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Bioengineering

Siembra celular escalonada en andamios teselados para estudiar la brotación de los vasos sanguíneos

Published: January 14, 2021 doi: 10.3791/61995
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Faculty of Biomedical Engineering, Technion, 2Department of Chemical Engineering and Biointerfaces Institute, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Los tejidos diseñados dependen en gran medida de las redes vasculares adecuadas para proporcionar nutrientes y gases vitales y eliminar los desechos metabólicos. En este trabajo, un protocolo de siembra escalonada de células endoteliales y células de apoyo crea redes vasculares altamente organizadas en una plataforma de alto rendimiento para estudiar el comportamiento de los vasos en desarrollo en un entorno 3D controlado.

Abstract

El sistema cardiovascular es un jugador clave en la fisiología humana, proporcionando nutrición a la mayoría de los tejidos en el cuerpo; los recipientes están presentes en diversos tamaños, estructuras, fenotipos, y funcionamiento dependiendo de cada tejido perfundido específico. El campo de la ingeniería de tejidos, que tiene como objetivo reparar o reemplazar los tejidos corporales dañados o faltantes, se basa en la angiogénesis controlada para crear una vascularización adecuada dentro de los tejidos diseñados. Sin un sistema vascular, las construcciones de ingeniería gruesas no se pueden nutrir suficientemente, lo que puede resultar en muerte celular, eninjerto deficiente y, en última instancia, fracaso. Por lo tanto, la comprensión y el control del comportamiento de los vasos sanguíneos diseñados es un desafío excepcional en el campo. Este trabajo presenta un sistema de alto rendimiento que permite la creación de redes de buques organizadas y repetibles para estudiar el comportamiento de los buques en un entorno de andamios 3D. Este protocolo de siembra en dos pasos muestra que los recipientes dentro del sistema reaccionan a la topografía del andamio, presentando comportamientos de brotación distintivos dependiendo de la geometría del compartimiento en el que residen los recipientes. Los resultados obtenidos y la comprensión de este sistema de alto rendimiento se pueden aplicar con el fin de informar mejores diseños de construcción de andamios bioimpresos en 3D, en los que la fabricación de varias geometrías 3D no se puede evaluar rápidamente cuando se utiliza la impresión 3D como base para entornos biológicos celularizados. Además, la comprensión de este sistema de alto rendimiento se puede utilizar para la mejora de la investigación rápida de la droga, el desarrollo rápido de los modelos de las co-culturas, y la investigación de estímulos mecánicos en la formación del vaso sanguíneo para profundizar el conocimiento del sistema vascular.

Introduction

El campo de la ingeniería de tejidos está progresando rápidamente hacia la fabricación de construcciones de ingeniería para reemplazar órganos y tejidos perdidos o dañados1. Sin embargo, las construcciones completamente funcionales todavía tienen que ser alcanzadas, en parte, puesto que la generación de las redes vasculares operacionales para la nutrición del tejido sigue siendo un desafío excepcional. Sin la vascularización adecuada, los tejidos diseñados se limitan a un transporte de difusión pasiva de oxígeno y nutrientes, limitando el espesor máximo viable del tejido al límite de difusión, aproximadamente 200 μm2. Tales espesores no son adecuados para reparar defectos tisulares grandes o para la fabricación completa de órganos, lo que hace que la presencia de una red vascular funcional sea una característica obligatoria para los tejidos funcionales e implantables3.

El sistema vascular se compone de una amplia variedad de vasos sanguíneos, con diversos tamaños, fenotipos, y organización, estrechamente relacionados con el tejido del anfitrión. Comprender el comportamiento, la respuesta y las decisiones de migración tomadas por los vasos en desarrollo y germinación puede indicar su integración en los tejidos deingeniería 4. Actualmente, el enfoque más común para crear redes vasculares in vitro es la combinación de células endoteliales (CE) con células de apoyo (SCs, con la capacidad de diferenciarse en células murales), sembradas dentro de un micro-ambiente tridimensional. Este entorno proporciona señales químicas y físicas para permitir que las células se adhieran, proliferen y seautoensamblan en redes de vasos2,5,6,7,8. Cuando se co-cultivan, los SCs secretan proteínas de la matriz extracelular (ECM) mientras proporcionan soporte mecánico a los CE, que forman las estructuras tubulares. Además, una interacción cruzada entre ambos tipos de células promueve la tubulogénesis, la brotación de vasos y la migración, además de la maduración y diferenciación de las SCs en células murales que expresan actina muscular α (αSMA)4. El desarrollo de redes de buques se estudia más comúnmente en entornos 3D creados con hidrogeles, andamios poliméricos porosos o una combinación de ellos. Esta última opción proporciona igualmente un entorno amigable con las células y el soporte mecánico requerido tanto para las células como para el ECM9.

Se ha llevado a cabo una gran cantidad de trabajo para estudiar el desarrollo vascular, incluyendo el co-cultivo de las células en hidrogeles10,combinaciones hidrogeles-andamios11,12,plataformas 2D, y dispositivos microfluídicos13. Sin embargo, los hidrogeles pueden ser fácilmente deformados por las fuerzas ejercidas por las células14,mientras que los sistemas 2D y microfluídicos no logran recrear un ambiente más cercano a la naturaleza para obtener una respuesta más extrapolable15,16. Comprender cómo reaccionan los buques en formación a su entorno circundante puede proporcionar información crítica que podría permitir la fabricación de entornos de ingeniería con la capacidad de guiar el desarrollo del buque de una manera predecible. Comprender los fenómenos de formación vascular es especialmente crítico para mantener el ritmo de la rápida aparición de técnicas de fabricación a escala submicrónica a micron, como la estereolitografía, la litografía de proyección digital, la producción continua de interfaces líquidas, la escritura de electroayección de fusión 3D, la escritura de electrorreactor 3D basada en soluciones y las técnicas emergentes de bioimpresión17,18,19,20,21. Alinear el control de estas técnicas de microfabricación con una comprensión más profunda de la biología vascular es clave para la creación de una vasculatura de ingeniería adecuada para un tejido diana.

Aquí, presentamos un sistema 3D para estudiar la respuesta de los nuevos vasos de conformado y brotación a la geometría del andamio circundante, observando su origen de brote y posterior migración22. Mediante la utilización de andamios 3D con geometrías compartimentales teseladas, y una técnica de siembra de dos pasos, tuvimos éxito en crear redes vasculares altamente organizadas de una manera clara y fácil de analizar. Las geometrías teseladas proporcionan un sistema de alto rendimiento con unidades individuales que contienen buques que responden a su entorno local. Utilizando ECs multicolores, rastreamos los orígenes de la formación de brotes y los patrones de migración posteriores, correlacionados con la geometría del compartimiento y la ubicación de los SCs22.

Aunque el protocolo propuesto se ha preparado para analizar los efectos de las señales geométricas sobre el comportamiento de vascularización, este enfoque se puede ampliar y aplicar a una variedad de nuevas aplicaciones. El andamio teselado y las redes fácilmente perceptibles permiten el análisis directo de la interacción de diferentes CE y SCs, la adición de células orgánicas específicas y su interacción con las redes vasculares, el efecto de los fármacos en las redes vasculares y más. Nuestro sistema sugerido resulta muy versátil y de fabricación y procesamiento simple.

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Protocol

1. Fabricación de andamios teselados

NOTA: La fotolitografía es una técnica generalizada que requiere equipos especializados que normalmente se encuentran dentro de una instalación de nanofabricación / laboratorio. El método establecido en este protocolo se generalizó tanto como fue posible para la audiencia; sin embargo, pueden ser necesarios ligeros cambios en los procedimientos dependiendo del equipo disponible para el lector. Recomendamos realizar estos procedimientos en una sala limpia en una instalación de nanofabricación para garantizar la más alta calidad del proceso. Antes de comenzar, obtenga acceso a un alineador de máscaras (o alguna configuración de exposición a los rayos UV), un recubridor de espín, placas calientes, una estación de lavado de solventes, una fotomáscara y un limpiador de plasma. Los disolventes y productos químicos utilizados en el procedimiento son peligrosos, así que por favor tome el mayor cuidado para evitar cualquier exposición química. Al diseñar la fotomáscara, identifique qué tamaño de obleas de silicio y fotomáscaras son compatibles con el recubridor de espín y el alineador de máscaras. Además, el fotorresistencia situado hacia los bordes de la oblea de silicio se deforma típicamente de la manipulación; por lo tanto, haga los diseños hacia el área central de la oblea.

  1. Prepare andamios utilizando una técnica de fotolitografía con la geometría de interés seleccionada.
    1. Antes del recubrimiento de espín, limpie la oblea de silicio. Esto se puede hacer con limpieza por plasma o una técnica a base de solventes. Si se limpia por plasma, siga el procedimiento operativo estándar del instrumento para obtener detalles operativos. Rocíe con gas de nitrógeno comprimido e inspeccione la oblea para asegurarse de que esté libre de desechos antes del recubrimiento por espín. Esta oblea servirá como sustrato sobre el que se crean los andamios.
      NOTA: Para obtener mejores resultados, comience con una oblea fresca. Las obleas se pueden reutilar, pero deben estar libres de fotorresistentes antiguos, defectos superficiales y escombros. Es útil utilizar pinzas de oblea para la manipulación.
    2. Centre una oblea de silicio en el mandril de la recubridora de espín usando una guía. Gire brevemente la oblea para asegurarse de que se ha centrado correctamente en el mandril, ajuste según sea necesario hasta que esté correctamente centrada. Esto debe hacerse cada vez que se coloca una oblea en el recubridor de espín. Dispense 1-4 mL del reactivo de despegue sobre la oblea (esto dependerá del tamaño de la oblea). Aproximadamente 2 mL de reactivo de despegue funciona bien para una oblea de 4 pulgadas.
      1. Establezca la velocidad de propagación del recubridor de giro a 500 rpm durante 5 segundos, y la velocidad de giro a 1000 rpm durante 30 segundos, luego gire el reactivo de despegue. Inspeccione la oblea para asegurarse de que tiene un recubrimiento uniforme a través de la oblea. Cualquier escombro que quede en la oblea será muy obvio en este punto. Cualquier andamio en un área con escombros probablemente será inutilizable. Después del recubrimiento de espín, transferir a una placa caliente y hornear durante 1 minuto a 200 °C.
    3. Repita el paso anterior dos veces más para un total de tres recubrimientos.
    4. Spin-coat la oblea de silicio recubierta de reactivo de despegue con fotorresiste SU-8 2050 hasta obtener un espesor de aproximadamente 100 μm.
      1. Dispense 1 mL de resistencia por cada 25 mm de diámetro de sustrato.
        NOTA: Tenga cuidado de evitar burbujas mientras vierte la resistencia. Para SU-8 2050, verter aproximadamente un círculo de 2 pulgadas de diámetro, cuando se utiliza una oblea de silicio de 4 pulgadas funciona bien.
      2. Spin-coat el SU-8 2050. Extender a una velocidad de 500 rpm durante 5 segundos, seguido de una velocidad de giro entre 1700 a 1800 rpm para lograr aproximadamente 100 μm de espesor.
      3. Opcional: Después de girar, deje las obleas recubiertas de espín para des-gas durante la noche en una superficie nivelada protegida de la luz antes de la pre-cocción. Esto puede ayudar a eliminar la resistencia de cualquier burbuja y permitir que los defectos se nivelen.
        NOTA: El espesor real de la resistencia y los andamios resultantes pueden variar con el error del usuario y los parámetros del equipo. Por lo tanto, el espesor de los andamios debe verificarse más adelante, en el paso 1.6. Modifique los procedimientos de recubrimiento de espín en consecuencia para lograr el espesor deseado.
    5. Antes de la exposición, hornear previamente las obleas a 65 °C durante 10 min y luego a 95 °C durante 40-50 min. Antes de la exposición, pruebe la superficie de la resistencia presionando el borde con un par de pinzas para asegurarse de que ya no sea pegajosa / viscosa. Es útil sacar la oblea de la placa caliente y dejar que se enfríe durante un minuto 0.5-1 antes de evaluar la tachuela.
      NOTA: Los tiempos de rampa de temperatura lenta (calefacción y refrigeración) pueden ayudar a prevenir la deformación de los andamios.
  2. Exponga el fotorresistido a la luz UV (350-400 nm) a través de una fotomáscara con una energía de exposición de 215-240 mJ/cm2 para un espesor de resistencia de 85 - 110 μm. Consulte las directrices del fabricante de fotorresistencia para obtener las correlaciones recomendadas entre energía y grosor de exposición.
    1. Asegúrese de que la exposición esté correctamente calibrada de tal manera que se verifique la energía. Ajuste el tiempo de exposición según sea necesario para lograr la energía de exposición deseada. Además, los alineadores de máscaras pueden permitir diferentes modos de exposición: contacto al vacío, contacto duro, contacto suave y contacto de proximidad (los términos específicos pueden variar). Por lo general, afectarán a la resolución y la alineación de características. Los autores solían utilizar un modo de "contacto duro".
    2. Para entidades pequeñas o capas múltiples, donde la alineación importará, considere los modos de exposición y los procedimientos del alineador de máscaras con más cuidado. Asegúrese de considerar la altura de la resistencia al ajustar el valor de espesor. Consulte los procedimientos operativos estándar de su alineador de máscaras para obtener detalles de la operación.
      NOTA: El diseño de la fotomáscara determinará el tamaño de los andamios, la geometría del compartimento y el número de andamios obtenidos por lote. El uso de una fotomáscara de vidrio duro o cuarzo producirá la resolución más alta; sin embargo, una fotomáscara de película transparente de polímero blando generalmente se puede usar para estos tamaños de características grandes (>10 μm). El uso de una fotomáscara de película puede conducir a características topográficas a lo largo del eje z de los poros del andamio como resultado de una resolución de características más pobre. Esto podría potencialmente tener una influencia en el comportamiento celular. Verifique la resolución deseada consulte con quien esté produciendo la fotomáscara para asegurarse de que se logra la resolución deseada.
  3. Hornear la oblea inmediatamente después de la exposición a los rayos UV a 65 °C durante 2-5 minutos y luego a 95 °C durante 8-10 minutos.
  4. Desarrollar los andamios para eliminar la resistencia no desarrollada.
    1. Sumerja los andamios utilizando un bajo volumen de solución de desarrollo SU-8 durante 7-10 minutos para disolver cualquier resistencia no desarrollada.
    2. Enjuague con alcohol isopropílico (API).
    3. Oblea seca con nitrógeno comprimido.
      NOTA: Tenga cuidado durante el paso 1.4 para no causar la liberación prematura de los andamios. Los volúmenes bajos de desarrollo y el manejo suave son necesarios para lograr esto.
  5. Después del desarrollo, hornear las obleas a 150 °C durante 15 min.
    NOTA: Después de hornear duro, apagar la placa caliente para permitir que las obleas se enfríen muy lentamente puede ser ventajoso para evitar la deformación / rizado de los andamios finales.
  6. Opcional:Después del horno duro y antes del despegue, evalúe el espesor del andamio, ya que los andamios aún deben adherirse suavemente a la superficie de la oblea. Para este procedimiento, la perfilometría de contacto funciona bien; sin embargo, se podría emplear cualquier método apropiado.
  7. Levante los andamios de la oblea.
    1. Sumerja los andamios en el desarrollador SU-8 para que despeguen inmediatamente la oblea. Si los andamios no despegar, empuje suavemente los andamios con un par de pinzas de oblea.
    2. Elimine el exceso de desarrollador.
    3. Transfiera los andamios a un nuevo recipiente y sumérjase en alcohol isopropílico. Enjuague en IPA durante un mínimo de 6 veces para asegurarse de que se ha eliminado todo el desarrollador.
  8. Seque al aire los andamios durante un mínimo de una semana antes de su uso.

2. Recubrimiento de fibronectina de andamios

  1. Para la desinfección, sumerja los andamios en etanol al 70% (v/v) durante un mínimo de 15 minutos, y lave 2 veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) antes de su uso.
    PRECAUCIÓN: Los andamios SU-8 son frágiles y pueden romperse fácilmente. Se recomienda el manejo con fórceps de punta roma y curva, y deben manejarse con el más cuidado. Se puede lograr un manejo más fácil sumergiendo los andamios en líquido, para evitar interacciones electrostáticas entre los andamios y la superficie.
  2. Preparar una dilución de 50 μg/mL de fibronectina humana en PBS y cubrir los andamios por adsorción de proteínas.
    1. Mezclar 1,5 μL de solución común de fibronectina (1 mg/mL) con 28,5 μL de PBS por cada andamio a sembrar. Preferiblemente, prepare solo una dilución de fibronectina que se utilizará para todos los andamios para evitar errores de pipeteo.
      1. Para 10 andamios, mezcle 15 μL de solución de fibronectina en 285 μL de PBS, lo que equivale a un total de 300 μL de dilución de fibronectina de 50 μg/mL.
    2. Coloque los andamios escasamente encima de una superficie hidrofóbica (es decir, plato de 10 cm sin cultivo de tejidos (nonTC)) y cubra cada andamio con 30 μL de la dilución de fibronectina preparada en el paso 2.2.1.
      PRECAUCIÓN: Asegúrese de que no haya burbujas atrapadas en los compartimentos de los andamios. Si las burbujas están presentes, se pueden eliminar agitando suavemente el andamio dentro de la gota o el pipeteo ligero.
    3. Substituya la tapa de la placa y coloque los andamios cubiertos de fibronectina en una incubadora con 37 °C y 100% de humedad durante un mínimo de una hora.
    4. Después de la incubación, enjuague ligeramente los andamios en PBS para eliminar los restos de fibronectina. Los andamios se pueden mantener en PBS a 4 °C hasta una semana antes de su uso.

3. Siembra de células endoteliales

  1. Prepare el medio de la EC mezclando el medio básico con sus componentes correspondientes del kit del medio, incluyendo una solución antibiótico (pluma/estreptococo), suero bovino fetal (FBS), y suplementos endoteliales del crecimiento de la célula, según lo indicado por el fabricante.
  2. Hacer una suspensión de células endoteliales microvasculares adiposas humanas (HAMEC) en medio CE con una concentración de 4 x 106 células/mL.
    NOTA: Las imágenes en tiempo real se pueden realizar si las células endoteliales utilizadas se transfectan previamente para expresar una proteína fluorescente, o se tiñen previamente con un tinte de membrana citoplasmática no tóxico (más conocido como CE etiquetados).
  3. Usando las medidas de suba, coloque un andamio recubierto de fibronectina por pocillo en un pozo de placa de 24 pocillos noTC.
  4. Cubra cada andamio con gotas de 25 μL de la suspensión HAMEC. Tenga cuidado de no dejar que la suspensión fluya lejos del andamio, ya que puede dificultar la adhesión celular.
  5. Poner la tapa en el plato y colocarla en una incubadora a 37 °C, 5% deCO2 y 100% de humedad. Dejar incubar durante un mínimo de 60 minutos y un máximo de 90 minutos.
    NOTA: Durante la incubación, la colocación de la placa en una coctelera orbital dentro de la incubadora mejora la fijación celular en las paredes del andamio. La coctelera orbital debe fijarse a no más de 5 rpm.
  6. Después de la incubación, llene cada pocillo con 700 μL de medio EC usando una pipeta.
    NOTA: Espere ver ECs en la parte inferior del pozo, ya que algunas de las celdas no se unen al andamio y caen a través de los vacíos del andamio.
  7. Incubar los andamios endotelializados hasta que se pueda observar la confluencia de la CE usando microscopía fluorescente en las paredes del andamio (cuando se usan CE etiquetados), o durante 3 días (cuando se usan CE no etiquetadas), lo que proporciona tiempo suficiente para lograr la confluencia de la CE. Cambie el medio cada dos días.

4. Apoyar la siembra celular y el co-cultivo

  1. Prepare el medio de células madre de pulpa dental (DPSC) (DPSCm) mezclando 500 mL de ácido alto modificado de Dulbecco Eagle medio (DMEM de baja glucosa), 57,5 mL de FBS, 5,75 mL de aminoácidos no esenciales (NEAA), 5,75 mL de GlutaMAX y 5,75 mL de solución de penicilina-estreptomicina-nistatina.
  2. Transfiera los andamios endotelializados a una nueva placa noTC de 24 pocillos para descartar los ECs unidos a la parte inferior de los pozos usando fórceps.
    1. Deseche todos los medios de la placa actual utilizando una pipeta de 1 mL o succión al vacío. Tenga cuidado de no aplicar vacío directamente sobre el andamio.
    2. Coloque un andamio por pozo, preferiblemente en el centro del pozo para evitar correr líquido hacia las paredes debido a los efectos de tensión superficial. Seque el área que rodea el andamio con vacío ligero, pero evite el secado completo del andamio.
  3. Prepare una suspensión DPSC en solución de fibrina pre-gel.
    1. Diluir soluciones de trombina y fibrinógeno con PBS hasta obtener una concentración final de 5 U/mL y 15 mg/mL, respectivamente.
    2. Preparar una suspensión 8 x 106 DPSC/mL en la dilución de trombina de 5 U/mL y distribuir en eppendorfs individuales 12,5 μL de dicha suspensión por andamio a sembrar.
    3. Fije una pipeta de 5-50 μL (o similar) a 12,5 μL y llénela con la solución de fibrinógeno de 15 mg/mL.
    4. Sin quitar la punta, fije la pipeta en 25 μL. El material en la punta debe elevarse y dejar un volumen vacío hacia la abertura de la punta.
    5. Presione lentamente el botón del émbolo hasta que el líquido llegue a la abertura de la punta, pero no se filtre. Sostenga el émbolo en esta posición y coloque la punta en uno de los tubos de microcentrífuga que contienen las células en suspensión de trombina, asegurándose de que la punta esté en contacto con el líquido.
      PRECAUCIÓN: La reticulación de fibrina comenzará inmediatamente después de que la trombina y el fibrinógeno entren en contacto. El siguiente paso debe hacerse rápidamente.
    6. Suelte suavemente el botón del émbolo y dibuje la suspensión de la celda en la punta. Mezcle a fondo ambos materiales, evitando la formación de burbujas.
  4. Dispense rápidamente los materiales mezclados en la parte superior de un andamio endotelializado. Repita los pasos anteriores para cada andamio, asegurándose de cambiar siempre las puntas entre usos para evitar la formación inesperada de gel de fibrina dentro de la punta.
  5. Substituya la tapa de la placa e incube los andamios a 37 °C, 5% deCO2 y 100% de humedad durante 30 minutos.
  6. Después de la incubación, llene cada pocillo con 1 mL de 1:1 DPSC y medio EC.
    1. Cultivo durante 1 semana, cambiando de medio cada dos días.
    2. Durante el cultivo, se retira el medio del pozo y se obtienen imágenes de los constructos utilizando un microscopio confocal en diferentes momentos para estudiar el desarrollo vascular o cualquier otro parámetro de interés.
      Nota : este paso sólo se puede realizar si el experimento se realiza mediante ECs etiquetados. Consulte el Paso 6 - NOTA para obtener más aclaraciones.

5. Tinción inmunofluorescente para los marcadores vasculares característicos

Nota: Los pasos siguientes se pueden realizar en los mismos pozos donde se cultivaron las construcciones. Es fundamental asegurarse siempre de que las soluciones cubran completamente los andamios. Además, cuando es posible, se recomienda realizar los pasos en una coctelera orbital, aunque no es obligatorio.

  1. En el día 7, deseche los medios de los pozos y enjuague los andamios agregando PBS a los pozos y retirándolo con vacío.
  2. Fije los andamios añadiendo un 4% de paraformadehído durante 20 minutos. Lavar en PBS 3 veces, 5 minutos por lavado.
  3. Permeabilizar las células fijas utilizando Tritón-X al 0,3% en PBS (v/v) durante 15 minutos. Lavar en PBS 3 veces, 5 minutos por lavado.
  4. Prepare una albúmina sérica bovina (BSA) al 5% en solución de bloqueo de PBS (p/v) y cubra los andamios. Dejar a temperatura ambiente durante 1 hora.
    NOTA: Todas las cantidades de solución requeridas dependerán del número de andamios a teñir. Prepare las soluciones según sea necesario manteniendo las concentraciones indicadas.
  5. Preparar y aplicar la solución de tinción de anticuerpos primarios.
    1. Diluya el anticuerpo del factor anti-von Willebrand del conejo (vWF) 1:150 y el anticuerpo anti-SMA del ratón 1:50 en la solución de bloqueo fresca.
      NOTA: Se pueden utilizar otros marcadores de células endoteliales, como CD31 o VE-Cadherina.
    2. Cubra los andamios con la solución de anticuerpos primarios y manténgalo a 4 °C durante la noche. Lavar en PBS tres veces, 5 minutos por lavado.
  6. Prepare y aplique la solución de tinción de anticuerpos secundarios.
    1. Diluir el anticuerpo anti-ratón Cy3 de cabra 1:150 y el anti-conejo de cabra Alexa-Fluor 488 1:400 en PBS.
    2. Cubra los andamios con la solución de anticuerpos secundarios e incube durante un mínimo de 3 horas a temperatura ambiente, o a 4 °C durante la noche. Lavar 3 veces en PBS, 5 minutos por lavado. Mantenga el andamio manchado en 0.3% PFA en PBS (v / v) hasta por un mes.

6. Análisis de imágenes confocales y desarrollo de vasos de andamios

NOTA: Los siguientes pasos se pueden realizar en los andamios fijos y teñidos en el punto de tiempo final elegido o, si se utilizaron células fluorescentes, durante el período de cultivo celular sin la necesidad de terminar el experimento. Para estos últimos, se recomienda establecer puntos de tiempo específicos; este trabajo muestra el día 0 (antes de la siembra de SCs), y los días 1, 3, 5 y 7 después de la siembra de SCs (Figura 3A).

  1. Imagen de los andamios utilizando un microscopio confocal con una lente 5X y un zoom de 0,5 y el rango z completo del andamio. Esto permitirá capturar 9 compartimentos separados para las geometrías cuadradas y circulares, o 8 compartimentos completos para la geometría hexagonal. Imagen de la señal fluorescente y la luz transmitida, para obtener tanto la estructura de la red del buque y la geometría del compartimiento (Figura 3A).
  2. Usando ImageJ (o cualquier otro software de procesamiento de imágenes), recorte cada compartimiento individual; para este proceso, sólo los marcadores de redes vasculares son relevantes. Retire cualquier recipiente que no se encuentre dentro del área del compartimiento. Cree una proyección de máxima intensidad y guarde cada compartimento recortado individual como una imagen TIFF.
    1. En ImageJ, pulse Archivo > Abrir y seleccione la imagen TIFF deseada que contenga varios compartimentos. La imagen debe tener al menos dos canales, la red de vasos fluorescentes y la imagen de luz transmitida.
    2. En la barra de herramientas, seleccione la herramienta De selección de polígono. Seleccione el canal de luz transmitido. Haga clic en una de las esquinas del compartimiento hexagonal, en la interfaz entre el área del compartimiento y la pared del andamio, esto iniciará la definición de la máscara. Continúe haciendo clic en las siguientes esquinas en un orden secuencial hasta que se seleccione la esquina inicial, cerrando la máscara.
      Nota : esta explicación se aplica a un compartimiento hexagonal. Cuando el compartimiento sea cuadrado o circular, utilice las herramientas Rectángulo u Óvalo, respectivamente, para crear una máscara adecuada. Independientemente de la forma, siempre ajuste la máscara para seguir la pared interior del andamio.
    3. Haga clic en Analizar herramientas de > > el administrador de ROI. En el gestor de ROI (ROI, región de interés), haga clic en el botón Agregar para guardar la máscara creada. La nueva máscara aparecerá en la lista del lado izquierdo. Este paso permite que el análisis sea consistente entre diferentes imágenes.
      NOTA: En el gestor de ROI, es posible guardar un archivo con todas las máscaras creadas haciendo clic en Más > Guardar. En la ventana Guardar selección, elija un nombre y una ubicación y guarde el archivo .roi. Para recuperar la máscara, en el administrador de ROI, haga clic en Más > Abrir y elija el archivo .roi deseado.
    4. Seleccione la imagen de la red de recipientes fluorescentes y haga clic en Editar > Borrar fuera. Solo quedará la imagen contenida en la máscara, mientras que el resto será eliminada.
    5. Con la imagen de red desactivada abierta, haga clic en Imagen > Duplicar. En la ventana emergente Duplicar, escriba el nombre de la imagen. Si está seleccionada la hiperstack Duplicar, anule la selección y haga clic en Aceptar. Se creará una nueva imagen que contenga solo las redes de vasos fluorescentes recortados.
    6. Guarde la imagen recortada haciendo clic en Archivo > Guardar como > Tiff. Elija el nombre y el directorio y haga clic en Aceptar.
  3. Analizar el desarrollo vascular en las imágenes recortadas.
    1. Descargue e instale el software analítico gratuito AngioTool, que proporciona herramientas cuantitativas para cuantificar una variedad de parámetros vasculares. El software se puede obtener en la siguiente dirección https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home.
    2. Establezca el valor de escala de las imágenes para obtener resultados en unidades milimétricas y cargar una imagen.
      1. Haga clic en la pestaña Configuración y rellene la Distancia en píxeles y la Distancia en mm con valores representativos de las imágenes tomadas. Utilizando los parámetros de imagen mencionados anteriormente, los valores a rellenar son 400 píxeles por 1 mm.
      2. Pulse el botón Abrir imagen y busque la imagen de interés.
    3. Elija los parámetros de análisis para cuantificar el desarrollo del buque en la pestaña Análisis.
      1. En el campo Diámetro e intensidad del recipiente, anule la selección de cualquier marcador presente del selector de rango superior y active el marcador que representa el número 3.
      2. En el campo Diámetro e intensidad del buque, en el selector de rango inferior, mueva el marcador de rango inferior a 60 y deje el fabricante de guardabosques alto en 255.
      3. Active el cuadro Quitar partículas pequeñas y establezca el marcador en 100.
      4. En el campo Preferencias de guardado, seleccione el nombre y la ubicación del archivo de hoja de cálculo en el que se guardarán los resultados y pulse el botón Ejecutar análisis. Si se selecciona el cuadro Guardar imagen de resultado, Angiotool generará y guardará una nueva imagen jpeg que muestre los parámetros cuantificados de la red de buques.
        Nota : para cada análisis realizado sin cambiar el nombre de archivo de hoja de cálculo, se añadirá una nueva fila en la parte inferior del archivo, con los resultados recién adquiridos.
  4. Organice los datos y ejecute un análisis estadístico.
    1. Para todas las imágenes procesadas, elija el parámetro de interés de la hoja de cálculo (por ejemplo, Eslora totaldel buque y Área del buque) e inscítelos en un software de análisis estadístico para estudiar adecuadamente los resultados obtenidos(Figura 3C).

7. Imágenes de lapso de tiempo para la detección de origen de la brotación y el seguimiento de la migración

  1. Alternativamente, para cultivar los andamios en la incubadora como se describe en el paso 4.6, establezca una cámara de cultivo de microscopio confocal a 37 °C, 5% de CO2 y 100% de humedad.
    1. Coloque la placa que contiene los andamios completamente sembrados en la cámara del microscopio confocal y establezca los parámetros de imagen en los valores deseados.
    2. Establezca el intervalo de toma de imágenes en 30 minutos y el tiempo total de creación de imágenes de 72 horas. Esto permitirá ejecutar el lapso de tiempo completamente sin la necesidad de un cambio de medio.
      PRECAUCIÓN: En caso de que se desee una proyección de imagen más larga del lapso de tiempo, una calibración cuidadosa de la posición se debe realizar para poder recuperar la localización original de la proyección de imagen, puesto que los cambios del medio requieren quitar la placa de la incubadora confocal y en la capilla biológica estéril.
      NOTA: El desprendimiento de los CE de las paredes del andamio y la formación de estructuras tubulares comenzará dentro de la primera hora después de la siembra de SCs (paso 4) y puede tardar hasta 50 horas en completarse. Después de la formación inicial del tubo, los nuevos brotes comenzarán a migrar al compartimento desde los vasos circundantes. La brotación y posterior remodelación de la red continuará a lo largo del experimento aproximadamente hasta el día 10, cuando las redes de buques se vuelvan estables22. Utilice esta información para elegir el punto de partida del lapso de tiempo y el paso de tiempo en consecuencia.
  2. Guarde el archivo de película de lapso de tiempo completo como una secuencia TIFF.
  3. Abra ImageJ y haga clic en Archivo > Importar > secuencia de imágenes y seleccione sus archivos. Esto abrirá la secuencia TIFF como una película.
  4. Abra el plugin de seguimiento manual haciendo clic en Plugins > Seguimiento manual. Esto abrirá la ventana Seguimiento.
  5. Observe la película y seleccione el recipiente a rastrear. Preste atención a su origen y migración.
  6. Active el cuadro Mostrar parámetros e introduzca los 30 minutos para Intervalo de tiempo. La calibración x/y dependerá de la cantidad de píxeles seleccionados durante la obtención de imágenes.
  7. Proceda a rastrear manualmente los recipientes de brotación desde el contorno del andamio.
    1. Pulse el botón Agregar pista. En el primer fotograma de la película, presione la ubicación de la embarcación que se va a rastrear. Después de esto, la película cambiará al siguiente fotograma automáticamente.
    2. Haga clic en la imagen del segundo marco donde se encuentra el buque. De nuevo, la película cambiará al siguiente fotograma automáticamente.
    3. Continúe con el mismo buque hasta que se haya completado el seguimiento completo de la migración.
    4. En la ventana Seguimiento, haga clic en Superponer puntos y líneas para imprimir una ruta visual de la migración del buque en la película. Esto abrirá una copia de la película con un punto que representa la posición actual del rastreador y una línea que muestra la ruta anterior.
    5. Haga clic en el botón Finalizar pista para finalizar el registro del movimiento actual del buque.
    6. Haga clic en el botón Agregar pista de nuevo para comenzar de nuevo con un nuevo recipiente. Al hacer esto, los marcadores de línea y punto cambiarán automáticamente su color para el nuevo recipiente. Repita hasta que se realice un seguimiento de todos los recipientes deseados.
      NOTA: La ubicación x/y, la velocidad del buque y la distancia movida se pueden recuperar desde la ventana emergente Resultados. Cada buque se identificará por su número de pista en la columna situada más a la izquierda. Estos datos se pueden copiar y pegar en una hoja de cálculo para realizar análisis adicionales.

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Representative Results

El protocolo presentado, utilizando técnicas de estereolitografía, permite la fabricación de andamios teselados hechos de fotorresistible SU-8. Se obtuvieron andamios con geometrías compartimentales distintas (cuadrados, hexágonos y círculos) y características altamente precisas y repetibles (Figura 1).

Figure 1
Figura 1:Imágenes representativas de microscopía electrónica de barrido de las geometrías de andamios cuadrados, circulares y hexagonales teselados (barra de escala = 500 μm). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Con una siembra celular escalonada (pasos 2 a 4), los andamios fabricados se utilizaron para crear redes vasculares altamente organizadas. Cuando se utilizaba una siembra simultánea tradicional de CE y SCs, los buques resultantes carecían de una organización clara. Para ello, se realizó el recubrimiento de fibronectina del andamio (paso 2), se omitió el paso de endotelialización del andamio (paso 3) y el DPSC y el HAMEC se cosembraron simultáneamente en gel de fibrina (paso 4). De esta manera, las células se distribuyen homogéneamente sobre el andamio(Figura 2,fila superior), dando lugar a redes vasculares desarrolladas impredecibles y desorganizadas que no parecen interactuar con el andamio circundante. Por el contrario, en primer lugar la siembra de los CE en las paredes del andamio proporciona un patrón de células endoteliales inicial preciso. La adición posterior de SCs dentro de un gel de fibrina resulta en un fenómeno de tubulogénesis predecible, con la formación de vasos siguiendo de cerca la forma de la pared del andamio, y la germinación de nuevos vasos que migran en el espacio del compartimiento(Figura 2,fila inferior).

Figure 2
Figura 2:Comparación de vascularización entre la siembra celular simultánea frente a la sembrada escalonada. Imágenes representativas del desarrollo vascular en andamios teselados para una siembra celular simultánea (fila superior) de CE (rojo) y SCs (verde), y siembra celular paso a paso (fila inferior) en los días 1 y 5. La siembra escalonada da como resultado redes vasculares organizadas que siguen las paredes del andamio y brotan en el espacio del compartimiento (barra de escala: 100 μm). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Cuando se utilizan CE fluorescentes, ya sea transfectados o teñidos, los vasos se pueden foto fotoizar en tiempo real sin la necesidad de fijar y terminar el experimento para cada punto de tiempo. La proteína fluorescente roja que expresaba los CE (RFP-ECs) fueron cultivadas en andamios hexagonales e imagenizada después de la siembra(Figura 3A,día 0). Al día 1, se añadieron los SCs y se fotogeneró las redes vasculares cada dos días para cuantificar el desarrollo de los vasos(Figura 3A,días 1, 3, 5 y 7). Para cada punto de tiempo, se tomaron imágenes amplias de todo el andamio (Figura 3B). Para cada compartimento, los vasos se organizaban e interactuaba principalmente con celdas ubicadas dentro de su confinamiento. Por lo tanto, cada compartimiento fue aislado y los recipientes superfluos fuera del compartimiento fueron quitados usando ImageJ. Las imágenes limpias, del solo-compartimiento entonces eran analizadas usando Angiotool. Angiotool devolvió un archivo de hoja de cálculo que contenía varios parámetros de recipiente y una representación visual de las características principales de la red, como el esqueleto, los puntos de intersección y la superficie del vaso. Los datos obtenidos se analizaron utilizando el software de análisis estadístico Prism, y se observó un claro crecimiento del vaso para la longitud total del vaso y el área durante el marco de tiempo del experimento (Figura 3C). Durante un experimento de 1 semana, se espera que los vasos se desarrollen y amplíen aún más, como se muestra en la Figura 3A y la Figura 2C. La disminución de la longitud o el área de los vasos, la falta de formación de buques para el día 3 o la formación de buques como se muestra en la fila superior de la Figura 2 pueden interpretarse como experimentos fallidos.

Figure 3
Figura 3:Imágenes representativas de desarrollo y análisis de redes vasculares organizadas. (A) Los CE (rojos) alcanzan la confluencia en la pared del andamio en la que posteriormente se siembran las CE; la adición de SCs representa el día 0 del experimento. Al día 1 después de la siembra de los SCs, los CE se separan al espacio del compartimento y comienzan a formar recipientes que continuarán brotando y conectándose en días posteriores. (B)Pasos de procesamiento de imágenes confocales para el análisis de redes vasculares (i) Se toma una imagen confocal amplia que contiene varios compartimentos, (ii) se recorta un solo compartimento (demarcado por el hexágono discontinuo blanco), (iii) luego se separa el canal de la red vascular y se recortan todos los vasos fuera de las paredes del compartimento. La imagen de un solo compartimento se analiza utilizando Angiotool, devolviendo una lista de parámetros vasculares complementados con marcadores visuales, como el área del vaso (delineada en amarillo), la longitud de los vasos (mostrada con líneas verdes) y los puntos de intersección (marcados como puntos azules). (C)Resultados comparativos de la eslora total del buque y del área total del buque dentro de los compartimentos hexagonales en diferentes puntos de tiempo (los resultados se presentan como media ± DE, n > 6; todas las barras de escala: 200 μm). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Usando ECs multicolores para facilitar la identificación unicelular, un lapso de tiempo confocal de la proyección de imagen fue realizado para permitir el seguimiento de un solo recipiente (vídeo suplementario 1). Los buques fueron observados y rastreados utilizando el plugin Manual Tracking ImageJ. La celda de punta fue seleccionada para cada fotograma de la película (Figura 4A) hasta que el vaso se anastomosó con la vasculatura circundante. Como resultado, el plugin Manual Tracking generó la ruta del buque en tiempo real, lo que permitió observar la migración del buque (Figura 4B).

Figure 4
Figura 4:Seguimiento representativo de los buques de brotación. (A)Se utiliza un lapso de tiempo multicolor de los CE (verde, rojo y azul) para facilitar la identificación de un solo buque. Un recipiente de brotación se identifica y rastrea utilizando el plugin ImageJ Seguimiento Manual. El lado final de la embarcación está marcado para cada punto de tiempo para rastrear en tiempo real; se agregó el marcador negro en blanco para mostrar el punto final del buque seleccionado. (B) El seguimiento 2D resultante del recipiente, tal como lo procesa el plugin ImageJ, que muestra el punto más lejano con un punto, y el camino formado con una línea (barra de escala = 200 μm). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

La maduración de los vasos, representada por la presencia de SMA + SCs, se puede observar fácilmente en la plataforma propuesta. Las vasculaturas que presentan un mayor número de SMA+ SCs representan una red más madura, ya que la expresión de SMA se correlaciona con la estabilización de los vasos a lo largo del tiempo23. Para los compartimentos circulares, hexagonales y cuadrados, la cantidad de SMA+ SCs aumenta con el tiempo (Figura 5A). Por el día 3, todas las formas mostraron SMA+ SCs dispersados y recipientes uncomplex con pocos o ningún brote cualesquiera. Para el día 7, todas las formas mostraron una red vascular rica y compleja, con una mayor presencia de SMA+ SCs que rodeaban los vasos. Además, las imágenes de mayor aumento revelan una presencia más densa de SMA+ SCs co-localizada con los vasos formados, evidenciando el reclutamiento y diferenciación de SCs que rodean las estructuras vasculares (Figura 5B).

Figure 5
Figura 5:SMA + SCs y vasos sanguíneos aumentan con el tiempo. A) La actina del músculo liso (rojo) y el vWF (vasos, verde) se muestran para las redes vasculares en compartimentos circulares, cuadrados y hexagonales en el día 3 y el día 7. Tanto la extensión de la vasculatura como las células de soporte que expresan SMA (SMA + SCs) aumentan con el tiempo, lo que significa una mayor maduración y complejidad de los vasos (barra de escala = 200 μm). B)Imágenes representativas de la acumulación más densa de SMA+ SCs alrededor de los buques en el día 7. Los núcleos (azules) en la imagen compuesta revelan la presencia de SCs que no expresan la proteína SMA (barra de escala = 50 μm). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Vídeo complementario 1: lapso de tiempo multicolor de los CE para el seguimiento de la migración de buques. Por favor, haga clic aquí para descargar este video.  

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Discussion

La necesidad de una vasculatura rica dentro de los tejidos incrustados en la ingeniería es fundamental para la supervivencia de la construcción y la función adecuada1. Aunque la ingeniería del sistema vascular ha sido el foco de una gran cantidad de investigación, queda mucho por investigar y entender24. En particular, al recrear un tejido específico, la microvasculatura debe comportarse y organizarse en consecuencia12. El enfoque más común para la generación de microvasos es la co-siembra de células endoteliales y de soporte dentro de un entorno 3D adecuado compatible para la unión celular, la proliferación y la formación de vasos25. Esta metodología a menudo resulta en redes muy desorganizadas, lo que dificulta el estudio del comportamiento microvascular22. Aquí, el protocolo presentado proporciona una nueva herramienta que genera redes vasculares altamente organizadas en un sistema de alto rendimiento, con vasos que pueden ser fácilmente rastreados y monitoreados a través del tiempo, para estudiar su desarrollo ycomportamiento. La siembra escalonada de los CE (paso 2-3), seguida de los CE (paso 4), son pasos críticos para lograr tales redes organizadas22. Además, esta técnica presenta un entorno 3D real para modelos vasculares, en el que los vasos pueden migrar en las tres dimensiones y crear estructuras relevantes. Por el contrario, los métodos más populares para el modelado vascular, como los sistemas de microfluídica, sólo ofrecen una representación tisular 2,5D26.

El método propuesto se puede modificar y aplicar fácilmente para estudiar muchos factores diferentes que afectan el desarrollo y el comportamiento de la red de buques. La fabricación fotolitográfica de andamios de resina SU-8 es una técnica común con una versatilidad impresionante que permite crear una amplia variedad de formas26,27,con el potencial de diseñar estructuras que se asemejan a construcciones nativas complejas, como los alvéolos o la unidad nefrótica. No obstante, un inconveniente del uso de SU-8 es su baja bioabsorbibilidad27,lo que hace que la plataforma sea principalmente una herramienta de investigación, en lugar de un tejido implantable. Sin embargo, esto podría mejorarse mediante la utilización de materiales biocompatibles que pueden reticularse bajo iluminación UV / luz visible, e impresos en 3D utilizando técnicas precisas como la estereolitografía29. Las construcciones vascularizadas resultantes podrían entonces ser implantadas en un modelo animal30. Otra limitación del sistema es el andamio de espesor máximo alcanzable con alta precisión de detalle, limitado por la técnica estereolitográfica31. El protocolo propuesto es adecuado para crear andamios delgados que podrían representar tamaños de tejido nativos.

Esta plataforma ofrece el potencial de investigar varias variables que afectan los fenómenos de vascularización4,32. En primer lugar, las interacciones entre los diferentes tipos de CE y SCs, y sus capacidades de formación, desarrollo y maduración de los vasos, que se sabe que difieren cuando se utilizan células de diferentes orígenes tisulares33. En segundo lugar, el efecto de los factores de crecimiento, moléculas pequeñas e inhibidores sobre la vasculatura, lo que permite una visualización clara de su impacto en tiempo real34,35. En tercer lugar, la adición de otros tipos celulares, esferoides u organoides y su comunicación e interacción con los vasos formadores36. Para ello, el sistema propuesto representa una poderosa herramienta para investigar el sistema microvascular.

Los pasos futuros aprovecharán el sistema propuesto para investigar el efecto de los estímulos mecánicos, como el flujo intersticial y el estiramiento mecánico37,38,sobre la vasculatura en desarrollo. Se espera que esto arroje luz sobre nuevos aspectos que ampliarán el conocimiento actual y la investigación de vanguardia de la mecanobiología vascular.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Esta investigación fue apoyada por fondos de la Asociación para la Investigación universidad de Michigan - Israel. Los autores desean agradecer a Uri Merdler, Lior Debbi y Galia Ben David por su gran ayuda y apoyo, a Nadine Wang, Ph.D. y Pilar Herrera-Fierro, Ph.D. de la Lurie Nanofabrication Facility en la Universidad de Michigan, así como a Luis Solorio, Ph.D. por sus esclarecedoras discusiones sobre técnicas de fotolitografía.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Angiotool freeware NIH-CCR Free download at https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home
Bovine albumin serum Probumin Millipore 82-045-1
Dental pulp stem cells Lonza PT-5025
ECM media + bullet kit Sciencell #1001
Ethanol 96% Gadot-Group 64-17-5
Evicel fibrin sealant Johnson&Johnson EVB05IL Provides both thrombin and fibrinogen (BAC2) solutions
GlutaMAX Gibco 35050061
Goat anti-mouse Cy3 antibody Jackson 115-166-072
Goat anti-rabbit Alexa-Fluor 488 Thermo- Fisher Scientific A11034
Human adipose microvascular cells Sciencell #7200
Human fibronectin Sigma F0895-5MG Stock concentration: 1 mg/mL
ImageJ NIH Free download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Isopropyl alcohol Gadot-Group 67-63-0
Lift-off reagent Kayaku Advanced Materials, Inc G112850 Commercial name Omnicoat
Low-glucose DMEM Biological Industries 01-050-1A
Mouse anti-SMA antibody Dako M0851
NEAA Gibco 11140068
Paraformaldehyde solution 4% in PBS ChemCruz SC-281692
Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution Biological Industries 03-032-1B
Phospate buffered saline (PBS) Sigma P5368-10PAK
Rabbit anti-vWF antibody Abcam ab9378
Silicon wafer Silicon Valley Microelectronics (SVM) Wafers 4", Type N-1-10, 500-550 microns thick
SU-8 2050 photoresist Kayaku Advanced Materials, Inc Y11058
SU-8 developer Kayaku Advanced Materials, Inc Y020100
Tryton-X 100 BioLab LTD 57836

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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