Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

البذر الخلايا Stepwise على السقالات تيسلاتيد لدراسة الأوعية الدموية تنبت

Published: January 14, 2021 doi: 10.3791/61995
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Faculty of Biomedical Engineering, Technion, 2Department of Chemical Engineering and Biointerfaces Institute, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

تعتمد الأنسجة المهندسة بشكل كبير على شبكات الأوعية الدموية المناسبة لتوفير العناصر الغذائية والغازات الحيوية وإزالة النفايات الأيضية. في هذا العمل، يخلق بروتوكول البذر التدريجي للخلايا البطانية وخلايا الدعم شبكات الأوعية الدموية عالية التنظيم في منصة عالية الإنتاجية لدراسة تطوير سلوك الأوعية في بيئة ثلاثية الأبعاد خاضعة للرقابة.

Abstract

نظام القلب والأوعية الدموية هو لاعب رئيسي في فسيولوجيا الإنسان، وتوفير الغذاء لمعظم الأنسجة في الجسم. الأوعية موجودة في أحجام مختلفة، والهياكل، والأنماط الظاهرية، والأداء اعتمادا على كل نسيج معين perfused. يعتمد مجال هندسة الأنسجة، الذي يهدف إلى إصلاح أو استبدال أنسجة الجسم التالفة أو المفقودة، على تكوين الأوعية الدموية الخاضع للرقابة لخلق الأوعية الدموية المناسبة داخل الأنسجة المهندسة. بدون نظام الأوعية الدموية ، لا يمكن تغذية البنى الهندسية السميكة بما فيه الكفاية ، مما قد يؤدي إلى موت الخلايا ، وسوء الحرمان ، والفشل في نهاية المطاف. وبالتالي ، فإن فهم ومراقبة سلوك الأوعية الدموية المهندسة هو تحد بارز في هذا المجال. يقدم هذا العمل نظام إنتاجية عالية يسمح بإنشاء شبكات سفن منظمة وقابلة للتكرار لدراسة سلوك السفن في بيئة سقالة ثلاثية الأبعاد. يظهر بروتوكول البذر هذا ذو الخطوتين أن الأوعية داخل النظام تتفاعل مع تضاريس السقالة ، وتقدم سلوكيات مميزة تنبت اعتمادا على هندسة المقصورة التي تتواجد فيها السفن. يمكن تطبيق النتائج التي تم الحصول عليها وفهم من هذا النظام الإنتاجي العالي من أجل إبلاغ تصاميم بناء سقالة ثلاثية الأبعاد ذات طباعة بيولوجية أفضل ، حيث لا يمكن تقييم تصنيع مختلف الأشكال الهندسية ثلاثية الأبعاد بسرعة عند استخدام الطباعة ثلاثية الأبعاد كأساس للبيئات البيولوجية الخلوية. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الفهم من هذا النظام الإنتاجي العالي لتحسين الفحص السريع للأدوية، والتطور السريع لنماذج الثقافات المشتركة، والتحقيق في المحفزات الميكانيكية على تكوين الأوعية الدموية لتعميق المعرفة بنظام الأوعية الدموية.

Introduction

مجال هندسة الأنسجة يتقدم بسرعة نحو تصنيع البنى الهندسية لتحل محل الأعضاء والأنسجة المفقودة أو التالفة1. ومع ذلك، لم يتم بعد تحقيق البنى الوظيفية بالكامل، جزئيا، لأن إنشاء شبكات الأوعية الدموية التشغيلية لتغذية الأنسجة لا يزال تحديا بارزا. دون الأوعية الدموية المناسبة، تقتصر الأنسجة المهندسة على نقل الانتشار السلبي للأوكسجين والمواد المغذية، وتقييد سمك الأنسجة قابلة للحياة القصوى إلى حد الانتشار، ما يقرب من 200 ميكرومتر2. هذه السماكة ليست مناسبة لإصلاح عيوب الأنسجة الكبيرة أو لتصنيع الأعضاء الكاملة ، مما يجعل وجود شبكة الأوعية الدموية الوظيفية سمة إلزامية للأنسجة الوظيفية والغرسة3.

يتكون نظام الأوعية الدموية من مجموعة واسعة من الأوعية الدموية ، مع أحجام مختلفة ، والأنماط الظاهرية ، والتنظيم ، ترتبط ارتباطا وثيقا بالأنسجة المضيفة. فهم السلوك والاستجابة وقرارات الهجرة التي تتخذها السفن النامية وتنبت يمكن أن يرشد اندماجها في الأنسجة المهندسة4. حاليا، النهج الأكثر شيوعا لإنشاء شبكات الأوعية الدموية في المختبر هو الجمع بين الخلايا البطانية (ECs) مع خلايا الدعم (SCs، مع القدرة على التفريق إلى خلايا جدارية)، بذر داخل بيئة صغيرة ثلاثية الأبعاد. توفر هذه البيئة إشارات كيميائية ومادية للسماح للخلايا بإرفاق الخلايا وتكاثرهاوتجميعها ذاتيا في شبكات السفن2و5و6و7و8. عندما تشارك في زراعة، SCs تفرز البروتينات مصفوفة خارج الخلية (ECM) مع توفير الدعم الميكانيكي لECs، والتي تشكل الهياكل الأنبوبية. وعلاوة على ذلك، فإن التفاعل المتبادل بين كلا النوعين من الخلايا يعزز تكوين الأنابيب، وتنبت الأوعية والهجرة، بالإضافة إلى نضوج SCs والتمايز إلى خلايا جدارية α الملساء للعضلات (αSMA)4. تتم دراسة تطوير شبكة السفن الأكثر شيوعا في بيئات ثلاثية الأبعاد تم إنشاؤها باستخدام الهيدروجيلات أو السقالات البوليمرية المسامية أو مزيج منها. يوفر الخيار الأخير بيئة صديقة للخلايا والدعم الميكانيكي المطلوب لكل من الخلايا و ECM9.

وقد تم تنفيذ قدر كبير من العمل لدراسة تطور الأوعية الدموية، بما في ذلك المشاركة في زراعة الخلايا علىالهيدروجيلس 10،hydrogels-سقالة تركيبات11،12،منصات 2D، والأجهزة microfluidic13. ومع ذلك، يمكن أن تشوه الهيدروجيل بسهولة من قبل القوات التي تمارسها الخلية14،في حين أن أنظمة 2D وmicrofluidics تفشل في إعادة بيئة أقرب إلى الطبيعة للحصول على استجابة أكثر استقراء15،16. ويمكن أن يوفر فهم كيفية تفاعل السفن المشكله مع بيئتها المحيطة رؤية حاسمة قد تسمح بتلفيق بيئات هندسية مع القدرة على توجيه تطور السفينة بطريقة يمكن التنبؤ بها. فهم ظواهر تكوين الأوعية الدموية أمر بالغ الأهمية بشكل خاص لمواكبة الظهور السريع لتقنيات التصنيع من تحت الميكرون إلى ميكرون ، مثل التصوير الحجري المجسم ، والطباعة الحجرية الرقمية الإسقاط ، وإنتاج واجهة السائل المستمر ، والكتابة النفاثة ثلاثية الأبعاد ، والحل القائم على الكتابة النفاثة الكهربائية ثلاثية الأبعاد ، وتقنيات الطباعة الحيوية الناشئة17و18و19و20و21. إن مواءمة التحكم في تقنيات التصنيع الدقيق هذه مع فهم عميق لبيولوجيا الأوعية الدموية هو المفتاح لإنشاء الأوعية الدموية المهندسة المناسبة للأنسجة المستهدفة.

هنا، نقدم نظام 3D لدراسة استجابة السفن تشكيل وتنتشر جديدة لهندسة السقالة المحيطة بها، ومراقبة أصلها تنبت والهجرة اللاحقة22. من خلال استخدام السقالات ثلاثية الأبعاد مع هندسة المقصورة تيسلاتيد ، وتقنية البذر من خطوتين ، نجحنا في إنشاء شبكات الأوعية الدموية عالية التنظيم بطريقة واضحة وسهلة التحليل. توفر الهندسة تيسلاتيد نظام الإنتاجية العالية مع وحدات فردية تحتوي على السفن التي تستجيب لبيئتهم المحلية. باستخدام ECs متعددة الألوان ، تتبعنا أصول تكوين البراعم وأنماط الهجرة اللاحقة ، المرتبطة بهندسة المقصورة وموقع SCs22.

على الرغم من أن البروتوكول المقترح قد تم إعداده لتحليل آثار الإشارات الهندسية على سلوك الأوعية الدموية ، إلا أنه يمكن توسيع هذا النهج وتطبيقه على مجموعة متنوعة من التطبيقات الجديدة. تسمح السقالة تيسلاتيد والشبكات القابلة للصور بسهولة بإجراء تحليل مباشر لمختلف تفاعل ECs و SCs ، وإضافة خلايا عضوية محددة وتفاعلها مع شبكات الأوعية الدموية ، وتأثير الدواء على شبكات الأوعية الدموية ، وأكثر من ذلك. لدينا نتائج النظام المقترح تنوعا للغاية وتصنيع بسيطة وتجهيز.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تيسلاتيد تصنيع السقالة

ملاحظة: التصوير الضوئي تقنية واسعة الانتشار تتطلب معدات متخصصة تقع عادة داخل منشأة/مختبر لتصنيع النانو. وقد تم تعميم الطريقة المنصوص عليها في هذا البروتوكول قدر الإمكان للجمهور؛ ومع ذلك، قد تكون هناك ضرورة لتغييرات طفيفة في الإجراءات اعتمادا على المعدات المتاحة للقارئ. نوصي بإجراء هذه الإجراءات في غرفة نظيفة في منشأة تصنيع النانو لضمان أعلى جودة عملية. قبل البدء، احصل على إمكانية الوصول إلى جهاز محاذاة القناع (أو بعض أجهزة إعداد التعرض للأشعة فوق البنفسجية)، ومعطف الدوران، والصحون الساخنة، ومحطة غسيل المذيبات، وقناع ضوئي، ومنظف البلازما. المذيبات والمواد الكيميائية المستخدمة في الإجراء هي خطرة، لذا يرجى اتخاذ أقصى درجات الحذر لتجنب أي التعرض للمواد الكيميائية. عند تصميم قناع ضوئي، حدد ما هي رقائق السيليكون الحجم والأقنعة الضوئية متوافقة مع المغلف الدوران وقناع المحاذاة. بالإضافة إلى ذلك، فإن المصامد الضوئي الموجود نحو حواف رقاقة السيليكون عادة ما يكون مشوها من المناولة. وبالتالي، جعل التصاميم نحو منطقة وسط رقاقة.

  1. إعداد السقالات باستخدام تقنية التصوير الضوئي مع الهندسة المختارة من الفائدة.
    1. قبل طلاء تدور، وتنظيف رقاقة السيليكون. ويمكن القيام بذلك مع تنظيف البلازما أو تقنية القائمة على المذيبات. إذا تنظيف البلازما، اتبع الإجراء التشغيلي القياسي للجهاز للحصول على تفاصيل التشغيل. رش مع غاز النيتروجين المضغوط وفحص رقاقة للتأكد من أنها خالية من الحطام قبل تدور الطلاء. هذه الرقاقة ستكون بمثابة الركيزة التي يتم إنشاء السقالات عليها.
      ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج ابدأ مع رقاقة جديدة. يمكن إعادة استخدام رقائق ولكن ينبغي أن تكون خالية من الاحتراس الضوئي القديم، والعيوب السطحية والحطام. من المفيد استخدام الملقط الرقائقي للتعامل معها.
    2. مركز رقاقة السيليكون على تشاك تدور coater باستخدام دليل. تدور لفترة وجيزة رقاقة لضمان أنه قد تركزت بشكل صحيح على تشاك، وضبط حسب الضرورة حتى تركزت بشكل صحيح. يجب أن يتم ذلك في كل مرة يتم فيها وضع رقاقة على المغلف الدوراني. الاستغناء عن 1-4 مل من كاشف الإقلاع على رقاقة (وهذا سوف يعتمد على حجم رقاقة). ما يقرب من 2 مل من كاشف الإقلاع يعمل بشكل جيد لرقائق 4 بوصة.
      1. تعيين سرعة انتشار تدور coater في 500 دورة في الدقيقة لمدة 5 ثوان، وتدور السرعة إلى 1000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية، ثم تدور كاشف الإقلاع. تفقد رقاقة للتأكد من أنه يحتوي على طلاء حتى عبر رقاقة. أي حطام يترك على الرقاقة سيكون واضحا جدا في هذه المرحلة أي سقالات في منطقة مع الحطام من المرجح أن تكون غير صالحة للاستعمال. بعد طلاء تدور، ونقل إلى لوحة ساخنة وخبز لمدة 1 دقيقة في 200 درجة مئوية.
    3. كرر الخطوة السابقة مرتين أخريين لما مجموعه ثلاثة طلاءات.
    4. تدور معطف كاشف رفع قبالة رقاقة السيليكون المغلفة مع SU-8 2050 الضوئية حتى الحصول على سمك ما يقرب من 100 ميكرومتر.
      1. الاستغناء عن 1 مل من مقاومة لكل 25 ملم من قطر الركيزة.
        ملاحظة: كن حذرا لتجنب الفقاعات أثناء صب المقاومة. ل SU-8 2050، صب ما يقرب من دائرة قطرها 2 بوصة، عند استخدام رقاقة السيليكون 4 بوصة يعمل بشكل جيد.
      2. تدور معطف SU-8 2050. انتشار بسرعة 500 دورة في الدقيقة لمدة 5 ثوان، تليها سرعة دوران بين 1700 إلى 1800 دورة في الدقيقة لتحقيق سمك 100 ميكرومتر تقريبا.
      3. اختياري:بعد الغزل، وترك رقائق المغلفة تدور إلى إزالة الغاز بين عشية وضحاها على سطح مستوى محمية من الضوء قبل قبل خبز. وهذا قد يساعد على تخليص مقاومة أي فقاعات والسماح للعيوب إلى مستوى.
        ملاحظة: يمكن أن تختلف السماكة الفعلية للمقاومة والسقالات الناتجة مع خطأ المستخدم ومعلمات المعدات. لذلك ، يجب التحقق من سمك السقالات لاحقا ، في الخطوة 1.6. تعديل إجراءات الطلاء تدور وفقا لذلك لتحقيق سمك المطلوب.
    5. قبل التعرض، قبل خبز رقائق في 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ثم 95 درجة مئوية لمدة 40-50 دقيقة. قبل التعرض، اختبر سطح المقاومة بالضغط على الحافة باستخدام زوج من الملاقط لضمان أنها لم تعد مبتذلة / لزجة. من المفيد سحب الرقاقة من الطبق الساخن والسماح له بالتبريد لمدة 0.5-1 دقيقة قبل تقييم التافهة.
      ملاحظة: قد تساعد أوقات درجات الحرارة البطيئة (التدفئة والتبريد) على منع تزييف السقالات.
  2. تعريض مقاومة للضوء للأشعة فوق البنفسجية (350-400 نانومتر) من خلال قناع ضوئي مع طاقة التعرض من 215-240 ملليجول / سم2 لسمك مقاومة من 85 -110 ميكرومتر. راجع إرشادات الشركة المصنعة لأخصائية الكواتر الضوئية للارتباطات الموصى بها لسمك الطاقة.
    1. تأكد من معايرة التعرض بشكل صحيح بحيث يتم التحقق من الطاقة. ضبط وقت التعرض حسب الضرورة لتحقيق طاقة التعرض المطلوبة. وعلاوة على ذلك، قد تسمح أجهزة محاذاة القناع بأوضاع تعرض مختلفة: الاتصال الفراغي، والاتصال الثابت، والاتصال الناعم، والاتصال عن قرب (قد تختلف المصطلحات المحددة). بشكل عام، ستؤثر هذه الدقة ومحاذاة المعالم. استخدم المؤلفون عادة وضع "الاتصال الثابت".
    2. بالنسبة للمعالم الصغيرة أو الطبقات المتعددة، حيث ستكون المحاذاة مهمة، فكر في أوضاع التعريض الضوئي وإجراءات محاذاة القناع بعناية أكبر. تأكد من النظر في ارتفاع مقاومة عند ضبط قيمة سمك. راجع إجراءات التشغيل القياسية لصفيح القناع للحصول على تفاصيل العملية.
      ملاحظة: تصميم قناع ضوئي سيحدد حجم السقالات، هندسة المقصورة، وعدد السقالات التي تم الحصول عليها لكل دفعة. استخدام الزجاج الصلب أو قناع ضوئي الكوارتز سوف تسفر عن أعلى دقة. ومع ذلك، يمكن استخدام قناع ضوئي شفاف البوليمر لينة عموما لهذه الأحجام ميزة كبيرة (>10 ميكرومتر). قد يؤدي استخدام قناع ضوئي للفيلم إلى ميزات طوبوغرافية على طول محور z لمسام السقالة نتيجة لضعف دقة الميزة. قد يكون لهذا تأثير على سلوك الخلية. تحقق من القرار المطلوب التشاور مع كل من ينتج قناع ضوئي لضمان تحقيق القرار المطلوب.
  3. خبز رقاقة مباشرة بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية في 65 درجة مئوية لمدة 2-5 دقائق ثم في 95 درجة مئوية لمدة 8-10 دقائق.
  4. تطوير السقالات لإزالة مقاومة غير متطورة.
    1. تزج السقالات باستخدام حجم منخفض من SU-8 حل المطور لمدة 7-10 دقائق لإذابة أي مقاومة غير المطورة.
    2. شطف مع الكحول ايزوبروبيل (IPA).
    3. رقاقة جافة مع النيتروجين المضغوط.
      ملاحظة: كن حذرا خلال الخطوة 1.4 لعدم التسبب في الإفراج المبكر عن السقالات. كميات منخفضة من المطور والتعامل لطيف ضرورية لتحقيق ذلك.
  5. بعد التطوير، من الصعب خبز رقائق في 150 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: بعد خبز الثابت، إيقاف hotplate للسماح الرقاقات لتبرد ببطء شديد قد يكون من المفيد في منع تزييف / الشباك من السقالات النهائية.
  6. اختياري: بعد الخبز الصلب وقبل الإقلاع، تقييم سمك السقالة منذ السقالات لا يزال ينبغي أن تلتزم بلطف إلى سطح رقاقة. لهذا الإجراء، الاتصال profilometry يعمل بشكل جيد; ومع ذلك، يمكن استخدام أي طريقة مناسبة.
  7. ارفع السقالات من الرقاقة
    1. غمر السقالات في مطور SU-8 لجعلها ترفع الرقائق على الفور. إذا لم ترفع السقالات ، فادفع السقالات برفق مع زوج من الملاقط.
    2. إزالة المطور الزائد.
    3. نقل السقالات في حاوية جديدة وتغمر في الكحول isopropyl. شطف في وكالة الألعاب الشعبية لمدة لا تقل عن 6 مرات لضمان إزالة جميع المطور.
  8. الهواء يجفف السقالات لمدة أسبوع على الأقل قبل الاستخدام.

2. سقالة طلاء فيبروكتين

  1. للتطهير، غمر السقالات في الإيثانول 70٪ (v/v) لمدة لا تقل عن 15 دقيقة، وغسل 2 مرات في الفوسفات المالحة المخزنة (PBS) قبل الاستخدام.
    تنبيه: السقالات SU-8 ضعيفة ويمكن كسرها بسهولة. ينصح بالمعالجة باستخدام ملقط حاد ومتعرج ، ويجب التعامل معها بعناية فائقة. يمكن تحقيق سهولة التعامل عن طريق غمر السقالات في السائل ، لتجنب التفاعلات الكهروستاتيكية بين السقالات والسطح.
  2. إعداد تخفيف 50 ميكروغرام / مل من فيبروكتين الإنسان في برنامج تلفزيوني وتغطية السقالات عن طريق امتصاص البروتين.
    1. مزيج 1.5 ميكرولتر من محلول الأسهم فيبروكتين (1 ملغ / مل) مع 28.5 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لكل سقالة لتكون البذور. ويفضل، وإعداد واحد فقط فيبروكتين تخفيف لاستخدامها لجميع السقالات لتجنب أخطاء الأنابيب.
      1. ل10 سقالة, مزيج 15 ميكرولتر من الأسهم فيبروكتين حل في 285 μL من برنامج تلفزيوني, تصل إلى ما مجموعه 300 ميكرولتر من 50 ميكروغرام / مل فيبروكتين تخفيف.
    2. ضع السقالات بشكل متفرق فوق سطح مسعور (أي زراعة غير نسيجية (nonTC) طبق 10 سم) وقم بتغطية كل سقالة ب 30 ميكرولتر من تخفيف فيبروكتين المعد في الخطوة 2.2.1.
      تنبيه: تأكد من عدم وجود فقاعات محاصرة في مقصورات السقالات. إذا كانت الفقاعات موجودة ، يمكن إزالتها عن طريق هز السقالة بلطف داخل القطرة أو الأنابيب الخفيفة.
    3. استبدل غطاء اللوحة وضع السقالات المغطاة بالفيبروكتين في حاضنة مع 37 درجة مئوية ورطوبة 100٪ لمدة ساعة على الأقل.
    4. بعد الحضانة، شطف طفيفة السقالات في برنامج تلفزيوني لإزالة بقايا فيبروكتين. يمكن الاحتفاظ السقالات في برنامج تلفزيوني في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع قبل الاستخدام.

3. الخلايا البطانية البذر

  1. إعداد المتوسطة EC عن طريق خلط المتوسط القاعدي مع مكوناته مجموعة متوسطة مراسل, بما في ذلك محلول مضاد حيوي (القلم / ستريب), مصل الأبقار الجنين (FBS), ومكملات نمو الخلايا البطانية, كما هو مبين من قبل الشركة المصنعة.
  2. جعل تعليق الخلية البطانية الأوعية الدموية الدقيقة الدهنية البشرية (HAMEC) في وسط المفوضية الأوروبية مع تركيز 4 × 106 خلايا / مل.
    ملاحظة: يمكن إجراء التصوير في الوقت الحقيقي إذا تم إعادة إصابة الخلايا البطانية المستخدمة سابقا للتعبير عن بروتين فلوري ، أو ملطخة مسبقا باستخدام صبغة غشاء سيتوبلازمي غير سامة (يشار إليها كذلك باسم ECs).
  3. باستخدام ملقط، ضع سقالة واحدة مغلفة فيبروكتين لكل بئر على لوحة غيرTC 24-well well.
  4. تغطية كل سقالة مع 25 قطرات ميكرولتر من تعليق HAMEC. حذار عدم السماح للتعليق تدفق بعيدا عن السقالة، لأنه يمكن أن يعوق الالتصاق الخلية.
  5. ضع الغطاء على اللوحة وضعه في حاضنة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 و 100٪ رطوبة. دع الحضانة لمدة لا تقل عن 60 دقيقة وبحد أقصى 90 دقيقة.
    ملاحظة: أثناء الحضانة، يؤدي وضع اللوحة على شاكر مداري داخل الحاضنة إلى تحسين ارتباط الخلية بجدران السقالة. يجب تعيين شاكر المداري في ما لا يزيد عن 5 دورة في الدقيقة.
  6. بعد الحضانة، ملء كل بئر مع 700 ميكرولتر من المتوسطة EC باستخدام ماصة.
    ملاحظة: نتوقع أن نرى ECs في الجزء السفلي من البئر، لأن بعض الخلايا لا نعلق على سقالة وتسقط من خلال الفراغات سقالة.
  7. احتضان السقالات البطانية حتى يمكن ملاحظة التقاء EC باستخدام المجهر الفلوري على جدران السقالة (عند استخدام ECs المسمى) ، أو لمدة 3 أيام (عند استخدام ECs غير المسمى) ، مما يوفر وقتا كافيا لتحقيق التقاء EC. تغيير المتوسطة كل يومين.

4. دعم بذر الخلايا والثقافة المشتركة

  1. إعداد الخلايا الجذعية لب الأسنان (DPSC) المتوسطة (DPSCm) عن طريق خلط 500 مل من متوسط النسر المعدلة Dulbecco منخفضة الجلوكوز (منخفضة الجلوكوز DMEM)، 57.5 مل من FBS، 5.75 مل من الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA)، 5.75 مل من الغلوتاماكس، و 5.75 مل من محلول البنسلين-العقدية-النيستاتين.
  2. نقل السقالات البطانية إلى لوحة جديدة غيرTC 24 جيدا لتجاهل ECs تعلق على أسفل الآبار باستخدام ملقط.
    1. تجاهل جميع الوسائط من اللوحة الحالية باستخدام ماصة 1 مل، أو شفط الفراغ. يجب الحرص على عدم تطبيق فراغ مباشرة على السقالة.
    2. ضع سقالة واحدة لكل بئر ، ويفضل أن تكون في وسط البئر لتجنب تشغيل السائل نحو الجدران بسبب آثار التوتر السطحي. جفف المنطقة المحيطة بالسقالة مع فراغ خفيف ولكن تجنب التجفيف الكامل للسقالة.
  3. إعداد تعليق DPSC في حل ما قبل هلام الفيبرين.
    1. تمييع thrombin وحلول الأسهم الفيبرينوجين مع برنامج تلفزيوني حتى الحصول على تركيز النهائي من 5 U / مل و 15 ملغ / مل، على التوالي.
    2. إعداد تعليق 8 ×10 6 DPSC / مل في تخفيف 5 U / مل thrombin وتوزيعها في eppendorfs الفردية 12.5 ميكرولتر من تعليق وقال لكل سقالة لتكون المصنف.
    3. تعيين ماصة 5-50 ميكرولتر (أو ما شابه ذلك) إلى 12.5 ميكرولتر وملئه مع محلول الفيبرينوجين 15 ملغ / مل.
    4. دون إزالة طرف، تعيين ماصة إلى 25 ميكرولتر. يجب أن ترتفع المادة الموجودة في الطرف وتترك حجما فارغا نحو فتحة الطرف.
    5. اضغط ببطء على زر المكبس حتى يصل السائل إلى فتحة الطرف ولكن لا يتسرب. عقد المكبس في هذا الموقف ووضع غيض في واحدة من أنابيب الطرد الدقيق التي تحتوي على الخلايا في تعليق الثرومبين، والتأكد من طرف على اتصال مع السائل.
      تنبيه: سيبدأ الربط العرضي للفيبرين مباشرة بعد ملامسة الثرومبين والفيبرينوجين. وينبغي أن تتم الخطوة التالية بسرعة.
    6. حرر زر المكبس برفق وارسم تعليق الخلية في الطرف. مزيج تماما كل من المواد، وتجنب تشكيل فقاعة.
  4. الاستغناء بسرعة المواد المختلطة على رأس سقالة البطانية. كرر الخطوات السابقة لكل سقالة، مع التأكد من تغيير النصائح دائما بين الاستخدامات لتجنب تشكيل هلام الفيبرين غير متوقع داخل الطرف.
  5. استبدل غطاء اللوحة واحتضن السقالات عند 37 درجة مئوية و5٪ CO2 ورطوبة 100٪ لمدة 30 دقيقة.
  6. بعد الحضانة، ملء كل بئر مع 1 مل من 1:1 DPSC و EC المتوسطة.
    1. الثقافة لمدة أسبوع واحد ، وتغيير المتوسطة كل يومين.
    2. أثناء الثقافة، قم بإزالة الوسط من البئر وصورة البنى باستخدام مجهر كونفوجكال في نقاط زمنية مختلفة لدراسة تطور الأوعية الدموية أو أي معلمة أخرى ذات أهمية.
      ملاحظة: يمكن تنفيذ هذه الخطوة فقط إذا تم إجراء التجربة باستخدام ECs المسمى. انظر الخطوة 6 - ملاحظة لمزيد من التوضيح.

5. تلطيخ immunofluorescent لعلامات الأوعية الدموية المميزة

ملاحظة: يمكن تنفيذ الخطوات التالية في الآبار نفسها حيث تم cultured الإنشاءات. من المهم التأكد دائما من أن الحلول تغطي السقالات تماما. وعلاوة على ذلك، عند الإمكان، ينصح تنفيذ الخطوات على شاكر المداري، وإن لم يكن إلزاميا.

  1. في اليوم السابع، تخلص من الوسائط من الآبار وشطف السقالات بإضافة برنامج تلفزيوني إلى الآبار، وإزالتها باستخدام الفراغ.
  2. إصلاح السقالات بإضافة 4٪ بارافورمالديهايد لمدة 20 دقيقة. يغسل في PBS 3 مرات، 5 دقائق لكل غسل.
  3. Permeabilize الخلايا الثابتة باستخدام 0.3 ٪ تريتون العاشر في برنامج تلفزيوني (الخامس / الخامس) لمدة 15 دقيقة. يغسل في PBS 3 مرات، 5 دقائق لكل غسل.
  4. إعداد 5٪ ألبوم مصل البقر (BSA) في برنامج تلفزيوني (ث / الخامس) حل حجب وتغطية السقالات. يترك في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
    ملاحظة: جميع المبالغ الحل المطلوب سوف تعتمد على عدد من السقالات لتكون ملطخة. إعداد الحلول حسب الحاجة الحفاظ على التركيزات المذكورة.
  5. إعداد وتطبيق الأجسام المضادة الأولية تلطيخ الحل.
    1. تمييع أرنب المضادة فون Willebrand عامل (vWF) الأجسام المضادة 1:150 والفأر المضادة SMA الأجسام المضادة 1:50 في حل حظر جديدة.
      ملاحظة: يمكن استخدام علامات الخلايا البطانية الأخرى، مثل CD31 أو VE-Cadherin.
    2. تغطية السقالات مع حل الأجسام المضادة الأولية والحفاظ على 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. اغسل في PBS ثلاث مرات، 5 دقائق لكل غسل.
  6. إعداد وتطبيق الأجسام المضادة الثانوية تلطيخ الحل.
    1. تمييع الماعز المضادة للفأرة Cy3 الأجسام المضادة 1:150 والماعز المضادة للأرانب اليكسا فلور 488 1:400 في برنامج تلفزيوني.
    2. تغطية السقالات مع حل الأجسام المضادة الثانوية واحتضان لمدة لا تقل عن 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة، أو في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. اغسل 3 مرات في PBS، 5 دقائق لكل غسل. الحفاظ على سقالة ملطخة في 0.3٪ PFA في برنامج تلفزيوني (v/v) لمدة تصل إلى شهر.

6. سقالة التصوير confocal وتحليل تطوير الأوعية

ملاحظة: يمكن تنفيذ الخطوات التالية على السقالات الثابتة والملطخة عند النقطة الزمنية النهائية المختارة أو، إذا تم استخدام الخلايا الفلورية، أثناء فترة ثقافة الخلية دون الحاجة إلى إنهاء التجربة. وبالنسبة لهذه الأخيرة، يوصى بتحديد نقاط زمنية محددة؛ يظهر هذا العمل اليوم 0 (قبل البذر SCs)، والأيام 1 و 3 و 5 و 7 بعد البذر SCs(الشكل 3A).

  1. صورة السقالات باستخدام المجهر confocal مع عدسة 5X والتكبير من 0.5 ومجموعة z الكامل من السقالة. سيسمح هذا بالتقاط 9 مقصورات منفصلة للهندستين التربيعية والتعميمية ، أو 8 مقصورات كاملة للهندسة السداسية. صورة إشارة الفلورسنت والضوء المرسلة، للحصول على كل من هيكل شبكة السفينة وهندسة المقصورة(الشكل 3A).
  2. باستخدام ImageJ (أو أي برنامج معالجة صور آخر)، قم بقص كل مقصورة فردية؛ لهذه العملية، فقط علامات شبكات الأوعية الدموية هي ذات الصلة. إزالة أي وعاء لا يقع داخل منطقة المقصورة. إنشاء إسقاط كثافة الحد الأقصى وحفظ كل مقصورة اقتصاص الفردية كصورة TIFF.
    1. في ImageJ، اضغط على ملف > فتح وحدد صورة TIFF المطلوبة التي تحتوي على عدة مقصورات. يجب أن تحتوي الصورة على قناتين على الأقل، شبكة المراكب الفلورية، والصورة الضوئية المرسلة.
    2. من شريط الأدوات، حدد أداة تحديد المضلع. حدد قناة الضوء المرسلة. انقر على واحدة من زوايا المقصورة سداسية، في واجهة بين منطقة المقصورة وجدار السقالة، وهذا سوف تبدأ تعريف القناع. استمر في النقر على الزوايا التالية بترتيب تسلسلي حتى يتم تحديد الزاوية الأولية، وإغلاق القناع.
      ملاحظة: ينطبق هذا التفسير على حجرة سداسية. عندما تكون المقصورة إما مربعة أو دائرية، استخدم أدوات المستطيل أو البيضاوي، على التوالي، لإنشاء قناع مناسب. بغض النظر عن الشكل، تناسب دائما قناع لمتابعة الجدار الداخلي للسقالة.
    3. انقر على تحليل أدوات > > مدير عائد الاستثمار. في مدير عائد الاستثمار (ROI، منطقة الاهتمام)، انقر فوق الزر إضافة لحفظ القناع الذي تم إنشاؤه. سيظهر القناع الجديد في قائمة الجانب الأيسر. تسمح هذه الخطوة للتحليل أن يكون متسقا بين الصور المختلفة.
      ملاحظة: في مدير ROI، فمن الممكن لحفظ ملف مع جميع الأقنعة التي تم إنشاؤها عن طريق النقر على المزيد من > حفظ. في إطار حفظ التحديد، اختر اسما وموقعا، واحفظ الملف .roi. لاسترداد القناع، في مدير عائد الاستثمار، انقر على المزيد من > فتح واختيار الملف المطلوب .roi.
    4. حدد صورة شبكة السفينة الفلورية وانقر على تحرير > واضح خارج. ستبقى الصورة الموجودة في القناع فقط، بينما سيتم القضاء على الباقي.
    5. مع صورة شبكة مسح مفتوحة، انقر على صورة > مكررة. في الإطار المنبثق مكررة، اكتب اسم الصورة. إذا تم تحديد hyperstack مكررة، إلغاء تحديده وانقر فوق موافق. سيتم إنشاء صورة جديدة تحتوي فقط على شبكات السفن الفلورية المزروعة.
    6. حفظ الصورة اقتصاص بالنقر على ملف > حفظ كما > Tiff. اختر الاسم والدليل وانقر فوق موافق.
  3. تحليل تطور الأوعية الدموية على الصور اقتصاص.
    1. تحميل وتثبيت البرمجيات التحليلية الحرة AngioTool، الذي يوفر أدوات كمية لتحديد مجموعة متنوعة من المعلمات الأوعية الدموية. يمكن الحصول على البرنامج من العنوان التالي https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home.
    2. تعيين قيمة مقياس الصور للحصول على نتائج في وحدات ملليمتر وتحميل صورة.
      1. انقر على علامة التبويب الإعداد وملء المسافة بالبكسل والمسافة في مم مع القيم التمثيلية من الصور التي تم التقاطها. باستخدام معلمات التصوير المذكورة أعلاه، تبلغ القيم المطلوب تعبئتها 400 بكسل لكل 1 مم.
      2. اضغط على الزر فتح الصورة واستعرض الصورة التي تهمك.
    3. اختر معلمات التحليل لتحديد كمية تطوير السفن في علامة التبويب تحليل.
      1. تحت قطر السفينة وكثافة المجال، إلغاء تحديد أي علامة الحالية من محدد النطاق العلوي، وتفعيل علامة تمثل عدد 3.
      2. تحت قطر السفينة وكثافة المجال، على محدد النطاق السفلي، نقل علامة النطاق السفلي إلى 60، وترك صانع الحارس عالية في 255.
      3. قم بتنشيط مربع إزالة الجسيمات الصغيرة وقم بتعيين العلامة إلى 100.
      4. ضمن الحقل حفظ التفضيلات، حدد اسم وموقع ملف ورقة الانتشار الذي سيتم حفظ النتائج فيه واضغط على زر تشغيل التحليل. إذا تم تحديد مربع صورة حفظ النتيجة، سوف Angiotool توليد وحفظ صورة JPEG جديدة تظهر المعلمات شبكة السفينة كميا.
        ملاحظة: لكل تحليل تنفيذ دون تغيير اسم ملف ورقة انتشار، سيتم إضافة صف جديد في الجزء السفلي من الملف، مع نتائج المكتسبة حديثا.
  4. تنظيم البيانات وتشغيل تحليل إحصائي.
    1. بالنسبة لجميع الصور المعالجة، اختر المعلمة ذات الأهمية من ورقة الانتشار (مثل إجمالي طول السفينة ومنطقة السفينة)وادخلها في برنامج تحليل إحصائي لدراسة النتائج التي تم الحصول عليها بشكل صحيح(الشكل 3C).

7. التصوير الفاصل الزمني لاكتشاف المنشأ وتتبع الهجرة

  1. بدلا من ذلك، لزراعة السقالات في الحاضنة كما هو موضح في الخطوة 4.6، تعيين غرفة ثقافة المجهر confocal إلى 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 و 100٪ الرطوبة.
    1. ضع اللوحة التي تحتوي على السقالات المصنفة بالكامل في غرفة المجهر الكونفوجكال وحدد معلمات التصوير للقيم المطلوبة.
    2. تعيين الفاصل الزمني لالتقاط الصورة إلى 30 دقيقة، وإجمالي وقت التصوير 72 ساعة. وهذا سيمكن من تشغيل الفاصل الزمني تماما دون الحاجة إلى تغيير متوسط.
      تنبيه: في حالة الرغبة في تصوير الفاصل الزمني الأطول، يجب إجراء معايرة موقف دقيق لتكون قادرة على استرداد موقع التصوير الأصلي، لأن التغييرات المتوسطة تتطلب إزالة لوحة من حاضنة confocal وإلى غطاء محرك السيارة البيولوجية العقيمة.
      ملاحظة: سيبدأ انفصال المركبات من جدران السقالة وتشكيل الهياكل الأنبوبية في غضون الساعة الأولى بعد بذر مركبات الكربون الهيدروفلورية (الخطوة 4) وقد يستغرق إكماله ما يصل إلى 50 ساعة. بعد تشكيل الأنبوب الأولي ، ستبدأ براعم جديدة في الهجرة إلى المقصورة من السفن المحيطة بها. سوف تنتشر وإعادة عرض الشبكة اللاحقة تستمر طوال التجربة تقريبا حتى اليوم 10، عندما تصبح شبكات السفن مستقرة22. استخدم هذه المعلومات لاختيار نقطة البداية الفاصل الزمني وخطوة الوقت وفقا لذلك.
  2. حفظ ملف الفيلم الفاصل الزمني الكامل كتسلسل TIFF.
  3. افتح ImageJ وانقر فوق ملف > استيراد تسلسل > الصورة وحدد الملفات. سيؤدي هذا إلى فتح تسلسل TIFF كفيلم.
  4. فتح دليل تتبع البرنامج المساعد عن طريق النقر على الإضافات > التتبع اليدوي. سيؤدي هذا إلى فتح إطار التتبع.
  5. مراقبة الفيلم وحدد السفينة ليتم تعقبها. انتبه إلى أصلها وهجرتها.
  6. تنشيط مربع إظهار المعلمات وإدخال 30 دقيقة للفاصل الزمني. تعتمد معايرة x/y على مقدار البكسل الذي تم تحديده أثناء التصوير.
  7. المضي قدما لتتبع يدويا السفن تنبت من كفاف سقالة.
    1. اضغط على الزر إضافة مسار. في الإطار الأول للفيلم، اضغط على موقع السفينة ليتم تعقبها. بعد ذلك، سيتم تغيير الفيلم إلى الإطار التالي تلقائيا.
    2. انقر على صورة الإطار الثاني حيث يقع السفينة. مرة أخرى، سيتم تغيير الفيلم إلى الإطار التالي تلقائيا.
    3. المضي قدما مع نفس السفينة حتى يتم الانتهاء من تتبع الهجرة الكامل.
    4. في إطار التتبع، انقر فوق تراكب النقاط والخطوط لطبع مسار مرئي لترحيل السفينة على الفيلم. سيؤدي ذلك إلى فتح نسخة من الفيلم مع نقطة تمثل الموضع الحالي للمتعقب ، وخط يظهر المسار السابق.
    5. انقر على زر نهاية المسار لإنهاء تسجيل حركة السفينة الحالية.
    6. انقر على زر إضافة المسار مرة أخرى لتبدأ من جديد مع سفينة جديدة. عند القيام بذلك، فإن علامات الخط والنقطة تغير لونها تلقائيا للسفينة الجديدة. كرر حتى يتم تعقب جميع السفن المطلوبة.
      ملاحظة: يمكن استرجاع الموقع x/y وسرعة السفينة والمسافة المنقولة من نتائج النافذة المنبثقة. سيتم تحديد كل سفينة من خلال رقم مسارها في العمود الموجود في أقصى اليسار. يمكن نسخ هذه البيانات ولصقها في ورقة انتشار لإجراء مزيد من التحليل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

البروتوكول المقدم، وذلك باستخدام تقنيات التصوير المجسم، يسمح لتصنيع السقالات تيسلاتيد مصنوعة من SU-8 الضوئي. تم الحصول على السقالات مع هندسات مقصورة متميزة (المربعات ، السداسي ، والدوائر) ، وميزات دقيقة للغاية وقابلة للتكرار(الشكل 1).

Figure 1
الشكل 1:صور المجهرالإلكتروني المسح التمثيلي للمربع تيسلاتيد، دائرية، والهندسة سقالة سداسية (شريط مقياس = 500 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مع بذر الخلايا التدريجي (الخطوات 2 إلى 4) ، تم استخدام السقالات المصنعة لإنشاء شبكات الأوعية الدموية عالية التنظيم. وعند استخدام البذر التقليدي المتزامن لكل من البلدان النامية ومركبات الكربون الهيدروفلورية، تفتقر السفن الناتجة عن ذلك إلى تنظيم واضح. لهذا، تم تنفيذ طلاء فيبروكتين سقالة (الخطوة 2)، تم تخطي خطوة بطانة السقالة (الخطوة 3)، وDPSC وHAMEC في وقت واحد شارك في المصنف في هلام الفيبرين (الخطوة 4). بهذه الطريقة ، يتم توزيع الخلايا بشكل متجانس على السقالة(الشكل 2، الصف العلوي) ، مما يؤدي إلى شبكات الأوعية الدموية المتقدمة غير المتوقعة وغير المنظمة التي لا يبدو أنها تتفاعل مع السقالة المحيطة بها. على العكس من ذلك ، أولا البذر ECs على جدران السقالة يوفر دقيقة الأولية نمط الخلية البطانية. إضافة في وقت لاحق من SCs داخل هلام الفيبرين النتائج في ظاهرة tubulogenesis يمكن التنبؤ بها، مع تشكيل السفن عن كثب بعد شكل جدار السقالة، وتنبت السفن الجديدة المهاجرة إلى مساحة المقصورة(الشكل 2،الصف السفلي).

Figure 2
الشكل 2: مقارنة الأوعية الدموية بين البذر الخلية في وقت واحد مقابل stepwise. صور تمثيلية لتطور الأوعية الدموية في السقالات تيسلاتيد لزرع الخلية في وقت واحد (الصف العلوي) من ECs (الأحمر) وSCs (الأخضر)، وخطوة الحكمة البذر الخلية (الصف السفلي) في اليومين 1 و 5. ينتج عن البذر التدريجي شبكات الأوعية الدموية المنظمة التي تتبع جدران السقالة وتنبت في مساحة المقصورة (شريط المقياس: 100 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

عند استخدام المركبات الفلورية، إما متحولة أو مصبوغة، يمكن تصوير السفن في الوقت الحقيقي دون الحاجة إلى إصلاح وإنهاء التجربة لكل نقطة زمنية. البروتين الفلوري الأحمر الذي يعبر عن ECs (RFP-ECs) تم استزراعه على السقالات سداسية اللون وتم تصويره بعد البذر(الشكل 3A، اليوم 0). في اليوم الأول، أضيفت المركبات المفلورة وصورت شبكات الأوعية الدموية كل يومين لتحديد حجم تطور الأوعية(الشكل 3A، الأيام 1 و 3 و 5 و 7). لكل نقطة زمنية ، تم التقاط صور واسعة من السقالة بأكملها (الشكل 3B). وفي كل مقصورة، كانت السفن تنظم وتتفاعل أساسا مع الزنزانات الموجودة داخل حبسها. ومن ثم، تم عزل كل مقصورة وأزيلت السفن الزائدة عن الحاجة خارج المقصورة باستخدام ImageJ. ثم تم تحليل الصور النظيفة ذات المقصورة الواحدة باستخدام Angiotool. أعاد Angiotool ملف ورقة انتشار يحتوي على معلمات سفينة عدة ، وتمثيل مرئي لخصائص الشبكة الرئيسية ، مثل الهيكل العظمي ونقاط التقاطع وسطح السفينة. تم تحليل البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام برنامج التحليل الإحصائي Prism ، ولوحظ نمو واضح في الأوعية لإجمالي طول السفينة ومنطقتها خلال الإطار الزمني للتجربة(الشكل 3C). وخلال تجربة 1 أسبوع، من المتوقع أن تزيد السفن من تطويرها وتوسيع نطاقها كما هو مبين في الشكل 3A والشكل 2C. ويمكن تفسير انخفاض طول السفينة أو مساحتها، أو عدم تكوين السفن بحلول اليوم الثالث، أو السفن التي تتشكل كما هو مبين في الصف العلوي من الشكل 2، على أنها تجارب فاشلة.

Figure 3
الشكل 3:صور التنمية التمثيلية وتحليل شبكات الأوعية الدموية المنظمة. (أ) ECs (أحمر) تصل إلى التقاء على جدار السقالة التي يتم بذرها بعد ذلك SCs؛ تمثل إضافة SCs اليوم 0 من التجربة. في اليوم الأول بعد بذر المركبات الخاصة، تنفصل المركبات البيئية إلى مساحة المقصورة وتبدأ في تشكيل السفن التي ستستمر في النبت والاتصال في أيام أخرى. (ب)خطوات معالجة الصور Confocal لتحليل شبكة الأوعية الدموية (1) يتم أخذ صورة confocal واسعة تحتوي على عدة مقصورات، (2) يتم اقتصاص مقصورة واحدة (demarked بواسطة سداسي أبيض متقطع)، (3) ثم يتم فصل قناة شبكة الأوعية الدموية، ويتم اقتصاص جميع السفن خارج جدران المقصورة. يتم تحليل صورة المقصورة المفردة باستخدام Angiotool ، مع إرجاع قائمة المعلمات الوعائية المكملة بعلامات بصرية ، مثل منطقة السفينة (المبينة باللون الأصفر) ، وطول الأوعية (المعروضة بخطوط خضراء) ، ونقاط التقاطع (التي تم وضع علامة عليها كنقاط زرقاء). (ج)النتائج المقارنة لإجمالي طول السفينة وإجمالي مساحة السفينة داخل مقصورات سداسية في نقاط زمنية مختلفة (تقدم النتائج على أنها متوسط ± SD، n > 6؛ جميع أشرطة المقياس: 200 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

باستخدام ECs متعددة الألوان لتسهيل تحديد خلية واحدة ، تم تنفيذ فاصل زمني للتصوير البؤري للسماح بتتبع سفينة واحدة(فيديو تكميلي 1). وقد لوحظت السفن وتتبع باستخدام دليل تتبع ImageJ البرنامج المساعد. تم اختيار الخلية تلميح لكل إطار من الفيلم (الشكل 4A) حتى anastomosed السفينة مع الأوعية المحيطة بها. ونتيجة لذلك، فإن البرنامج المساعد تتبع دليل ولدت مسار السفينة في الوقت الحقيقي، والتي سمحت لمراقبة هجرة السفينة (الشكل 4B).

Figure 4
الشكل 4: ممثل تنبت تتبع السفينة. (أ) يتم استخدام ECs متعددة الألوان (الأخضر والأحمر والأزرق) الفاصل الزمني لتسهيل تحديد سفينة واحدة. يتم تحديد سفينة تنبت وتتبع باستخدام البرنامج المساعد ImageJ تتبع يدوي. يتم وضع علامة على الجانب النهائي من السفينة لكل نقطة زمنية لتتبع في الوقت الحقيقي; تمت إضافة علامة الأسود في الأبيض لإظهار نقطة نهاية السفينة المحددة. (ب) تتبع 2D الناتجة من السفينة، كما معالجتها من قبل البرنامج المساعد ImageJ، تبين أبعد نقطة مع نقطة، والمسار شكلت مع خط (شريط مقياس = 200 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ويمكن ملاحظة نضوج السفن، ممثلة بوجود مركبات SMA+ SCs، بسهولة في المنصة المقترحة. Vasculatures تقديم أعداد أكبر من SMA + SCs تمثل شبكة أكثر نضجا، منذ التعبير SMA يرتبط مع استقرار السفينة مع مرور الوقت23. بالنسبة للمقصورات الدائرية سداسية الأضلاع والمربعة، يزيد مقدار SMA+ SCs بمرور الوقت(الشكل 5A). بحلول اليوم الثالث، أظهرت جميع الأشكال SMA + SCs المتناثرة والأوعية uncomplex مع براعم قليلة أو معدومة على الإطلاق. بحلول اليوم السابع، أظهرت جميع الأشكال شبكة الأوعية الدموية الغنية والمعقدة، مع وجود أعلى من SMA + SCs المحيطة السفن. وعلاوة على ذلك، تكشف صور التكبير الأعلى عن وجود أكثر كثافة SMA + SCs تشارك في توطينها مع السفن التي تشكلت، مما يدل على تجنيد الشركات الخاصة والتمايز المحيطة هياكل الأوعية الدموية(الشكل 5B).

Figure 5
الشكل 5:SMA + SCs والأوعية الدموية تزيد مع مرور الوقت. أ) تظهر العضلات الملساء أكتين (الأحمر) وvWF (الأوعية، الأخضر) لشبكات الأوعية الدموية في مقصورات دائرية ومربعة وخداسية في اليوم 3 واليوم 7. يزداد كل من تمديد الأوعية الدموية وخلايا الدعم المعبرة عن SMA (SMA + SCs) بمرور الوقت ، مما يدل على نضج وتعقيد أعلى للوعاء (شريط المقياس = 200 ميكرومتر). ب)صور تمثيلية لتراكم SMA + SCs أكثر كثافة حول السفن في اليوم 7. تكشف النوى (الزرقاء) في الصورة المركبة عن وجود مركبات SCs لا تعبر عن بروتين SMA (شريط المقياس = 50 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الفيديو التكميلي 1: الفاصل الزمني متعدد الألوان ل ECs لتتبع هجرة السفن. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.  

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الحاجة إلى الأوعية الدموية الغنية داخل جزءا لا يتجزأ من الأنسجة المهندسة أمر بالغ الأهمية لبناء البقاء على قيد الحياة والوظيفة المناسبة1. على الرغم من أن هندسة نظام الأوعية الدموية كانت محور كمية كبيرة من البحوث ، إلا أنه لم يتبق الكثير للتحقيق وفهم24. على وجه الخصوص ، عند إعادة إنشاء نسيج معين ، يجب أن تتصرف الميكروسكولاتور وتنظم وفقالذلك 12. النهج الأكثر شيوعا لتوليد microvessels هو المشاركة في البذر البطانية ودعم الخلايا داخل بيئة 3D مناسبة متوافقة مع ارتباط الخلية، والانتشار، وتشكيلالسفينة 25. هذه المنهجية غالبا ما يؤدي إلى شبكات غير منظمة إلى حد كبير، مما يجعل من الصعب دراسة سلوك الأوعية الدموية الدقيقة22. هنا، يوفر البروتوكول المقدم أداة جديدة تولد شبكات الأوعية الدموية عالية التنظيم في نظام عالي الإنتاجية، مع الأوعية التي يمكن تعقبها ورصدها بسهولة عبر الزمن، لدراسة تطورهاوسلوكها. إن البذر التدريجي ل ECs (الخطوة 2-3) ، تليها الشركات الخاصة (الخطوة 4) ، هي خطوات حاسمة لتحقيق مثل هذه الشبكات المنظمة22. بالإضافة إلى ذلك ، تقدم هذه التقنية بيئة ثلاثية الأبعاد حقيقية لنماذج الأوعية الدموية ، حيث يمكن للأوعية أن تهاجر في الأبعاد الثلاثة وإنشاء هياكل ذات صلة. في المقابل ، فإن الطرق الأكثر شعبية لنمذجة الأوعية الدموية ، مثل أنظمة microfluidics ، تقدم فقط تمثيل الأنسجة 2.5D26.

يمكن تعديل الطريقة المقترحة بسهولة وتطبيقها لدراسة العديد من العوامل المختلفة التي تؤثر على تطوير شبكة السفن وسلوكها. Photolithographic SU-8 تصنيع سقالة الراتنج هو تقنية شائعة مع براعة مثيرة للإعجاب التي تمكن من خلق مجموعة واسعة من الأشكال26،27، مع إمكانية تصميم هياكل تشبه البنى الأصلية المعقدة ، مثل الحويصلات الهوائية أو وحدة الكلية. ومع ذلك ، فإن عيب استخدام SU-8 هو انخفاض القدرة على التحلل الحيوي27، مما يجعل المنصة أداة بحثية بشكل رئيسي ، بدلا من الأنسجة القابلة للزرع. ومع ذلك ، يمكن تحسين هذا باستخدام مواد متوافقة بيولوجيا والتي يمكن أن تتقاطع تحت الأشعة فوق البنفسجية / إضاءة الضوء المرئي ، وطباعة ثلاثية الأبعاد باستخدام تقنيات دقيقة مثل التصوير المجسم29. ويمكن بعد ذلك أن تزرع البنى الوعائية الناتجة في نموذج حيواني30. وهناك قيد آخر للنظام هو سماكة سقالة أقصى يمكن تحقيقه مع دقة عالية من التفاصيل، محدودة بتقنية مجسمة31. البروتوكول المقترح مناسب لإنشاء سقالة رقيقة قد تمثل أحجام الأنسجة الأصلية.

توفر هذه المنصة إمكانية التحقيق في العديد من المتغيرات التي تؤثر على ظواهر الأوعية الدموية4،32. أولا، التفاعلات بين أنواع مختلفة من ECs وSCs، وتكوين الأوعية، وقدرات التطوير والنضج، والتي من المعروف أن تختلف عند استخدام الخلايا من أصول الأنسجة المختلفة33. ثانيا ، تأثير عوامل النمو ، والجزيئات الصغيرة ، ومثبطات على الأوعية الدموية ، مما يسمح بتصور واضح لتأثيرها في الوقت الحقيقي34،35. ثالثا، إضافة أنواع الخلايا الأخرى، كرويدات، أو organoids والاتصالات والتفاعل مع الأوعية تشكيل36. ولهذا الغرض، يمثل النظام المقترح أداة قوية للتحقيق في نظام الأوعية الدموية الدقيقة.

وسوف تستفيد الخطوات المستقبلية من النظام المقترح للتحقيق في تأثير المحفزات الميكانيكية ، مثل التدفق الخلالي والميكايكية تمتد37،38، على الأوعية الدموية النامية. ونأمل أن يلقي ذلك الضوء على جوانب جديدة من شأنها توسيع المعرفة الحالية وأحدث الأبحاث في علم الأحياء الميكانيكية الوعائية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا البحث بتمويل من جامعة ميشيغان - الشراكة الإسرائيلية للبحوث. ويود المؤلفون أن يشكروا أوري ميردلر وليور ديبي وغاليا بن ديفيد على مساعدتهم ودعمهم الكبيرين، ونادين وانغ، والدكتوراه، وبيلار هيريرا - فييرو، والدكتوراه في مرفق لوري للإنشاءات النانوية في جامعة ميشيغان، وكذلك لويس سولوريو، دكتوراه في المناقشات المستنيرة لتقنيات التصوير الضوئي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Angiotool freeware NIH-CCR Free download at https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home
Bovine albumin serum Probumin Millipore 82-045-1
Dental pulp stem cells Lonza PT-5025
ECM media + bullet kit Sciencell #1001
Ethanol 96% Gadot-Group 64-17-5
Evicel fibrin sealant Johnson&Johnson EVB05IL Provides both thrombin and fibrinogen (BAC2) solutions
GlutaMAX Gibco 35050061
Goat anti-mouse Cy3 antibody Jackson 115-166-072
Goat anti-rabbit Alexa-Fluor 488 Thermo- Fisher Scientific A11034
Human adipose microvascular cells Sciencell #7200
Human fibronectin Sigma F0895-5MG Stock concentration: 1 mg/mL
ImageJ NIH Free download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Isopropyl alcohol Gadot-Group 67-63-0
Lift-off reagent Kayaku Advanced Materials, Inc G112850 Commercial name Omnicoat
Low-glucose DMEM Biological Industries 01-050-1A
Mouse anti-SMA antibody Dako M0851
NEAA Gibco 11140068
Paraformaldehyde solution 4% in PBS ChemCruz SC-281692
Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution Biological Industries 03-032-1B
Phospate buffered saline (PBS) Sigma P5368-10PAK
Rabbit anti-vWF antibody Abcam ab9378
Silicon wafer Silicon Valley Microelectronics (SVM) Wafers 4", Type N-1-10, 500-550 microns thick
SU-8 2050 photoresist Kayaku Advanced Materials, Inc Y11058
SU-8 developer Kayaku Advanced Materials, Inc Y020100
Tryton-X 100 BioLab LTD 57836

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4), 300-311 (2011).
  2. Landau, S., Guo, S., Levenberg, S. Localization of Engineered Vasculature within 3D Tissue Constructs. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 2 (2018).
  3. Griffith, C. K., et al. Diffusion Limits of an in Vitro Thick Prevascularized Tissue. Tissue Engineering. 11 (12), (2005).
  4. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
  5. Landau, S., et al. Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation. Biomaterials. 122, 72-82 (2017).
  6. Lesman, A., et al. Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs. Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).
  7. Richards, D., Jia, J., Yost, M., Markwald, R., Mei, Y. 3D Bioprinting for Vascularized Tissue Fabrication. Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 132-147 (2017).
  8. Levenberg, S., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nature Biotechnology. 23 (7), 879-884 (2005).
  9. Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
  10. Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11, (2012).
  11. Gariboldi, M. I., Butler, R., Best, S. M., Cameron, R. E. Engineering vasculature Architectural effects on microcapillary-like structure self-assembly. PLOS ONE. 14 (1), 1-13 (2019).
  12. Blache, U., Guerrero, J., Güven, S., Klar, A. S., Scherberich, A. Microvascular Networks and Models, In vitro Formation. Vascularization for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. , 1-40 (2018).
  13. Wong, K. H. K., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. Microfluidic Models of Vascular Functions. Annual Review of Biomedical Engineering. 14 (1), 205-230 (2012).
  14. Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress. Biophysical Journal. 105 (10), 2240-2251 (2013).
  15. Pollet, A. M. A. O., den Toonder, J. M. J. Recapitulating the vasculature using Organ-on-Chip technology. Bioengineering. 7 (1), (2020).
  16. Hasan, A., et al. Microfluidic techniques for development of 3D vascularized tissue. Biomaterials. 35 (26), 7308-7325 (2014).
  17. Jordahl, J. H., et al. 3D Jet Writing: Functional Microtissues Based on Tessellated Scaffold Architectures. Advanced Materials. 30 (14), 1707196 (2018).
  18. Gauvin, R., et al. Microfabrication of complex porous tissue engineering scaffolds using 3D projection stereolithography. Biomaterials. 33 (15), 3824-3834 (2012).
  19. Coscoy, S., et al. Microtopographies control the development of basal protrusions in epithelial sheets. Biointerphases. 13 (4), 041003 (2018).
  20. Kaplan, B., et al. Rapid prototyping fabrication of soft and oriented polyester scaffolds for axonal guidance. Biomaterials. , (2020).
  21. Steier, A., Muñiz, A., Neale, D., Lahann, J. Emerging Trends in Information-Driven Engineering of Complex Biological Systems. Advanced Materials. 31 (26), 11806898 (2019).
  22. Szklanny, A. A., et al. High-Throughput Scaffold System for Studying the Effect of Local Geometry and Topology on the Development and Orientation of Sprouting Blood Vessels. Advanced Functional Materials. , 1901335 (2019).
  23. Welti, J., Loges, S., Dimmeler, S., Carmeliet, P. Recent molecular discoveries in angiogenesis and antiangiogenic therapies in cancer. Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3190-3200 (2013).
  24. Gui, L., Niklason, L. E. Vascular Tissue Engineering: Building Perfusable Vasculature for Implantation. Current Opinion in Chemical Engineering. 3, 68-74 (2014).
  25. Blache, U., Ehrbar, M. Inspired by nature: Hydrogels as versatile tools for vascular engineering. Advances in Wound Care. 7 (7), 232-246 (2018).
  26. Cochrane, A., et al. Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).
  27. Nemani, K. V., Moodie, K. L., Brennick, J. B., Su, A., Gimi, B. In vitro and in vivo evaluation of SU-8 biocompatibility. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 33 (7), 4453-4459 (2013).
  28. Mathew, R., Ravi Sankar, A. A Review on Surface Stress-Based Miniaturized Piezoresistive SU-8 Polymeric Cantilever Sensors. Nano-Micro Letters. 10 (2), 1-41 (2018).
  29. Knowlton, S., Yenilmez, B., Anand, S., Tasoglu, S. Photocrosslinking-based bioprinting: Examining crosslinking schemes. Bioprinting. 5, 10-18 (2017).
  30. Redd, M. A., et al. Patterned human microvascular grafts enable rapid vascularization and increase perfusion in infarcted rat hearts. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
  31. Zhu, Y., et al. SU-8 Photoresist. Encyclopedia of Nanotechnology. , 2530-2543 (2012).
  32. Zheng, F., et al. Organ-on-a-Chip Systems: Microengineering to Biomimic Living Systems. Small. 12 (17), 2253-2282 (2016).
  33. Freiman, A., et al. Adipose-derived endothelial and mesenchymal stem cells enhance vascular network formation on three-dimensional constructs in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 5 (2016).
  34. van Duinen, V., et al. Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform. Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).
  35. Nguyen, D. -H. T., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (17), 6712-6717 (2013).
  36. Nashimoto, Y., et al. Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).
  37. Rosenfeld, D., et al. Morphogenesis of 3D vascular networks is regulated by tensile forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3215-3220 (2016).
  38. Neto, F., et al. and TAZ regulate adherens junction dynamics and endothelial cell distribution during vascular development. bioRxiv. , 174185 (2017).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 167، الميكروسكولاتور، هجرة السفن، الأداة التحليلية، المقايسة عالية الإنتاجية، تحليل تولد الأوعية، هندسة الأنسجة
البذر الخلايا Stepwise على السقالات تيسلاتيد لدراسة الأوعية الدموية تنبت
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Szklanny, A. A., Neale, D. B.,… More

Szklanny, A. A., Neale, D. B., Lahann, J., Levenberg, S. Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels. J. Vis. Exp. (167), e61995, doi:10.3791/61995 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter