Summary
工程组织严重依赖适当的血管网络来提供重要的营养和气体，并清除代谢废物。在这项工作中，内皮细胞和支持细胞的分步播种协议在高通量平台中创建高度有序的血管网络，用于研究在受控的 3D 环境中开发血管行为。
Abstract
心血管系统是人体生理学的关键角色，为人体大多数组织提供营养：容器存在不同的大小，结构，表型和性能取决于每个特定的香水组织。组织工程领域，旨在修复或替换受损或缺失的身体组织，依靠受控血管生成在工程组织内创建适当的血管化。如果没有血管系统，厚重的工程结构就无法充分滋养，这可能导致细胞死亡、不良的灌输，并最终失败。因此，了解和控制工程血管的行为是该领域的一个突出挑战。这项工作提出了一个高通量系统，允许创建有组织和可重复的船舶网络，用于研究船舶行为在3D脚手架环境中。此两步播种协议显示系统内的容器对脚手架地形做出反应，根据船舶居住的隔间几何形状呈现独特的发芽行为。可应用这一高吞吐量系统获得的结果和理解，以便更好地实现 3D 生物打印脚手架构造设计，其中使用 3D 打印作为蜂窝化生物环境的基础时，无法快速评估各种 3D 几何形状的制造。此外，从这种高吞吐量系统的理解可以用来改进快速药物筛选，快速发展共培养模式，研究机械刺激血管形成，加深血管系统的认识。
Introduction
组织工程领域正在迅速向制造工程结构，以取代缺失或损坏的器官和组织1。然而，由于为组织营养而生成操作血管网络仍然是一个突出的挑战，但尚未实现全功能结构。如果没有适当的血管化，工程组织仅限于氧气和营养物质的被动扩散传输，将最大可行的组织厚度限制在扩散极限，约200μm2。这种厚度不适合修复大型组织缺陷或全器官制造，这使得功能血管网络的存在成为功能和植入组织3的必修特征。
血管系统由多种血管组成，具有不同的大小、表型和组织，与宿主组织密切相关。了解发育和发芽的血管的行为、反应和迁移决定可以指导它们融入工程组织4。目前，创建体外血管网络的最常见方法是将内皮细胞 （ECs） 与支持细胞 （SCs） 相结合，从而能够分化成壁画细胞），在三维微环境中播种。这种环境提供化学和物理线索，使细胞附着，增殖和自我组装到容器网络2，5，6，7，8。当共同培养时，SCs 分泌细胞外基质 （ECM） 蛋白质，同时为形成管状结构的 EC 提供机械支持。此外，两种细胞类型之间的交叉相互作用促进管状形成、血管发芽和迁移，此外，SCs 成熟和分化成α光滑的肌肉作用表达 （αSMA） 壁画细胞4。船舶网络开发最常在使用水凝胶、多孔聚合物脚手架或其组合创建的 3D 环境中进行研究。后一种选择同样为细胞和 ECM9提供了细胞友好的环境和所需的机械支持。
研究血管发育的工作很多，包括共同培养水凝胶10上的细胞，水凝胶-脚手架组合11，12，2D平台，和微流体装置13。然而，水凝胶很容易被细胞施加的力14变形，而2D和微流体系统无法重建一个更接近自然的环境，以获得更外推的反应15，16。了解成型容器如何对其周围环境做出反应，可以提供关键见解，使工程环境能够以可预测的方式指导船舶发展。了解血管形成现象对于跟上亚微米到微米尺度制造技术的迅速出现尤为关键，如立体成形、数字投影光刻、连续液体接口生产、3D熔融电喷射写、基于溶液的3D电喷射写写，以及新兴的生物打印技术17、18、19、20、21等。将这些微制造技术的控制与加深对血管生物学的理解相协调，是为目标组织创建适当的工程血管学的关键。
在这里，我们提出了一个3D系统，以研究新的成形和发芽的容器对周围脚手架几何的反应，观察它们的发芽起源和随后的迁移22。通过利用带分壳隔间几何形状的 3D 脚手架和两步播种技术，我们成功地以清晰易分析的方式创建了高度有序的血管网络。分壳几何形状提供高吞吐量系统，每个单元包含对当地环境有反应的船只。使用五颜六色的ECs，我们跟踪芽的形成起源和随后的迁移模式，与隔间几何和SCs位置22相关。
虽然拟议的协议已准备分析几何线索对血管化行为的影响，但这种方法可以扩展到各种新应用。特有脚手架和易于成像的网络允许直接分析不同的 UC 和 SCs 相互作用、增加特定器官细胞及其与血管网络的相互作用、药物对血管网络的影响等等。我们建议的系统结果非常多才多艺，简单制造和处理。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 泰瑟尔脚手架制造
注：光刻技术是一种广泛的技术，需要专门设备，通常位于纳米制泡设施/实验室内。本议定书中规定的方法尽可能为观众所采用：但是，根据读者可获得的设备，可能需要对程序进行轻微更改。我们建议在纳米制剂设施的洁净室中执行这些程序，以确保最高的工艺质量。在开始之前，请访问面膜对齐器（或一些紫外线曝光设置）、旋转涂层、热板、溶剂洗涤站、光面罩和等离子清洁剂。手术中使用的溶剂和化学品是危险的，因此请采取最起最大的注意，以避免任何化学品暴露。在设计光面罩时，确定大小硅晶圆和光罩与旋转涂层和面膜对齐器兼容。此外，位于硅晶片边缘的光分辨率通常从处理变形：因此，对晶圆的中心区域进行设计。
- 使用照片刻度技术准备脚手架，并选择感兴趣的几何形状。
- 旋转涂层前，清洁硅晶片。这可以通过等离子清洗或基于溶剂的技术来完成。如果等离子体清洁，请按照仪器的标准操作程序操作详细信息。喷洒压缩氮气并检查晶圆，以确保在旋转涂层之前没有碎屑。此晶圆将用作创建脚手架的基板。
注意：为了获得最佳效果，请从新鲜晶圆开始。晶圆可以重复使用，但应不含旧光分辨率、表面缺陷和碎屑。使用晶圆钳处理是有帮助的。 - 使用指南将硅晶片放在旋转涂层夹头上。短暂旋转晶圆，以确保它已正确地集中在夹头，根据需要调整，直到适当的中心。每次将晶圆放在旋转涂层上时，都必须这样做。将 1-4 mL 的升降试剂分配到晶圆上（这将取决于晶圆的大小）。大约 2 mL 的升降试剂适用于 4 英寸晶圆。
- 将旋转涂层的传播速度设定为 500 rpm 5 秒，旋转速度设定为 1000 rpm 30 秒，然后旋转升降试剂。检查晶圆，以确保它在晶圆上涂上均匀的涂层。此时，晶圆上留下的任何碎屑都非常明显。在有碎屑的区域内，任何脚手架都可能无法使用。旋转涂层后，转移到热板，在200°C下烘烤1分钟。
- 重复前一步两次，共三个涂层。
- 将脱下试剂涂层硅晶片与SU-8 2050光分辨率一起旋转，直到获得约100μm的厚度。
- 每 25 mm 基板直径分配 1 mL 的电阻。
注意：在浇注电阻时要小心避免气泡。对于SU-8 2050，浇注约2英寸直径的圆，当使用4英寸硅晶片工作得很好。 - 旋转涂层SU-8 2050。以 500 rpm 的速度传播 5 秒，然后以 1700 至 1800 rpm 的自转速度传播，以达到约 100 μm 厚度。
-
可选：旋转后，将旋转涂层晶圆在预烘烤前保护的不发光水平表面上过夜。这可能有助于消除任何气泡的抵抗，并允许缺陷升级。
注意：电阻的实际厚度和由此产生的脚手架可能因用户错误和设备参数而异。因此，脚手架的厚度应稍后在第 1.6 步进行验证。相应地修改旋转涂层程序，以达到所需的厚度。
- 每 25 mm 基板直径分配 1 mL 的电阻。
- 在接触之前，在 65 °C 预烤晶圆 10 分钟，然后在 95 °C 预烤 40-50 分钟。在暴露之前，用一对钳子压在边缘，以测试电阻的表面，以确保它不再俗气/粘稠。将晶圆从热板上拉下来，在评估粘度之前冷却 0.5-1 分钟是有帮助的。
注意：缓慢的温度坡道时间（加热和冷却）可能有助于防止脚手架扭曲。
- 旋转涂层前，清洁硅晶片。这可以通过等离子清洗或基于溶剂的技术来完成。如果等离子体清洁，请按照仪器的标准操作程序操作详细信息。喷洒压缩氮气并检查晶圆，以确保在旋转涂层之前没有碎屑。此晶圆将用作创建脚手架的基板。
- 通过曝光能量为 215-240 mJ/cm 2 的光罩将光分辨率暴露在紫外线 （350-400 nm） 下，电阻厚度为 85 - 110 μm。参考光分辨率制造商推荐的暴露能量厚度相关性的指南。
- 确保暴露得到适当校准，以便验证能量。根据需要调整暴露时间，以达到所需的暴露能量。此外，面膜对齐器可能允许不同的暴露模式：真空接触、硬接触、软接触和接近接触（特定术语可能有所不同）。一般来说，这些将影响分辨率和功能对齐。作者通常使用"硬接触"模式。
- 对于小功能或多层，如果对齐很重要，请更仔细地考虑曝光模式和掩蔽对齐程序。调整厚度值时，一定要考虑电阻的高度。有关操作详细信息，请参阅您的面膜对齐器的标准操作程序。
注：照片罩的设计将决定脚手架的大小、隔间几何形状和每批获得的脚手架数量。使用硬玻璃或石英光罩将产生最高的分辨率：然而，软聚合物透明膜光面罩通常可用于这些大功能尺寸（>10 μm）。由于功能分辨率较差，使用胶片照片罩可能导致脚手架毛孔的 z 轴沿线的地形特征。这可能对细胞行为产生影响。验证所需的分辨率，与制作光罩的任何人协商，以确保实现所需的分辨率。
- 紫外线照射后立即在 65 °C 下烘烤晶圆 2-5 分钟，然后在 95 °C 下烘烤 8-10 分钟。
- 开发脚手架以去除未开发的电阻。
- 使用低容量的 SU-8 开发人员解决方案将脚手架浸入 7-10 分钟，以溶解任何未开发的电阻。
- 用异丙醇 （IPA） 冲洗。
- 带压缩氮的干晶圆。
注意：在第 1.4 步期间要小心，不要导致脚手架过早松开。实现此目标需要低容量的开发人员和温和的处理。
- 开发后，在 150 °C 下硬烤晶圆 15 分钟。
注意：硬烘烤后，关闭热板，让晶圆冷却非常缓慢，可能有利于防止扭曲/卷曲的最终脚手架。 - 可选：在硬烘烤后和起飞前，评估脚手架厚度，因为脚手架仍应轻轻地粘附在晶圆表面。对于此过程，接触特征学效果良好：但是，可以采用任何适当的方法。
- 将脚手架从晶圆上抬起来。
- 将脚手架浸入 SU-8 开发人员中，使其立即从晶圆上抬起来。如果脚手架不能抬起，用一对晶圆钳轻轻推脚手架。
- 删除多余的开发人员。
- 将脚手架转移到新的容器中，并浸入异丙醇中。在 IPA 中冲洗至少 6 次，以确保所有开发人员已被移除。
- 使用前，空气至少干燥脚手架一周。
2. 脚手架纤维素涂层
- 对于消毒，将脚手架浸入 70% 乙醇 （v/v） 中至少 15 分钟，并在使用前用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 清洗 2 次。
注意：SU-8脚手架体弱，容易断裂。建议使用钝和弯曲的钳子处理，并且应最小心地处理它们。通过将脚手架浸入液体中，可以实现更轻松的处理，以避免脚手架和表面之间的静电相互作用。 - 在PBS中准备稀释50微克/mL的人类纤维素，并通过蛋白质吸附覆盖脚手架。
- 将 1.5μL 的纤维素库存溶液 （1 毫克/mL） 与每个脚手架 28.5μL 的 PBS 混合以播种。最好，只准备一个纤维素稀释，用于所有脚手架，以避免管道错误。
- 对于 10 个脚手架，将 15 μL 的库存纤维素溶液混合在 285 μL 的 PBS 中，总计 300μL 的 50μg/mL 纤维素稀释。
- 将脚手架稀疏地放在疏水表面（即非组织培养（非TC）10厘米盘）的顶部，用步骤2.2.1中准备的纤维素稀释30μL覆盖每个脚手架。
注意：确保脚手架舱内没有气泡。如果存在气泡，可以通过轻轻摇动液滴内的脚手架或轻管来消除气泡。 - 更换板盖，将纤维素覆盖的脚手架放入孵化器中，37 °C 和 100% 湿度至少一小时。
- 孵化后，轻轻冲洗PBS中的脚手架，去除纤维素残留物。脚手架可在 PBS 中保持在 4 °C，使用前最多一周。
- 将 1.5μL 的纤维素库存溶液 （1 毫克/mL） 与每个脚手架 28.5μL 的 PBS 混合以播种。最好，只准备一个纤维素稀释，用于所有脚手架，以避免管道错误。
3. 内皮细胞播种
- 准备EC介质混合基础介质与其对约介质套件组件，包括抗生素溶液（Pen/Strep），胎儿牛血清（FBS）和内皮细胞生长补充剂，如制造商所示。
- 在 EC 介质中使人类脂肪微血管内皮细胞 （HAMEC） 悬浮，浓度为 4 x 106 细胞/mL。
注意：如果以前使用的内皮细胞被转染以表达荧光蛋白，或者使用无毒细胞质膜染料（进一步称为标记的 ECs）预先染色，则可以进行实时成像。 - 使用钳子，将每口井一个纤维素涂层脚手架放在非TC 24井板井上。
- 用 HAMEC 悬架的 25 μL 液滴覆盖每个脚手架。小心不要让悬架从脚手架上流出，因为它会阻碍细胞粘附。
- 将盖子盖在盘子上，在37°C、5%CO2 和100%湿度下放入孵化器中。让孵育至少60分钟，最多90分钟。
注意：在孵化过程中，将板放在孵化器内的轨道摇床上可改善脚手架墙壁上的单元连接。轨道摇床应设置在不超过 5 rpm。 - 孵化后，用移液器为每口井加注 700 μL 的 EC 介质。
注意：期待看到油井底部的 ES，因为有些细胞不附着在脚手架上，从脚手架的空隙中掉下来。 - 在脚手架的墙壁上使用荧光显微镜（使用标记的 EC 时）或 3 天（使用非标记的 EC 时），可以观察到内皮脚手架，从而提供足够的时间实现 EC 汇合。每隔一天更换一次媒体。
4. 支持细胞播种和共同培养
- 通过混合 500 毫升低葡萄糖杜尔贝科的改性鹰介质 （低葡萄糖 DMEM）， 57.5 mL 的 FBS， 来准备牙髓干细胞 （DPSC） 介质 （DPSCm），5.75毫升非必需氨基酸（NEAA）、5.75毫升谷氨酰胺和5.75毫升青霉素-链霉素-尼他汀溶液。
- 将内皮脚手架转移到新的非TC 24井板中，以使用钳子丢弃连接到井底的EC。
- 使用 1 mL 移液器或真空吸气器从当前板中丢弃所有介质。小心不要将真空直接涂在脚手架上。
- 每口井放置一个脚手架，最好放在井中央，以避免由于表面张力作用而将液体流向墙壁。用光真空干燥脚手架周围的区域，但避免脚手架完全干燥。
- 在纤维素预凝胶溶液中准备 DPSC 悬架。
- 用PBS稀释血栓和纤维素库存解决方案，直到分别获得5U/mL和15毫克/mL的最终浓度。
- 在 5 U/mL 血栓稀释中准备 8 x 106 DPSC/mL 悬架，并在每个脚手架上单独分配 12.5μL 的悬架。
- 设置 5-50 μL 移液器（或类似）至 12.5 μL，并填充 15 毫克/mL 纤维素溶液。
- 无需移除尖端，将移液器设置为 25 μL。尖端中的材料应上升，并留下空体积朝尖开口。
- 慢慢按下柱塞按钮，直到液体到达尖端开口，但不会泄漏出去。将柱塞放在这个位置，并将尖端放入含有血栓悬架中细胞的微中性管中，确保尖端与液体接触。
注意：纤维素交叉链接将在血栓和纤维蛋白原接触后立即开始。下一步应迅速完成。 - 轻轻释放柱塞按钮，并将单元格悬架拉入尖端。彻底混合两种材料，避免气泡形成。
- 快速将混合材料分配到内皮脚手架上。重复每个脚手架以前的步骤，确保始终在使用之间更改提示，以避免尖端内意外形成纤维蛋白凝胶。
- 更换板盖，在 37 °C、5% CO2 和 100% 湿度下孵化脚手架 30 分钟。
- 孵化后，用 1 mL 的 1：1 DPSC 和 EC 介质填充每个油井。
- 文化1周，每隔一天更换一次媒体。
- 在培养过程中，从井中取出介质，并在不同时间点使用共聚焦显微镜对构造进行成像，以研究血管发育或任何其他感兴趣的参数。
注意：只有使用标记的 UC 执行实验，才能执行此步骤。请参阅第 6 步 - 请进一步说明。
5. 特有血管标记的免疫荧光染色
注：以下步骤可在培养构造的同一油井中执行。始终确保解决方案完全覆盖脚手架至关重要。此外，如果可能，建议在轨道摇床上执行步骤，虽然不是强制性的。
- 第 7 天，将介质从井中丢弃，通过在井中加入 PBS 并使用真空将其移除来冲洗脚手架。
- 通过添加4%的甲醛修复脚手架20分钟。用PBS清洗3次，每次洗涤5分钟。
- 在 PBS （v/v） 中使用 0.3% 的 Triton-X 对固定电池进行渗透 15 分钟。用PBS清洗3次，每次洗涤5分钟。
- 在 PBS （w/v） 阻塞溶液中准备 5% 牛血清白蛋白 （BSA），并覆盖脚手架。在室温下离开1小时。
注：所有所需的解决方案金额将取决于要染色的脚手架数量。根据需要准备解决方案，保持所述浓度。 - 准备并应用主要抗体染色溶液。
- 稀释兔子抗冯威勒布兰德因子 （vWF） 抗体 1：150 和鼠标抗 SMA 抗体 1：50 在新鲜阻塞溶液。
注意：其他内皮细胞标记，如CD31或VE-卡德林，可以使用。 - 用主要抗体溶液盖住脚手架，并在 4 °C 过夜。在PBS中洗三次，每次洗5分钟。
- 稀释兔子抗冯威勒布兰德因子 （vWF） 抗体 1：150 和鼠标抗 SMA 抗体 1：50 在新鲜阻塞溶液。
- 准备并应用二次抗体染色溶液。
- 稀释山羊防鼠Cy3抗体1：150和山羊抗兔亚历克萨-弗卢尔488 1：400在PBS。
- 用二次抗体溶液覆盖脚手架，在室温下或在 4 °C 过夜时孵育至少 3 小时。在PBS中清洗3次，每次洗涤5分钟。在 PBS （v/v） 中将染色脚手架保持在 0.3% PFA 中长达一个月。
6. 脚手架对焦成像和血管开发分析
注：以下步骤可以在选择的最后时间点固定和彩色脚手架上执行，或者，如果使用了荧光细胞，在细胞培养期间无需终止实验。对于后者，建议设置特定的时间点：此工作显示第 0 天（SCs 播种前）和 SCs 播种后的第 1 天、第 3 天、第 5 天和第 7 天（图 3A）。
- 使用带 5 倍镜头和 0.5 变焦的共聚焦显微镜以及脚手架的全 z 范围对脚手架进行成像。这将允许捕获 9 个独立的隔间，用于方形和圆形几何，或 8 个用于六边形几何的完整隔间。图像荧光信号和传输的光，以获得容器网络结构和舱室几何（图3A）。
- 使用 ImageJ（或任何其他图像处理软件），裁剪每个单独的隔间：对于这个过程，只有血管网络标记是相关的。 拆下不在舱内的任何船只。 创建最大强度投影，并将每个裁剪的隔间保存为 TIFF 图像。
- 在 ImageJ 中，按 文件>打开 并选择包含多个隔间的所需 TIFF 图像。图像应至少有两个通道，荧光容器网络和传输的光图像。
- 从工具栏中选择 多边形选择 工具。选择传输的光通道。单击六边形隔间的一个角，在隔间区域与脚手架墙之间的界面处，这将启动面膜定义。继续按顺序单击下一个角，直到选择初始角，关闭面膜。
注：此解释适用于六边形隔间。当隔间是方形的或圆形的时，分别使用 矩形 或 椭圆形 工具创建适当的面膜。无论形状如何，始终适合面罩跟随脚手架的内壁。 - 点击 分析>工具>投资回报率经理。在投资回报率管理器（投资回报率，感兴趣的区域）中，单击 "添加" 按钮以保存创建的面膜。新的面膜将显示在左侧列表中。此步骤允许分析在不同的图像之间保持一致。
注：在投资回报率管理器中，可以通过单击 "更多>保存"来保存带有所有创建的口罩的文件。在 保存选择 窗口中，选择名称和位置，并保存 .roi 文件。要检索面膜，请在投资回报率管理器中单击 "更多>打开 "并选择所需的 。roi 文件。 - 选择荧光容器网络图像，然后单击 "编辑>清除外部"。只有面罩中包含的图像将保留，其余的将消除。
- 打开已清除的网络图像后，单击 "图像>重复"。在 重复 弹出窗口中，写下图像的名称。如果选择了 重复的超级堆栈 ，请取消选择它并单击 "确定"。将创建一个仅包含裁剪荧光容器网络的新图像。
- 通过单击 文件>保存为>蒂夫保存裁剪的图像。选择名称和目录，然后单击 "确定"。
- 分析裁剪图像上的血管发育。
- 下载并安装分析免费软件 AngioTool，它提供定量工具来量化各种血管参数。软件可以从以下地址 https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home 获取。
- 设置图像的尺度值，以以毫米单位获得结果并加载图像。
- 单击 "设置" 选项卡，用所拍摄的图像中的代表性值以 像素 和 距离 mm 填充距离。使用上述成像参数，填充值为每 1 mm 400 像素。
- 按 下"打开"图像 按钮并浏览感兴趣的图像。
- 选择分析参数以量化 分析 选项卡中的容器发展。
- 在 容器直径和强度 字段下，从顶部范围选择器中取消选择任何当前标记，并激活表示数字 3 的标记。
- 在 容器直径和强度 场下，在底部范围选择器上，将下范围标记移动到 60，并将高护林员制造商保持在 255。
- 激活 "删除"小颗粒 框，并将标记设置为 100。
- 在字段 "保存"首选项下，选择保存结果的点差表文件的名称和位置，然后按 下"运行"分析 按钮。如果选择 保存结果图像 框，Angiotool 将生成并保存显示容器网络量化参数的新 jpeg 图像。
注：对于每次执行的分析，无需更改扩展表文件名称，将在文件底部添加一行新行，并附有新获得的结果。
- 组织数据并运行统计分析。
- 对于所有处理过的图像，请从分布表中选择感兴趣的参数（例如船体总长度和船体面积），并将其输入统计分析软件，以正确研究获得的结果（图3C）。
7. 发芽源检测和迁移跟踪的时间推移成像
- 或者，在第 4.6 步中，在孵化器中培养脚手架，将共焦显微镜培养室设置为 37 °C、5% CO2 和 100% 湿度。
- 将包含完全种子脚手架的板放入共聚焦显微镜室中，并将成像参数设置为所需的值。
- 将图像拍摄间隔设置为 30 分钟，总成像时间为 72 小时。这将使运行时间完全失效，而无需中等变化。
注意：如果需要较长时间的失效成像，应进行仔细的位置校准，以便能够检索原始成像位置，因为中等变化需要从共焦孵化器中取出板并放入无菌生物罩中。
注：从脚手架墙壁和管状结构形成的 ES 分离将在 SCs 播种后的第一小时内开始（第 4 步），可能需要长达 50 小时才能完成。在最初的管状形成后，新的芽将从周围的容器迁移到舱内。在整个实验中，喷发和随后的网络改造将持续到第10天，届时船舶网络将变得稳定。使用此信息相应地选择时间推移起点和时间步骤。
- 将完整的时间推移电影文件保存为 TIFF 序列。
- 打开图像J，单击 文件>导入>图像序列 并选择您的文件。这将打开你的TIFF序列作为电影。
- 通过单击插件>手动跟踪打开手动跟踪插件。这将打开跟踪窗口。
- 观察电影并选择要跟踪的容器。注意它的起源和迁移。
- 激活 显示参数 框并输入 30 分钟 的时间间隔。 x/y 校准 将取决于成像过程中选择的像素量。
- 继续手动跟踪脚手架轮廓的发芽容器。
- 按 "添加"跟踪 按钮。在电影的第一帧中，按下要跟踪的船只的位置。在此之后，电影将自动更改为下一帧。
- 单击容器所在的第二帧的图像。同样，电影将自动更改为下一帧。
- 继续同一船只，直到完成完整的迁移跟踪。
- 在跟踪窗口上，单击 覆盖点和线条 ，在影片中印上船只迁移的视觉路径。这将打开电影的副本，其中有一个点表示跟踪器的当前位置，以及显示上一条路径的行。
- 单击 "末尾轨道" 按钮以完成记录当前船只运动。
- 再次单击 "添加"跟踪 按钮，从新容器重新开始。执行此操作时，线条和点标记将自动更改新容器的颜色。重复，直到跟踪所有所需的容器。
注：x/y 位置、容器速度和移动距离可从弹出窗口 结果检索。每艘船将由其最左侧列的轨道编号进行识别。这些数据可以复制并粘贴到传播表中以执行进一步分析。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
所提出的协议，使用立体摄影技术，允许制造由SU-8光分辨率器制成的特星脚手架。获得具有不同隔间几何形状（正方形、六边形和圆圈）的脚手架，以及高度准确和可重复的特征（图 1）。
图1：代表扫描电子显微镜图像的特卖方形，圆形，六边形脚手架几何（比例杆 = 500μm）。请单击此处查看此图的较大版本。
通过分步细胞播种（步骤 2 到 4），制造的脚手架用于创建高度有序的血管网络。在使用传统的同时播种 ES 和 SC 时，生成的容器缺乏明确的组织。为此，进行了脚手架纤维素涂层（第 2 步），跳过了脚手架内皮化步骤（步骤 3），DPSC 和 HAMEC 同时在纤维蛋白凝胶（第 4 步）中共同播种。以这种方式，细胞均匀地分布在脚手架上（图2，上排），导致不可预知和混乱的发达血管网络，似乎不与周围的脚手架相互作用。相反，首先在脚手架壁上播种 ECs 提供了准确的初始内皮细胞模式。后来在纤维蛋白凝胶中加入SC会导致可预测的管状形成现象，形成的容器紧跟脚手架壁的形状，并萌芽进入隔间空间的新容器（图2，下排）。
图2：同时细胞播种与步进细胞播种的血管化比较。在分壳脚手架中血管发育的代表性图像，用于在 1 天和第 5 天同时（上排）细胞播种的 ECs （红色） 和 SCs （绿色） 和阶梯式细胞播种（下排）。分步播种导致有组织的血管网络，沿着脚手架墙，芽入隔间空间（比例杆：100微米）。请单击此处查看此图的较大版本。
当使用荧光 CC 时，无论是变色还是染色，容器都可以实时成像，而无需修复和终止每个时间点的实验。表达ECs（RFP-ECs）的红色荧光蛋白在六边形脚手架上培养，播种后进行成像（图3A，第0天）。在第1天，增加了SC，血管网络每隔一天被成像，以量化船舶的发展（图3A，第1天，第3天，第5天和第7天）。每个时间点，整个脚手架的宽图像被拍摄（图3B）。对于每个隔间，这些容器主要组织起来并与位于其禁区内的细胞相互作用。因此，每个隔间都是隔离的，隔间外的多余容器使用 ImageJ 被移除。然后使用血管醇分析干净、单节图像。血管毒素返回了包含多个容器参数的分布板文件，以及主网络特征（如骨架、交汇点和容器表面）的视觉表示。利用统计分析软件Prism对获得的数据进行了分析，在实验时间范围内观察到容器总长度和面积的容器生长清晰（图3C）。在为期1周的实验中，预计船只将进一步发展和扩展，如图3A和图2C所示。减少船长或面积，在第3天之前未形成容器或图2上排所示形成的船只，可解释为失败的实验。
图3：代表性的发展图像和有组织的血管网络分析。 （A） ES（红色）到达后播种的支架墙上的汇合点：SCs的添加表示实验的第0天。在SCs播种后的第1天，ECs分离到舱室空间，并开始形成容器，这些容器将在以后几天继续发芽和连接。（B） 血管网络分析的共焦图像处理步骤 （i） 拍摄包含多个隔间的宽共焦图像，（ii） 裁剪单个隔间（由白色破折号六边形标记），（iii） 然后分离血管网络通道，并裁剪出隔间墙壁外的所有容器。使用血管图分析单个舱室图像，返回附有视觉标记的血管参数列表，如容器区域（以黄色勾勒）、容器长度（显示为绿色线）和交叉点（标记为蓝点）。（C） 不同时间点六角舱内总船长和总船体面积的比较结果（结果为平均± SD，n > 6;所有比例杆：200μm）。请单击此处查看此图的较大版本。
使用五颜六色的 ES 来促进单个细胞识别，执行了共焦成像时间推移，以便单个容器跟踪（补充视频 1）。使用 手动跟踪 图像J插件观察和跟踪这些船只。尖端细胞被选中为电影的每一帧（图4A），直到容器与周围的血管同化。因此， 手动跟踪 插件实时生成了船舶路径，从而能够观察船舶迁移（图 4B）。
图4：代表发芽船只追踪。 （A） 使用五颜六色的 ES（绿色、红色和蓝色）时间推移来方便单艘船的识别。使用 ImageJ 插件手动跟踪识别和跟踪发芽容器。船舶的末端被标记为每个时间点实时跟踪：添加了黑白标记以显示选定的容器端点。（B） 由 ImageJ 插件处理的容器的生成二维跟踪，显示带点的最远点，以及带线的成形路径（比例杆 = 200 μm）。请单击此处查看此图的较大版本。
在提议的平台中，可以轻松观察到以 SMA® SC 为代表的船舶成熟。表示更多 SMA® SCs 的 Vasculatures 代表一个更成熟的网络，因为 SMA 表达与23年一段时间内的容器稳定相关。对于圆形、六边形和方形隔间，SMA® SC 的数量会随着时间的推移而增加（图5A）。到第 3 天，所有形状都显示分散的 SMA® SC 和不复杂的容器，很少或根本没有芽。到第7天，所有形状都显示出丰富而复杂的血管网络，船只周围有较高的SMA®SC。此外，更高的放大图像显示，与成形血管共同本地化的 SMA® SCs 存在更密集，这证明 SCS 招募和血管结构周围的分化（图 5B）。
图5：SMA®SC和血管随着时间的推移而增加。A） 平滑肌肉作用（红色）和vWF（容器，绿色）显示为血管网络在圆形，方形和六边形隔间在第3天和第7天。血管扩张和 SMA 表达支持细胞 （SMA+ SCs） 都随着时间的推移而增加，表示更高的血管成熟度和复杂性（比例杆 = 200 μm）。B） 在第 7 天，SMA® SCs 在船只周围密集积累的代表图像。复合图像中的核（蓝色）显示未表达 SMA 蛋白的 SC 的存在（比例杆 = 50 μm）。请单击此处查看此图的较大版本。
补充视频 1： 船舶迁移跟踪的多色 ECs 时间推移。 请点击这里下载此视频。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在工程组织内需要丰富的血管，这对构建生存和适当的功能至关重要。虽然工程血管系统一直是大量研究的重点，但还有许多问题有需要研究和理解。特别是，在重建特定组织时，微血管应相应地表现和组织。微维斯生成最常见的方法是在适合细胞附着、增殖和血管形成的合适 3D 环境中共同播种内皮细胞和支持细胞。这种方法往往导致网络大大无组织，使得研究微血管行为变得困难。在这里，介绍的协议提供了一个新的工具，在高通量系统中生成高度有序的血管网络，容器可以很容易地跟踪和监测通过时间，以研究其发展和行为。ECs 的逐步播种（步骤 2-3），其次是 SC（第 4 步），是实现此类有组织的网络22的关键步骤。此外，该技术为血管模型提供了一个真正的 3D 环境，其中容器可以在三维中迁移并创建相关结构。相比之下，血管建模（如微流体系统）更流行的方法只提供2.5D组织表示26。
建议的方法可以很容易地修改和应用，以研究许多不同的因素影响船舶网络的发展和行为。光刻SU-8树脂脚手架制造是一种常见的技术，具有令人印象深刻的多功能性，能够创建各种形状26，27，具有设计类似复杂的原生结构的结构的潜力，如树脂或肾动单元。尽管如此，使用SU-8的缺点是其低生物吸收性27，使平台主要是一个研究工具，而不是一个植入组织。然而，这可以通过利用生物相容材料，可以在紫外/可见光照射下交叉连接，以及使用精确的技术，如立体光29打印来改善。由此产生的血管化构造可以植入动物模型30。该系统的另一个局限性是脚手架最大可实现厚度与高细节精度，受立体技术31的限制。拟议的协议适用于创建可能代表原生组织大小的薄脚手架。
这个平台提供了调查影响血管化现象的几个变量4，32的潜力。首先，不同类型的EC和SC之间的相互作用，以及它们的血管形成、发育和成熟能力，在使用不同组织起源的细胞时，已知会有所不同。其次，生长因子、小分子和抑制剂对血管的影响，可以实时清晰地可视化它们的影响。第三，增加其他细胞类型，球体，或器官及其与形成容器的通信和相互作用36。为此，拟议的系统是研究微血管系统的有力工具。
今后将利用拟议的系统来研究机械刺激的影响，如间质流动和机械伸展37，38，对发展血管。这将有望揭示新的方面，将扩大目前的知识和最先进的血管机械生物学研究。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了密歇根大学-以色列研究伙伴关系的资助。作者要感谢乌里·默德勒、利奥·黛比和加利亚·本·大卫给予的巨大帮助和支持，感谢密歇根大学卢里纳米制剂设施博士王纳丁博士和皮拉尔·埃雷拉-菲罗博士，以及路易斯·索洛里奥博士对光刻技术的启发性讨论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angiotool freeware | NIH-CCR | Free download at https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home | |
| Bovine albumin serum Probumin | Millipore | 82-045-1 | |
| Dental pulp stem cells | Lonza | PT-5025 | |
| ECM media + bullet kit | Sciencell | #1001 | |
| Ethanol 96% | Gadot-Group | 64-17-5 | |
| Evicel fibrin sealant | Johnson&Johnson | EVB05IL | Provides both thrombin and fibrinogen (BAC2) solutions |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| Goat anti-mouse Cy3 antibody | Jackson | 115-166-072 | |
| Goat anti-rabbit Alexa-Fluor 488 | Thermo- Fisher Scientific | A11034 | |
| Human adipose microvascular cells | Sciencell | #7200 | |
| Human fibronectin | Sigma | F0895-5MG | Stock concentration: 1 mg/mL |
| ImageJ | NIH | Free download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Isopropyl alcohol | Gadot-Group | 67-63-0 | |
| Lift-off reagent | Kayaku Advanced Materials, Inc | G112850 | Commercial name Omnicoat |
| Low-glucose DMEM | Biological Industries | 01-050-1A | |
| Mouse anti-SMA antibody | Dako | M0851 | |
| NEAA | Gibco | 11140068 | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | SC-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma | P5368-10PAK | |
| Rabbit anti-vWF antibody | Abcam | ab9378 | |
| Silicon wafer | Silicon Valley Microelectronics (SVM) | Wafers 4", Type N-1-10, 500-550 microns thick | |
| SU-8 2050 photoresist | Kayaku Advanced Materials, Inc | Y11058 | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials, Inc | Y020100 | |
| Tryton-X 100 | BioLab LTD | 57836 |
References
- Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4), 300-311 (2011).
- Landau, S., Guo, S., Levenberg, S. Localization of Engineered Vasculature within 3D Tissue Constructs. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 2 (2018).
- Griffith, C. K., et al. Diffusion Limits of an in Vitro Thick Prevascularized Tissue. Tissue Engineering. 11 (12), (2005).
- Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
- Landau, S., et al. Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation. Biomaterials. 122, 72-82 (2017).
- Lesman, A., et al. Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs. Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).
- Richards, D., Jia, J., Yost, M., Markwald, R., Mei, Y. 3D Bioprinting for Vascularized Tissue Fabrication. Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 132-147 (2017).
- Levenberg, S., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nature Biotechnology. 23 (7), 879-884 (2005).
- Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
- Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11, (2012).
- Gariboldi, M. I., Butler, R., Best, S. M., Cameron, R. E. Engineering vasculature Architectural effects on microcapillary-like structure self-assembly. PLOS ONE. 14 (1), 1-13 (2019).
- Blache, U., Guerrero, J., Güven, S., Klar, A. S., Scherberich, A. Microvascular Networks and Models, In vitro Formation. Vascularization for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. , 1-40 (2018).
- Wong, K. H. K., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. Microfluidic Models of Vascular Functions. Annual Review of Biomedical Engineering. 14 (1), 205-230 (2012).
- Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress. Biophysical Journal. 105 (10), 2240-2251 (2013).
- Pollet, A. M. A. O., den Toonder, J. M. J. Recapitulating the vasculature using Organ-on-Chip technology. Bioengineering. 7 (1), (2020).
- Hasan, A., et al. Microfluidic techniques for development of 3D vascularized tissue. Biomaterials. 35 (26), 7308-7325 (2014).
- Jordahl, J. H., et al. 3D Jet Writing: Functional Microtissues Based on Tessellated Scaffold Architectures. Advanced Materials. 30 (14), 1707196 (2018).
- Gauvin, R., et al. Microfabrication of complex porous tissue engineering scaffolds using 3D projection stereolithography. Biomaterials. 33 (15), 3824-3834 (2012).
- Coscoy, S., et al. Microtopographies control the development of basal protrusions in epithelial sheets. Biointerphases. 13 (4), 041003 (2018).
- Kaplan, B., et al. Rapid prototyping fabrication of soft and oriented polyester scaffolds for axonal guidance. Biomaterials. , (2020).
- Steier, A., Muñiz, A., Neale, D., Lahann, J. Emerging Trends in Information-Driven Engineering of Complex Biological Systems. Advanced Materials. 31 (26), 11806898 (2019).
- Szklanny, A. A., et al. High-Throughput Scaffold System for Studying the Effect of Local Geometry and Topology on the Development and Orientation of Sprouting Blood Vessels. Advanced Functional Materials. , 1901335 (2019).
- Welti, J., Loges, S., Dimmeler, S., Carmeliet, P. Recent molecular discoveries in angiogenesis and antiangiogenic therapies in cancer. Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3190-3200 (2013).
- Gui, L., Niklason, L. E. Vascular Tissue Engineering: Building Perfusable Vasculature for Implantation. Current Opinion in Chemical Engineering. 3, 68-74 (2014).
- Blache, U., Ehrbar, M. Inspired by nature: Hydrogels as versatile tools for vascular engineering. Advances in Wound Care. 7 (7), 232-246 (2018).
- Cochrane, A., et al. Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).
- Nemani, K. V., Moodie, K. L., Brennick, J. B., Su, A., Gimi, B. In vitro and in vivo evaluation of SU-8 biocompatibility. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 33 (7), 4453-4459 (2013).
- Mathew, R., Ravi Sankar, A. A Review on Surface Stress-Based Miniaturized Piezoresistive SU-8 Polymeric Cantilever Sensors. Nano-Micro Letters. 10 (2), 1-41 (2018).
- Knowlton, S., Yenilmez, B., Anand, S., Tasoglu, S. Photocrosslinking-based bioprinting: Examining crosslinking schemes. Bioprinting. 5, 10-18 (2017).
- Redd, M. A., et al. Patterned human microvascular grafts enable rapid vascularization and increase perfusion in infarcted rat hearts. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
- Zhu, Y., et al. SU-8 Photoresist. Encyclopedia of Nanotechnology. , 2530-2543 (2012).
- Zheng, F., et al. Organ-on-a-Chip Systems: Microengineering to Biomimic Living Systems. Small. 12 (17), 2253-2282 (2016).
- Freiman, A., et al. Adipose-derived endothelial and mesenchymal stem cells enhance vascular network formation on three-dimensional constructs in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 5 (2016).
- van Duinen, V., et al. Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform. Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).
- Nguyen, D. -H. T., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (17), 6712-6717 (2013).
- Nashimoto, Y., et al. Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).
- Rosenfeld, D., et al. Morphogenesis of 3D vascular networks is regulated by tensile forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3215-3220 (2016).
- Neto, F., et al. and TAZ regulate adherens junction dynamics and endothelial cell distribution during vascular development. bioRxiv. , 174185 (2017).
