البذر الخلايا Stepwise على السقالات تيسلاتيد لدراسة الأوعية الدموية تنبت
Summary
تعتمد الأنسجة المهندسة بشكل كبير على شبكات الأوعية الدموية المناسبة لتوفير العناصر الغذائية والغازات الحيوية وإزالة النفايات الأيضية. في هذا العمل، يخلق بروتوكول البذر التدريجي للخلايا البطانية وخلايا الدعم شبكات الأوعية الدموية عالية التنظيم في منصة عالية الإنتاجية لدراسة تطوير سلوك الأوعية في بيئة ثلاثية الأبعاد خاضعة للرقابة.
Abstract
نظام القلب والأوعية الدموية هو لاعب رئيسي في فسيولوجيا الإنسان، وتوفير الغذاء لمعظم الأنسجة في الجسم. الأوعية موجودة في أحجام مختلفة، والهياكل، والأنماط الظاهرية، والأداء اعتمادا على كل نسيج معين perfused. يعتمد مجال هندسة الأنسجة، الذي يهدف إلى إصلاح أو استبدال أنسجة الجسم التالفة أو المفقودة، على تكوين الأوعية الدموية الخاضع للرقابة لخلق الأوعية الدموية المناسبة داخل الأنسجة المهندسة. بدون نظام الأوعية الدموية ، لا يمكن تغذية البنى الهندسية السميكة بما فيه الكفاية ، مما قد يؤدي إلى موت الخلايا ، وسوء الحرمان ، والفشل في نهاية المطاف. وبالتالي ، فإن فهم ومراقبة سلوك الأوعية الدموية المهندسة هو تحد بارز في هذا المجال. يقدم هذا العمل نظام إنتاجية عالية يسمح بإنشاء شبكات سفن منظمة وقابلة للتكرار لدراسة سلوك السفن في بيئة سقالة ثلاثية الأبعاد. يظهر بروتوكول البذر هذا ذو الخطوتين أن الأوعية داخل النظام تتفاعل مع تضاريس السقالة ، وتقدم سلوكيات مميزة تنبت اعتمادا على هندسة المقصورة التي تتواجد فيها السفن. يمكن تطبيق النتائج التي تم الحصول عليها وفهم من هذا النظام الإنتاجي العالي من أجل إبلاغ تصاميم بناء سقالة ثلاثية الأبعاد ذات طباعة بيولوجية أفضل ، حيث لا يمكن تقييم تصنيع مختلف الأشكال الهندسية ثلاثية الأبعاد بسرعة عند استخدام الطباعة ثلاثية الأبعاد كأساس للبيئات البيولوجية الخلوية. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الفهم من هذا النظام الإنتاجي العالي لتحسين الفحص السريع للأدوية، والتطور السريع لنماذج الثقافات المشتركة، والتحقيق في المحفزات الميكانيكية على تكوين الأوعية الدموية لتعميق المعرفة بنظام الأوعية الدموية.
Introduction
مجال هندسة الأنسجة يتقدم بسرعة نحو تصنيع البنى الهندسية لتحل محل الأعضاء والأنسجة المفقودة أو التالفة1. ومع ذلك، لم يتم بعد تحقيق البنى الوظيفية بالكامل، جزئيا، لأن إنشاء شبكات الأوعية الدموية التشغيلية لتغذية الأنسجة لا يزال تحديا بارزا. دون الأوعية الدموية المناسبة، تقتصر الأنسجة المهندسة على نقل الانتشار السلبي للأوكسجين والمواد المغذية، وتقييد سمك الأنسجة قابلة للحياة القصوى إلى حد الانتشار، ما يقرب من 200 ميكرومتر2. هذه السماكة ليست مناسبة لإصلاح عيوب الأنسجة الكبيرة أو لتصنيع الأعضاء الكاملة ، مما يجعل وجود شبكة الأوعية الدموية الوظيفية سمة إلزامية للأنسجة الوظيفية والغرسة3.
يتكون نظام الأوعية الدموية من مجموعة واسعة من الأوعية الدموية ، مع أحجام مختلفة ، والأنماط الظاهرية ، والتنظيم ، ترتبط ارتباطا وثيقا بالأنسجة المضيفة. فهم السلوك والاستجابة وقرارات الهجرة التي تتخذها السفن النامية وتنبت يمكن أن يرشد اندماجها في الأنسجة المهندسة4. حاليا، النهج الأكثر شيوعا لإنشاء شبكات الأوعية الدموية في المختبر هو الجمع بين الخلايا البطانية (ECs) مع خلايا الدعم (SCs، مع القدرة على التفريق إلى خلايا جدارية)، بذر داخل بيئة صغيرة ثلاثية الأبعاد. توفر هذه البيئة إشارات كيميائية ومادية للسماح للخلايا بإرفاق الخلايا وتكاثرهاوتجميعها ذاتيا في شبكات السفن2و5و6و7و8. عندما تشارك في زراعة، SCs تفرز البروتينات مصفوفة خارج الخلية (ECM) مع توفير الدعم الميكانيكي لECs، والتي تشكل الهياكل الأنبوبية. وعلاوة على ذلك، فإن التفاعل المتبادل بين كلا النوعين من الخلايا يعزز تكوين الأنابيب، وتنبت الأوعية والهجرة، بالإضافة إلى نضوج SCs والتمايز إلى خلايا جدارية α الملساء للعضلات (αSMA)4. تتم دراسة تطوير شبكة السفن الأكثر شيوعا في بيئات ثلاثية الأبعاد تم إنشاؤها باستخدام الهيدروجيلات أو السقالات البوليمرية المسامية أو مزيج منها. يوفر الخيار الأخير بيئة صديقة للخلايا والدعم الميكانيكي المطلوب لكل من الخلايا و ECM9.
وقد تم تنفيذ قدر كبير من العمل لدراسة تطور الأوعية الدموية، بما في ذلك المشاركة في زراعة الخلايا علىالهيدروجيلس 10،hydrogels-سقالة تركيبات11،12،منصات 2D، والأجهزة microfluidic13. ومع ذلك، يمكن أن تشوه الهيدروجيل بسهولة من قبل القوات التي تمارسها الخلية14،في حين أن أنظمة 2D وmicrofluidics تفشل في إعادة بيئة أقرب إلى الطبيعة للحصول على استجابة أكثر استقراء15،16. ويمكن أن يوفر فهم كيفية تفاعل السفن المشكله مع بيئتها المحيطة رؤية حاسمة قد تسمح بتلفيق بيئات هندسية مع القدرة على توجيه تطور السفينة بطريقة يمكن التنبؤ بها. فهم ظواهر تكوين الأوعية الدموية أمر بالغ الأهمية بشكل خاص لمواكبة الظهور السريع لتقنيات التصنيع من تحت الميكرون إلى ميكرون ، مثل التصوير الحجري المجسم ، والطباعة الحجرية الرقمية الإسقاط ، وإنتاج واجهة السائل المستمر ، والكتابة النفاثة ثلاثية الأبعاد ، والحل القائم على الكتابة النفاثة الكهربائية ثلاثية الأبعاد ، وتقنيات الطباعة الحيوية الناشئة17و18و19و20و21. إن مواءمة التحكم في تقنيات التصنيع الدقيق هذه مع فهم عميق لبيولوجيا الأوعية الدموية هو المفتاح لإنشاء الأوعية الدموية المهندسة المناسبة للأنسجة المستهدفة.
هنا، نقدم نظام 3D لدراسة استجابة السفن تشكيل وتنتشر جديدة لهندسة السقالة المحيطة بها، ومراقبة أصلها تنبت والهجرة اللاحقة22. من خلال استخدام السقالات ثلاثية الأبعاد مع هندسة المقصورة تيسلاتيد ، وتقنية البذر من خطوتين ، نجحنا في إنشاء شبكات الأوعية الدموية عالية التنظيم بطريقة واضحة وسهلة التحليل. توفر الهندسة تيسلاتيد نظام الإنتاجية العالية مع وحدات فردية تحتوي على السفن التي تستجيب لبيئتهم المحلية. باستخدام ECs متعددة الألوان ، تتبعنا أصول تكوين البراعم وأنماط الهجرة اللاحقة ، المرتبطة بهندسة المقصورة وموقع SCs22.
على الرغم من أن البروتوكول المقترح قد تم إعداده لتحليل آثار الإشارات الهندسية على سلوك الأوعية الدموية ، إلا أنه يمكن توسيع هذا النهج وتطبيقه على مجموعة متنوعة من التطبيقات الجديدة. تسمح السقالة تيسلاتيد والشبكات القابلة للصور بسهولة بإجراء تحليل مباشر لمختلف تفاعل ECs و SCs ، وإضافة خلايا عضوية محددة وتفاعلها مع شبكات الأوعية الدموية ، وتأثير الدواء على شبكات الأوعية الدموية ، وأكثر من ذلك. لدينا نتائج النظام المقترح تنوعا للغاية وتصنيع بسيطة وتجهيز.
Protocol
Representative Results
Discussion
الحاجة إلى الأوعية الدموية الغنية داخل جزءا لا يتجزأ من الأنسجة المهندسة أمر بالغ الأهمية لبناء البقاء على قيد الحياة والوظيفة المناسبة1. على الرغم من أن هندسة نظام الأوعية الدموية كانت محور كمية كبيرة من البحوث ، إلا أنه لم يتبق الكثير للتحقيق وفهم24. على وجه الخ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا البحث بتمويل من جامعة ميشيغان – الشراكة الإسرائيلية للبحوث. ويود المؤلفون أن يشكروا أوري ميردلر وليور ديبي وغاليا بن ديفيد على مساعدتهم ودعمهم الكبيرين، ونادين وانغ، والدكتوراه، وبيلار هيريرا – فييرو، والدكتوراه في مرفق لوري للإنشاءات النانوية في جامعة ميشيغان، وكذلك لويس سولوريو، دكتوراه في المناقشات المستنيرة لتقنيات التصوير الضوئي.
Materials
| Angiotool freeware | NIH-CCR | Free download at https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home | |
| Bovine albumin serum Probumin | Millipore | 82-045-1 | |
| Dental pulp stem cells | Lonza | PT-5025 | |
| ECM media + bullet kit | Sciencell | #1001 | |
| Ethanol 96% | Gadot-Group | 64-17-5 | |
| Evicel fibrin sealant | Johnson&Johnson | EVB05IL | Provides both thrombin and fibrinogen (BAC2) solutions |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| Goat anti-mouse Cy3 antibody | Jackson | 115-166-072 | |
| Goat anti-rabbit Alexa-Fluor 488 | Thermo- Fisher Scientific | A11034 | |
| Human adipose microvascular cells | Sciencell | #7200 | |
| Human fibronectin | Sigma | F0895-5MG | Stock concentration: 1 mg/mL |
| ImageJ | NIH | Free download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Isopropyl alcohol | Gadot-Group | 67-63-0 | |
| Lift-off reagent | Kayaku Advanced Materials, Inc | G112850 | Commercial name Omnicoat |
| Low-glucose DMEM | Biological Industries | 01-050-1A | |
| Mouse anti-SMA antibody | Dako | M0851 | |
| NEAA | Gibco | 11140068 | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | SC-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma | P5368-10PAK | |
| Rabbit anti-vWF antibody | Abcam | ab9378 | |
| Silicon wafer | Silicon Valley Microelectronics (SVM) | Wafers 4", Type N-1-10, 500-550 microns thick | |
| SU-8 2050 photoresist | Kayaku Advanced Materials, Inc | Y11058 | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials, Inc | Y020100 | |
| Tryton-X 100 | BioLab LTD | 57836 |
References
- Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4), 300-311 (2011).
- Landau, S., Guo, S., Levenberg, S. Localization of Engineered Vasculature within 3D Tissue Constructs. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 2 (2018).
- Griffith, C. K., et al. Diffusion Limits of an in Vitro Thick Prevascularized Tissue. Tissue Engineering. 11 (12), (2005).
- Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
- Landau, S., et al. Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation. Biomaterials. 122, 72-82 (2017).
- Lesman, A., et al. Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs. Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).
- Richards, D., Jia, J., Yost, M., Markwald, R., Mei, Y. 3D Bioprinting for Vascularized Tissue Fabrication. Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 132-147 (2017).
- Levenberg, S., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nature Biotechnology. 23 (7), 879-884 (2005).
- Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
- Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11, (2012).
- Gariboldi, M. I., Butler, R., Best, S. M., Cameron, R. E. Engineering vasculature Architectural effects on microcapillary-like structure self-assembly. PLOS ONE. 14 (1), 1-13 (2019).
- Blache, U., Guerrero, J., Güven, S., Klar, A. S., Scherberich, A. Microvascular Networks and Models, In vitro Formation. Vascularization for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. , 1-40 (2018).
- Wong, K. H. K., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. Microfluidic Models of Vascular Functions. Annual Review of Biomedical Engineering. 14 (1), 205-230 (2012).
- Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress. Biophysical Journal. 105 (10), 2240-2251 (2013).
- Pollet, A. M. A. O., den Toonder, J. M. J. Recapitulating the vasculature using Organ-on-Chip technology. Bioengineering. 7 (1), (2020).
- Hasan, A., et al. Microfluidic techniques for development of 3D vascularized tissue. Biomaterials. 35 (26), 7308-7325 (2014).
- Jordahl, J. H., et al. 3D Jet Writing: Functional Microtissues Based on Tessellated Scaffold Architectures. Advanced Materials. 30 (14), 1707196 (2018).
- Gauvin, R., et al. Microfabrication of complex porous tissue engineering scaffolds using 3D projection stereolithography. Biomaterials. 33 (15), 3824-3834 (2012).
- Coscoy, S., et al. Microtopographies control the development of basal protrusions in epithelial sheets. Biointerphases. 13 (4), 041003 (2018).
- Kaplan, B., et al. Rapid prototyping fabrication of soft and oriented polyester scaffolds for axonal guidance. Biomaterials. , (2020).
- Steier, A., Muñiz, A., Neale, D., Lahann, J. Emerging Trends in Information-Driven Engineering of Complex Biological Systems. Advanced Materials. 31 (26), 11806898 (2019).
- Szklanny, A. A., et al. High-Throughput Scaffold System for Studying the Effect of Local Geometry and Topology on the Development and Orientation of Sprouting Blood Vessels. Advanced Functional Materials. , 1901335 (2019).
- Welti, J., Loges, S., Dimmeler, S., Carmeliet, P. Recent molecular discoveries in angiogenesis and antiangiogenic therapies in cancer. Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3190-3200 (2013).
- Gui, L., Niklason, L. E. Vascular Tissue Engineering: Building Perfusable Vasculature for Implantation. Current Opinion in Chemical Engineering. 3, 68-74 (2014).
- Blache, U., Ehrbar, M. Inspired by nature: Hydrogels as versatile tools for vascular engineering. Advances in Wound Care. 7 (7), 232-246 (2018).
- Cochrane, A., et al. Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).
- Nemani, K. V., Moodie, K. L., Brennick, J. B., Su, A., Gimi, B. In vitro and in vivo evaluation of SU-8 biocompatibility. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 33 (7), 4453-4459 (2013).
- Mathew, R., Ravi Sankar, A. A Review on Surface Stress-Based Miniaturized Piezoresistive SU-8 Polymeric Cantilever Sensors. Nano-Micro Letters. 10 (2), 1-41 (2018).
- Knowlton, S., Yenilmez, B., Anand, S., Tasoglu, S. Photocrosslinking-based bioprinting: Examining crosslinking schemes. Bioprinting. 5, 10-18 (2017).
- Redd, M. A., et al. Patterned human microvascular grafts enable rapid vascularization and increase perfusion in infarcted rat hearts. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
- Zhu, Y., et al. SU-8 Photoresist. Encyclopedia of Nanotechnology. , 2530-2543 (2012).
- Zheng, F., et al. Organ-on-a-Chip Systems: Microengineering to Biomimic Living Systems. Small. 12 (17), 2253-2282 (2016).
- Freiman, A., et al. Adipose-derived endothelial and mesenchymal stem cells enhance vascular network formation on three-dimensional constructs in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 5 (2016).
- van Duinen, V., et al. Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform. Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).
- Nguyen, D. -. H. T., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (17), 6712-6717 (2013).
- Nashimoto, Y., et al. Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).
- Rosenfeld, D., et al. Morphogenesis of 3D vascular networks is regulated by tensile forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3215-3220 (2016).
- Neto, F., et al. and TAZ regulate adherens junction dynamics and endothelial cell distribution during vascular development. bioRxiv. , 174185 (2017).
