Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Stegvis cell sådd på tessellerade byggnadsställningar för att studera spirande blodkärl

Published: January 14, 2021 doi: 10.3791/61995
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Faculty of Biomedical Engineering, Technion, 2Department of Chemical Engineering and Biointerfaces Institute, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Konstruerade vävnader är starkt beroende av lämpliga kärlnätverk för att ge viktiga näringsämnen och gaser och ta bort metaboliskt avfall. I det här arbetet skapar ett stegvis såddprotokoll av endotelceller och stödceller högorganiserade kärlnätverk i en plattform med hög genomströmning för att studera utveckling av fartygsbeteende i en kontrollerad 3D-miljö.

Abstract

Det kardiovaskulära systemet är en nyckelspelare i människans fysiologi, vilket ger näring till de flesta vävnader i kroppen; fartyg finns i olika storlekar, strukturer, fenotyper och prestanda beroende på varje specifik perfused vävnad. Området vävnadsteknik, som syftar till att reparera eller ersätta skadade eller saknade kroppsvävnader, förlitar sig på kontrollerad angiogenes för att skapa en korrekt kärlisering inom de konstruerade vävnaderna. Utan ett kärlsystem kan tjocka konstruerade konstruktioner inte vara tillräckligt närande, vilket kan leda till celldöd, dålig engraftment och i slutändan misslyckande. Således är förståelse och kontroll av beteendet hos konstruerade blodkärl en enastående utmaning på fältet. Detta arbete presenterar ett höggenomströmningssystem som gör det möjligt att skapa organiserade och repeterbara fartygsnätverk för att studera fartygsbeteende i en 3D-byggnadsställningsmiljö. Detta tvåstegs såddprotokoll visar att fartyg inom systemet reagerar på byggnadsställningens topografi och presenterar distinkta spirande beteenden beroende på fackgeometrin där fartygen bor. De erhållna resultaten och förståelsen från detta höga genomströmningssystem kan tillämpas för att informera bättre 3D-bioprintade byggnadsställningar, där tillverkning av olika 3D-geometrier inte snabbt kan bedömas när 3D-utskrift används som grund för cellulära biologiska miljöer. Dessutom kan förståelsen från detta system med hög genomströmning användas för förbättring av snabb läkemedelsscreening, snabb utveckling av samkulturmodeller och undersökning av mekaniska stimuli på blodkärlsbildning för att fördjupa kunskapen om kärlsystemet.

Introduction

Området vävnadsteknik utvecklas snabbt mot tillverkning av konstruerade konstruktioner för att ersätta saknade eller skadade organ ochvävnader 1. Fullt fungerande konstruktioner har dock ännu inte uppnåtts, delvis, eftersom generera operativa vaskulär nätverk för vävnad näring är fortfarande en enastående utmaning. Utan korrekt kärlisering är konstruerade vävnader begränsade till en passiv diffusionstransport av syre och näringsämnen, vilket begränsar den maximala livskraftiga vävnadstjockleken till diffusionsgränsen, cirka 200 μm2. Sådana tjocklekar är inte lämpliga för att reparera stora vävnadsdefekter eller för full organtillverkning, vilket gör närvaron av funktionellt kärlnätverk till en obligatorisk egenskap för funktionella och implanterbaravävnader 3.

Kärlsystemet består av en mängd olika blodkärl, med olika storlekar, fenotyper och organisation, tätt relaterade till värdvävnaden. Att förstå beteende, svar och migrationsbeslut som fattas av utvecklings- och groddkärlen kan instruera deras integration i konstrueradevävnader 4. För närvarande är det vanligaste tillvägagångssättet för att skapa in vitro-kärlnätverk att kombinera endotelceller (ECs) med stödceller (SCs, med förmågan att differentiera till muralceller), sådda inom en tredimensionell mikromiljö. Denna miljö ger kemiska och fysiska signaler så att cellerna kan fästa, föröka sig och självmontera i kärlnätverk2,5,6,7,8. När SCs samkulturerade utsöndrar de extracellulära matrisproteiner (ECM) samtidigt som de ger mekaniskt stöd till ECs, som bildar de rörformiga strukturerna. Dessutom främjar en tvärinteraktion mellan båda celltyperna tubulogenes, kärlgrodd och migration, förutom SCs mognad och differentiering till α-smooth muskelaktin-uttrycker (αSMA) väggmålning celler4. Utveckling av fartygsnät studeras oftast i 3D-miljöer som skapats med hjälp av hydrogeler, porösa polymera byggnadsställningar eller en kombination av dessa. Det senare alternativet ger också en cellvänlig miljö och det mekaniska stöd som krävs för både cellerna och ECM9.

En stor mängd arbete har utförts för att studera vaskulär utveckling, inklusive samodling av cellerna på hydrogeler10,hydrogeler-byggnadsställningarkombinationer 11,12,2D plattformar och mikrofluidiska enheter13. Hydrogeler kan dock enkelt deformeras av de cellpåflytadekrafterna 14, medan 2D- och mikrofluidiksystem misslyckas med att återskapa en närmare naturmiljö för att få ett mer extrapolabeltsvar 15,16. Att förstå hur formande fartyg reagerar på sin omgivning kan ge kritisk insikt som kan möjliggöra tillverkning av konstruerade miljöer med förmågan att styra fartygsutvecklingen på ett förutsägbart sätt. Att förstå kärlbildningsfenomen är särskilt viktigt för att hålla jämna steg med den snabba uppkomsten av submicron-to-micron-skaltillverkningstekniker, såsom stereolitografi, digital projektionslitografi, kontinuerlig produktion av vätskegränssnitt, 3D-smältelektroflektroflykan, lösningsbaserad 3D-elektrostråleskrivning och framväxande bioprintingtekniker17,18,19,20,21. Att anpassa kontrollen av dessa mikrotillverkningstekniker till en fördjupad förståelse av kärlbiologi är nyckeln till skapandet av en lämplig konstruerad vaskulatur för en målvävnad.

Här presenterar vi ett 3D-system för att studera svaret från nya formnings- och groddkärl på den omgivande ställningsgeometrin, observera deras groddursprung och efterföljande migration22. Genom att använda 3D-byggnadsställningar med tessellerade fackgeometrier och en tvåstegsteknik lyckades vi skapa välorganiserade kärlnätverk på ett tydligt och enkelt sätt analyserat. De tessellerade geometrierna ger ett högt genomströmningssystem med enskilda enheter som innehåller fartyg som svarar på deras lokala miljö. Med hjälp av mångfärgade ECs spårade vi groddbildningsursprung och efterföljande migreringsmönster, korrelerade till fackgeometrin och SCs plats22.

Även om det föreslagna protokollet har förberetts för att analysera effekterna av geometriska signaler på vascularization beteende, kan denna metod utökas och tillämpas på en mängd nya applikationer. Den tessellerade byggnadsställningen och de lätt bildbara nätverken möjliggör enkel analys av olika ECs och SCs interaktion, tillägg av specifika organceller och deras interaktion med vaskulär nätverk, läkemedelseffekt på vaskulär nätverk och mer. Vårt föreslagna system resulterar mycket mångsidigt och av enkel tillverkning och bearbetning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tessellerad byggnadsställning tillverkning

OBS: Fotolitografi är en utbredd teknik som kräver specialiserad utrustning som vanligtvis finns i en nanofabriceringsanläggning / laboratorium. Metoden som anges i detta protokoll generaliserades så mycket som möjligt för publiken; Små ändringar av förfarandena kan dock vara nödvändiga beroende på vilken utrustning läsaren har. Vi rekommenderar att du utför dessa procedurer i ett rent rum på en nanotillverkningsanläggning för att säkerställa högsta processkvalitet. Innan du börjar, få tillgång till en maskjusterare (eller någon UV-exponeringsuppsättning), en spincoater, värmeplattor, en lösningsmedelstvättstation, en fotomask och en plasmarengöringsmedel. De lösningsmedel och kemikalier som används i förfarandet är farliga, så var försiktig så att du undviker kemisk exponering. När du utformar fotomasken, identifiera vilken storlek kiselplattor och fotomasker är kompatibla med spin-coater och mask-aligner. Dessutom deformeras fotoresisten som ligger mot kanterna på kiselskivan vanligtvis från hantering; gör därför designen mot mitten av skivan.

  1. Förbered byggnadsställningar med hjälp av en fotolitografiteknik med den valda geometrin av intresse.
    1. Rengör silikonskivan före spinnbeläggningen. Detta kan göras med plasmarengöring eller en lösningsmedelsbaserad teknik. Om plasmarengöring, följ instrumentets standardrutiner för driftdetaljer. Spraya med komprimerad kvävegas och inspektera skivan för att säkerställa att den är fri från skräp före spinnbeläggning. Denna skiva kommer att fungera som det substrat på vilket byggnadsställningarna skapas.
      OBS: För bästa resultat börja med en ny skiva. Wafers kan återutnådas men bör vara fria från gammal fotoresist, ytdefekter och skräp. Det är bra att använda wafer-pincett för hantering.
    2. Centrera en kiselskiva på spincoaterchucken med hjälp av en guide. Snurra skivan en kort stund för att säkerställa att den är ordentligt centrerad på chucken, justera vid behov tills den är ordentligt centrerad. Detta måste göras varje gång en skiva placeras på spin-coater. Dispensera 1-4 ml lyftreagens på skivan (detta beror på skivans storlek). Cirka 2 ml lyftreagens fungerar bra för en 4-tums wafer.
      1. Ställ in spreadhastigheten för spincoater på 500 varv/min i 5 sekunder och spinnhastigheten till 1 000 varv/min i 30 sekunder och snurra sedan lyftreagenset. Inspektera skivan för att säkerställa att den har en jämn beläggning över skivan. Allt skräp som finns kvar på skivan kommer att vara mycket uppenbart vid denna tidpunkt. Alla byggnadsställningar i ett område med skräp kommer sannolikt att vara oanvändbara. Efter spinnbeläggning, överför till en värmeplatta och grädda i 1 minut vid 200 °C.
    3. Upprepa föregående steg ytterligare två gånger för totalt tre beläggningar.
    4. Spin-coat hissreagensbelagd kiselskiva med SU-8 2050 fotoresist tills den får en tjocklek på cirka 100 μm.
      1. Dispensera 1 ml motstånd för varje 25 mm substratdiameter.
        OBS: Var noga med att undvika bubblor medan du häller motståndet. För SU-8 2050 fungerar det bra att hälla ungefär en cirkel med 2 tums diameter när du använder en 4-tums kiselskiva.
      2. Snurra-täcka SU-8 2050. Sprid med en hastighet av 500 varv/min i 5 sekunder, följt av en rotationshastighet mellan 1700 och 1 800 varv/min för att uppnå cirka 100 μm tjocklek.
      3. Tillval: Efter spinning, lämna de spin belagda wafersna för att avgasa över natten på en jämn yta skyddad från ljus före förbakningen. Detta kan hjälpa till att befria motståndet från eventuella bubblor och tillåta defekter att plana ut.
        OBS: Den faktiska tjockleken på motståndet och de resulterande byggnadsställningarna kan variera med användarfel och utrustningsparametrar. Därför bör tjockleken på byggnadsställningarna verifieras senare, i steg 1.6. Ändra spinnbeläggningsförfarandena i enlighet därmed för att uppnå önskad tjocklek.
    5. Före exponering, förbaka plattor vid 65 °C i 10 min och sedan 95 °C i 40-50 min. Före exponeringen ska du testa motståndsytan genom att trycka på kanten med ett par pincett för att säkerställa att den inte längre är klibbig/trögflytande. Det är bra att dra av skivan från värmeplattan och låta den svalna i en 0,5-1 min innan du bedömer klibbigheten.
      OBS: Ramptider med låg temperatur (uppvärmning och kylning) kan bidra till att förhindra försvring av byggnadsställningarna.
  2. Exponera fotoresisten för UV-ljus (350-400 nm) genom en fotomask med en exponeringsenergi på 215-240 mJ/cm2 för en resistanstjocklek på 85 - 110 μm. Se tillverkarens riktlinjer för rekommenderad exponering för korrelationer mellan energitjocklek och exponering.
    1. Se till att exponeringen är korrekt kalibrerad så att energin är verifierad. Justera exponeringstiden efter behov för att uppnå önskad exponeringsenergi. Dessutom kan maskjusterare möjliggöra olika exponeringslägen: vakuumkontakt, hård kontakt, mjuk kontakt och närhetskontakt (specifika termer kan variera). I allmänhet påverkar dessa upplösning och funktionsjustering. Författarna använde vanligtvis ett "hård kontaktläge".
    2. För små funktioner eller flera lager, där justeringen spelar roll, bör du överväga exponeringslägen och maskjusteringsprocedurer mer noggrant. Var noga med att överväga höjden på motståndet när du justerar tjockleksvärdet. Se standardrutinerna för maskjusteraren för driftinformation.
      OBS: Fotomaskens design bestämmer byggnadsställningars storlek, fackgeometri och antalet byggnadsställningar som erhålls per sats. Användningen av ett hårt glas eller kvartsfotomask ger högsta upplösning; En mjuk polymer transparent filmfotomask kan dock i allmänhet användas för dessa stora funktionsstorlekar (>10 μm). Användningen av en filmfotomask kan leda till topografiska funktioner längs z-axeln i ställningsporerna som ett resultat av sämre funktionsupplösning. Detta kan potentiellt påverka cellbeteendet. Kontrollera önskad upplösning rådgör med den som producerar fotomasken för att säkerställa att önskad upplösning uppnås.
  3. Grädda skivan omedelbart efter UV-exponering vid 65 °C i 2-5 minuter och sedan vid 95 °C i 8-10 minuter.
  4. Utveckla ställningarna för att ta bort outvecklat motstånd.
    1. Sänk ned ställningarna med en låg volym SU-8-utvecklarlösning i 7-10 minuter för att lösa upp eventuellt outvecklat motstånd.
    2. Skölj med isopropylalkohol (IPA).
    3. Torr skiva med komprimerat kväve.
      OBS: Var försiktig under steg 1.4 för att inte orsaka för tidig utsättning av byggnadsställningarna. Låga volymer utvecklare och skonsam hantering är nödvändiga för att uppnå detta.
  5. Efter utveckling, hårdbaka wafers vid 150 °C i 15 min.
    OBS: Efter hårdbakning kan det vara fördelaktigt att stänga av värmeplattan så att plattorna kan svalna mycket långsamt för att förhindra warping/curling av de slutliga byggnadsställningarna.
  6. Tillval: Efter den hårda bakningen och före lyftning, bedöm ställningens tjocklek eftersom byggnadsställningarna fortfarande ska fästas försiktigt på skivans yta. För den här proceduren fungerar kontaktprofilometri bra; Alla lämpliga metoder skulle dock kunna användas.
  7. Lyft ställningarna från skivan.
    1. Sänk ner byggnadsställningarna i SU-8-utvecklaren för att få dem att omedelbart lyfta av skivan. Om byggnadsställningarna inte lyfter, tryck försiktigt på byggnadsställningarna med ett par wafer-pincett.
    2. Ta bort överflödig utvecklare.
    3. Överför ställningarna till ny behållare och sänk ner i isopropylalkohol. Skölj i IPA i minst 6 gånger för att säkerställa att alla utvecklare har tagits bort.
  8. Lufttorka ställningarna i minst en vecka före användning.

2. Fibronectinbeläggning för byggnadsställningar

  1. För desinfektion, sänk ner byggnadsställningarna i 70% etanol (v/v) i minst 15 minuter och tvätta 2 gånger i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) före användning.
    VARNING: SU-8-byggnadsställningarna är sköra och kan lätt gå sönder. Hantering rekommenderas med trubbiga och böjda spetstångar, och de bör hanteras med högsta försiktighet. Enklare hantering kan uppnås genom att nedsänka byggnadsställningarna i vätska, för att undvika elektrostatiska interaktioner mellan byggnadsställningarna och ytan.
  2. Förbered en utspädning på 50 μg/ml humant fibronektin i PBS och täck ställningarna genom protein adsorption.
    1. Blanda 1,5 μL fibronectinbuljonglösning (1 mg/ml) med 28,5 μL PBS per varje byggnadsställning som ska sås. Förbered helst endast en fibronectin utspädning som ska användas för alla byggnadsställningar för att undvika pipetting fel.
      1. För 10 byggnadsställningar, blanda 15 μL lagerfibronektinlösning i 285 μL PBS, vilket uppgår till totalt 300 μL 50 μg/mL fibronektinutspädning.
    2. Placera byggnadsställningarna glest ovanpå en hydrofobisk yta (dvs. icke-vävnadskultur (nonTC) 10 cm skål) och täck varje byggnadsställning med 30 μL av fibronectinutspädningen beredd i steg 2.2.1.
      VARNING: Se till att inga bubblor fastnar i ställningsfacken. Om det finns bubblor kan de avlägsnas genom att försiktigt skaka ställningen i droppen eller ljusrören.
    3. Sätt tillbaka plattans lock och placera de fibronectintäckta byggnadsställningarna i en inkubator med 37 °C och 100 % luftfuktighet i minst en timme.
    4. Skölj ställningarna i PBS lätt efter inkubation för att avlägsna fibronektinrester. Byggnadsställningarna kan förvaras i PBS vid 4 °C i upp till en vecka före användning.

3. Slutotelceller sådd

  1. Bered EG-medium genom att blanda det basala mediet med dess korrespondentmedelsatskomponenter, inklusive en antibiotikalösning (Penna/Strep), fetala bovinserum (FBS) och endotelcellstillväxttillskott, enligt tillverkarens anvisningar.
  2. Gör en human fettmikrovaskulär endotelcellsupphängning (HAMEC) i EG-medium med en koncentration på 4 x 106 celler/ml.
    OBS: Realtidsavbildning kan utföras om de använda endotelcellerna tidigare transfekteras för att uttrycka ett fluorescerande protein eller förfärgas med hjälp av ett giftfritt cytoplasmiskt membranfärg (även kallat märkta ECs).
  3. Använd tång, placera en fibronectinbelagd byggnadsställning per brunn på en ickeTC 24-brunn.
  4. Täck varje byggnadsställning med 25 μL droppar av HAMEC-suspensionen. Se upp för att inte låta fjädringen flöda bort från ställningen, eftersom det kan hindra cellens vidhäftning.
  5. Lägg locket på plattan och placera det i en inkubator vid 37 °C, 5% CO2 och 100% luftfuktighet. Låt inkubera i minst 60 minuter och högst 90 minuter.
    OBS: Vid inkubation förbättrar placering av plattan på en orbital shaker i inkubatorn cellfästet på ställningens väggar. Orbital shaker bör ställas in på högst 5 varv/min.
  6. Efter inkubation, fyll varje brunn med 700 μL EG-medium med en pipett.
    OBS: Förvänta dig att se ECs längst ner i brunnen, eftersom vissa av cellerna inte fäster på ställningen och faller genom ställningens hålrum.
  7. Inkubera de endoteliserade byggnadsställningarna tills EG-sammanflödet kan observeras med fluorescerande mikroskopi på ställningens väggar (vid användning av märkta ECs) eller i 3 dagar (vid användning av icke-märkta ECs), vilket ger tillräckligt med tid för att uppnå EG-sammanflöde. Byt medium varannan dag.

4. Stöd cell sådd och samkultur

  1. Förbered DPSC-medium (Dental Pulp Stem Cell) (DPSCm) genom att blanda 500 ml lågsockerDulbeccos modifierade Eagle medium (LOW-glucose DMEM), 57,5 ml FBS. 5,75 ml icke-essentiella aminosyror (NEAA), 5,75 ml GlutaMAX och 5,75 ml penicillin-streptomycin-nystatinlösning.
  2. Överför de endoteliserade byggnadsställningarna till en ny ickeTC 24-brunnsplatta för att kassera ECs som är fästa vid brunnens botten med tång.
    1. Kassera alla medier från strömplattan med en 1 ml pipett eller vakuumsugning. Var försiktig så att du inte applicerar vakuum rakt på ställningen.
    2. Placera en byggnadsställning per brunn, helst i mitten av brunnen för att undvika att köra vätska mot väggarna på grund av ytspänningseffekter. Torka området kring ställningen med lätt vakuum men undvik fullständig torkning av ställningen.
  3. Förbered en DPSC-suspension i fibrinlösning före gel.
    1. Späd ut trombin- och fibrinogenlagerlösningar med PBS tills de får en slutlig koncentration på 5 U/ml respektive 15 mg/ml.
    2. Förbered en 8 x 106 DPSC/ml suspension i 5 U/mL trombinutspädning och fördela i enskilda eppendorfs 12,5 μL av denna suspension per byggnadsställning som ska sås.
    3. Ställ in en 5-50 μL pipett (eller liknande) på 12,5 μL och fyll den med 15 mg/ml fibrinogenlösning.
    4. Utan att ta bort spetsen ställer du in pipetten på 25 μL. Materialet i spetsen ska stiga och lämna en tom volym mot spetsöppningen.
    5. Tryck långsamt på kolvens knapp tills vätskan når spetsöppningen men läcker inte ut. Håll kolven i detta läge och sätt spetsen i ett av mikrocentrifugrören som innehåller cellerna i trombinupphängning och se till att spetsen kommer i kontakt med vätskan.
      VARNING: Fibrinkorslänkningen börjar omedelbart efter att trombin och fibrinogen har kommit i kontakt. Följande steg bör göras snabbt.
    6. Släpp försiktigt kolvens knapp och dra cellupphängningen i spetsen. Blanda noggrant båda materialen och undvik bubbelbildning.
  4. Dela snabbt ut de blandade materialen ovanpå en endoteliserad byggnadsställning. Upprepa de föregående stegen för varje byggnadsställning och se till att alltid byta tips mellan användningarna för att undvika oväntad fibringelbildning i spetsen.
  5. Sätt tillbaka plåtlocket och inkubera ställningarna vid 37 °C, 5 % CO2 och 100 % luftfuktighet i 30 minuter.
  6. Efter inkubation, fyll varje brunn med 1 ml 1:1 DPSC och EC medium.
    1. Kultur i 1 vecka, byta medium varannan dag.
    2. Under kulturen, ta bort mediet från brunnen och avbilda konstruktionerna med hjälp av ett konfokalt mikroskop vid olika tidpunkter för att studera kärlutvecklingen eller någon annan parameter av intresse.
      Obs: Det här steget kan bara utföras om experimentet utförs med märkta ECs. Se steg 6 - OBS för ytterligare förtydliganden.

5. Immunofluorescerande färgning för karakteristiska kärlmarkörer

OBS: Följande steg kan utföras i samma brunnar där konstruktionerna odlades. Det är viktigt att alltid se till att lösningarna helt täcker byggnadsställningarna. Dessutom rekommenderas om möjligt att utföra stegen på en orbital shaker, men inte obligatoriskt.

  1. På dag 7 kasserar du mediet från brunnarna och sköljer byggnadsställningarna genom att lägga till PBS till brunnarna och ta bort det med vakuum.
  2. Fixa ställningarna genom att tillsätta 4% paraformaldehyd i 20 minuter. Tvätta i PBS 3 gånger, 5 minuter per tvätt.
  3. Permeabilisera de fasta cellerna med 0,3% Triton-X i PBS (v/v) i 15 minuter. Tvätta i PBS 3 gånger, 5 minuter per tvätt.
  4. Bered en 5% bovin serumalbumin (BSA) i PBS (w/v) blockerande lösning och täck ställningarna. Lämna i rumstemperatur i 1 timme.
    OBS: Alla nödvändiga lösningsmängder beror på antalet byggnadsställningar som ska färgas. Förbered lösningarna efter behov för att hålla de angivna koncentrationerna.
  5. Förbered och applicera den primära antikroppsfärgningslösningen .
    1. Utspädd kanin anti-von Willebrand faktor (vWF) antikroppar 1:150 och mus anti-SMA antikroppar 1:50 i färsk blockering lösning.
      OBS: Andra endotelcellsmarkörer, såsom CD31 eller VE-Cadherin, kan användas.
    2. Täck ställningarna med den primära antikroppslösningen och förvara den vid 4 °C över natten. Tvätta i PBS tre gånger, 5 minuter per tvätt.
  6. Förbered och applicera den sekundära antikroppsfärgningslösningen.
    1. Späd get antimus Cy3 antikropp 1:150 och get anti-kanin Alexa-Fluor 488 1:400 i PBS.
    2. Täck ställningarna med den sekundära antikroppslösningen och inkubera i minst 3 timmar vid rumstemperatur eller vid 4 °C över natten. Tvätta 3 gånger i PBS, 5 minuter per tvätt. Förvara den färgade ställningen i 0,3 % PFA i PBS (v/v) i upp till en månad.

6. Analys av konfokal avbildning av byggnadsställningar och fartygsutveckling

OBS: Följande steg kan utföras på de fasta och färgade byggnadsställningarna vid den valda sista tidpunkten eller, om fluorescerande celler användes, under cellkulturperioden utan att experimentet behövde avslutas. För de senare rekommenderas att särskilda tidpunkter fastställs. Detta arbete visar dag 0 (före SCs sådd) och dag 1, 3, 5 och 7 efter SCs sådd (Figur 3A).

  1. Avbilda byggnadsställningarna med ett konfokalt mikroskop med en 5X-lins och en zoom på 0,5 och ställningens fulla z-intervall. Detta gör det möjligt att fånga 9 separata fack för kvadratiska och cirkulära geometrier, eller 8 fulla fack för den sexkantiga geometrin. Avbilda lysrörssignalen och det överförda ljuset för att få både kärlets nätverksstruktur och fackgeometrin (Figur 3A).
  2. Använd ImageJ (eller någon annan bildbehandlingsprogramvara) och beskär varje enskilt fack. För denna process är endast kärlnätverksmarkörerna relevanta. Ta bort något kärl som inte är placerat inuti kupéområdet. Skapa en maximal intensitetsprojektion och spara varje enskilt beskuret fack som en TIFF-bild.
    1. I ImageJ trycker du på > öppna och väljer önskad TIFF-bild som innehåller flera fack. Bilden ska ha minst två kanaler, det fluorescerande fartygsnätet och den överförda ljusbilden.
    2. Välj markeringsverktyget Polygon i verktygsfältet. Välj den överförda ljuskanalen. Klicka på ett av hörnen på det sexkantiga facket, vid gränssnittet mellan fackområdet och ställningsväggen, detta startar maskdefinitionen. Fortsätt att klicka i nästa hörn i sekventiell ordning tills det första hörnet är markerat och stäng masken.
      OBS: Denna förklaring gäller för ett sexkantigt fack. När facket är antingen kvadratiskt eller cirkulärt, använd rektangeln respektive ovala verktygen för att skapa en lämplig mask. Oavsett form, passa alltid masken för att följa byggnadsställningens innervägg.
    3. Klicka på Analysera > Verktyg > ROI-chef. I ROI-chefen (ROI, intresseregion) klickar du på knappen Lägg till för att spara den skapade masken. Den nya masken visas i listan till vänster. Det här steget gör att analysen kan vara konsekvent mellan olika bilder.
      OBS: I ROI-chefen är det möjligt att spara en fil med alla skapade masker genom att klicka på Mer > Spara. I fönstret Spara markering väljer du ett namn och en plats och sparar ROI-filen. Om du vill hämta masken klickar du på Mer information i ROI-chefen och > och väljer önskad ROI-fil.
    4. Välj nätverksbilden för fluorescerande fartyg och klicka på Redigera > Rensa utanför. Endast bilden i masken kommer att finnas kvar, medan resten kommer att elimineras.
    5. När den rensade nätverksbilden är öppen klickar du på Bild > Duplicera. Skriv bildens namn i popup-fönstret Duplicera. Om duplicera hyperstacken är markerad avmarkerar du den och klickar på OK. En ny bild som endast innehåller de beskurna lysrörsnäten kommer att skapas.
    6. Spara den beskurna bilden genom att klicka på > Spara som > Tiff. Välj namn och katalog och klicka på OK.
  3. Analysera kärlutvecklingen på de beskurna bilderna.
    1. Ladda ner och installera den analytiska fria programvaran AngioTool, som tillhandahåller kvantitativa verktyg för att kvantifiera en mängd olika kärlparametrar. Programvaran kan erhållas från följande adress https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home.
    2. Ange skalvärdet för bilderna så att de får resultat i millimeterenheter och läs in en bild.
      1. Klicka på fliken Inställning och fyll avståndet i pixlar och Avstånd i mm med representativa värden från de tagna bilderna. Med hjälp av de bildparametrar som nämns ovan är värdena för fyllning 400 pixlar per 1 mm.
      2. Tryck på knappen Öppna bild och bläddra efter bilden av intresse.
    3. Välj analysparametrarna för att kvantifiera fartygsutvecklingen på fliken Analys.
      1. Under fältet Fartygsdiameter och intensitet avmarkerar du alla nuvarande markörer från den övre intervallväljaren och aktiverar markören som representerar siffran 3.
      2. Under fältet Kärldiameter och intensitet flyttar du markören för det nedre intervallet till 60 och lämnar högavståndstillverkaren på 255.
      3. Aktivera rutan Ta bort små partiklar och ställ in markören på 100.
      4. Under fältsparinställningarna väljerdu namn och plats för den uppslagsbladsfil där resultaten ska sparas och trycker på knappen Kör analys. Om rutan Spara resultatavbildning är markerad genererar angiotool och sparar en ny jpeg-avbildning som visar de kvantifierade parametrarna för fartygsnätverket.
        OBS: För varje utförd analys utan att ändra uppslagsbladets filnamn läggs en ny rad till längst ned i filen, med de nyligen förvärvade resultaten.
  4. Ordna data och kör en statistisk analys.
    1. För alla bearbetade bilder väljer du den parameter som är av intresse från spridningsbladet (t.ex. total fartygslängd och fartygsområde)och matar in dem i en statistisk analysprogramvara för att korrekt studera de erhållna resultaten ( figur3C).

7. Time lapse imaging för spirande ursprungsdetektering och migreringsspårning

  1. Alternativt, för att odla byggnadsställningarna i inkubatorn enligt beskrivningen i steg 4.6, ställ in en konfokal mikroskopkulturkammare på 37 °C, 5% CO2 och 100% luftfuktighet.
    1. Lägg plattan som innehåller de helt sådda byggnadsställningarna i den konfokala mikroskopkammaren och ställ in avbildningsparametrarna på önskade värden.
    2. Ställ in bildintervallet på 30 minuter och den totala bildtiden på 72 timmar. Detta gör det möjligt att köra tidsförfall helt utan behov av en medelstor förändring.
      VARNING: Om en längre tidsfördröjningsavbildning önskas bör en noggrann positionskalibrering utföras för att kunna hämta den ursprungliga bildplatsen, eftersom medelstora förändringar kräver att plattan avlägsnas från konfokal inkubatorn och in i den sterila biologiska huven.
      OBS: ECs lossning från ställningsväggarna och rörformiga strukturer bildas börjar inom den första timmen efter SCs sådd (steg 4) och kan ta upp till 50 timmar att slutföra. Efter den första rörbildningen kommer nya groddar att börja migrera in i facket från de omgivande kärlen. Spiring och efterföljande ombyggnad av nätverk kommer att fortsätta under hela experimentet ungefär fram till dag 10, då fartygsnäten blir stabila22. Använd den här informationen för att välja startpunkt för tidsfördröjning och tidssteg i enlighet därmed.
  2. Spara den fullständiga tidsfördröjningsfilmfilen som en TIFF-sekvens.
  3. Öppna ImageJ och klicka på > Importera > Bildsekvens och markera dina filer. Detta öppnar TIFF-sekvensen som en film.
  4. Öppna plugin-programmet manuell spårning genom att klicka på plugins > manuell spårning. Detta öppnar spårningsfönstret.
  5. Observera filmen och välj det fartyg som ska spåras. Var uppmärksam på dess ursprung och migration.
  6. Aktivera rutan Visa parametrar och mata in 30 minuter för tidsintervall. X/y-kalibreringen beror på den pixelmängd som valts under avbildningen.
  7. Fortsätt att manuellt spåra groddkärlen från ställningskonturen.
    1. Tryck på knappen Lägg till spår. På filmens första bildruta trycker du på platsen för det fartyg som ska spåras. Därefter ändras filmen automatiskt till nästa bildruta.
    2. Klicka på bilden av den andra ramen där kärlet är beläget. Återigen ändras filmen automatiskt till nästa bildruta.
    3. Fortsätt med samma fartyg tills den fullständiga migreringsspårningen har slutförts.
    4. Klicka på Overlay Dots & Lines i spårningsfönstret för att prägla en visuell sökväg för fartygsmigrering på filmen. Detta öppnar en kopia av filmen med en prick som representerar spårarens aktuella position och en rad som visar föregående sökväg.
    5. Klicka på knappen Slutspår för att slutföra inspelningen av den aktuella fartygsrörelsen.
    6. Klicka på knappen Lägg till spår igen för att börja om med ett nytt fartyg. När du gör detta ändrar linje- och prickmarkörerna automatiskt sin färg för det nya fartyget. Upprepa tills alla önskade fartyg spåras.
      OBS: X/y-platsen, fartygets hastighet och flyttade avstånd kan hämtas från popup-fönstret Resultat. Varje fartyg kommer att identifieras med sitt spårnummer i den vänstra kolumnen. Dessa data kan kopieras och klistras in i ett uppslagsblad för att utföra ytterligare analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det presenterade protokollet, med hjälp av stereolitografi tekniker, möjliggör tillverkning av tessellated byggnadsställningar gjorda av SU-8 fotoresist. Byggnadsställningar med distinkta fackgeometrier (kvadrater, hexagoner och cirklar) och mycket exakta och repeterbara egenskaper erhölls (figur 1).

Figure 1
Figur 1:Representativa scanningelektronmikroskopibilder av tessellerade kvadratiska, cirkulära och sexkantiga ställningsgeometrier (skalstång = 500 μm). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Med en stegvis cell sådd (steg 2 till 4) användes de tillverkade byggnadsställningarna för att skapa välorganiserade kärlnätverk. Vid användning av traditionell samtidig sådd av både ECs och SCs saknade de resulterande fartygen en tydlig organisation. För detta utfördes ställning fibronectin beläggningen (steg 2), ställningen endotelisering steg hoppades över (steg 3), och DPSC och HAMEC var samtidigt co-seeded i fibrin gel (steg 4). På detta sätt fördelas cellerna homogent över ställningen(figur 2, översta raden), vilket resulterar i oförutsägbara och oorganiserade utvecklade kärlnätverk som inte verkar interagera med den omgivande ställningen. Kontrarily, först så ECs på byggnadsställning väggar ger en exakt inledande endotel cell mönstring. Det senare tillskottet av SCs i en fibringel resulterar i ett förutsägbart tubulogenesfenomen, med formande kärl som noga följer formen på ställningsväggen och spirar nya kärl som migrerar in i fackutrymmet (figur 2, nedre raden).

Figure 2
Figur 2:Jämförelse av kärlisering mellan samtidig kontra stegvis cellsådd. Representativa bilder av vaskulär utveckling i tessellated byggnadsställningar för en samtidig (översta raden) cell sådd av ECs (röd) och SCs (grön) och stegvis cell sådd (nedre raden) vid dag 1 och 5. Stegvis sådd resulterar i organiserade kärlnätverk som följer ställningsväggarna och spirar in i fackutrymmet (skalstång: 100 μm). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Vid användning av fluorescerande ECs, antingen transfekterade eller färgade, kan fartygen avbildas i realtid utan att behöva fixa och avsluta experimentet för varje tidpunkt. Rött fluorescerande protein som uttrycker ECs (RFP-ECs) odlades på sexkantiga byggnadsställningar och avbildades efter sådd(figur 3A,dag 0). Dag 1 tillkom SCs och kärlnätverken avbildades varannan dag för att kvantifiera fartygsutvecklingen (figur 3A, dag 1, 3, 5 och 7). För varje tidpunkt togs breda bilder av hela byggnadsställningen (figur 3B). För varje fack organiserade och interagerade fartygen huvudsakligen med celler som ligger inom deras inneslutning. Därför isolerades varje fack och de överflödiga fartygen utanför facket avlägsnades med ImageJ. De rena enfacksbilderna analyserades sedan med Angiotool. Angiotool returnerade en spridningsbladfil som innehöll flera fartygsparametrar och en visuell representation av huvudnätverkets egenskaper, såsom skelett, skärningspunkter och fartygsyta. De erhållna uppgifterna analyserades med hjälp av den statistiska analysprogramvaran Prism, och en tydlig fartygstillväxt observerades för den totala fartygslängden och området under experimenttiden (figur 3C). Under ett enveckasförsök förväntas fartygen vidareutvecklas och utvidgas enligt figur 3A och figur 2C. Minskande fartygslängd eller fartygsområde, underlåtenhet att bilda fartyg dag 3 eller fartyg som bildas enligt figur 2:s översta rad kan tolkas som ett misslyckat experiment.

Figure 3
Figur 3: Representativa utvecklingsbilder och analysav organiserade kärlnätverk. Tillägg av SCs representerar dag 0 i experimentet. Dag 1 efter SCs sådd lossar ECs till utrymmesutrymmet och börjar bilda fartyg som kommer att fortsätta att gro och ansluta vid ytterligare dagar. (B) Konfokala bildbehandlingssteg för kärlnätverksanalys (i) En bred konfokal bild som innehåller flera fack tas, ii) ett enda fack beskärs (avmarkeras av den vita streckade hexagonen), iii) sedan separeras kärlnätverkskanalen och alla fartyg utanför fackväggarna beskärs. Bilden med ett fack analyseras med Angiotool, vilket returnerar en lista över kärlparametrar kompletterade med visuella markörer, till exempel kärlområdet (skisserat i gult), kärllängden (visas med gröna linjer) och skärningspunkterna (markerade som blå prickar). C)Jämförande resultat av fartygets totala längd och den totala fartygsarealen inom sexkantiga utrymmen vid olika tidpunkter (resultaten presenteras som medelvärdet ± SD, n > 6; alla skalstänger: 200 μm). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Med hjälp av flerfärgade ECs för att underlätta identifiering av en cell utfördes en konfokal bildtidsfördröjning för att tillåta spårning av enstaka fartyg (Kompletterande video 1). Fartygen observerades och spårades med hjälp av plugin-programmet Manuell spårningsbildj. Spetscellen valdes för varje bildruta i filmen (Figur 4A) tills kärlet anastomoserades med den omgivande vaskulaturen. Som ett resultat genererade plugin-programmet Manuell spårning fartygsbanan i realtid, vilket gjorde det möjligt att observera fartygsmigrationen (figur 4B).

Figure 4
Figur 4: Representativ spårning av groddarkärl. Ett groddkärl identifieras och spåras med hjälp av ImageJ plugin Manual Tracking. Fartygets ändsida är markerad för varje tidpunkt att spåra i realtid. Den svartvita markören lades till för att visa den valda fartygets ändpunkt. (B) Den resulterande 2D-spårningen av fartyget, som bearbetas av ImageJ-plugin, som visar den längsta punkten med en punkt och den bildade banan med en linje (skalstreck = 200 μm). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Fartygsmognad, som representeras av närvaron av SMA+ SCs, kan lätt observeras i den föreslagna plattformen. Vaskulaturer som presenterar ett högre antal SMA + SCs representerar ett mer moget nätverk, eftersom SMA-uttryck korrelerar med kärlstabilisering övertid 23. För cirkulära, sexkantiga och kvadratiska fack ökar mängden SMA+-SCs med tiden (figur 5A). Dag 3 visade alla former spridda SMA + SCs och uncomplex fartyg med få eller inga groddar alls. Dag 7 visade alla former ett rikt och komplext kärlnätverk, med en högre närvaro av SMA + SCs som omger fartygen. Dessutom visar bilder av högre förstoring en tätare SMA + SCs närvaro samlokalisering med bildade fartyg, vilket styrker rekryteringen och differentiering av SCs kring kärlstrukturer (figur 5B).

Figure 5
Figur 5: SMA+ SCs och blodkärl ökar med tiden. A) Glatt muskelaktin (rött) och vWF (kärl, grönt) visas för kärlnätverk i cirkulära, kvadratiska och sexkantiga fack dag 3 och dag 7. Både vaskulaturförlängning och SMA-uttryckande stödceller (SMA + SCs) ökar med tiden, vilket innebär en högre kärlmognad och komplexitet (skalstång = 200 μm). B) Representativa bilder av SMA+ SCs tätare ackumulering runt fartyg vid dag 7. Kärnorna (blå) i den sammansatta bilden avslöjar närvaron av SCs som inte uttrycker SMA-proteinet (skalstreck = 50 μm). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Kompletterande video 1: flerfärgade ECs-tidsförfall för spårning av fartygsmigration. Klicka här för att ladda ner den här videon.  

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Behovet av en rik vaskulatur inuti inbäddad i konstruerade vävnader är avgörande för konstruktionsöverlevnad och korrekt funktion1. Även om ingenjörskonsten i kärlsystemet har varit i fokus för en stor mängd forskning, återstår mycket att undersöka och förstå24. I synnerhet, när man återskapar en specifik vävnad, bör mikrovaskulaturen bete sig och organisera i enlighet därmed12. Det vanligaste tillvägagångssättet för mikrovesselgenerering är samsådd endotel och stödceller inom en lämplig 3D-miljö som är kompatibel för cellfäste, spridning och kärlbildning25. Denna metodik resulterar ofta i mycket oorganiserade nätverk, vilket gör det svårt att studera det mikrovaskulära beteendet22. Här ger det presenterade protokollet ett nytt verktyg som genererar högorganiserade kärlnätverk i ett höggenomströmningssystem, med fartyg som enkelt kan spåras och övervakas genom tiden, för att studera deras utveckling och beteende. Stegvis sådd av ECs (steg 2-3), följt av SCs (steg 4), är avgörande steg för att uppnå sådana organiserade nätverk22. Dessutom presenterar denna teknik en riktig 3D-miljö för kärlmodeller, där fartyg kan migrera i de tre dimensionerna och skapa relevanta strukturer. Däremot erbjuder mer populära metoder för kärlmodellering, såsom mikrofluidiksystem, bara en 2,5D-vävnadsrepresentation26.

Den föreslagna metoden kan enkelt modifieras och tillämpas för att studera många olika faktorer som påverkar fartygsnätverkets utveckling och beteende. Fotolitografisk SU-8 hartsställningstillverkning är en vanlig teknik med en imponerande mångsidighet som gör det möjligt att skapa ett brett utbud avformer 26,27, med potential att designa strukturer som liknar komplexa inhemska konstruktioner, såsom alveol eller nefrotisk enhet. En nackdel med att använda SU-8 är dock dess låga bioabsorberbarhet27, vilket gör plattformen främst till ett forskningsverktyg, istället för en implanterbar vävnad. Detta kan dock förbättras genom att använda biokompatibla material som kan korsa länken under UV / synlig ljusbelysning och 3D-printas med exakta tekniker som stereolitografi29. De resulterande vascularized konstruktionerna kunde sedan implanteras i en djurmodell30. En annan begränsning av systemet är ställningens maximala uppnåeliga tjocklek med hög detaljnoggrannhet, begränsad av stereolitografisk teknik31. Det föreslagna protokollet är lämpligt för att skapa tunn byggnadsställning som kan representera inhemska vävnadsstorlekar.

Denna plattform erbjuder potential att undersöka flera variabler som påverkar kärliseringsfenomenet4,32. För det första, interaktionerna mellan olika typer av ECs och SCs, och deras fartygsbildning, utveckling och mognadsförmåga, som är kända för att skilja sig åt när man använder celler från olika vävnads ursprung33. För det andra, effekten av tillväxtfaktorer, små molekyler och hämmare på vaskulaturen, vilket möjliggör en tydlig visualisering av deras inverkan i realtid34,35. För det tredje, tillsats av andra celltyper, sfäroider eller organoider och deras kommunikation och interaktion med de formandekärlen 36. För detta utgör det föreslagna systemet ett kraftfullt verktyg för att undersöka det mikrovaskulära systemet.

Framtida åtgärder kommer att dra nytta av det föreslagna systemet för att undersöka effekten av mekaniska stimuli, såsom interstitiellt flöde och mekanisksträckning 37,38, på den utvecklande vaskulaturen. Detta kommer förhoppningsvis att belysa nya aspekter som kommer att utöka den nuvarande kunskapen och den senaste forskningen inom kärlmekanobiologin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Denna forskning stöddes av finansiering från University of Michigan - Israel Partnership for Research. Författarna vill tacka Uri Merdler, Lior Debbi och Galia Ben David för deras stora hjälp och stöd, Nadine Wang, Ph.D. och Pilar Herrera-Fierro, Ph.D. vid Lurie Nanofabrication Facility vid University of Michigan, samt Luis Solorio, Ph.D. för upplysande diskussioner om fotolitografitekniker.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Angiotool freeware NIH-CCR Free download at https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home
Bovine albumin serum Probumin Millipore 82-045-1
Dental pulp stem cells Lonza PT-5025
ECM media + bullet kit Sciencell #1001
Ethanol 96% Gadot-Group 64-17-5
Evicel fibrin sealant Johnson&Johnson EVB05IL Provides both thrombin and fibrinogen (BAC2) solutions
GlutaMAX Gibco 35050061
Goat anti-mouse Cy3 antibody Jackson 115-166-072
Goat anti-rabbit Alexa-Fluor 488 Thermo- Fisher Scientific A11034
Human adipose microvascular cells Sciencell #7200
Human fibronectin Sigma F0895-5MG Stock concentration: 1 mg/mL
ImageJ NIH Free download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Isopropyl alcohol Gadot-Group 67-63-0
Lift-off reagent Kayaku Advanced Materials, Inc G112850 Commercial name Omnicoat
Low-glucose DMEM Biological Industries 01-050-1A
Mouse anti-SMA antibody Dako M0851
NEAA Gibco 11140068
Paraformaldehyde solution 4% in PBS ChemCruz SC-281692
Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution Biological Industries 03-032-1B
Phospate buffered saline (PBS) Sigma P5368-10PAK
Rabbit anti-vWF antibody Abcam ab9378
Silicon wafer Silicon Valley Microelectronics (SVM) Wafers 4", Type N-1-10, 500-550 microns thick
SU-8 2050 photoresist Kayaku Advanced Materials, Inc Y11058
SU-8 developer Kayaku Advanced Materials, Inc Y020100
Tryton-X 100 BioLab LTD 57836

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4), 300-311 (2011).
  2. Landau, S., Guo, S., Levenberg, S. Localization of Engineered Vasculature within 3D Tissue Constructs. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 2 (2018).
  3. Griffith, C. K., et al. Diffusion Limits of an in Vitro Thick Prevascularized Tissue. Tissue Engineering. 11 (12), (2005).
  4. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
  5. Landau, S., et al. Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation. Biomaterials. 122, 72-82 (2017).
  6. Lesman, A., et al. Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs. Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).
  7. Richards, D., Jia, J., Yost, M., Markwald, R., Mei, Y. 3D Bioprinting for Vascularized Tissue Fabrication. Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 132-147 (2017).
  8. Levenberg, S., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nature Biotechnology. 23 (7), 879-884 (2005).
  9. Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
  10. Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11, (2012).
  11. Gariboldi, M. I., Butler, R., Best, S. M., Cameron, R. E. Engineering vasculature Architectural effects on microcapillary-like structure self-assembly. PLOS ONE. 14 (1), 1-13 (2019).
  12. Blache, U., Guerrero, J., Güven, S., Klar, A. S., Scherberich, A. Microvascular Networks and Models, In vitro Formation. Vascularization for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. , 1-40 (2018).
  13. Wong, K. H. K., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. Microfluidic Models of Vascular Functions. Annual Review of Biomedical Engineering. 14 (1), 205-230 (2012).
  14. Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress. Biophysical Journal. 105 (10), 2240-2251 (2013).
  15. Pollet, A. M. A. O., den Toonder, J. M. J. Recapitulating the vasculature using Organ-on-Chip technology. Bioengineering. 7 (1), (2020).
  16. Hasan, A., et al. Microfluidic techniques for development of 3D vascularized tissue. Biomaterials. 35 (26), 7308-7325 (2014).
  17. Jordahl, J. H., et al. 3D Jet Writing: Functional Microtissues Based on Tessellated Scaffold Architectures. Advanced Materials. 30 (14), 1707196 (2018).
  18. Gauvin, R., et al. Microfabrication of complex porous tissue engineering scaffolds using 3D projection stereolithography. Biomaterials. 33 (15), 3824-3834 (2012).
  19. Coscoy, S., et al. Microtopographies control the development of basal protrusions in epithelial sheets. Biointerphases. 13 (4), 041003 (2018).
  20. Kaplan, B., et al. Rapid prototyping fabrication of soft and oriented polyester scaffolds for axonal guidance. Biomaterials. , (2020).
  21. Steier, A., Muñiz, A., Neale, D., Lahann, J. Emerging Trends in Information-Driven Engineering of Complex Biological Systems. Advanced Materials. 31 (26), 11806898 (2019).
  22. Szklanny, A. A., et al. High-Throughput Scaffold System for Studying the Effect of Local Geometry and Topology on the Development and Orientation of Sprouting Blood Vessels. Advanced Functional Materials. , 1901335 (2019).
  23. Welti, J., Loges, S., Dimmeler, S., Carmeliet, P. Recent molecular discoveries in angiogenesis and antiangiogenic therapies in cancer. Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3190-3200 (2013).
  24. Gui, L., Niklason, L. E. Vascular Tissue Engineering: Building Perfusable Vasculature for Implantation. Current Opinion in Chemical Engineering. 3, 68-74 (2014).
  25. Blache, U., Ehrbar, M. Inspired by nature: Hydrogels as versatile tools for vascular engineering. Advances in Wound Care. 7 (7), 232-246 (2018).
  26. Cochrane, A., et al. Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).
  27. Nemani, K. V., Moodie, K. L., Brennick, J. B., Su, A., Gimi, B. In vitro and in vivo evaluation of SU-8 biocompatibility. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 33 (7), 4453-4459 (2013).
  28. Mathew, R., Ravi Sankar, A. A Review on Surface Stress-Based Miniaturized Piezoresistive SU-8 Polymeric Cantilever Sensors. Nano-Micro Letters. 10 (2), 1-41 (2018).
  29. Knowlton, S., Yenilmez, B., Anand, S., Tasoglu, S. Photocrosslinking-based bioprinting: Examining crosslinking schemes. Bioprinting. 5, 10-18 (2017).
  30. Redd, M. A., et al. Patterned human microvascular grafts enable rapid vascularization and increase perfusion in infarcted rat hearts. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
  31. Zhu, Y., et al. SU-8 Photoresist. Encyclopedia of Nanotechnology. , 2530-2543 (2012).
  32. Zheng, F., et al. Organ-on-a-Chip Systems: Microengineering to Biomimic Living Systems. Small. 12 (17), 2253-2282 (2016).
  33. Freiman, A., et al. Adipose-derived endothelial and mesenchymal stem cells enhance vascular network formation on three-dimensional constructs in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 5 (2016).
  34. van Duinen, V., et al. Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform. Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).
  35. Nguyen, D. -H. T., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (17), 6712-6717 (2013).
  36. Nashimoto, Y., et al. Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).
  37. Rosenfeld, D., et al. Morphogenesis of 3D vascular networks is regulated by tensile forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3215-3220 (2016).
  38. Neto, F., et al. and TAZ regulate adherens junction dynamics and endothelial cell distribution during vascular development. bioRxiv. , 174185 (2017).

Tags

Bioengineering utgåva 167 mikrovaskulatur kärlmigration analysverktyg hög genomströmningsanalys angiogenesanalys vävnadsteknik
Stegvis cell sådd på tessellerade byggnadsställningar för att studera spirande blodkärl
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Szklanny, A. A., Neale, D. B.,… More

Szklanny, A. A., Neale, D. B., Lahann, J., Levenberg, S. Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels. J. Vis. Exp. (167), e61995, doi:10.3791/61995 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter