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Bioengineering

अंकुरण रक्त वाहिकाओं का अध्ययन करने के लिए टेसेलेटेड मचान पर स्टेपवाइज सेल सीडिंग

Published: January 14, 2021 doi: 10.3791/61995
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Faculty of Biomedical Engineering, Technion, 2Department of Chemical Engineering and Biointerfaces Institute, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

इंजीनियर ऊतक महत्वपूर्ण पोषक तत्वों और गैसों को प्रदान करने और मेटाबोलिक कचरे को हटाने के लिए उचित संवहनी नेटवर्क पर भारी भरोसा करते हैं। इस काम में, एंडोथेलियल कोशिकाओं और समर्थन कोशिकाओं का एक स्टेपवाइज सीडिंग प्रोटोकॉल नियंत्रित 3 डी वातावरण में विकासशील पोत व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट मंच में अत्यधिक संगठित संवहनी नेटवर्क बनाता है।

Abstract

हृदय प्रणाली मानव शरीर विज्ञान में एक महत्वपूर्ण खिलाड़ी है, जो शरीर में अधिकांश ऊतकों को पोषण प्रदान करती है; प्रत्येक विशिष्ट छिद्रित ऊतक के आधार पर जहाज विभिन्न आकारों, संरचनाओं, फेनोटाइप और प्रदर्शन में मौजूद होते हैं। ऊतक इंजीनियरिंग का क्षेत्र, जिसका उद्देश्य क्षतिग्रस्त या लापता शरीर के ऊतकों की मरम्मत या प्रतिस्थापित करना है, इंजीनियर ऊतकों के भीतर एक उचित संवहनी बनाने के लिए नियंत्रित एंजियोजेनेसिस पर निर्भर करता है। एक संवहनी प्रणाली के बिना, मोटी इंजीनियर निर्माण पर्याप्त रूप से पोषित नहीं किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप सेल मृत्यु, खराब एनग्रेफ्टमेंट और अंततः विफलता हो सकती है। इस प्रकार, इंजीनियर रक्त वाहिकाओं के व्यवहार को समझना और नियंत्रित करना क्षेत्र में एक उत्कृष्ट चुनौती है। यह काम एक उच्च थ्रूपुट प्रणाली प्रस्तुत करता है जो 3 डी पाड़ वातावरण में पोत व्यवहार का अध्ययन करने के लिए संगठित और दोहराने योग्य पोत नेटवर्क के निर्माण की अनुमति देता है। इस दो कदम सीडिंग प्रोटोकॉल से पता चलता है कि प्रणाली के भीतर जहाजों पाड़ स्थलाकृति पर प्रतिक्रिया, डिब्बे ज्यामिति जिसमें जहाजों रहते है के आधार पर विशिष्ट अंकुरण व्यवहार पेश । इस उच्च थ्रूपुट प्रणाली से प्राप्त परिणामों और समझ को बेहतर 3 डी बायोप्रिंटेड पाड़ निर्माण डिजाइनों को सूचित करने के लिए लागू किया जा सकता है, जिसमें सेलुलरीकृत जैविक वातावरण के आधार के रूप में 3 डी प्रिंटिंग का उपयोग करते समय विभिन्न 3 डी ज्यामिति के निर्माण का तेजी से आकलन नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, इस उच्च थ्रूपुट प्रणाली से समझ का उपयोग तेजी से दवा स्क्रीनिंग के सुधार, सह-संस्कृतियों के मॉडलों के तेजी से विकास और संवहनी प्रणाली के ज्ञान को गहरा करने के लिए रक्त वाहिका गठन पर यांत्रिक उत्तेजनाओं की जांच के लिए किया जा सकता है।

Introduction

टिश्यू इंजीनियरिंग का क्षेत्र लापता या क्षतिग्रस्त अंगों और ऊतकों को बदलने के लिए इंजीनियर निर्माणों के निर्माण की दिशा में तेजी से प्रगति कर रहा है1. हालांकि, पूरी तरह से कार्यात्मक निर्माण अभी तक प्राप्त किया जाना है, भाग में, ऊतक पोषण के लिए परिचालन संवहनी नेटवर्क पैदा करने के बाद से एक उत्कृष्ट चुनौती बनी हुई है । उचित संवहनी के बिना, इंजीनियर ऊतक ऑक्सीजन और पोषक तत्वों के निष्क्रिय प्रसार परिवहन तक सीमित हैं, जो अधिकतम व्यवहार्य ऊतक मोटाई को प्रसार सीमा तक बाधित करते हैं, लगभग 200 माइक्रोन2। इस तरह की मोटाई बड़े ऊतक दोषों की मरम्मत या पूर्ण अंग निर्माण के लिए उपयुक्त नहीं हैं, जो कार्यात्मक संवहनी नेटवर्क की उपस्थिति को कार्यात्मक और प्रत्यारोपित ऊतकों के लिए एक अनिवार्य विशेषता प्रदान करता है3।

संवहनी प्रणाली में विभिन्न आकारों, फेनोटाइप और संगठन के साथ विभिन्न प्रकार की रक्त वाहिकाओं शामिल हैं, जो मेजबान ऊतक से कसकर संबंधित हैं। विकासशील और अंकुरित जहाजों द्वारा किए गए व्यवहार, प्रतिक्रिया और प्रवासन निर्णयों को समझना इंजीनियर ऊतकों में उनके एकीकरण का निर्देश दे सकता है4। वर्तमान में, इन विट्रो वैस्कुलर नेटवर्क बनाने के लिए सबसे आम दृष्टिकोण त्रि-आयामी सूक्ष्म वातावरण के भीतर वरीयता प्राप्त, भित्ति कोशिकाओं में अंतर करने की क्षमता के साथ समर्थन कोशिकाओं (एससी) के साथ एंडोथेलियल कोशिकाओं (एनसी) का संयोजन है। यह वातावरण कोशिकाओं को पोत नेटवर्क2, 5, 6, 7, 8में संलग्न, प्रसार और स्वयं को इकट्ठा करने की अनुमति देनेकेलिए रासायनिक और भौतिक संकेत प्रदान करता है। जब सह-संस्कारी, एससी ईसी को यांत्रिक सहायता प्रदान करते हुए बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन का स्राव करते हैं, जो ट्यूबलर संरचनाओं का निर्माण करते हैं। इसके अलावा, दोनों सेल प्रकारों के बीच एक क्रॉस-इंटरैक्शन ट्यूबुलोजेनेसिस, पोत अंकुरण और प्रवासन को बढ़ावा देता है, अनुसूचित जाति परिपक्वता और α-चिकनी मांसपेशी ऐक्टिन-एक्सप्रेसिंग (αSMA) भित्ति कोशिकाओं में भेदभाव के अलावा4। पोत नेटवर्क विकास का सबसे अधिक अध्ययन हाइड्रोगेल, असुरक्षित बहुलक मचान, या उसके संयोजन का उपयोग करके बनाए गए 3 डी वातावरण में किया जाता है। उत्तरार्द्ध विकल्प समान रूप से सेल-अनुकूल वातावरण और कोशिकाओं और ईसीएम9दोनों के लिए आवश्यक यांत्रिक सहायता प्रदान करता है।

संवहनी विकास का अध्ययन करने के लिए काफी काम किया गया है, जिसमें हाइड्रोगेल10,हाइड्रोगेल्स-पाड़ संयोजन11, 12,2डीप्लेटफार्मों और माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों13पर कोशिकाओं को सह-खेती करना शामिल है। हालांकि, हाइड्रोगेल को सेल-डालती बलों द्वारा आसानी से विकृत किया जा सकताहै,जबकि 2डी और माइक्रोफ्लुइडिक्स सिस्टम अधिक एक्सट्रपलेबल प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए प्रकृति के करीब वातावरण को फिर से बनाने में विफलरहतेहैं15,16। यह समझना कि जहाजों को उनके आसपास के वातावरण पर कैसे प्रतिक्रिया देनी महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की जा सकती है जो एक उम्मीद के मुताबिक तरीके से पोत के विकास का मार्गदर्शन करने की क्षमता के साथ इंजीनियर वातावरण के निर्माण के लिए अनुमति दे सकती है। संवहनी गठन की घटनाओं को समझना विशेष रूप से सबमिक्र-टू-माइक्रोन स्केल फैब्रिकेशन तकनीकों के तेजी से उद्भव के साथ तालमेल रखने के लिए महत्वपूर्ण है, जैसे स्टीरियोलिथोग्राफी, डिजिटल प्रोजेक्शन लिथोग्राफी, निरंतर तरल इंटरफेस उत्पादन, 3 डी मेल्ट-इलेक्ट्रो जेटराइटिंग, समाधान आधारित 3डी इलेक्ट्रो जेट लेखन, और उभरती बायोप्रिंटिंग तकनीक17,18,19,20,21। संवहनी जीव विज्ञान की गहरी समझ के साथ इन माइक्रोमैन्यूफैक्चरिंग तकनीकों के नियंत्रण को संरेखित करना एक लक्ष्य ऊतक के लिए एक उपयुक्त इंजीनियर वैक्यूलेचर के निर्माण के लिए महत्वपूर्ण है।

यहां, हम आसपास के पाड़ ज्यामिति के लिए नए बनाने और अंकुरण जहाजों की प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक 3 डी प्रणाली पेश करते हैं, उनके अंकुरित मूल और बाद में प्रवास22देख रहे हैं। टेसेलेटेड डिब्बे ज्यामिति, और दो-चरण सीडिंग तकनीक के साथ 3 डी मचानों का उपयोग करके, हम फैशन का विश्लेषण करने के लिए एक स्पष्ट और आसान में अत्यधिक संगठित संवहनी नेटवर्क बनाने में सफल रहे। टेसेलेटेड ज्यामिति एक उच्च थ्रूपुट प्रणाली प्रदान करती है जिसमें जहाजों वाले अलग-अलग इकाइयां होती हैं जो उनके स्थानीय पर्यावरण का जवाब देती हैं। बहुरंगी ECs का उपयोग करते हुए, हमने अंकुरित गठन मूल और बाद में माइग्रेशन पैटर्न को ट्रैक किया, जो डिब्बे ज्यामिति और एससी स्थान22से सहसंबद्ध था।

यद्यपि प्रस्तावित प्रोटोकॉल संवहनी व्यवहार पर ज्यामितीय संकेतों के प्रभावों का विश्लेषण करने के लिए तैयार किया गया है, इस दृष्टिकोण का विस्तार किया जा सकता है और विभिन्न नए अनुप्रयोगों पर लागू किया जा सकता है। टेसेलेटेड पाड़ और आसानी से इमेज करने योग्य नेटवर्क विभिन्न ईसीएस और एससी इंटरैक्शन के सीधे विश्लेषण, विशिष्ट अंग कोशिकाओं के अलावा और संवहनी नेटवर्क के साथ उनकी बातचीत, संवहनी नेटवर्क पर दवा प्रभाव, और अधिक के लिए अनुमति देते हैं। हमारे सुझाए गए सिस्टम के परिणाम बहुत बहुमुखी और सरल निर्माण और प्रसंस्करण के हैं।

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Protocol

1. टेसेलेटेड पाड़ निर्माण

नोट: फोटोलिथोग्राफी एक व्यापक तकनीक है जिसके लिए आम तौर पर नैनोफैब्रिकेशन सुविधा/प्रयोगशाला के भीतर रखे गए विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है । इस प्रोटोकॉल में रखी गई विधि को दर्शकों के लिए जितना संभव हो उतना सामान्यीकृत किया गया था; हालांकि, पाठक के लिए उपलब्ध उपकरणों के आधार पर प्रक्रियाओं में मामूली परिवर्तन आवश्यक हो सकता है। हम उच्चतम प्रक्रिया की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए नैनोफैब्रिकेशन सुविधा पर एक साफ कमरे में इन प्रक्रियाओं को निष्पादित करने की सलाह देते हैं। शुरुआत से पहले, मास्क-एलाइनर (या कुछ यूवी-एक्सपोजर सेट-अप), एक स्पिन कोटर, हॉट प्लेट्स, एक सॉल्वेंट वाशिंग स्टेशन, एक फोटोमास्क और प्लाज्मा क्लीनर तक पहुंच प्राप्त करें। प्रक्रिया में उपयोग किए जाने वाले सॉल्वैंट्स और रसायन खतरनाक होते हैं, इसलिए कृपया किसी भी रासायनिक जोखिम से बचने के लिए सबसे अधिक सावधानी बरतें। फोटोमास्क डिजाइन करते समय, पहचानें कि स्पिन-कोटर और मास्क-एलाइनर के साथ क्या आकार के सिलिकॉन वेफर्स और फोटोमास्क संगत हैं। इसके अतिरिक्त, सिलिकॉन वेफर के किनारों की ओर स्थित फोटोरेसिस्ट आमतौर पर हैंडलिंग से विकृत होता है; इसलिए, वेफर के केंद्र क्षेत्र की ओर डिजाइन करें।

  1. ब्याज की चयनित ज्यामिति के साथ एक फोटोलिथोग्राफी तकनीक का उपयोग करके मचान तैयार करें।
    1. स्पिन कोटिंग से पहले सिलिकॉन वेफर को साफ करें। यह प्लाज्मा सफाई या एक विलायक आधारित तकनीक के साथ किया जा सकता है। प्लाज्मा सफाई, परिचालन विवरण के लिए उपकरण के मानक ऑपरेटिंग प्रक्रिया का पालन करें। संकुचित नाइट्रोजन गैस के साथ स्प्रे और यह सुनिश्चित करने के लिए वेफर का निरीक्षण स्पिन कोटिंग से पहले मलबे से मुक्त है । यह वेफर सब्सट्रेट के रूप में काम करेगा जिस पर मचान बनाए जाते हैं।
      नोट: सबसे अच्छा परिणाम के लिए एक ताजा वेफर के साथ शुरू करते हैं । वेफर्स को फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है लेकिन पुराने फोटोरेसिस्ट, सतह दोषों और मलबे से मुक्त होना चाहिए। हैंडलिंग के लिए वेफर-चिमटी का उपयोग करना मददगार है।
    2. एक गाइड का उपयोग कर स्पिन-कोटर चक पर एक सिलिकॉन वेफर केंद्र । संक्षेप में वेफर स्पिन सुनिश्चित करने के लिए यह ठीक से चक पर केंद्रित किया गया है, के रूप में आवश्यक के रूप में समायोजित जब तक ठीक से केंद्रित । यह हर बार एक वेफर स्पिन कोटर पर रखा जाता है किया जाना चाहिए । वेफर पर लिफ्ट-ऑफ रिएजेंट के 1-4 एमएल बांटना (यह वेफर के आकार पर निर्भर करेगा)। लिफ्ट-ऑफ रिएजेंट का लगभग 2 एमएल 4 इंच वेफर के लिए अच्छी तरह से काम करता है।
      1. 5 सेकंड के लिए 500 आरपीएम पर स्पिन-कोटर स्प्रेड स्पीड और स्पिन-स्पीड को 30 सेकंड के लिए 1000 आरपीएम पर सेट करें, फिर लिफ्ट-ऑफ रिएजेंट को स्पिन करें। वेफर का निरीक्षण करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि इसमें वेफर में एक भी कोटिंग हो। वेफर पर छोड़ा गया कोई भी मलबा इस बिंदु पर बहुत स्पष्ट होगा । मलबे के साथ एक क्षेत्र में किसी भी मचान की संभावना अनुपयोगी हो जाएगा । स्पिन कोटिंग के बाद, एक गर्म प्लेट में स्थानांतरित करें और 200 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए बेक करें।
    3. कुल तीन कोटिंग्स के लिए पिछले चरण को दो बार और दोहराएं।
    4. स्पिन-कोट लगभग 100 माइक्रोन की मोटाई प्राप्त करने तक एसयू-8 2050 फोटोरेसिस्ट के साथ लिफ्ट-ऑफ रिएजेंट लेपित सिलिकॉन वेफर।
      1. हर 25 मिमी सब्सट्रेट व्यास के लिए विरोध के 1 एमएल बांटें।
        नोट: विरोध डालने के दौरान बुलबुले से बचने के लिए सावधान रहें। एसयू-8 2050 के लिए, लगभग 2 इंच व्यास सर्कल डालना, जब 4 इंच सिलिकॉन वेफर का उपयोग करना अच्छी तरह से काम करता है।
      2. स्पिन-कोट एसयू-8 2050। 5 सेकंड के लिए 500 आरपीएम की गति से फैलाएं, इसके बाद लगभग 100 माइक्रोन मोटाई प्राप्त करने के लिए 1700 से 1800 आरपीएम के बीच स्पिन गति हो।
      3. वैकल्पिक:कताई के बाद, स्पिन लेपित वेफर्स को पूर्व-बेक से पहले प्रकाश से संरक्षित स्तर की सतह पर रात भर डी-गैस के लिए छोड़ दें। यह किसी भी बुलबुले के विरोध से छुटकारा पाने में मदद कर सकता है और दोषों को स्तर तक पहुंचाने की अनुमति दे सकता है।
        नोट: विरोध की वास्तविक मोटाई और परिणामी मचान उपयोगकर्ता त्रुटि और उपकरण मापदंडों के साथ भिन्न हो सकते हैं। इसलिए, मचान की मोटाई बाद में सत्यापित किया जाना चाहिए, चरण 1.6 में। वांछित मोटाई प्राप्त करने के लिए तदनुसार स्पिन कोटिंग प्रक्रियाओं को संशोधित करें।
    5. एक्सपोजर से पहले, वेफर्स को 10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर और फिर 40-50 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर प्री-बेक करें। एक्सपोजर से पहले, चिमटी की एक जोड़ी के साथ किनारे पर दबाकर विरोध की सतह का परीक्षण करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि यह अब चिपचिपा/चिपचिपा नहीं है । यह गर्म थाली के वेफर को खींचने के लिए उपयोगी है और इसे टैकनेस का आकलन करने से पहले 0.5-1 मिनट के लिए ठंडा करने की अनुमति देता है।
      नोट: धीमी गति से तापमान रैंप बार (हीटिंग और ठंडा) मचान के warping को रोकने में मदद कर सकते हैं ।
  2. 85 - 110 माइक्रोन की विरोध मोटाई के लिए 215-240 mJ/सेमी2 की एक जोखिम ऊर्जा के साथ एक फोटोमास्क के माध्यम से यूवी प्रकाश (350-400 एनएम) के लिए फोटोरेसिस्ट का पर्दाफाश करें। अनुशंसित एक्सपोजर ऊर्जा-मोटाई सहसंबंधों के लिए फोटोरेसिस्ट निर्माता दिशानिर्देशों को देखें।
    1. सुनिश्चित करें कि एक्सपोजर को ठीक से कैलिब्रेट किया जाए ताकि ऊर्जा सत्यापित हो। वांछित एक्सपोजर ऊर्जा प्राप्त करने के लिए आवश्यक के रूप में जोखिम समय समायोजित करें। इसके अलावा, मास्क एलाइनर विभिन्न एक्सपोजर मोड के लिए अनुमति दे सकते हैं: वैक्यूम संपर्क, कठिन संपर्क, नरम संपर्क, और निकटता संपर्क (विशिष्ट शर्तें भिन्न हो सकती हैं)। आम तौर पर, ये रिज़ॉल्यूशन और फीचर अलाइनमेंट को प्रभावित करेंगे। लेखकों ने आम तौर पर "हार्ड संपर्क" मोड का उपयोग किया।
    2. छोटी सुविधाओं या कई परतों के लिए, जहां संरेखण मायने रखेगा, एक्सपोजर मोड और मास्क एलाइनर प्रक्रियाओं पर अधिक सावधानीपूर्वक विचार करें। मोटाई मूल्य को समायोजित करते समय विरोध की ऊंचाई पर विचार करना सुनिश्चित करें। ऑपरेशन विवरण के लिए अपने मास्क-एलाइनर की मानक ऑपरेटिंग प्रक्रियाओं को देखें।
      नोट: फोटोमास्क का डिजाइन प्रति बैच प्राप्त मचान आकार, डिब्बे ज्यामिति और मचानों की संख्या निर्धारित करेगा। हार्ड ग्लास या क्वार्ट्ज फोटोमास्क का उपयोग उच्चतम संकल्प प्राप्त करेगा; हालांकि, एक नरम बहुलक पारदर्शी फिल्म फोटोमास्क आम तौर पर इन बड़े फीचर आकार (>10 माइक्रोन) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। फिल्म-फोटोमास्क के उपयोग से गरीब फीचर रिज़ॉल्यूशन के परिणामस्वरूप पाड़ छिद्रों के जेड-एक्सिस के साथ स्थलाकृतिक विशेषताएं हो सकती हैं। यह संभवतः सेल व्यवहार पर प्रभाव डाल सकता है। वांछित संकल्प को सत्यापित करें जो भी वांछित संकल्प प्राप्त करने के लिए फोटोमास्क का उत्पादन कर रहा है।
  3. 2-5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर यूवी एक्सपोजर के तुरंत बाद वेफर बेक करें और फिर 8-10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर।
  4. अविकसित विरोध को दूर करने के लिए मचान विकसित करें।
    1. किसी भी अविकसित विरोध को भंग करने के लिए 7-10 मिनट के लिए एसयू-8 डेवलपर समाधान की कम मात्रा का उपयोग करके मचान विसर्जित करें।
    2. आइसोप्रोपिल अल्कोहल (आईपीए) के साथ कुल्ला।
    3. संकुचित नाइट्रोजन के साथ सूखी वेफर।
      नोट: चरण 1.4 के दौरान सावधान रहें ताकि मचानों की समय से पहले रिहाई न हो। इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए डेवलपर और कोमल हैंडलिंग की कम मात्रा आवश्यक है।
  5. विकास के बाद, हार्ड 15 मिनट के लिए 150 डिग्री सेल्सियस पर वेफर्स सेंकना।
    नोट: हार्ड बेक के बाद, गर्म करने के लिए बहुत धीरे शांत करने के लिए अनुमति देने के लिए hotplate मोड़ warping को रोकने में लाभप्रद हो सकता है/
  6. वैकल्पिक:कठिन सेंकना और लिफ्ट-ऑफ से पहले, पाड़ मोटाई का आकलन करें क्योंकि पाड़ को अभी भी वेफर की सतह का धीरे-धीरे पालन किया जाना चाहिए। इस प्रक्रिया के लिए, संपर्क प्रोफाइलोमेट्री अच्छी तरह से काम करता है; हालांकि, किसी भी उपयुक्त विधि को नियोजित किया जा सकता है।
  7. वेफर से मचान उठा।
    1. एसयू-8 डेवलपर में मचान जलमग्न करने के लिए उन्हें तुरंत वेफर से उठाने के लिए कारण। यदि मचान नहीं उठाते हैं, तो धीरे-धीरे वेफर-चिमटी की एक जोड़ी के साथ मचान को धक्का देते हैं।
    2. अतिरिक्त डेवलपर को हटा दें।
    3. मचान को नए कंटेनर में स्थानांतरित करें और आइसोप्रोपिल अल्कोहल में डूबे। सभी डेवलपर को हटा दिया गया है यह सुनिश्चित करने के लिए न्यूनतम 6 बार आईपीए में कुल्ला।
  8. हवा उपयोग से पहले एक सप्ताह के एक ंयूनतम के लिए मचान सूखी ।

2. पाड़ फाइब्रोनेक्टिन कोटिंग

  1. कीटाणुशोधन के लिए, 70% इथेनॉल (v/v) में न्यूनतम 15 मिनट के लिए मचान को जलमग्न करें, और उपयोग से पहले फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) में 2 बार धोएं।
    सावधानी: एसयू-8 मचान कमजोर हैं और आसानी से टूट सकते हैं। कुंद और घुमावदार-टिप संदंश का उपयोग करके हैंडलिंग की सिफारिश की जाती है, और उन्हें सबसे अधिक देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए। मचान और सतह के बीच इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन से बचने के लिए, तरल में मचान को जलमग्न करके आसान हैंडलिंग हासिल की जा सकती है।
  2. पीबीएस में मानव फाइब्रोनेक्टिन के 50 μg/mL का एक कमजोर पड़ने तैयार करें और प्रोटीन सोखने द्वारा मचान को कवर करें।
    1. प्रत्येक पाड़ के प्रति पीबीएस के 28.5 माइक्रोन के साथ फाइब्रोनेक्टिन स्टॉक समाधान (1 मिलीग्राम/एमएल) के 1.5 माइक्रोन मिलाएं। अधिमानतः, सभी मचानों के लिए उपयोग किए जाने वाले केवल एक फाइब्रोनेक्टिन कमजोर पड़ने को तैयार करें ताकि त्रुटियों से बचा जा सके।
      1. 10 मचानों के लिए, पीबीएस के 285 माइक्रोनेक्टिन समाधान में स्टॉक फाइब्रोनेक्टिन समाधान के 15 माइक्रोनिकिन घोल को मिलाएं, जो कुल 300 माइक्रोन 50 माइक्रोन/एमएल फाइब्रोनेक्टिन कमजोर पड़ने की राशि है।
    2. एक हाइड्रोफोबिक सतह (यानी, गैर ऊतक संस्कृति (गैर-ऊतक संस्कृति (गैर-टीसी) 10 सेमी डिश) के शीर्ष पर पाड़ों को रखें और प्रत्येक पाड़ को चरण 2.2.1 में तैयार फाइब्रोनेक्टिन कमजोर पड़ने के 30 माइक्रोन के साथ कवर करें।
      सावधानी: सुनिश्चित करें कि पाड़ के डिब्बों में कोई बुलबुले नहीं फंसे हैं। यदि बुलबुले मौजूद हैं, तो उन्हें धीरे-धीरे बूंदी या हल्के पाइपिंग के भीतर पाड़ मिलाते हुए हटाया जा सकता है।
    3. प्लेट के ढक्कन को बदलें और फाइब्रोनेक्टिन से ढके मचानों को न्यूनतम एक घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 100% आर्द्रता के साथ एक इनक्यूबेटर में रखें।
    4. इनक्यूबेशन के बाद, फाइब्रोनेक्टिन अवशेषों को हटाने के लिए पीबीएस में मचान को हल्के से कुल्ला करें। इस्तेमाल से पहले एक सप्ताह तक पीबीएस में 4 डिग्री सेल्सियस पर मचान रखे जा सकते हैं।

3. एंडोथेलियल कोशिकाओं सीडिंग

  1. निर्माता द्वारा इंगित एंटीबायोटिक समाधान (पेन/स्ट्रेप), भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), और एंडोथेलियल सेल ग्रोथ सप्लीमेंट सहित बेसल माध्यम को अपने संवाददाता मध्यम किट घटकों के साथ मिलाकर ईसी माध्यम तैयार करें ।
  2. 4 x 106 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता के साथ ईसी माध्यम में एक मानव आदिपोस माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल सेल (HAMEC) निलंबन बनाओ ।
    नोट: रियल टाइम इमेजिंग किया जा सकता है यदि उपयोग किए गए एंडोथेलियल कोशिकाओं को पहले फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए संक्रमित किया जाता है, या गैर-जहरीले साइटोप्लाज्मिक झिल्ली डाई का उपयोग करके पूर्व-दाग (आगे लेबल वाले ईसीएस के रूप में संदर्भित)।
  3. संदंश का उपयोग करके, एक फाइब्रोनेक्टिन-लेपित पाड़ को अच्छी तरह से गैरटीसी 24-अच्छी तरह से प्लेट पर रखें।
  4. हमईसी निलंबन की 25 माइक्रोन बूंदों के साथ प्रत्येक पाड़ को कवर करें। निलंबन को पाड़ से दूर न जाने दें, क्योंकि यह सेल आसंजन में बाधा डाल सकता है।
  5. प्लेट पर ढक्कन लगाकर 37 डिग्री सेल्सियस, 5 फीसदी सीओ2 और 100 फीसद आर्द्रता पर इनक्यूबेटर में रखें। कम से कम 60 मिनट और अधिकतम 90 मिनट तक इनक्यूबेट करें।
    नोट: इनक्यूबेशन के दौरान, इनक्यूबेटर के भीतर एक कक्षीय शेखर पर थाली रखने पाड़ की दीवारों पर सेल लगाव में सुधार । कक्षीय शेखर को 5 आरपीएम से अधिक नहीं स्थापित किया जाना चाहिए ।
  6. इनक्यूबेशन के बाद, प्रत्येक को एक पिपेट का उपयोग करके ईसी माध्यम के 700 माइक्रोन के साथ अच्छी तरह से भरें।
    नोट: अच्छी तरह से नीचे ECs देखने की उम्मीद है, क्योंकि कोशिकाओं में से कुछ पाड़ से देते हैं और पाड़ के शून्य के माध्यम से गिर जाते हैं।
  7. एंडोथेलियलाइज्ड मचान को तब तक इनक्यूबेट करें जब तक ईसी संगम को पाड़ की दीवारों (लेबल ईसी का उपयोग करते समय) या 3 दिनों के लिए (गैर-लेबल ईसी का उपयोग करते समय), जो ईसी संगम प्राप्त करने के लिए पर्याप्त समय प्रदान करता है, पर फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके देखा जा सकता है। हर दूसरे दिन माध्यम बदलें।

4. समर्थन सेल सीडिंग और सह-संस्कृति

  1. कम ग्लूकोज डल्बेको के संशोधित ईगल माध्यम (कम ग्लूकोज डीएमईएम), एफबीएस के 57.5 एमएल के 500 मिलीलीटर मिलाकर डेंटल पल्प स्टेम सेल (डीपीएससी) माध्यम (डीपीएसएम) तैयार करें, गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (एनईएए), ग्लूटामैक्स के 5.75 मिलियन और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन-निस्टाटिन समाधान के 5.75 एमएल।
  2. एंडोथेलियलाइज्ड मचानों को एक नई गैरटीसी 24-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें ताकि संदंश का उपयोग करके कुओं के नीचे से जुड़े ईसीएस को त्याग दिया जा सके।
    1. 1 एमएल पिपेट, या वैक्यूम सक्शन का उपयोग करके वर्तमान प्लेट से सभी मीडिया को त्यागें। सावधान रहें कि सीधे पाड़ पर वैक्यूम लागू न करें।
    2. सतह तनाव प्रभावों के कारण दीवारों की ओर तरल चलने से बचने के लिए अच्छी तरह से अच्छी तरह से केंद्र में एक पाड़ रखें। हल्के वैक्यूम के साथ पाड़ आसपास के क्षेत्र सूखी लेकिन पाड़ के पूर्ण सुखाने से बचें।
  3. फाइब्रिन प्री-जेल समाधान में डीपीएससी निलंबन तैयार करें।
    1. पीबीएस के साथ क्रमशः 5 यू/एमएल और 15 मिलीग्राम/एमएल की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने तक पतला थ्रोम्बिन और फाइब्रिनोजेन स्टॉक समाधान ।
    2. 5 यू/एमएल थ्रोम्बिन कमजोर पड़ने में 8 x10 6 डीपीएससी/एमएल निलंबन तैयार करें और व्यक्तिगत एपेंडोर्फ में वितरित करें 12.5 माइक्रोन प्रति पाड़ वरीयता प्राप्त करने के लिए।
    3. 12.5 माइक्रोन के लिए एक 5-50 μL पिपेट (या इसी तरह) सेट करें और इसे 15 मिलीग्राम/एमएल फाइब्रिनोजेन समाधान के साथ भरें।
    4. टिप को हटाए बिना, पिपेट को 25 माइक्रोन सेट करें। टिप में सामग्री बढ़नी चाहिए और टिप खोलने की ओर एक खाली मात्रा छोड़दें।
    5. धीरे-धीरे प्लंजर बटन दबाएं जब तक कि तरल टिप खोलने तक न पहुंच जाता लेकिन लीक न हो। इस स्थिति में प्लंजर पकड़ो और थ्रोम्बिन निलंबन में कोशिकाओं युक्त माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में से एक में टिप डाल दिया, सुनिश्चित करें कि टिप तरल के संपर्क में है ।
      सावधानी: थ्रोम्बिन और फाइब्रिनोजेन के संपर्क में आने के तुरंत बाद फाइब्रिन क्रॉसलिंकिंग शुरू हो जाएगी। निम्नलिखित चरण जल्दी से किया जाना चाहिए।
    6. धीरे-धीरे प्लंजर बटन जारी करें और सेल निलंबन को टिप में आकर्षित करें। बुलबुला गठन से परहेज करते हुए दोनों सामग्रियों को अच्छी तरह से मिलाएं।
  4. एंडोथेलियलाइज्ड पाड़ के शीर्ष पर मिश्रित सामग्रियों को जल्दी से वितरित करें। प्रत्येक पाड़ के लिए पिछले चरणों को दोहराएं, टिप के भीतर अप्रत्याशित फाइब्रिन जेल गठन से बचने के लिए उपयोगों के बीच हमेशा सुझाव ों को बदलना सुनिश्चित करें।
  5. प्लेट के ढक्कन को बदलें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 और 100% आर्द्रता पर 30 मिनट के लिए मचान को इनक्यूबेट करें।
  6. इनक्यूबेशन के बाद, प्रत्येक अच्छी तरह से 1:1 डीपीएससी और ईसी माध्यम के 1 एमसीएल के साथ भरें।
    1. 1 सप्ताह के लिए संस्कृति, हर दूसरे दिन माध्यम बदल रहा है ।
    2. संस्कृति के दौरान, माध्यम को अच्छी तरह से हटा दें और विभिन्न समय बिंदुओं पर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके निर्माणों को संवहनी विकास या ब्याज के किसी अन्य पैरामीटर का अध्ययन करने के लिए बनाता है।
      नोट: यह चरण तभी किया जा सकता है जब प्रयोग लेबल वाले ईसीएस का उपयोग करके किया जाए. चरण 6 देखें - आगे स्पष्टीकरण के लिए नोट करें।

5. विशेषता संवहनी मार्कर के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला

नोट: निम्नलिखित चरणों को उसी कुओं में किया जा सकता है जहां निर्माण सुसंस्कृत थे। यह हमेशा यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि समाधान पूरी तरह से मचान को कवर करते हैं। इसके अलावा, जब संभव हो, एक कक्षीय शेखर पर कदम प्रदर्शन की सिफारिश की है, हालांकि अनिवार्य नहीं है ।

  1. 7 दिन में, कुओं से मीडिया को त्यागें और कुओं में पीबीएस जोड़कर मचानों को कुल्ला करें, और इसे वैक्यूम का उपयोग करके हटा दें।
  2. 20 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड जोड़कर मचान को ठीक करें। पीबीएस में 3 बार, 5 मिनट प्रति वॉश धोएं।
  3. पीबीएस (v/v) में 0.3% ट्राइटन-एक्स का उपयोग करके 15 मिनट के लिए निश्चित कोशिकाओं को पार करें। पीबीएस में 3 बार, 5 मिनट प्रति वॉश धोएं।
  4. पीबीएस (w/v) अवरुद्ध समाधान में 5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) तैयार करें और मचानों को कवर करें। 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें।
    नोट: सभी आवश्यक समाधान राशि दाग होने के लिए मचान की संख्या पर निर्भर करेगा। बताए गए सांद्रता को ध्यान में रखते हुए आवश्यक समाधान तैयार करें।
  5. प्राथमिक एंटीबॉडी धुंधला समाधान तैयार करें और लागू करें।
    1. पतला खरगोश विरोधी वॉन Willebrand कारक (vWF) एंटीबॉडी 1:150 और माउस विरोधी SMA एंटीबॉडी 1:50 ताजा अवरुद्ध समाधान में ।
      नोट: अन्य एंडोथेलियल कोशिकाओं मार्कर, जैसे सीडी 31 या वीई-कैथेरिन का उपयोग किया जा सकता है।
    2. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ मचान को कवर करें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें। पीबीएस में तीन बार, 5 मिनट प्रति वॉश धोएं।
  6. द्वितीयक एंटीबॉडी धुंधला समाधान तैयार करें और लागू करें।
    1. पतला बकरी विरोधी माउस Cy3 एंटीबॉडी 1:150 और बकरी विरोधी खरगोश एलेक्सा-फ्लोर ४८८ 1:400 PBS में ।
    2. माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ मचान को कवर करें और कमरे के तापमान पर न्यूनतम 3 घंटे के लिए या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। पीबीएस में 3 बार धोएं, 5 मिनट प्रति वॉश। एक महीने तक पीबीएस (v/v) में 0.3% पीएफए में दाग पाड़ रखें।

6. पाड़ कॉन्फोकल इमेजिंग और पोत विकास विश्लेषण

नोट: निम्नलिखित चरणों को चुने गए अंतिम समय बिंदु पर निश्चित और दाग वाले मचानों पर किया जा सकता है या, यदि प्रयोग को समाप्त करने की आवश्यकता के बिना सेल संस्कृति अवधि के दौरान फ्लोरोसेंट कोशिकाओं का उपयोग किया जाता था। उत्तरार्द्ध के लिए, विशिष्ट समय अंक निर्धारित करने की सिफारिश की जाती है; यह काम 0 दिन (अनुसूचित जाति सीडिंग से पहले) से पता चलता है, और दिन 1, 3, 5 और 7 अनुसूचित जाति सीडिंग(चित्रा 3A)के बाद ।

  1. एक 5X लेंस और 0.5 के ज़ूम और पाड़ की पूरी जेड रेंज के साथ एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करscaffolds छवि। यह चुकता और परिपत्र ज्यामिति के लिए 9 अलग डिब्बों, या षट्कोणीय ज्यामिति के लिए 8 पूर्ण डिब्बों पर कब्जा करने की अनुमति देगा । छवि फ्लोरोसेंट सिग्नल और संचारित प्रकाश, दोनों पोत नेटवर्क संरचना और डिब्बे ज्यामिति(चित्रा 3A)पाने के लिए ।
  2. इमेजजे (या किसी अन्य इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर) का उपयोग करना, प्रत्येक व्यक्तिगत डिब्बे को क्रॉप करें; इस प्रक्रिया के लिए, केवल संवहनी नेटवर्क मार्कर प्रासंगिक हैं। डिब्बे क्षेत्र के अंदर स्थित किसी भी पोत को हटा दें। अधिकतम तीव्रता का प्रक्षेपण बनाएं और प्रत्येक व्यक्ति फसली डिब्बे को झगड़ा छवि के रूप में सहेजें।
    1. इमेजजे में, प्रेस फाइल > ओपन करें और कई डिब्बों वाले वांछित टिफ छवि का चयन करें। छवि में कम से कम दो चैनल, फ्लोरोसेंट पोत नेटवर्क और संचारित प्रकाश छवि होनी चाहिए।
    2. टूलबार से, बहुभुज चयन उपकरण का चयन करें। ट्रांसमिटेड लाइट चैनल का चयन करें। लक्ष् तागोनल डिब्बे के कोनों में से एक पर क्लिक करें, डिब्बे क्षेत्र और पाड़ दीवार के बीच इंटरफेस पर, यह मुखौटा परिभाषा शुरू कर देगा। जब तक प्रारंभिक कोने का चयन नहीं किया जाता है, मुखौटा बंद करने तक एक अनुक्रमिक क्रम में अगले कोनों पर क्लिक करना जारी रखें।
      नोट: यह स्पष्टीकरण एक षट्कोणीय डिब्बे पर लागू होता है । जब डिब्बे को या तो चुकता या गोलाकार किया जाता है, तो एक उपयुक्त मुखौटा बनाने के लिए क्रमशः आयत या अंडाकार उपकरणों का उपयोग करें। आकार के बावजूद, हमेशा पाड़ की भीतरी दीवार का पालन करने के लिए मुखौटा फिट करें।
    3. आरओआई मैनेजर > विश्लेषण > टूल्सपर क्लिक करें । आरओआई मैनेजर (आरओआई, रुचि के क्षेत्र) में, बनाए गए मास्क को बचाने के लिए ऐड बटन पर क्लिक करें। नया मुखौटा लेफ्ट साइड की लिस्ट में दिखाई देगा । यह कदम विश्लेषण को विभिन्न छवियों के बीच सुसंगत होने की अनुमति देता है।
      नोट: आरओआई प्रबंधक में, अधिक > सेव पर क्लिक करके सभी बनाए गए मास्क के साथ एक फ़ाइल को सहेजनासंभव है। सेव सेलेक्शन विंडो में, एक नाम और स्थान चुनें, और .roi फ़ाइल को सहेजें। मास्क को पुनः प्राप्त करने के लिए, आरओआई प्रबंधक में, अधिक > ओपन पर क्लिक करें और वांछित .roi फ़ाइल चुनें।
    4. फ्लोरोसेंट पोत नेटवर्क छवि का चयन करें और बाहर स्पष्ट > संपादितकरें । केवल मुखौटा में निहित छवि रहेगी, जबकि बाकी को समाप्त कर दिया जाएगा।
    5. क्लीयर नेटवर्क इमेज ओपन होने के साथ इमेज > डुप्लीकेटपर क्लिक करें । डुप्लीकेट पॉप-अप विंडो में, छवि का नाम लिखें। यदि डुप्लिकेट हाइपरस्टैक का चयन किया जाता है, तो इसे अनसेलेक्ट करें और ओकेपर क्लिक करें। केवल फसली फ्लोरोसेंट पोत नेटवर्क वाली एक नई छवि बनाई जाएगी ।
    6. फ़ाइल > सेव > झगड़ा पर क्लिक करके फसली छवि को सहेजें। नाम और निर्देशिका चुनें और ठीक क्लिककरें ।
  3. फसली छवियों पर संवहनी विकास का विश्लेषण करें।
    1. विश्लेषणात्मक मुक्त सॉफ्टवेयर एंजियोटूल डाउनलोड करें और इंस्टॉल करें, जो विभिन्न प्रकार के संवहनी मापदंडों की मात्रा निर्धारित करने के लिए मात्रात्मक उपकरण प्रदान करता है। सॉफ्टवेयर निम्नलिखित पते https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home से प्राप्त किया जा सकता है।
    2. मिलीमीटर इकाइयों में परिणाम प्राप्त करने और एक छवि लोड करने के लिए छवियों के पैमाने मूल्य निर्धारित करें।
      1. सेटिंग टैब पर क्लिक करें और लिया छवियों से प्रतिनिधि मूल्यों के साथ पिक्सल और मिमी में दूरी भरें । ऊपर उल्लिखित इमेजिंग मापदंडों का उपयोग करके, भरने के लिए मान 400 पिक्सल प्रति 1 मिमी हैं।
      2. ओपन इमेज बटन दबाएं और ब्याज की छवि के लिए ब्राउज़ करें।
    3. विश्लेषण टैब में पोत विकास की मात्रा निर्धारित करने के लिए विश्लेषण मापदंडों का चयन करें।
      1. पोत व्यास और तीव्रता क्षेत्र के तहत, शीर्ष रेंज चयनकर्ता से किसी भी वर्तमान मार्कर का चयन करें, और संख्या 3 का प्रतिनिधित्व करने वाले मार्कर को सक्रिय करें।
      2. पोत व्यास और तीव्रता क्षेत्र के तहत, नीचे रेंज चयनकर्ता पर, कम रेंज मार्कर को 60 तक ले जाएं, और उच्च रेंजर निर्माता को 255 पर छोड़ दें।
      3. छोटे कणों बॉक्स को हटा दें और मार्कर को 100 तक सेट करें।
      4. फील्ड सेविंग वरीयताओंके तहत, स्प्रेड शीट फ़ाइल का नाम और स्थान चुनें जिसमें परिणाम सेव होंगे और रन विश्लेषण बटन दबाएंगे। यदि सेव रिजल्ट इमेज बॉक्स का चयन किया जाता है, तो एंजियोटूल एक नई जेपीईजी छवि उत्पन्न करेगा और बचाएगा जो पोत नेटवर्क मात्रात्मक मापदंडों को दिखाता है।
        नोट: स्प्रेड शीट फ़ाइल नाम को बदले बिना प्रत्येक प्रदर्शन विश्लेषण के लिए, नए अधिग्रहीत परिणामों के साथ फ़ाइल के नीचे एक नई पंक्ति जोड़ी जाएगी।
  4. डेटा को व्यवस्थित करें और एक सांख्यिकीय विश्लेषण चलाएं।
    1. सभी प्रसंस्कृत छवियों के लिए, स्प्रेड शीट (जैसे कुल पोत लंबाई और पोत क्षेत्र)से ब्याज का पैरामीटर चुनें और प्राप्त परिणामों(चित्र 3सी)का ठीक से अध्ययन करने के लिए उन्हें सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर में इनपुट करें।

7. उद्गम का पता लगाने और माइग्रेशन ट्रैकिंग अंकुरण के लिए समय चूक इमेजिंग

  1. वैकल्पिक रूप से, कदम 4.6 में वर्णित इनक्यूबेटर में मचान को तैयार करने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 और 100% आर्द्रता के लिए एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप कल्चर चैंबर सेट करें।
    1. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप कक्ष में पूरी तरह से वरीयता प्राप्त मचान वाली प्लेट रखें और इमेजिंग पैरामीटर को वांछित मूल्यों पर सेट करें।
    2. 30 मिनट के लिए अंतराल लेने छवि सेट, और ७२ घंटे के कुल इमेजिंग समय । इससे मध्यम परिवर्तन की जरूरत के बिना समय चूक पूरी तरह से चल सकेगी।
      सावधानी: यदि एक लंबे समय तक चूक इमेजिंग वांछित है, तो मूल इमेजिंग स्थान को पुनः प्राप्त करने में सक्षम होने के लिए एक सावधान स्थिति अंशांकन किया जाना चाहिए, क्योंकि मध्यम परिवर्तनों को कॉन्फोकल इनक्यूबेटर से प्लेट को हटाने और बाँझ जैविक हुड में हटाने की आवश्यकता होती है।
      नोट: पाड़ की दीवारों और ट्यूबलर संरचनाओं के गठन से ईसीएस टुकड़ी अनुसूचित जाति सीडिंग (चरण 4) के बाद पहले घंटे के भीतर शुरू हो जाएगी और इसे पूरा होने में 50 घंटे तक का समय लग सकता है। शुरुआती ट्यूब बनने के बाद नए अंकुरित आसपास के जहाजों से डिब्बे में पलायन शुरू हो जाएंगे। अंकुरण और बाद में नेटवर्क रीमॉडलिंग लगभग 10 दिन तक प्रयोग भर में जारी रहेगा, जब पोत नेटवर्क स्थिरहो 22। इस जानकारी का उपयोग समय चूक प्रारंभिक बिंदु और समय के अनुसार कदम चुनने के लिए करें।
  2. एक झगड़ा अनुक्रम के रूप में पूरा समय चूक फिल्म फ़ाइल बचाओ।
  3. इमेजजे खोलें और फाइल > आयात > इमेज सीक्वेंस पर क्लिक करें और अपनी फ़ाइलों का चयन करें। यह एक फिल्म के रूप में अपने झगड़ा अनुक्रम खुल जाएगा।
  4. प्लगइन्स > मैनुअल ट्रैकिंग पर क्लिक करके मैनुअल ट्रैकिंग प्लगइन खोलें। इससे ट्रैकिंग विंडो खुल जाएगी।
  5. फिल्म का निरीक्षण करें और ट्रैक किए जाने वाले पोत का चयन करें। इसके मूल और प्रवास पर ध्यान दें।
  6. शो पैरामीटर बॉक्स को सक्रिय करें और समय अंतरालके लिए 30 मिनट इनपुट करें। एक्स/वाई अंशांकन इमेजिंग के दौरान चयनित पिक्सेल राशि पर निर्भर करेगा ।
  7. पाड़ समोच्च से अंकुरित जहाजों को मैन्युअल रूप से ट्रैक करने के लिए आगे बढ़ें।
    1. ऐड ट्रैक बटन दबाएं। फिल्म के पहले फ्रेम पर, पोत के स्थान को ट्रैक करने के लिए दबाएं । इसके बाद फिल्म अपने आप अगले फ्रेम में बदल जाएगी ।
    2. दूसरे फ्रेम की छवि पर क्लिक करें जहां पोत स्थित है। फिर, फिल्म अगले फ्रेम में स्वचालित रूप से बदल जाएगा ।
    3. पूर्ण माइग्रेशन ट्रैकिंग पूरी होने तक उसी पोत के साथ आगे बढ़ें।
    4. ट्रैकिंग विंडो पर, फिल्म पर पोत प्रवास के एक दृश्य पथ को छापने के लिए ओवरले डॉट्स और लाइनों पर क्लिक करें । यह ट्रैकर की वर्तमान स्थिति का प्रतिनिधित्व करने वाले डॉट के साथ फिल्म की एक प्रति खोलेगा, और पिछले पथ को दिखाने वाली एक लाइन होगी।
    5. वर्तमान पोत आंदोलन रिकॉर्डिंग को अंतिम रूप देने के लिए एंड ट्रैक बटन पर क्लिक करें।
    6. एक नए पोत के साथ शुरू करने के लिए फिर से ऐड ट्रैक बटन पर क्लिक करें। ऐसा करते समय लाइन और डॉट मार्कर अपने आप नए वेस्टेज के लिए अपना रंग बदल देंगे। जब तक सभी वांछित जहाजों को ट्रैक नहीं किया जाता है तब तक दोहराएं।
      नोट: एक्स/वाई स्थान, पोत वेग और स्थानांतरित दूरी पॉप-अप विंडो परिणामों से प्राप्त किया जा सकता है। प्रत्येक पोत की पहचान बाएं कॉलम में इसके ट्रैक नंबर से की जाएगी । आगे विश्लेषण करने के लिए इस डेटा को कॉपी किया जा सकता है और एक स्प्रेड शीट में चिपकाया जा सकता है।

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Representative Results

प्रस्तुत प्रोटोकॉल, स्टीरियोलिथोग्राफी तकनीकों का उपयोग करके, एसयू-8 फोटोरेसिस्ट से बने टेसेलेटेड मचानों के निर्माण की अनुमति देता है। अलग-अलग डिब्बे ज्यामिति (वर्ग, हेक्सागोन और सर्कल) के साथ मचान, और अत्यधिक सटीक और दोहराने योग्य विशेषताएं प्राप्त की गईं(चित्र 1)।

Figure 1
चित्रा 1:टेसेलेटेड स्क्वायर, परिपत्र और हेक्सागोनल पाड़ ज्यामिति (स्केल बार = 500 माइक्रोन) की इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों को स्कैन करने वाले प्रतिनिधि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

एक स्टेपवाइज सेल सीडिंग (चरण 2 से 4) के साथ, अत्यधिक संगठित संवहनी नेटवर्क बनाने के लिए गढ़े गए मचानों का उपयोग किया गया था। जब दोनों ECs और अनुसूचित जाति के एक साथ एक साथ बोने का उपयोग कर, जिसके परिणामस्वरूप जहाजों एक स्पष्ट संगठन का अभाव था । इसके लिए, पाड़ फाइब्रोनेक्टिन कोटिंग (चरण 2) किया गया था, पाड़ एंडोथेलियलाइजेशन चरण को छोड़ दिया गया था (चरण 3), और डीपीएससी और हामेक को एक साथ फाइब्रिन जेल (चरण 4) में सह-वरीयता दी गई थी। इस फैशन में, कोशिकाओं को पाड़(चित्रा 2,शीर्ष पंक्ति) पर सजातीय रूप से वितरित किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप अप्रत्याशित और अव्यवस्थित विकसित संवहनी नेटवर्क होते हैं जो आसपास के पाड़ के साथ बातचीत नहीं करते हैं। इसके विपरीत, सबसे पहले पाड़ की दीवारों पर ईसीएस सीडिंग एक सटीक प्रारंभिक एंडोथेलियल सेल पैटर्निंग प्रदान करता है। एक फाइब्रिन जेल के भीतर एससी के बाद के अलावा एक उम्मीद के मुताबिक ट्यूबुलोजेनेसिस घटना में परिणाम होता है, जिसमें पाड़ की दीवार के आकार के बाद जहाजों को बारीकी से बनाने के साथ, और डिब्बे की जगह(चित्रा 2, नीचेपंक्ति) में पलायन करने वाले नए जहाजों को अंकुरित किया जाता है।

Figure 2
चित्र 2:एक साथ बनाम स्टेपवाइज सेल सीडिंग के बीच संवहनी तुलना। 1 और 5 दिनों में एक साथ (लाल) और अनुसूचित जाति (हरा) और स्टेप-वार सेल सीडिंग (निचली पंक्ति) के एक साथ (शीर्ष पंक्ति) सेल सीडिंग के लिए टेसेलेटेड मचान में संवहनी विकास की प्रतिनिधि छवियां। स्टेपवाइज सीडिंग के परिणामस्वरूप संगठित संवहनी नेटवर्क होते हैं जो पाड़ की दीवारों का पालन करते हैं और डिब्बे की जगह (स्केल बार: 100 माइक्रोन) में अंकुरित होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

फ्लोरोसेंट ईसीएस का उपयोग करते समय, या तो संक्रमित या रंगे, जहाजों को हर समय बिंदु के लिए प्रयोग को ठीक करने और समाप्त करने की आवश्यकता के बिना वास्तविक समय में इमेज किया जा सकता है। लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने वाले ईसीएस (आरएफपी-ईसीएस) को षट्कोणीय मचानों पर सुसंस्कृत किया गया था और सीडिंग के बाद चित्रित किया गया था(चित्र 3 ए,दिन 0)। 1 दिन में, अनुसूचित जाति को जोड़ा गया था और संवहनी नेटवर्क हर दूसरे दिन पोत विकास(चित्र 3 ए, दिन 1, 3,5 और 7) की मात्रा निर्धारित करने के लिए चित्रित किए गए थे । हर समय बिंदु के लिए, पूरे पाड़ की विस्तृत छवियां ली गई थीं(चित्रा 3B)। हर डिब्बे के लिए, जहाजों मुख्य रूप से संगठित और उनके कारावास के भीतर स्थित कोशिकाओं के साथ बातचीत की । इसलिए, प्रत्येक डिब्बे को अलग-थलग कर दिया गया था और डिब्बे के बाहर अनावश्यक जहाजों को इमेजजे का उपयोग करके हटा दिया गया था। इसके बाद एंजियोटूल का उपयोग करके स्वच्छ, एकल-डिब्बे छवियों का विश्लेषण किया गया । एंजियोटूल ने कई पोत मापदंडों वाली एक स्प्रेड शीट फ़ाइल वापस कर दी, और मुख्य नेटवर्क विशेषताओं का एक दृश्य प्रतिनिधित्व, जैसे कंकाल, चौराहे अंक और पोत सतह। सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर चश्मे का उपयोग करके प्राप्त आंकड़ों का विश्लेषण किया गया था, और प्रयोग समय सीमा(चित्रा 3C)के दौरान कुल पोत लंबाई और क्षेत्र के लिए एक स्पष्ट पोत वृद्धि देखी गई थी। 1 सप्ताह के प्रयोग के दौरान, जहाजों को आगे विकसित करने और विस्तारित करने की उम्मीद है जैसा कि चित्रा 3A और चित्रा 2Cमें दिखाया गया है । जहाज की लंबाई या क्षेत्रफल कम करना, 3 दिन तक जहाजों को बनाने में विफलता या चित्रा 2 की शीर्ष पंक्ति में दिखाए गए जहाजों को एक असफल प्रयोगों के रूप में समझा जा सकता है।

Figure 3
चित्र 3:प्रतिनिधि विकास छवियां और संगठित संवहनी नेटवर्क का विश्लेषण। (ए)ईसीएस (लाल) पाड़ की दीवार पर संगम तक पहुंचते हैं जिस पर एससी बाद में वरीयता प्राप्त होते हैं; अनुसूचित जाति के अलावा प्रयोग के दिन 0 का प्रतिनिधित्व करता है। अनुसूचित जाति सीडिंग के बाद 1 दिन में, ईसीएस डिब्बे अंतरिक्ष के लिए अलग और जहाजों कि अंकुरण और आगे के दिनों में जोड़ने जारी रहेगा बनाने शुरू करते हैं । (ख)वैस्कुलर नेटवर्क विश्लेषण के लिए कॉन्फोकल इमेज प्रोसेसिंग स्टेप्स (i) कई डिब्बों वाली एक विस्तृत कॉन्फोकल इमेज ली जाती है, (ii) एक ही डिब्बे को क्रॉप किया जाता है (सफेद धराशायी हेक्सागोन द्वारा चिह्नित), (iii) फिर संवहनी नेटवर्क चैनल को अलग कर दिया जाता है, और डिब्बे की दीवारों के बाहर सभी जहाजों को बाहर निकाल दिया जाता है । एकल डिब्बे की छवि का विश्लेषण एंजियोटूल का उपयोग करके किया जाता है, जो दृश्य मार्कर के साथ पूरित संवहनी मापदंडों की एक सूची लौटाता है, जैसे पोत क्षेत्र (पीले रंग में उल्लिखित), जहाजों की लंबाई (हरी रेखाओं के साथ प्रदर्शित), और चौराहे बिंदु (नीले बिंदुओं के रूप में चिह्नित)। (ग)कुल पोत लंबाई के तुलनात्मक परिणाम और विभिन्न समय बिंदुओं पर षट्कोणीय डिब्बों के भीतर कुल पोत क्षेत्र (परिणाम एसडी, एन > 6; सभी पैमाने पर सलाखों: २०० μm) के ± मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

एकल सेल पहचान की सुविधा के लिए बहुरंगी आईसी का उपयोग करना, एकल पोत ट्रैकिंग(अनुपूरक वीडियो 1)की अनुमति देने के लिए एक कॉन्फोकल इमेजिंग समय चूक किया गया था। मैनुअल ट्रैकिंग इमेजजे प्लगइन का उपयोग करके जहाजों को देखा गया और ट्रैक किया गया। टिप सेल फिल्म के प्रत्येक फ्रेम के लिए चुना गया था(चित्रा 4A)जब तक पोत आसपास के vasculature के साथ anastomosed । नतीजतन, मैनुअल ट्रैकिंग प्लगइन ने वास्तविक समय में पोत पथ उत्पन्न किया, जिसने पोत प्रवास(चित्रा 4B)का निरीक्षण करने की अनुमति दी।

Figure 4
चित्र 4:प्रतिनिधि अंकुरित पोत ट्रैकिंग। (A)एकल पोत पहचान की सुविधा के लिए एक बहुरंगी ईसीएस (हरा, लाल और नीला) समय चूक का उपयोग किया जाता है । इमेजजे प्लगइन मैनुअल ट्रैकिंगका उपयोग करके अंकुरित पोत की पहचान की जाती है और उसे ट्रैक किया जाता है। पोत के अंत पक्ष को वास्तविक समय में ट्रैक करने के लिए हर समय बिंदु के लिए चिह्नित किया जाता है; चयनित पोत अंत बिंदु दिखाने के लिए काले-इन-व्हाइट मार्कर को जोड़ा गया था। (ख) इस पोत की परिणामस्वरूप 2डी ट्रैकिंग, जैसा कि इमेजजे प्लगइन द्वारा संसाधित किया गया है, जो डॉट के साथ सबसे दूर बिंदु दिखाता है, और एक लाइन के साथ गठित पथ (स्केल बार = 200 माइक्रोन) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्रस्तावित मंच में एसएमए + एससी की उपस्थिति द्वारा प्रतिनिधित्व किए गए पोत परिपक्वता को आसानी से देखा जा सकता है। एसएमए + एससी की उच्च संख्या पेश करने वाले वासकुलेचर अधिक परिपक्व नेटवर्क का प्रतिनिधित्व करते हैं, क्योंकि एसएमए अभिव्यक्ति समय23के साथ पोत स्थिरीकरण से संबंधित है। परिपत्र, षट्कोणीय और चुकता डिब्बों के लिए, समय के साथ SMA + अनुसूचित जाति की मात्रा बढ़ जातीहै (चित्रा 5A)। 3 दिन तक, सभी आकृतियों में बिखरे हुए SMA + अनुसूचित जाति और अनकंपलेक्स जहाजों को कुछ या कोई अंकुरित नहीं दिखाया गया । 7 दिन तक, सभी आकृतियों ने एक समृद्ध और जटिल संवहनी नेटवर्क दिखाया, जिसमें जहाजों के आसपास एसएमए + एससी की उच्च उपस्थिति थी। इसके अलावा, उच्च आवर्धन छवियों से पता चलता है एक डेंजर SMA + अनुसूचित जाति उपस्थिति का गठन जहाजों के साथ सह-स्थानीयकृत, अनुसूचित जाति भर्ती और संवहनीसंरचनाओं (चित्रा 5B)के आसपास भेदभाव evidencing ।

Figure 5
चित्र 5:समय के साथ SMA + अनुसूचित जाति और रक्त वाहिकाओं में वृद्धि। ए) चिकनी मांसपेशी ऐक्टिन (लाल) और वीडब्ल्यूएफ (जहाजों, हरे) परिपत्र, चुकता और 3 दिन और 7 दिन में षट्कोणीय डिब्बों में संवहनी नेटवर्क के लिए दिखाया गया है । वासकुलेचर विस्तार और एसएमए-व्यक्त समर्थन कोशिकाएं (एसएमए + एससी) दोनों समय के साथ बढ़ती हैं, जो एक उच्च पोत परिपक्वता और जटिलता (स्केल बार = 200 माइक्रोन) को दर्शाती हैं। B)7 दिन में जहाजों के आसपास एसएमए + एससी डेंजर संचय की प्रतिनिधि छवियां । समग्र छवि में नाभिक (नीला) एससी की उपस्थिति को एसएमए प्रोटीन (स्केल बार = 50 माइक्रोन) व्यक्त नहीं करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक वीडियो 1: पोत माइग्रेशन ट्रैकिंग के लिए बहुरंगी ईसीएस समय चूक। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।  

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Discussion

इंजीनियर ऊतकों में एम्बेडेड के भीतर एक समृद्ध वैक्यूलेचर की आवश्यकता जीवित रहने और उचित कार्य के निर्माण के लिए महत्वपूर्ण है1. हालांकि संवहनी प्रणाली इंजीनियरिंग अनुसंधान की एक विशाल राशि का ध्यान केंद्रित किया गया है, बहुत जांच और24समझने के लिए छोड़ दिया है । विशेष रूप से, जब एक विशिष्ट ऊतक पुनः बनाने, माइक्रोवसकुलेचर व्यवहार और तदनुसार12का आयोजन करना चाहिए । माइक्रोवेसेल्स उत्पादन के लिए सबसे आम दृष्टिकोण सेल लगाव, प्रसार और पोत निर्माण25के लिए संगत उपयुक्त 3 डी वातावरण के भीतर एंडोथेलियल और समर्थन कोशिकाओं को सह-सीडिंग करना है। इस पद्धति के परिणामस्वरूप अक्सर बहुत असंगठित नेटवर्क होते हैं, जिससे माइक्रोवैस्कुलर व्यवहार22का अध्ययन करना मुश्किल हो जाता है। यहां, प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक नया उपकरण प्रदान करता है जो उच्च-थ्रूपुट प्रणाली में अत्यधिक संगठित संवहनी नेटवर्क उत्पन्न करता है, जिसमें जहाजों को आसानी से ट्रैक किया जा सकता है और समय के माध्यम से निगरानी की जा सकती है, ताकि उनके विकास और व्यवहार का अध्ययन किया जासके। अनुसूचित जाति (चरण 4) के बाद, ईसीएस (चरण 2-3) की स्टेवाइज सीडिंग, ऐसे संगठित नेटवर्क22को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं। इसके अतिरिक्त, यह तकनीक संवहनी मॉडल के लिए एक वास्तविक 3 डी वातावरण प्रस्तुत करती है, जिसमें जहाज तीन आयामों में स्थानांतरित हो सकते हैं और प्रासंगिक संरचनाएं बना सकते हैं। इसके विपरीत, वैस्कुलर मॉडलिंग के लिए अधिक लोकप्रिय तरीके, जैसे माइक्रोफ्लुइडिक्स सिस्टम, केवल 2.5D ऊतक प्रतिनिधित्व26प्रदान करते हैं।

प्रस्तावित विधि को आसानी से संशोधित किया जा सकता है और पोत नेटवर्क के विकास और व्यवहार को प्रभावित करने वाले कई अलग-अलग कारकों का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है। फोटोलिथोग्राफिक एसयू-8 राल पाड़ निर्माण एक प्रभावशाली बहुमुखी प्रतिभा के साथ एक आम तकनीक है जो26,27आकारों की एक विस्तृत विविधता बनाने में सक्षम बनाता है, जिसमें जटिल देशी निर्माण जैसी संरचनाओं को डिजाइन करने की क्षमता होती है, जैसे अल्वेओली या नेफ्रोटिक इकाई। फिर भी, एसयू-8 का उपयोग करने की एक खामी इसकी कम जैव-कृषि क्षमता27है, जो मंच को मुख्य रूप से एक शोध उपकरण बना रहा है, बजाय एक प्रत्यारोपण ऊतक। हालांकि, जैव संगत सामग्रियों का उपयोग करके इसमें सुधार किया जा सकता है जो यूवी/दृश्यमान प्रकाश रोशनी के तहत क्रॉसलिंक कर सकते हैं, और स्टीरियोलिटोग्राफी 29 जैसी सटीक तकनीकों का उपयोग करकेमुद्रित 3डी। परिणामस्वरूप संवहनी संरचनाओं को तब पशु मॉडल30में प्रत्यारोपित किया जा सकता है । सिस्टम की एक और सीमा उच्च विस्तार सटीकता के साथ पाड़ अधिकतम प्राप्त करने योग्य मोटाई है, जो स्टीरियोलिथोग्राफिक तकनीक31द्वारा सीमित है। प्रस्तावित प्रोटोकॉल पतली पाड़ जो देशी ऊतक आकार का प्रतिनिधित्व कर सकते है बनाने के लिए उपयुक्त है ।

यह मंच संवहनीय घटनाओं को प्रभावित करने वाले कई चरों की जांच करने की क्षमता प्रदान करता है4,32 सबसे पहले, विभिन्न प्रकार के ईसीएस और एससी के बीच बातचीत, और उनके पोत निर्माण, विकास और परिपक्वता क्षमताओं, जो विभिन्न ऊतक मूल33से कोशिकाओं का उपयोग करते समय अलग-अलग होने के लिए जाने जाते हैं। दूसरा, विकास कारकों, छोटे अणुओं और वाक्यूलेचर पर अवरोधकों का प्रभाव, वास्तविक समय34,35में उनके प्रभाव के स्पष्ट दृश्य की अनुमति देता है। तीसरा, अन्य सेल प्रकार, स्फेरॉइड, या ऑर्गेनॉइड और उनके संचार और गठन जहाजों के साथ बातचीत के अलावा36। इसके लिए, प्रस्तावित प्रणाली माइक्रोवैस्कुलर प्रणाली की जांच के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है।

भविष्य के कदमों से यांत्रिक उत्तेजनाओं के प्रभाव की जांच करने के लिए प्रस्तावित प्रणाली का लाभ उठाया जाएगा, जैसे कि इंटरस्टिशियल फ्लो और मैकेनिकल स्ट्रेचिंग37,38,विकासशील वेक्यूलेचर पर। यह उम्मीद है कि नए पहलुओं पर प्रकाश डाला जाएगा जो वर्तमान ज्ञान और संवहनी मशीनोलॉजी के अत्याधुनिक अनुसंधान का विस्तार करेंगे।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध को मिशिगन विश्वविद्यालय-अनुसंधान के लिए इज़राइल पार्टनरशिप से वित्तपोषण द्वारा समर्थित किया गया था । लेखक उड़ी मेर्डलर, लिओर डेबी और गैलिया बेन डेविड को उनकी महान सहायता और समर्थन, नाडीन वांग, पीएचडी और पिलर हेरेरा-फिएरो, मिशिगन विश्वविद्यालय में लुरी नैनोफैब्रिकेशन सुविधा के पीएचडी के साथ-साथ फोटोलिथोग्राफी तकनीकों की ज्ञानवर्धक चर्चाओं के लिए लुइस सोलोरियो, पीएचडी का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Angiotool freeware NIH-CCR Free download at https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home
Bovine albumin serum Probumin Millipore 82-045-1
Dental pulp stem cells Lonza PT-5025
ECM media + bullet kit Sciencell #1001
Ethanol 96% Gadot-Group 64-17-5
Evicel fibrin sealant Johnson&Johnson EVB05IL Provides both thrombin and fibrinogen (BAC2) solutions
GlutaMAX Gibco 35050061
Goat anti-mouse Cy3 antibody Jackson 115-166-072
Goat anti-rabbit Alexa-Fluor 488 Thermo- Fisher Scientific A11034
Human adipose microvascular cells Sciencell #7200
Human fibronectin Sigma F0895-5MG Stock concentration: 1 mg/mL
ImageJ NIH Free download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Isopropyl alcohol Gadot-Group 67-63-0
Lift-off reagent Kayaku Advanced Materials, Inc G112850 Commercial name Omnicoat
Low-glucose DMEM Biological Industries 01-050-1A
Mouse anti-SMA antibody Dako M0851
NEAA Gibco 11140068
Paraformaldehyde solution 4% in PBS ChemCruz SC-281692
Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution Biological Industries 03-032-1B
Phospate buffered saline (PBS) Sigma P5368-10PAK
Rabbit anti-vWF antibody Abcam ab9378
Silicon wafer Silicon Valley Microelectronics (SVM) Wafers 4", Type N-1-10, 500-550 microns thick
SU-8 2050 photoresist Kayaku Advanced Materials, Inc Y11058
SU-8 developer Kayaku Advanced Materials, Inc Y020100
Tryton-X 100 BioLab LTD 57836

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References

  1. Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4), 300-311 (2011).
  2. Landau, S., Guo, S., Levenberg, S. Localization of Engineered Vasculature within 3D Tissue Constructs. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 2 (2018).
  3. Griffith, C. K., et al. Diffusion Limits of an in Vitro Thick Prevascularized Tissue. Tissue Engineering. 11 (12), (2005).
  4. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
  5. Landau, S., et al. Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation. Biomaterials. 122, 72-82 (2017).
  6. Lesman, A., et al. Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs. Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).
  7. Richards, D., Jia, J., Yost, M., Markwald, R., Mei, Y. 3D Bioprinting for Vascularized Tissue Fabrication. Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 132-147 (2017).
  8. Levenberg, S., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nature Biotechnology. 23 (7), 879-884 (2005).
  9. Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
  10. Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11, (2012).
  11. Gariboldi, M. I., Butler, R., Best, S. M., Cameron, R. E. Engineering vasculature Architectural effects on microcapillary-like structure self-assembly. PLOS ONE. 14 (1), 1-13 (2019).
  12. Blache, U., Guerrero, J., Güven, S., Klar, A. S., Scherberich, A. Microvascular Networks and Models, In vitro Formation. Vascularization for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. , 1-40 (2018).
  13. Wong, K. H. K., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. Microfluidic Models of Vascular Functions. Annual Review of Biomedical Engineering. 14 (1), 205-230 (2012).
  14. Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress. Biophysical Journal. 105 (10), 2240-2251 (2013).
  15. Pollet, A. M. A. O., den Toonder, J. M. J. Recapitulating the vasculature using Organ-on-Chip technology. Bioengineering. 7 (1), (2020).
  16. Hasan, A., et al. Microfluidic techniques for development of 3D vascularized tissue. Biomaterials. 35 (26), 7308-7325 (2014).
  17. Jordahl, J. H., et al. 3D Jet Writing: Functional Microtissues Based on Tessellated Scaffold Architectures. Advanced Materials. 30 (14), 1707196 (2018).
  18. Gauvin, R., et al. Microfabrication of complex porous tissue engineering scaffolds using 3D projection stereolithography. Biomaterials. 33 (15), 3824-3834 (2012).
  19. Coscoy, S., et al. Microtopographies control the development of basal protrusions in epithelial sheets. Biointerphases. 13 (4), 041003 (2018).
  20. Kaplan, B., et al. Rapid prototyping fabrication of soft and oriented polyester scaffolds for axonal guidance. Biomaterials. , (2020).
  21. Steier, A., Muñiz, A., Neale, D., Lahann, J. Emerging Trends in Information-Driven Engineering of Complex Biological Systems. Advanced Materials. 31 (26), 11806898 (2019).
  22. Szklanny, A. A., et al. High-Throughput Scaffold System for Studying the Effect of Local Geometry and Topology on the Development and Orientation of Sprouting Blood Vessels. Advanced Functional Materials. , 1901335 (2019).
  23. Welti, J., Loges, S., Dimmeler, S., Carmeliet, P. Recent molecular discoveries in angiogenesis and antiangiogenic therapies in cancer. Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3190-3200 (2013).
  24. Gui, L., Niklason, L. E. Vascular Tissue Engineering: Building Perfusable Vasculature for Implantation. Current Opinion in Chemical Engineering. 3, 68-74 (2014).
  25. Blache, U., Ehrbar, M. Inspired by nature: Hydrogels as versatile tools for vascular engineering. Advances in Wound Care. 7 (7), 232-246 (2018).
  26. Cochrane, A., et al. Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).
  27. Nemani, K. V., Moodie, K. L., Brennick, J. B., Su, A., Gimi, B. In vitro and in vivo evaluation of SU-8 biocompatibility. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 33 (7), 4453-4459 (2013).
  28. Mathew, R., Ravi Sankar, A. A Review on Surface Stress-Based Miniaturized Piezoresistive SU-8 Polymeric Cantilever Sensors. Nano-Micro Letters. 10 (2), 1-41 (2018).
  29. Knowlton, S., Yenilmez, B., Anand, S., Tasoglu, S. Photocrosslinking-based bioprinting: Examining crosslinking schemes. Bioprinting. 5, 10-18 (2017).
  30. Redd, M. A., et al. Patterned human microvascular grafts enable rapid vascularization and increase perfusion in infarcted rat hearts. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
  31. Zhu, Y., et al. SU-8 Photoresist. Encyclopedia of Nanotechnology. , 2530-2543 (2012).
  32. Zheng, F., et al. Organ-on-a-Chip Systems: Microengineering to Biomimic Living Systems. Small. 12 (17), 2253-2282 (2016).
  33. Freiman, A., et al. Adipose-derived endothelial and mesenchymal stem cells enhance vascular network formation on three-dimensional constructs in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 5 (2016).
  34. van Duinen, V., et al. Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform. Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).
  35. Nguyen, D. -H. T., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (17), 6712-6717 (2013).
  36. Nashimoto, Y., et al. Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).
  37. Rosenfeld, D., et al. Morphogenesis of 3D vascular networks is regulated by tensile forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3215-3220 (2016).
  38. Neto, F., et al. and TAZ regulate adherens junction dynamics and endothelial cell distribution during vascular development. bioRxiv. , 174185 (2017).

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बायोइंजीनियरिंग अंक 167 माइक्रोवसकुलेचर पोत माइग्रेशन एनालिटिकल टूल हाई-थ्रूपुट परख एंजियोजेनेसिस विश्लेषण ऊतक इंजीनियरिंग
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Szklanny, A. A., Neale, D. B., Lahann, J., Levenberg, S. Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels. J. Vis. Exp. (167), e61995, doi:10.3791/61995 (2021).

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