC ובינוני EC.
    1. תרבות במשך שבוע, משתנה מדיום כל יומיים.
    2. במהלך התרבות, להסיר את המדיום מן הבאר תמונה המבנים באמצעות מיקרוסקופ confocal בזמן שונה מצביע ללמוד את התפתחות כלי הדם או כל פרמטר אחר של עניין.
      הערה: שלב זה יכול להתבצע רק אם הניסוי מבוצע באמצעות ECs שכותרתו. ראה שלב 6 - הערה לבירור נוסף.

5. כתמי כשל חיסוני לסמני כלי דם אופייניים

הערה: ניתן לבצע את השלבים הבאים באותן בארות שבהן המבנים היו תרבותיים. זה קריטי תמיד לוודא כי הפתרונות מכסים לחלוטין את הפיגומים. יתר על כן, כאשר הדבר אפשרי, מומלץ לבצע את השלבים על שייקר מסלולית, אם כי לא חובה.

  1. ביום 7, להשליך את התקשורת מן הבארות ולשטוף את הפיגומים על ידי הוספת PBS לבארות, והסרת אותו באמצעות ואקום.
  2. לתקן את הפיגומים על ידי הוספת 4% paraformaldehyde במשך 20 דקות. יש לשטוף ב-PBS 3 פעמים, 5 דקות לכביסה.
  3. לחלחל לתאים הקבועים באמצעות 0.3% טריטון-X ב PBS (v / v) במשך 15 דקות. יש לשטוף ב-PBS 3 פעמים, 5 דקות לכביסה.
  4. הכינו 5% אלבומין סרום שור (BSA) בתמיסת חסימת PBS (w/v) וכיסוי הפיגומים. השאירו בטמפרטורת החדר למשך שעה.
    הערה: כל סכומי הפתרון הנדרשים יהיו תלויים במספר הפיגומים שיוכתמו. הכינו את הפתרונות לפי הצורך תוך שמירה על הריכוזים המוצהרים.
  5. להכין וליישם את הנוגדנים העיקריים כתם פתרון .
    1. לדלל ארנב נגד פון Willebrand גורם (vWF) נוגדן 1:150 ועכבר נגד SMA נוגדן 1:50 בתמיסת חסימה טריים.
      הערה: ניתן להשתמש בסמנים אחרים של תאי אנדותל, כגון CD31 או VE-Cadherin.
    2. מכסים את הפיגומים בתמיסת הנוגדנים העיקרית ושומרים על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לשטוף PBS שלוש פעמים, 5 דקות לכל לשטוף.
  6. להכין וליישם את הנוגדנים המשניים כתם פתרון.
    1. לדלל עז נגד עכבר Cy3 נוגדן 1:150 ועז נגד ארנב אלקסה-פלואור 488 1:400 ב PBS.
    2. מכסים את הפיגומים בתמיסת הנוגדנים המשנית ומדגרים למשך 3 שעות לפחות בטמפרטורת החדר, או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. יש לשטוף 3 פעמים ב-PBS, 5 דקות לכביסה. שמור פיגום מוכתם ב 0.3% PFA ב PBS (v / v) עד חודש.

6. הדמיה קונפוקלית פיגומים וניתוח פיתוח כלי שיט

הערה: ניתן לבצע את השלבים הבאים על הפיגומים הקבועים והמוכתמים בנקודת הזמן הסופית שנבחרה או, אם נעשה שימוש בתאי פלואורסצנט, במהלך תקופת תרבות התא ללא צורך לסיים את הניסוי. עבור האחרון, מומלץ להגדיר נקודות זמן ספציפיות; עבודה זו מציגה את היום 0 (לפני זריעת SCs) ואת הימים 1, 3, 5 ו- 7 לאחר זריעת SCs (איור 3A).

  1. צלם את הפיגומים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם עדשת פי 5 וזום של 0.5 וטווח z המלא של הפיגום. זה יאפשר ללכוד 9 תאים נפרדים עבור הגיאומטריות המרובעות והמעגליות, או 8 תאים מלאים לגיאומטריה המשושה. צלם את אות הפלואורסצנט ואת האור המשודר, כדי לקבל הן את מבנה רשת כלי השיט והן את הגיאומטריה של התא (איור 3A).
  2. באמצעות ImageJ (או כל תוכנה אחרת לעיבוד תמונה), חתוך כל תא בנפרד; עבור תהליך זה, רק סמני רשתות כלי הדם רלוונטיים. הסר כל כלי שאינו ממוקם בתוך אזור התא. צרו הקרנה בעוצמה מרבית ושמרו כל תא חתוך כתמונת TIFF.
    1. ב- ImageJ, הקש על קובץ > פתח ובחר את תמונת TIFF הרצויה המכילה מספר תאים. לתמונה צריכים להיות לפחות שני ערוצים, רשת כלי הפלואורסצנט ותמונת האור המשודרת.
    2. בסרגל הכלים, בחרו בכלי הבחירה 'מצולע'. בחר את ערוץ האור המשודר. לחץ על אחת הפינות של תא משושה, בממשק בין אזור התא לבין קיר הפיגום, זה יתחיל את הגדרת המסכה. המשך ללחוץ על הפינות הבאות בסדר רציף עד לבחירת הפינה ההתחלתית, וסגור את המסיכה.
      הערה: הסבר זה חל על תא משושה. כאשר התא בריבוע או באופן מעגלי, השתמש בכלי מלבן או אליפסה, בהתאמה, כדי ליצור מסיכה מתאימה. ללא קשר לצורה, תמיד להתאים את המסכה לעקוב אחר הקיר הפנימי של הפיגום.
    3. לחץ על ניתוח כלי > > מנהל ההחזר על ההשקעה. במנהל ההחזרים על ההשקעה (ROI, אזור עניין), לחץ על לחצן הוסף כדי לשמור את המסיכה שנוצרה. המסכה החדשה תופיע ברשימה השמאלית. שלב זה מאפשר לניתוח להיות עקבי בין תמונות שונות.
      הערה: במנהל ההחזר על ההשקעה, ניתן לשמור קובץ עם כל המסכות שנוצרו על ידי לחיצה על עוד > שמור. בחלון שמירת בחירה, בחר שם ומיקום ושמור את קובץ ה- .roi כדי לאחזר את המסכה, במנהל ההחזר על ההשקעה, לחץ על עוד > פתח ובחר את קובץ ה- .roi הרצוי.
    4. בחרו בתמונת רשת כלי השיט הפלואורסצנטית ולחצו על 'ערוך > נקה בחוץ. רק התמונה הכלולה במסכה תישאר, והשאר יבוטלו.
    5. כאשר תמונת הרשת המנוקה פתוחה, לחץ על תמונה > שכפל. בחלון הנפתח Duplicate, כתוב את שם התמונה. אם נבחרה האפשרות 'שכפול היפר-סטאק', בטלו את הבחירה בו ולחצו על הלחצן 'אשר'. תמונה חדשה המכילה רק את רשתות כלי הפלואורסצנט החתוכים תיווצר.
    6. שמור את התמונה שנחתכה על-ידי לחיצה על קובץ > שמור כ- Tiff >. בחרו בשם ובספריה ולחצו על הלחצן 'אשר'.
  3. לנתח את התפתחות כלי הדם על התמונות שנחתכו.
    1. הורד והתקן את התוכנה החופשית האנליטית AngioTool, המספקת כלים כמותיים לכמת מגוון פרמטרים של כלי דם. ניתן להשיג את התוכנה מהכתובת הבאה https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home.
    2. קבעו את ערך קנה המידה של התמונות כדי להשיג תוצאות ביחידות מילימטר ולטעון תמונה.
      1. לחץ על הכרטיסיה הגדרה ומלא את המרחק בפיקסלים ומרחק במ"מ עם ערכים מייצגים מהתמונות שצולמו. באמצעות פרמטרי ההדמיה שהוזכרו לעיל, הערכים למילוי הם 400 פיקסלים לכל 1 מ"מ.
      2. לחצו על הלחצן 'פתח תמונה' ודנו את התמונה המעניינת.
    3. בחר את פרמטרי הניתוח כדי לכמת את התפתחות כלי השיט בכרטיסיה ניתוח.
      1. תחת השדה 'קוטר כלי קיבול' ו'אינטנסיביות', בטלו את הבחירה בכל סמן קיים מהבורר בטווח העליון, והפעילו את הסמן המייצג את המספר 3.
      2. תחת קוטר כלי השיט ושדה האינטנסיביות, בבורר הטווח התחתון, הזיזו את סמן הטווח התחתון ל-60, והשאירו את יצרנית הריינג'רים הגבוהה על 255.
      3. הפעל את התיבה הסר חלקיקים קטנים והגדר את הסמן ל- 100.
      4. תחת השדה העדפות שמירה, בחר את השם והמיקום של קובץ גליון הכפולות שבו יישמרו התוצאות ולחץ על לחצן הפעל ניתוח. אם התיבה שמור תמונת תוצאה נבחרה, אנגיטול תיצור ותשמור תמונת jpeg חדשה המציגה את הפרמטרים המכומתים של רשת כלי השיט.
        הערה: עבור כל ניתוח שבוצע מבלי לשנות את שם קובץ גליון הכפולות, שורה חדשה תתווסף בתחתית הקובץ, עם התוצאות החדשות שנרכשו.
  4. ארגן את הנתונים והפעל ניתוח סטטיסטי.
    1. עבור כל התמונות המעובדות, בחרו בפרמטר העניין מגיליון הכפולה (למשל אורך כלי שיט ואזור כלי שיט)והזינו אותן לתוכנת ניתוח סטטיסטית כדי ללמוד כראוי את התוצאות שהתקבלו (איור 3C).

7. הדמיית זמן לשגות עבור נבט זיהוי מקור ומעקב הגירה

  1. לחלופין, כדי culturing הפיגומים באינקובטור כמתואר בשלב 4.6, להגדיר תא תרבות מיקרוסקופ confocal ל 37 °C (69 °F), 5% CO2 ו 100% לחות.
    1. שים את הצלחת המכילה את הפיגומים שנזרעו במלואם בתא המיקרוסקופ הקונפוקלי והגדר את פרמטרי ההדמיה לערכים הרצויים.
    2. הגדר את מרווח הזמן של התמונה ל- 30 דקות ואת זמן ההדמיה הכולל של 72 שעות. פעולה זו תאפשר להפעיל את הזמן לשגות לחלוטין ללא צורך בשינוי בינוני.
      התראה: במקרה של זמן רב יותר הדמיה לשגות רצוי, כיול מיקום זהיר צריך להתבצע כדי להיות מסוגל לאחזר את מיקום ההדמיה המקורי, שכן שינויים בינוניים דורשים הסרת הצלחת מן החממה confocal לתוך מכסה המנוע הביולוגי סטרילי.
      הערה: ניתוק מעגלים אלקטרוניים מקירות הפיגום וממבנה הצינור יתחיל בשעה הראשונה לאחר זריעת SCs (שלב 4) ועשוי להימשך עד 50 שעות. לאחר היווצרות הצינור הראשונית, נבטים חדשים יתחילו לנדוד לתוך התא מכלי הדם שמסביב. הנבטים ושיפוץ הרשת הבאים יימשכו לאורך כל הניסוי בערך עד יום 10, כאשר רשתות כלי השיט יהפכו ליציבות22. השתמש במידע זה כדי לבחור את נקודת ההתחלה ואת שלב הזמן בהתאם.
  2. שמור את קובץ הסרט לשגות זמן מלא כרצף TIFF.
  3. פתחו את ImageJ ולחצו על 'קובץ' > 'ייבוא > רצף תמונה' ובחרו את הקבצים שלכם. פעולה זו תפתח את רצף TIFF שלך כסרט.
  4. פתח את תוסף המעקב הידני על ידי לחיצה על תוספים > מעקב ידני. פעולה זו תפתח את החלון מעקב.
  5. התבונן בסרט ובחר את הכלי למעקב. שים לב למקורו ולנדידתו.
  6. הפעל את התיבה הצג פרמטרים והזן את 30 הדקות עבור מרווח זמן. כיול x/y יהיה תלוי בכמות הפיקסלים שנבחרה במהלך ההדמיה.
  7. המשך לעקוב ידנית אחר כלי הנבטים מקווי המתאר של הפיגומים.
    1. לחץ על לחצן הוסף רצועה. על המסגרת הראשונה של הסרט, לחץ על המיקום של כלי השיט כדי להיות במעקב. לאחר מכן, הסרט ישתנה למסגרת הבאה באופן אוטומטי.
    2. לחץ על התמונה של המסגרת השנייה שבה כלי השיט ממוקם. שוב, הסרט ישתנה למסגרת הבאה באופן אוטומטי.
    3. המשך עם אותה ספינה עד להשלמת מעקב ההעברה המלא.
    4. בחלון מעקב, לחץ על נקודות כיסוי & קווים כדי להטביע נתיב חזותי של העברת כלי השיט בסרט. פעולה זו תפתח עותק של הסרט עם נקודה המייצגת את המיקום הנוכחי של הגשש וקו המציג את הנתיב הקודם.
    5. לחץ על כפתור רצועת סיום כדי לסיים את הקלטת תנועת כלי השיט הנוכחית.
    6. לחץ שוב על לחצן הוסף רצועה כדי להתחיל מחדש עם כלי חדש. כאשר עושים זאת, סמני הקו והנקודה ישנו באופן אוטומטי את צבעם עבור הכלי החדש. יש לחזור על הפעולה עד למעקב אחר כל כלי השיט הרצויים.
      הערה: ניתן לאחזר את מיקום x/y, מהירות כלי השיט והמרחק המוזז מהחלון המוקפץ תוצאות. כל חללית תזוהה לפי מספר המסלול שלה בעמודה השמאלית ביותר. ניתן להעתיק ולהדביק נתונים אלה בגליון כפולות כדי לבצע ניתוח נוסף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפרוטוקול המוצג, בטכניקות סטריאוליטוגרפיה, מאפשר ייצור של פיגומים עם טסלה העשויים מפוטורסיסט SU-8. הושגו פיגומים עם גיאומטריות תא נפרדות (ריבועים, משושים ועיגולים) ותכונות מדויקות וחוזרות על עצמן ביותר (איור 1).

Figure 1
איור 1: סריקת תמונות מיקרוסקופיות אלקטרונים מייצגות של הגיאומטריות המרובעות, המעגליות והפיגומים המשושה (סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

עם זריעת תאים חורגת (שלבים 2 עד 4), הפיגומים המפוברקים שימשו ליצירת רשתות כלי דם מאורגנות מאוד. בעת שימוש בזרעים בו זמנית מסורתיים של מחשבים אישיים ומחשבי SCs, כלי השיט וכתוצאה מכך חסר ארגון ברור. לצורך כך בוצע ציפוי הפיגום פיברונקטין (שלב 2), דלג על שלב אנדותל הפיגומים (שלב 3), וה-DPSC וה-HAMEC היו בו זמנית שותפים לג'ל פיברין (שלב 4). באופן זה, התאים מפוזרים באופן הומוגני על הפיגום(איור 2, שורה עליונה), וכתוצאה מכך רשתות כלי דם מפותחות בלתי צפויות ולא מאורגנות שלא נראה שהן מתקשרות עם הפיגום שמסביב. להיפך, ראשית זריעת ECs על קירות הפיגום מספק דפוס תא אנדותל ראשוני מדויק. התוספת המאוחרת יותר של מחשבי SCs בתוך ג'ל פיברין גורמת לתופעת טובלוגנזה צפויה, עם כלי יוצרים העוקבים מקרוב אחר צורת דופן הפיגום, ומצמיחים כלי שיט חדשים הנודדים לחלל התא(איור 2, שורה תחתונה).

Figure 2
איור 2: השוואת כלי דם בין זריעת תאים בו-זמנית לעומת זריעת תאים חורגת. תמונות מייצגות של התפתחות כלי דם בפיגומים עם tessellated עבור זריעת תאים בו-זמנית (שורה עליונה) של ECs (אדום) ו- SCs (ירוק), וזריעת תאים חכמה (שורה תחתונה) בימים 1 ו- 5. הזריעה החורגת גורמת לרשתות כלי דם מאורגנות העוקבות אחר קירות הפיגום ונבטות לתוך שטח התא (סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

בעת שימוש ב- ECs פלואורסצנטיים, או מצטלבים או צבועים, ניתן לדמיין את כלי הדם בזמן אמת ללא צורך לתקן ולסיים את הניסוי עבור כל נקודת זמן. חלבון פלואורסצנטי אדום המבטא ECs (RFP-ECs) היו מתורבתים על פיגומים משושים וצולמו לאחר הזריעה(איור 3A, יום 0). ביום הראשון נוספו המחשבים ה-SCs ורשתות כלי הדם צולמו מדי יומיים כדי לכמת את התפתחות כלי השיט (איור 3A, ימים 1, 3, 5 ו-7). עבור כל נקודת זמן צולמו תמונות רחבות של הפיגום כולו (איור 3B). עבור כל תא, כלי השיט מאורגנים בעיקר ואינטראקציה עם תאים הממוקמים בתוך כליאתם. לפיכך, כל תא היה מבודד וכלי המיותר מחוץ לתא הוסרו באמצעות ImageJ. התמונות הנקיות של תא יחיד נותחו לאחר מכן באמצעות אנגיטול. אנגיטול החזיר קובץ גיליון התפשטות המכיל מספר פרמטרים של כלי שיט, וייצוג חזותי של מאפייני הרשת העיקריים, כגון שלד, נקודות חיתוך ומשטח כלי שיט. הנתונים שהתקבלו נותחו באמצעות תוכנת הניתוח הסטטיסטית פריזמה, וצמיחה ברורה של כלי השיט נצפתה לאורך כלי השיט ולאזור הכוללים במהלך זמן הניסוי (איור 3C). במהלך ניסוי בן שבוע, כלי שיט צפויים להתפתח ולהרחיב עוד יותר כפי שמוצג באיור 3A ובאיור 2C. הפחתת אורך או אזור כלי השיט, כשל ביצירת כלי שיט לפי יום 3 או כלי שיט הנוצרים כפי שמוצג בשורה העליונה של איור 2 יכולים להתפרש כניסויים כושלים.

Figure 3
איור 3: תמונות פיתוח מייצגות וניתוח של רשתות כלי דם מאורגנות. (A) ECs (אדום) להגיע מפגש על קיר הפיגום שבו SCs הם זרע לאחר מכן; תוספת SCs מייצגת את היום 0 של הניסוי. ביום הראשון לאחר זריעת המחשבים האלקטרוניים, המחשבים האלקטרוניים מנתקים לחלל התא ומתחילים ליצור כלי שיט שימשיכו לנבוט ולהתחבר בימים נוספים. (B)שלבי עיבוד תמונה קונפוקליים לניתוח רשת כלי דם (i) תמונה קונפוקלית רחבה המכילה מספר תאים נלקחת, (ii) תא יחיד נחתך (מסומן על ידי משושה מקווקו לבן), (iii) אז ערוץ רשת כלי הדם מופרד, וכל כלי הדם מחוץ לקירות התא נחתכים החוצה. תמונת התא הבודד מנותח באמצעות אנגיטול, ומחזיר רשימה של פרמטרים של כלי דם המשלימים סמנים חזותיים, כגון אזור כלי השיט (המתואר בצהוב), אורך כלי השיט (מוצג עם קווים ירוקים) ונקודות ההצטלבות (מסומנות כנקודות כחולות). (C)תוצאות השוואתיות של אורך הכלי הכולל ואזור כלי השיט הכולל בתוך תאים משושים בנקודות זמן שונות (התוצאות מוצגות כ ממוצעות ± SD, n > 6; כל סרגלי קנה המידה: 200 מיקרומטר). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

באמצעות ECs צבעוניים כדי להקל על זיהוי תא יחיד, בוצעה מעידה בזמן הדמיה קונפוקלית כדי לאפשר מעקב אחר כלי שיט יחיד (וידאו משלים 1). כלי השיט נצפו ועקבו באמצעות תוסף ImageJ למעקב ידני. תא הקצה נבחר עבור כל פריים של הסרט (איור 4A) עד שהכלי התמלא בכלי הדם שמסביב. כתוצאה מכך, תוסף המעקב הידני יצר את נתיב כלי השיט בזמן אמת, מה שאיפשר לצפות בנדידת כלי השיט (איור 4B).

Figure 4
איור 4: מעקב אחר כלי שיט נבטים מייצגים. (A) כשל זמן של מחשבים אלקטרוניים צבעוניים (ירוק, אדום וכחול) משמש כדי להקל על זיהוי כלי שיט יחיד. כלי נבט מזוהה ומעקב באמצעות תוסף ImageJ מעקב ידני. הצד הסופי של הכלי מסומן עבור כל נקודת זמן לעקוב בזמן אמת; הסמן בשחור-לבן נוסף כדי להציג את נקודת הסיום של כלי השיט שנבחר. (ב) המעקב הדו-מימדי שנוצר של כלי השיט, כפי שעובד על-ידי תוסף ImageJ, המציג את הנקודה הרחוקה ביותר עם נקודה, ואת הנתיב שנוצר עם קו (סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

התבגרות כלי, המיוצג על ידי נוכחות של SMA + SCs, ניתן לראות בקלות בפלטפורמה המוצעת. Vasculatures המציגים מספרים גבוהים יותר של SMA + SCs מייצגים רשת בוגרת יותר, שכן ביטוי SMA מתואם עם ייצוב כלי לאורך זמן23. עבור התאים המעגליים, המשושה והמרובעים, כמות ה- SMA+ SCs גדלה עם הזמן (איור 5A). ביום 3, כל הצורות הראו SMA + SCs מפוזרים וכלי uncomplex עם מעט או ללא נבטים כלשהם. ביום 7, כל הצורות הראו רשת כלי דם עשירה ומורכבת, עם נוכחות גבוהה יותר של SMA + SCs המקיפים את כלי הדם. יתר על כן, תמונות הגדלה גבוהות יותר חושפות נוכחות צפופה יותר של SMA+ SCs המותאמת במשותף עם כלי שיט שנוצרו, ומעוררת את גיוס SCs ואת הבידול סביב מבני כלי הדם (איור 5B).

Figure 5
איור 5: SMA+ SCs וכלי דם גדלים עם הזמן. A) אקטין שרירים חלק (אדום) ו- vWF (כלי דם, ירוק) מוצגים עבור רשתות כלי דם בתאים מעגליים, בריבוע ומשושה ביום 3 וביום 7. הן הרחבת כלי הדם והן תאי תמיכה המבטאים SMA (SMA+ SCs) גדלים עם הזמן, מה שמסמן התבגרות ומורכבות כלי שיט גבוהים יותר (סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר). ב)תמונות מייצגות של הצטברות צפופה יותר של SMA+ SCs סביב כלי שיט ביום 7. הגרעינים (כחול) בתמונה מורכבת לחשוף את נוכחותם של SCs לא להביע את חלבון SMA (סרגל בקנה מידה = 50 מיקרומטר). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

וידאו משלים 1: זמן ECs צבעוניים לשגות עבור מעקב נדידת כלי שיט. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.  

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הצורך בכלי דם עשיר בתוך מוטבע ברקמות מהונדסות הוא קריטי לבניית הישרדות ותפקוד תקין1. למרות הנדסת מערכת כלי הדם כבר המוקד של כמות עצומה של מחקר, הרבה נשאר לחקור ולהבין24. בפרט, בעת יצירה מחדש של רקמה ספציפית, microvasculature צריך להתנהג ולארגן בהתאם12. הגישה הנפוצה ביותר ליצירת מיקרו-סלבסלים היא תאי אנדותל ותמיכה בזריעת תאים בתוך סביבה תלת-ממדית מתאימה התואמת לחיבור לתאים, התפשטות והיווצרות כלישיט 25. מתודולוגיה זו גורמת לעתים קרובות רשתות לא מאורגנות מאוד, מה שמקשה על חקר ההתנהגות microvascular22. כאן, הפרוטוקול המוצג מספק כלי חדש שיוצר רשתות כלי דם מאורגנות מאוד במערכת תפוקה גבוהה, עם כלי שניתן לעקוב אחריהם בקלות ולנטר אותם לאורך זמן, כדי ללמוד את התפתחותם והתנהגותם. הזריעה החורגת של המחשבים האלקטרוניים (שלב 2-3), ואחריה מחשבי ה- SCs (שלב 4), הם צעדים קריטיים להשגת רשתות מאורגנותכאלה 22. בנוסף, טכניקה זו מציגה סביבה תלת-ממדית אמיתית עבור מודלים של כלי דם, שבה כלי שיט יכולים לנדוד בשלושת הממדים וליצור מבנים רלוונטיים. לעומת זאת, שיטות פופולריות יותר למידול כלי דם, כגון מערכות מיקרופלואידיקה, מציעות רק ייצוג רקמה 2.5D26.

השיטה המוצעת ניתן לשנות בקלות וליישם ללמוד גורמים רבים ושונים המשפיעים על התפתחות רשת כלי והתנהגות. ייצור פיגומים פוטוליטוגרפי SU-8 הוא טכניקה נפוצה עם צדדיות מרשימה המאפשרת יצירת מגוון רחב של צורות26,27, עם פוטנציאל לעצב מבנים דומים מבנים מקומיים מורכבים, כגון alveoli או היחידה הנפרוטית. עם זאת, חיסרון של שימוש SU-8 הוא bioabsorbability נמוך שלה27, מה שהופך את הפלטפורמה בעיקר כלי מחקר, במקום רקמה מושתלת. עם זאת, זה יכול להשתפר על ידי שימוש בחומרים תואמים ביולוגית אשר יכול לחצות תחת תאורת אור UV / גלוי, ו 3D מודפס בטכניקות מדויקות כמו stereolitography29. המבנים כלי הדם וכתוצאה מכך יכול להיות מושתל במודל בעליחיים 30. מגבלה נוספת של המערכת היא עובי הפיגום המרבי בר השגה עם דיוק פרטים גבוה, מוגבל על ידי טכניקה סטראוליתוגרפית31. הפרוטוקול המוצע מתאים ליצירת פיגומים דקים שעשויים לייצג גדלי רקמות מקוריים.

פלטפורמה זו מציעה פוטנציאל לחקור מספר משתנים המשפיעים על תופעות כלי הדם4,32. ראשית, האינטראקציות בין סוגים שונים של ECs ו- SCs, ואת היווצרות כלי השיט שלהם, יכולות פיתוח והתבגרות, אשר ידועים שונים בעת שימוש בתאים ממקורות רקמות שונים33. שנית, ההשפעה של גורמי גדילה, מולקולות קטנות, ומעכבים על כלי הדם, המאפשר הדמיה ברורה של השפעתם בזמן אמת34,35. שלישית, תוספת של סוגי תאים אחרים, ספרואידים, או אורגנואידים ואת התקשורת והאינטראקציה שלהם עם כלי להרכיב36. לצורך כך, המערכת המוצעת מייצגת כלי רב עוצמה לחקירת מערכת המיקרו-וסקולרית.

צעדים עתידיים ינצלו את המערכת המוצעת כדי לחקור את ההשפעה של גירויים מכניים, כגון זרימה ביניים ומתיחה מכנית37,38, על כלי הדם המתפתחים. זה יהיה בתקווה לשפוך אור על היבטים חדשים שירחיבו את הידע הנוכחי ואת המחקר המדינה-of-the-art של mechanobiology כלי הדם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך במימון אוניברסיטת מישיגן - שותפות ישראלית למחקר. המחברים מבקשים להודות לאורי מרדלר, ליאור דבי וגליה בן דוד על עזרתם ותמיכתם הרבה, נדין וואנג, Ph.D. ופילאר הררה-פיירו, Ph.D. של מתקן Nanofabrication לוריא באוניברסיטת מישיגן, כמו גם לואיס Solorio, Ph.D. עבור דיונים מאירי עיניים של טכניקות פוטוליטוגרפיה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Angiotool freeware NIH-CCR Free download at https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home
Bovine albumin serum Probumin Millipore 82-045-1
Dental pulp stem cells Lonza PT-5025
ECM media + bullet kit Sciencell #1001
Ethanol 96% Gadot-Group 64-17-5
Evicel fibrin sealant Johnson&Johnson EVB05IL Provides both thrombin and fibrinogen (BAC2) solutions
GlutaMAX Gibco 35050061
Goat anti-mouse Cy3 antibody Jackson 115-166-072
Goat anti-rabbit Alexa-Fluor 488 Thermo- Fisher Scientific A11034
Human adipose microvascular cells Sciencell #7200
Human fibronectin Sigma F0895-5MG Stock concentration: 1 mg/mL
ImageJ NIH Free download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Isopropyl alcohol Gadot-Group 67-63-0
Lift-off reagent Kayaku Advanced Materials, Inc G112850 Commercial name Omnicoat
Low-glucose DMEM Biological Industries 01-050-1A
Mouse anti-SMA antibody Dako M0851
NEAA Gibco 11140068
Paraformaldehyde solution 4% in PBS ChemCruz SC-281692
Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution Biological Industries 03-032-1B
Phospate buffered saline (PBS) Sigma P5368-10PAK
Rabbit anti-vWF antibody Abcam ab9378
Silicon wafer Silicon Valley Microelectronics (SVM) Wafers 4", Type N-1-10, 500-550 microns thick
SU-8 2050 photoresist Kayaku Advanced Materials, Inc Y11058
SU-8 developer Kayaku Advanced Materials, Inc Y020100
Tryton-X 100 BioLab LTD 57836

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4), 300-311 (2011).
  2. Landau, S., Guo, S., Levenberg, S. Localization of Engineered Vasculature within 3D Tissue Constructs. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 2 (2018).
  3. Griffith, C. K., et al. Diffusion Limits of an in Vitro Thick Prevascularized Tissue. Tissue Engineering. 11 (12), (2005).
  4. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
  5. Landau, S., et al. Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation. Biomaterials. 122, 72-82 (2017).
  6. Lesman, A., et al. Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs. Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).
  7. Richards, D., Jia, J., Yost, M., Markwald, R., Mei, Y. 3D Bioprinting for Vascularized Tissue Fabrication. Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 132-147 (2017).
  8. Levenberg, S., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nature Biotechnology. 23 (7), 879-884 (2005).
  9. Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
  10. Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11, (2012).
  11. Gariboldi, M. I., Butler, R., Best, S. M., Cameron, R. E. Engineering vasculature Architectural effects on microcapillary-like structure self-assembly. PLOS ONE. 14 (1), 1-13 (2019).
  12. Blache, U., Guerrero, J., Güven, S., Klar, A. S., Scherberich, A. Microvascular Networks and Models, In vitro Formation. Vascularization for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. , 1-40 (2018).
  13. Wong, K. H. K., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. Microfluidic Models of Vascular Functions. Annual Review of Biomedical Engineering. 14 (1), 205-230 (2012).
  14. Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress. Biophysical Journal. 105 (10), 2240-2251 (2013).
  15. Pollet, A. M. A. O., den Toonder, J. M. J. Recapitulating the vasculature using Organ-on-Chip technology. Bioengineering. 7 (1), (2020).
  16. Hasan, A., et al. Microfluidic techniques for development of 3D vascularized tissue. Biomaterials. 35 (26), 7308-7325 (2014).
  17. Jordahl, J. H., et al. 3D Jet Writing: Functional Microtissues Based on Tessellated Scaffold Architectures. Advanced Materials. 30 (14), 1707196 (2018).
  18. Gauvin, R., et al. Microfabrication of complex porous tissue engineering scaffolds using 3D projection stereolithography. Biomaterials. 33 (15), 3824-3834 (2012).
  19. Coscoy, S., et al. Microtopographies control the development of basal protrusions in epithelial sheets. Biointerphases. 13 (4), 041003 (2018).
  20. Kaplan, B., et al. Rapid prototyping fabrication of soft and oriented polyester scaffolds for axonal guidance. Biomaterials. , (2020).
  21. Steier, A., Muñiz, A., Neale, D., Lahann, J. Emerging Trends in Information-Driven Engineering of Complex Biological Systems. Advanced Materials. 31 (26), 11806898 (2019).
  22. Szklanny, A. A., et al. High-Throughput Scaffold System for Studying the Effect of Local Geometry and Topology on the Development and Orientation of Sprouting Blood Vessels. Advanced Functional Materials. , 1901335 (2019).
  23. Welti, J., Loges, S., Dimmeler, S., Carmeliet, P. Recent molecular discoveries in angiogenesis and antiangiogenic therapies in cancer. Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3190-3200 (2013).
  24. Gui, L., Niklason, L. E. Vascular Tissue Engineering: Building Perfusable Vasculature for Implantation. Current Opinion in Chemical Engineering. 3, 68-74 (2014).
  25. Blache, U., Ehrbar, M. Inspired by nature: Hydrogels as versatile tools for vascular engineering. Advances in Wound Care. 7 (7), 232-246 (2018).
  26. Cochrane, A., et al. Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).
  27. Nemani, K. V., Moodie, K. L., Brennick, J. B., Su, A., Gimi, B. In vitro and in vivo evaluation of SU-8 biocompatibility. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 33 (7), 4453-4459 (2013).
  28. Mathew, R., Ravi Sankar, A. A Review on Surface Stress-Based Miniaturized Piezoresistive SU-8 Polymeric Cantilever Sensors. Nano-Micro Letters. 10 (2), 1-41 (2018).
  29. Knowlton, S., Yenilmez, B., Anand, S., Tasoglu, S. Photocrosslinking-based bioprinting: Examining crosslinking schemes. Bioprinting. 5, 10-18 (2017).
  30. Redd, M. A., et al. Patterned human microvascular grafts enable rapid vascularization and increase perfusion in infarcted rat hearts. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
  31. Zhu, Y., et al. SU-8 Photoresist. Encyclopedia of Nanotechnology. , 2530-2543 (2012).
  32. Zheng, F., et al. Organ-on-a-Chip Systems: Microengineering to Biomimic Living Systems. Small. 12 (17), 2253-2282 (2016).
  33. Freiman, A., et al. Adipose-derived endothelial and mesenchymal stem cells enhance vascular network formation on three-dimensional constructs in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 5 (2016).
  34. van Duinen, V., et al. Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform. Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).
  35. Nguyen, D. -H. T., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (17), 6712-6717 (2013).
  36. Nashimoto, Y., et al. Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).
  37. Rosenfeld, D., et al. Morphogenesis of 3D vascular networks is regulated by tensile forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3215-3220 (2016).
  38. Neto, F., et al. and TAZ regulate adherens junction dynamics and endothelial cell distribution during vascular development. bioRxiv. , 174185 (2017).

Tags

הנדסה ביולוגית גיליון 167 מיקרוווסקולטורה הגירת כלי שיט כלי אנליטי בדיקות תפוקה גבוהה ניתוח אנגיוגנזה הנדסת רקמות
זריעת תאים Stepwise על פיגומים Tessellated ללמוד כלי דם מונבטים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Szklanny, A. A., Neale, D. B.,… More

Szklanny, A. A., Neale, D. B., Lahann, J., Levenberg, S. Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels. J. Vis. Exp. (167), e61995, doi:10.3791/61995 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter