Summary
設計された組織は、重要な栄養素やガスを提供し、代謝廃棄物を除去するために適切な血管ネットワークに大きく依存しています。この研究では、内皮細胞と支持細胞の段階的な播種プロトコルにより、制御された3D環境における血管挙動の開発を研究するための高スループットプラットフォームで、高度に組織化された血管ネットワークを作成する。
Abstract
心血管系は、人間の生理学の重要なプレーヤーであり、体内のほとんどの組織に栄養を提供します。血管は、各特定の浸透組織に応じて異なるサイズ、構造、フェノタイプ、および性能で存在する。損傷または欠けている身体組織の修復または置き換えを目的とする組織工学の分野は、制御された血管新生に依存して、設計された組織内で適切な血管導入を生み出す。血管系がなければ、厚い工学的な構造は十分に栄養を与えられず、細胞死、生着不良、そして最終的には失敗を引き起こし得る。このように、操作された血管の挙動を理解し、制御することは、この分野における顕著な課題です。この研究は、3D足場環境における船舶行動を研究するための組織的かつ繰り返し可能な船舶ネットワークの作成を可能にするハイスループットシステムを提示する。この2段階のシーディングプロトコルは、システム内の血管が足場地形に反応し、血管が存在する区画形状に応じて独特の発芽動作を示すことを示しています。この高スループットシステムから得られた結果と理解は、より良い3Dバイオプリント足場構築設計を知らせるために適用することができ、細胞化された生物学的環境の基礎として3Dプリンティングを使用する場合、様々な3Dジオメトリの製造を迅速に評価することはできません。さらに、この高スループットシステムからの理解は、迅速な薬物スクリーニングの改善、共培養モデルの急速な開発、血管形成に関する機械的刺激の検討を行い、血管系の知識を深めるために利用することができる。
Introduction
組織工学の分野は、欠損または損傷した器官および組織を置き換えるために設計された構造の製造に向けて急速に進んでいる1.しかし、組織の栄養のための運用血管ネットワークを生成することは依然として顕著な課題であるため、完全に機能する構造はまだ達成されていません。適切な血管化がなければ、工学的組織は酸素および栄養素の受動的拡散輸送に限定され、最大生存可能な組織厚さを拡散限界まで拘束し、約200μm2。このような厚みは、大きな組織欠損を修復したり、機能的および埋め込み型組織に必須の特性を機能的な血管ネットワークの存在をレンダリングする全臓器製造のためには適していない。
血管系は、多種多様な血管から構成され、サイズ、型、組織が異なり、宿主組織と密接に関連している。開発船と発芽船によって行われた行動、応答および移行の決定を理解することは、設計された組織4におけるそれらの統合を指示することができる。現在、インビトロ血管ネットワークを作成するための最も一般的なアプローチは、3次元のマイクロ環境内に播種された内皮細胞(EC)と支持細胞(SC、壁画細胞に分化する能力)を組み合わせることです。この環境は、細胞が血管ネットワーク2、5、6、7、8に接続し、増殖し、自己組み立てできるように、化学的および物理的な手がかりを提供します。共同培養すると、SCは細胞外マトリックス(ECM)タンパク質を分泌すると同時に、管状構造を形成するECsに機械的なサポートを提供します。さらに、両細胞型間の交差相互作用は、管切垂、血管発芽および遊走を促進し、SCの成熟およびα平滑筋アクチン発現(αSMA)壁画細胞への分化に加えて4。血管ネットワークの開発は、ヒドロゲル、多孔質ポリマー足場、またはその組み合わせを使用して作成された3D環境で最も一般的に研究されています。後者のオプションは、セルに優しい環境と、セルと ECM9の両方に必要な機械的サポートを提供します。
ヒドロゲル10上の細胞を共培養する、ヒドロゲルス足場の組み合わせ11、12、2Dプラットフォーム、およびマイクロ流体デバイス13を含む血管発達を研究するために多量の作業が行われている。しかし、ヒドロゲルは細胞力14によって容易に変形することができるが、2Dおよびマイクロ流体システムは、より近い自然環境を再現できず、より外界的な応答15、16を得る。形成容器が周囲の環境にどのように反応するかを理解することは、予測可能な方法で血管の開発を導く能力を備えたエンジニアリングされた環境の製造を可能にする重要な洞察を提供することができます。血管形成現象を理解することは、ステレオリソグラフィ、デジタル投影リソグラフィ、連続液体界面生産、3Dメルトエレクトロジェットライティング、ソリューションベースの3Dエレクトロジェット書き、および新しいバイオプリンティング技術17、18、19、20、21などのサブミクロンからミクロンへのスケール製造技術の急速な出現に追いつくために特に重要である。これらのマイクロマニュファクチャリング技術の制御を血管生物学の深い理解と整合させることは、標的組織に対する適切な工学的血管構造の作成の鍵となる。
ここでは、周囲の足場幾何学に対する新しい形成および発芽容器の応答を研究し、その芽発生とその後の移行22を観察する3Dシステムを提示する。テッセレーションコンパートメントの形状を持つ3Dスキャフォールドと2段階のシード技術を駆使し、明確で簡単に解析できる血管ネットワークを作り出すことに成功しました。テッセレーションされたジオメトリは、ローカル環境に応答する容器を含む個々のユニットで高スループットシステムを提供します。多色の IC を使用して、スプラウトの形成の原点とその後の移行パターンを追跡し、コンパートメント ジオメトリと SC 位置22と相関しました。
提案されたプロトコルは、幾何学的手がかりが血管化行動に及ぼす影響を分析するために準備されているが、このアプローチは拡大され、様々な新しいアプリケーションに適用することができる。テッセレーションされた足場と容易にイメージ可能なネットワークは、異なるICおよびSC相互作用の簡単な分析、特定の器官細胞の追加および血管ネットワークとの相互作用、血管ネットワークへの薬物効果などを可能にする。私たちの提案されたシステムの結果は非常に多目的で、簡単な製造および処理の。
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Protocol
1. テッセレーション足場製作
メモ:フォトリソグラフィは、ナノファブリケーション施設/研究室内に通常収容される特殊な機器を必要とする広範な技術です。このプロトコルでレイアウトされたメソッドは、聴衆のために可能な限り一般化されました。ただし、読者が利用できる機器によっては、手順を若干変更する必要があります。これらの手順は、ナノファブリケーション施設のクリーンルームで行い、最高のプロセス品質を確保することをお勧めします。始める前に、マスクアライナー(またはUV露光セットアップ)、スピンコーター、ホットプレート、溶剤洗浄ステーション、フォトマスク、およびプラズマクリーナーへのアクセスを取得します。手順に使用される溶剤や化学物質は危険ですので、化学物質への暴露を避けるため、細心の注意を払ってください。フォトマスクを設計する際、シリコンウエハーとフォトマスクのサイズがスピンコーターおよびマスクアライナーと互換性があるかを特定します。さらに、シリコンウエハの縁に向かって位置するフォトレジストは、通常、ハンドリングから変形します。したがって、ウエハーの中心領域に向けて設計を行います。
- 目的の選択したジオメトリを使用してフォトリソグラフィ技術を使用して足場を準備します。
- スピンコーティングの前に、シリコンウエハを清掃してください。これは、プラズマ洗浄または溶剤ベースの技術で行うことができます。プラズマクリーニングの場合は、動作の詳細については、機器の標準操作手順に従ってください。圧縮窒素ガスをスプレーし、ウエハーを検査して、スピンコーティング前に破片がないことを確認します。このウエハは足場が作成される基材として機能する。
注:最良の結果を得るには、新鮮なウエハーから始めます。ウエハーは再利用できますが、古いフォトレジスト、表面欠陥、破片を含まない必要があります。取り扱いにはウエハーピンセットを使用すると便利です。 - ガイドを使用してスピンコーターチャックにシリコンウエハーをセンタします。ウエハを短く回転してチャックを適切に中央に配置し、必要に応じて適切に中央に配置します。これは、ウエハーがスピンコーターに置かれるたびに行う必要があります。リフトオフ試薬の1〜4 mLをウエハに塗布します(これはウエハの大きさに依存します)。約2mLのリフトオフ試薬は、4インチのウエハーに適しています。
- スピンコーターの拡散速度を500rpmで5秒間、スピン速度を1000rpmに30秒間設定し、リフトオフ試薬をスピンします。ウエハを点検して、ウエハ全体に均一なコーティングがあることを確認します。ウェーハに残った破片は、この時点で非常に明白になります。破片のある地域の足場は使用できない可能性があります。スピンコート後、ホットプレートに移し、200°Cで1分間焼きます。
- 合計 3 つのコーティングについて、前の手順をさらに 2 回繰り返します。
- 約100μmの厚さを得るまで、SU-8 2050フォトレジストでシリコンウエハをコーティングしたリフトオフ試薬をスピンコートします。
- 基板直径の25mmごとに1mLのレジストを塗布します。
注:レジストを注ぐ間は、泡を避けるように注意してください。SU-8 2050では、4インチシリコンウエハを使用する場合、直径約2インチの円を注ぎます。 - SU-8 2050をスピンコートします。500 rpmの速度で5秒間広がり、続いて1700~1800rpmのスピン速度で約100μmの厚さを実現します。
-
任意:回転させた後、事前ベークの前に光から保護されたレベルの表面に一晩脱ガスするために、スピンコートされたウエハーを残します。これは、任意の気泡の抵抗を取り除き、欠陥がレベルアウトすることを可能にするのに役立ちます。
注: レジストの実際の厚さと結果の足場は、ユーザのエラーと機器のパラメータによって異なる場合があります。したがって、足場の厚さは、ステップ1.6で後で検証する必要があります。目的の厚さを達成するために、スピンコーティング手順を適宜変更します。
- 基板直径の25mmごとに1mLのレジストを塗布します。
- 露光する前に、ウエハースを65°Cで10分間予め焼き、95°Cで40〜50分間予ベークします。露出する前に、ピンセットでエッジを押してレジストの表面をテストし、粘着性/粘性がなくなったことを確認します。ホットプレートからウエハーを引き出し、粘着度を評価する前に0.5〜1分間冷却すると便利です。
注: 温度ランプの遅い時間(加熱と冷却)は、足場の歪みを防ぐのに役立つ場合があります。
- スピンコーティングの前に、シリコンウエハを清掃してください。これは、プラズマ洗浄または溶剤ベースの技術で行うことができます。プラズマクリーニングの場合は、動作の詳細については、機器の標準操作手順に従ってください。圧縮窒素ガスをスプレーし、ウエハーを検査して、スピンコーティング前に破片がないことを確認します。このウエハは足場が作成される基材として機能する。
- 85 -110 μmの抵抗の厚さのための215-240 mJ/cm2 の露出エネルギーのフォトマスクを通してUVライト(350-400 nm)にフォトレジストを露出させます。推奨される露光エネルギーと厚さの相関については、フォトレジストメーカーのガイドラインを参照してください。
- エネルギーが検証されるように、露出が正しく調整されていることを確認します。必要な露光エネルギーを得るために必要に応じて露光時間を調整します。さらに、マスクアライダは、真空接触、ハードコンタクト、ソフトコンタクト、近接接触(特定の項が異なる場合があります)など、さまざまな露出モードを可能にする場合があります。通常、解像度と機能の配置に影響します。著者らは通常、「ハードコンタクト」モードを使用した。
- 位置合わせが重要な小さなフィーチャまたは複数のレイヤーの場合は、露出モードとマスク アライナーの手順を慎重に検討してください。厚さの値を調整するときは、必ずレジストの高さを考慮してください。操作の詳細については、マスクアライアラーの標準操作手順を参照してください。
注: フォトマスクのデザインにより、スキャフォールドのサイズ、コンパートメントのジオメトリ、およびバッチごとに取得されるスキャフォールドの数が決まります。硬いガラスまたは石英フォトマスクを使用すると、最高の解像度が得られます。しかし、ソフトポリマー透明フィルムフォトマスクは、一般的にこれらの大きな特徴サイズ(>10 μm)に使用することができます。フィルムフォトマスクを使用すると、特徴の解像度が悪くなる結果として、足場の毛穴の Z 軸に沿って地形的特徴が生じる可能性があります。これは、細胞の動作に影響を与える可能性があります。希望する解像度が達成されることを確認するために、フォトマスクを製造している人との希望の解像度の相談を確認します。
- 65°Cで65°Cでウエハースを2〜5分間焼き、95°Cで8〜10分間焼きます。
- 未開発のレジストを除去するために足場を開発します。
- 低容量のSU-8現像液を使用してスキャフォールドを7〜10分間浸し、未開発のレジストを溶解します。
- イソプロピルアルコール(IPA)でリンスします。
- 圧縮窒素を用いた乾燥ウエハー。
注: ステップ 1.4 の間に、スキャフォールディングの早期リリースが起こるように注意してください。これを達成するには、開発者の少ない量と穏やかな取り扱いが必要です。
- 開発後、150°Cで15分間、ウエハースをハードベークします。
注:ハードベーク後、ホットプレートをオフにしてウエハースが非常にゆっくりと冷却できるようにすると、最終的な足場の反り/カールを防ぐのに有利になる可能性があります。 - 任意:ハードベークに続き、リフトオフする前に、足場はまだウエハーの表面に穏やかに付着する必要があるため、足場の厚さを評価します。この手順では、連絡プロフィロメトリーがうまく機能します。ただし、適切な方法を採用することができます。
- ウエハーから足場を持ち上げます。
- SU-8開発者に足場を沈め、すぐにウエハーを持ち上げます。足場が持ち上がらない場合は、ウエハーピンセットで足場を軽く押します。
- 余分な開発者を削除します。
- 足場を新しい容器に移し、イソプロピルアルコールに沈めます。すべての開発者が削除されたことを確認するために、最低6回IPAでリンスします。
- 空気は使用前に最低1週間足場を乾燥させます。
2. スキャフォールドフィブロネクチンコーティング
- 消毒のために、70%エタノール(v/v)で最低15分間足場を沈め、使用前にリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗浄する。
注意:SU-8足場は虚弱であり、容易に壊れる可能性がある。ハンドリングは、鈍い先端の鉗子を使用することを推奨し、それらは最も細心の注意を払って扱われるべきである。スキャフォールドを液体に沈めることで容易に取り扱いができ、足場と表面の間の静電気的な相互作用を避けることができます。 - PBSで50μg/mLのヒトフィブロネクチンの希釈を調製し、タンパク質吸着によって足場を覆います。
- フィブロネクチンストック溶液1.5 μL(1 mg/mL)を、各スキャフォールドあたり28.5 μLのPBSと混合してシードします。好ましくは、ピペットの誤りを避けるために、すべての足場に使用されるフィブロネクチン希釈液を1つだけ調製する。
- 10個の足場の場合、285 μLのPBSに15μLのストックフィブロネクチン溶液を混合し、合計300 μLの50 μg/mLフィブロネクチン希釈液に相当します。
- 疎水性表面の上にスキャフォールドをまばらに置き(すなわち、非組織培養(非TC)10cm皿)、ステップ2.2.1で調製したフィブロネクチン希釈の30μLで各足場を覆う。
注意: スキャフォールドコンパートメントに泡が閉じ込められないようにしてください。気泡が存在する場合、それらは穏や滴または光ピペットの中で足場を穏やかに振ることによって除去することができる。 - プレートの蓋を交換し、フィブロネクチンで覆われた足場を37°C、湿度100%のインキュベーターに最低1時間置きます。
- インキュベーション後、PBSでスキャフォールドを軽くすすいでフィブロネクチン残骸を除去する。スキャフォールドは、使用前に最大1週間、4°CでPBSに保管することができます。
- フィブロネクチンストック溶液1.5 μL(1 mg/mL)を、各スキャフォールドあたり28.5 μLのPBSと混合してシードします。好ましくは、ピペットの誤りを避けるために、すべての足場に使用されるフィブロネクチン希釈液を1つだけ調製する。
3. 内皮細胞の播種
- 製造者が示すとおり、抗生物質溶液(Pen/Strep)、ウシ胎児血清(FBS)、内皮細胞増殖サプリメントなど、その対応する媒体キット成分と共に基底培地を混合して、EC培地を調製します。
- ヒト脂肪微小血管内皮細胞(HAMEC)を4 x106 細胞/mLの濃度でEC培地に懸濁させる。
注: リアルタイムイメージングは、使用された内皮細胞が蛍光タンパク質を発現するために以前にトランスフェクションされた場合、または非毒性の細胞質膜色素(さらに標識されたECsと呼ばれる)を使用して事前染色された場合に行うことができます。 - 鉗子を使用して、非TC 24ウェルプレートウェル上にウェルあたり1フィブロネクチンコーティング足場を置きます。
- 各足場にHAMEC懸濁液の25 μLの液滴を覆います。細胞接着を妨げる可能性があるため、懸濁液が足場から流れ出ないように注意してください。
- 蓋をプレートに置き、37°C、5%CO2、湿度100%のインキュベーターに入れます。60分以上、最大90分のインキュベートを行います。
注:インキュベーション中に、インキュベーター内の軌道シェーカーにプレートを置くと、足場の壁に細胞の取り付けが向上します。軌道シェーカーは5rpm以下に設定する必要があります。 - インキュベーション後、ピペットを使用して700 μLのEC培地を各ウェルに充填します。
注: 一部のセルは足場に付着せず、足場の空隙から落下するため、ウェルの底部に AC が表示されます。 - 管鏡壁の蛍光顕微鏡(標識付きICを使用する場合)を使用してEC合流を観察できるまで、または3日間(非標識ICを使用する場合)、EC合流を達成するのに十分な時間を提供するまで、内皮化された足場をインキュベートします。1 日おきにメディアを変更します。
4. 細胞の播種と共培養をサポート
- 歯科パルプ幹細胞(DPSC)培地(DPSCm)を調製し、低グルコースダルベックコの修飾イーグル培地(低グルコースDMEM)、FBSの57.5 mLを混合することによって、 5.75 mLの非必須アミノ酸(NEAA)、グルタマックス5.75 mL、ペニシリンストレプトマイシン-ナイスタチン溶液5.75 mL。
- 内皮化された足場を新しい非TC 24ウェルプレートに移し、鉗子を使用して井戸底に取り付けられたECsを廃棄します。
- 1 mL ピペット、または真空吸引を使用して、現在のプレートからすべての媒体を廃棄します。足場に真空をまっすぐに当てないように注意してください。
- 表面張力効果のために壁に向かって液体を走らないように、ウェルあたり1つの足場を置きます。スキャフォールドの周囲を軽い真空で乾燥させますが、足場の完全な乾燥は避けてください。
- フィブリンプレゲル溶液でDPSC懸濁液を調製します。
- PBSでスロンビンおよびフィブリノーゲンのストック溶液を希釈し、最終的な濃度がそれぞれ5 U/mLと15mg/mLを得る。
- 5 U/mLトロンビン希釈液に8 x 106 DPSC/mLサスペンションを用意し、種をまくスキャフォールドごとに12.5μLの個々のエペンドルフで分配します。
- 5~50 μL のピペット(または類似)を 12.5 μL にセットし、15 mg/mL フィブリノーゲン溶液で充填します。
- チップを取り外さずに、ピペットを25μLに設定します。先端の材料は上昇し、先端の開口部に向かって空のボリュームを残す必要があります。
- 液体が先端の開口部に届くまで、プランジャーボタンをゆっくりと押しますが、漏れ出しません。プランジャーをこの位置に持ち、トロンビン懸濁液中の細胞を含むマイクロ遠心分離管の1つにチップを入れ、先端が液体に接触していることを確認します。
注意:フィブリン架橋は、トロンビンとフィブリノーゲンが接触した直後に開始されます。次の手順は、すぐに行う必要があります。 - プランジャーボタンをそっと放し、セルサスペンションを先端に引き込みます。両方の材料を十分に混合し、泡の形成を避けます。
- 内皮化足場の上に混合材料を素早く分配する。各スキャフォールドに対して上記の手順を繰り返し、チップ内の予期しないフィブリンゲル形成を避けるために、使用間のチップを常に変更してください。
- プレート蓋を交換し、37°C、5%CO2、湿度100%で30分間インキュベートします。
- インキュベーション後、1:1 DPSCおよびEC培地の1 mLで各ウェルを充填します。
- 1週間の培養、一日おきに培地交換。
- 培養中に、ウェルから培地を取り出し、異なる時点で共焦点顕微鏡を使用して構築物を画像化し、血管の発達または他の目的のパラメータを研究する。
注: この手順は、ラベル付きの IC を使用して実験を実行する場合にのみ実行できます。詳細については、ステップ 6 - 注 を参照してください。
5. 特徴的な血管マーカーの免疫蛍光染色
注: 次の手順は、構成体が培養された井戸と同じウェルで実行できます。ソリューションがスキャフォールドを完全にカバーしていることを常に確認することが重要です。さらに、可能な場合は、オービタルシェーカーでのステップを実行することは必須ではありませんが、推奨されます。
- 7日目に、井戸から培地を捨て、PBSを井戸に加えて足場をすすいで、真空を使用して取り除きます。
- 4%パラホルムアルデヒドを20分間加えて足場を固定します。PBSで3回、1回5分で洗います。
- PBS(v/v)で0.3%トリトン-Xを使用して15分間、固定細胞を透過させます。PBSで3回、1回5分で洗います。
- PBS(w/v)ブロッキング溶液に5%のウシ血清アルブミン(BSA)を準備し、足場を覆います。室温で1時間放置します。
注: 必要なソリューションの量はすべて、染色するスキャフォールドの数によって異なります。必要に応じて、記載された濃度を維持して溶液を準備します。 - 一次抗体染色液を準備し、適用する。
- 希薄いブロッキング溶液中の希薄ウサギ抗フォン・ヴィレブランド因子(vWF)抗体1:150およびマウス抗SMA抗体1:50。
注: CD31 や VE-カドヘリンなどの他の内皮細胞マーカーを使用できます。 - 足場を一次抗体溶液で覆い、一晩4°Cに保ちます。PBSで3回、1回5分洗浄します。
- 希薄いブロッキング溶液中の希薄ウサギ抗フォン・ヴィレブランド因子(vWF)抗体1:150およびマウス抗SMA抗体1:50。
- 二次抗体染色液を調製し、適用します。
- 希ヤギ抗マウスCy3抗体 1:150 およびヤギ抗ウサギ アレクサ-フルオール 488 1:400 PBS.
- スキャフォールドを二次抗体溶液で覆い、室温または夜間4°Cで最低3時間インキュベートします。PBSで3回、1回5分洗浄する。PBS(v/v)で0.3%のPFAで最大1ヶ月間染色された足場を保管してください。
6. 足場共焦点イメージングと血管開発解析
注:次の手順は、選択した最終時点で固定および染色された足場、または蛍光細胞を使用した場合、実験を終了する必要なく細胞培養期間中に実行できます。後者の場合は、特定の時間ポイントを設定することをお勧めします。この作業は、SC シードの前の 0 日目と、SC シード後の 1、3、5、および 7 日目 (図 3A)を示しています。
- 5Xレンズと0.5のズームと足場のフルz範囲を使用して足場をイメージします。これにより、2 乗ジオメトリと円形ジオメトリ用の 9 つの独立したコンパートメント、または六角形ジオメトリの 8 つの完全なコンパートメントをキャプチャできます。蛍光信号と透過光を画像化して、容器ネットワーク構造とコンパートメント形状の両方を得た(図3A)。
- ImageJ (または他の画像処理ソフトウェア) を使用して、個々のコンパートメントをトリミングします。このプロセスでは、血管ネットワークマーカーのみが関連しています。 コンパートメントエリア内にない容器を取り外します。 最大強度投影を作成し、個々のトリミングされたコンパートメントを TIFF イメージとして保存します。
- ImageJ で、[ ファイル> Open] を押して、複数のコンパートメントを含む目的の TIFF イメージを選択します。画像には、少なくとも2つのチャネル、蛍光容器ネットワーク、および透過光画像が必要です。
- ツールバーから[ ポリゴン]選択 ツールを選択します。送信光チャンネルを選択します。六角形のコンパートメントの角の1つをクリックして、コンパートメント領域と足場壁との間のインタフェースで、これはマスク定義を開始します。最初のコーナーが選択されるまで、次のコーナーを順番にクリックし続け、マスクを閉じます。
注: この説明は六角形のコンパートメントに適用されます。コンパートメントが 2 乗または円形の場合は、それぞれ [長方形] または [楕円 ]ツールを使用して、適切なマスクを作成します。形状に関係なく、マスクは常に足場の内壁に沿ってフィットします。 - [> ツール> ROI マネージャの分析] をクリックします。ROI マネージャ (ROI、対象地域) で、[ 追加 ] ボタンをクリックして、作成したマスクを保存します。新しいマスクが左側のリストに表示されます。この手順により、異なる画像間で解析の一貫性を保つ。
注: ROI マネージャでは、[その他の>保存] をクリックすると、作成したすべてのマスクを含 むファイルを保存できます。 [選択の保存] ウィンドウで、名前と場所を選択し、.roi ファイルを保存します。マスクを取得するには、ROI マネージャで[ その他の>を開く ] をクリックし、目的の .roi ファイルを選択します。 - 蛍光容器ネットワークイメージを選択し、[ 外部>クリアの編集]をクリックします。マスクに含まれる画像のみが残り、残りは除去されます。
- クリアされたネットワーク イメージを開いた状態で、[ イメージ>複製] をクリックします。[ 複製 ] ポップアップ ウィンドウに、イメージの名前を書き込みます。 [重複ハイパースタック ] が選択されている場合は、選択を解除して [OK]をクリックします。切り抜かれた蛍光容器ネットワークのみを含む新しい画像が作成されます。
- [TIFF 形式で保存] > をクリックして、トリミングされたイメージ >保存します。名前とディレクトリを選択し 、[OK]をクリックします。
- トリミングされた画像の血管の発達を分析します。
- さまざまな血管パラメータを定量化するための定量的ツールを提供する分析フリーソフトウェアAngioToolをダウンロードしてインストールします。本ソフトウェアは、以下のアドレス https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home から入手できます。
- ミリ単位で結果を取得し、イメージをロードするために、画像のスケール値を設定します。
- [ 設定 ] タブをクリックし、[ 距離(ピクセル単位)] と [距離(mm)] に、撮影した画像の代表的な値を入力します。上記のイメージングパラメータを使用して、塗りつぶす値は1mmあたり400ピクセルです。
- [ 画像を開く ] ボタンを押して、目的の画像を参照します。
- [解析]タブで、容器の開発を定量化するための解析パラメータを 選択 します。
- [ 血管の直径と強度 ]フィールドで、上部範囲セレクターから現在のマーカーの選択を解除し、番号3を表すマーカーをアクティブにします。
- 容器の 直径と強度 フィールドの下で、下の範囲のセレクターで、下の範囲マーカーを60に移動し、255で高レンジャーメーカーを残します。
- [小さいパーティクルを削除]ボックスをアクティブにし、マーカーを 100 に設定します。
- [ 保存設定] フィールドで、結果を保存するスプレッドシート ファイルの名前と場所を選択し、[ 分析の実行 ] ボタンを押します。 [結果イメージを保存] ボックスを選択すると、血管ネットワークの定量化されたパラメータを示す新しいjpeg画像が生成され、保存されます。
注: スプレッドシート ファイル名を変更せずに実行した各分析では、新しい行がファイルの下部に追加され、新たに取得した結果が表示されます。
- データを整理し、統計分析を実行します。
- すべての処理された画像について、対象となるパラメータ(例えば、全容器長および容器面積)から選択し、それらを統計解析ソフトウェアに入力して、得られた結果を適切に研究します(図3C)。
7. 発芽発生源検出および移行追跡のためのタイムラプスイメージング
- あるいは、工程4.6に記載されているようにインキュベーターで足場を培養し、共焦点顕微鏡培養チャンバーを37°C、5%CO2および100%湿度に設定する。
- 完全にシードされた足場を含むプレートを共焦点顕微鏡室に入れ、イメージングパラメータを所望の値に設定します。
- 画像の撮影間隔を30分、イメージング時間の合計を72時間に設定します。これにより、中程度の変更を必要とせずに、完全に時間経過を実行できるようになります。
注意:より長い時間経過イメージングが望ましい場合は、媒体の変更が共焦点インキュベーターから滅菌生物学的フードにプレートを取り除く必要があるため、元のイメージング位置を取得できるように慎重な位置較正を行う必要があります。
注: SC のシーディング(ステップ 4)後、最初の 1 時間以内にスキャフォールディングウォールとチューブ構造の形成から AC が分離され、完了するまでに最大 50 時間かかる場合があります。最初の管形成の後、新しい芽は周囲の容器からコンパートメントに移動し始める。発芽およびそれ以降のネットワークの改造は、船舶ネットワークが安定した22になる10日目まで、実験を通して続く。この情報を使用して、時間経過の開始点と時間ステップを適切に選択します。
- 完全なタイムラプスムービーファイルをTIFFシーケンスとして保存します。
- ImageJ を開き、[ファイル] > [イメージ シーケンス>インポート ] をクリックして、ファイルを選択します。これにより、TIFF シーケンスがムービーとして開きます。
- プラグインをクリックして手動追跡プラグインを開く>手動追跡.[追跡]ウィンドウが開きます。
- 映画を観察し、追跡する船を選択します。その起源と移行に注意してください。
- [ パラメータの表示 ] ボックスをオンにし、[ 時間間隔] に 30 分を入力します。 X/yキャリブレーション は、イメージング中に選択されたピクセル量によって異なります。
- スキャフォールド輪郭から発芽した血管を手動で追跡します。
- [トラックの追加]ボタンを押します。映画の最初のフレームで、追跡する船の位置を押します。この後、ムービーは自動的に次のフレームに変わります。
- 容器が配置されている2番目のフレームの画像をクリックします。繰り返しますが、ムービーは自動的に次のフレームに変わります。
- 完全な移動追跡が完了するまで、同じ船舶で進みます。
- [トラッキング] ウィンドウで、[ ドットとラインのオーバーレイ ] をクリックして、ムービー上の船舶移動の視覚的パスをインプリントします。これにより、トラックの現在位置を表すドットと、前のパスを示す線が含まれているムービーのコピーが開きます。
- 現在の船舶の動きを記録するには、 トラックの終了 ボタンをクリックします。
- 新しい船でやり直すためにトラックを 追加 ボタンをもう一度クリックしてください。これを行うと、ラインマーカーとドットマーカーは、新しい容器の色を自動的に変更します。すべての目的の容器が追跡されるまで繰り返します。
注:X/Yの位置、船舶の速度、移動距離は、ポップアップウィンドウ 結果から取得することができます。各船舶は、左端の列のトラック番号で識別されます。このデータをコピーして、さらに分析を実行するために、スプレッドシートに貼り付けることができます。
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Representative Results
提示されたプロトコルは、ステレオリソグラフィー技術を使用して、SU-8フォトレジストで作られたテッセレーション足場の製作を可能にする。異なるコンパートメントジオメトリ(正方形、六角形、円)を持つ足場と、精度の高い再現性の高い特徴が得られました(図1)。
図1:テッセレーションされた四角形、円形、六角足場の形状(スケールバー=500μm)の代表的な走査型電子顕微鏡画像。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
段階的な細胞播種(ステップ2〜4)では、作製された足場を使用して、高度に組織化された血管ネットワークを作成しました。従来の同時シードを使用して、ICとSCの両方を使用する場合、結果として得られる容器は明確な組織を欠いていた。このために、スキャフォールドフィブロネクチンコーティング(ステップ2)、足場内皮化工程をスキップ(ステップ3)、DPSCとHAMECを同時にフィブリンゲルに共播させた(ステップ4)。この方法では、細胞は足場(図2、上段)上に均一に分布し、周囲の足場と相互作用しないように見える予測不可能で組織化されていない血管ネットワークを生み出します。それどころか、まず足場の壁にICを播種すると、正確な初期内皮細胞パターニングが得られます。フィブリンゲル内に後でSCを添加すると、予測可能なチューブロージェネシス現象が発生し、足場の壁の形状に密接に従って血管が形成され、新しい血管が区画空間に移動します(図2、下列)。
図2:同時細胞播種とステップワイズ細胞の血管化比較IC(赤)とSC(緑)の同時(上段)細胞播種のためのテッセレーション足場における血管発達の代表的な画像、および1日目と5日目のステップワイズセルシード(下列)。段階的なシード処理は、足場の壁に従い、区画空間に芽を出す組織化された血管ネットワークをもたらします(スケールバー:100 μm)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
蛍光性ICを使用する場合、トランスフェクションまたは染色のいずれでも、各時点の実験を修正して終了する必要なしに、血管をリアルタイムで画像化することができます。EC(RFP-IC)を発現する赤色蛍光タンパク質を六角足場上で培養し、播種後に画像化した(図3A、Day0)。1日目にSCを追加し、血管ネットワークを1日おきに画像化して血管の発達を定量化した(図3A、日1、3、5および7)。各時点について、スキャフォールディング全体のワイド画像が撮影されました (図 3B)。すべてのコンパートメントについて、容器は主に閉じ込め内にある細胞を組織し、相互作用した。したがって、各コンパートメントを隔離し、コンパートメントの外側の余分な容器をImageJを使用して取り除いた。その後、クリーンな単一コンパートメント画像をAngiotoolを使用して分析しました。アンジオツールは、いくつかの容器パラメータを含むスプレッドシートファイルを返し、骨格、交点、血管表面などの主要なネットワーク特性を視覚的に表現しました。得られたデータを、統計解析ソフトウェアプリズムを用いて分析し、実験期間中に全血管長および面積について明確な血管成長を観察した(図3C)。1週間の実験では、図3Aおよび図2Cに示すように、船舶はさらに発達し、拡張することが期待される。船長または面積を減少させる、図2の最上列に示すように3日目までに血管を形成できなかったり、血管を形成したりすると、実験が失敗したと解釈できる。
図3:組織化された血管ネットワークの代表的な開発画像と分析. (A) ECs (赤) は、SC が後に播種された足場壁の合流点に達する。SC の追加は、実験の 0 日目を表します。SCの播種後1日目に、ICはコンパートメントスペースに切り離され、さらに数日で発芽して接続し続ける容器の形成を開始します。(B)血管ネットワーク解析のための共焦点画像処理ステップ(i)複数の区画を含む広い共焦点画像が撮影され、(ii)単一のコンパートメントが切り取られ(白い破線六角形でマーク)、(iii)血管網チャネルが分離され、区画壁の外側のすべての血管が切り取られる。単一のコンパートメント画像は、血管領域(黄色で輪郭を描いた)、血管長(緑色の線で表示)、交点(青い点としてマーク)などの視覚的マーカーで補完された血管パラメータのリストを返します。(C)異なる時点での六角形のコンパートメント内の全容器長と全容器面積の比較結果(結果は、SD、n>6、すべてのスケールバー:200μm)の平均±として提示される)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
多色のICを使用して単一細胞の識別を容易にし、単一の血管追跡を可能にするために共焦点イメージング時間の経過を行った(補足ビデオ1)。船舶は手動追跡画像Jプラグインを使用して観察され、追跡されました。先端細胞は、周囲の血管構造で血管が吻合されるまで、映画の各フレーム(図4A)に対して選択した。その結果、手動追跡プラグインは、船舶の移動を観察することを可能にする、リアルタイムで容器の経路を生成しました (図 4B).
図4:代表的な発芽船追跡(A)多色のIC(緑、赤、青)の時間経過は、単一の容器の識別を容易にするために使用されます。発芽容器は ImageJ プラグインマニュアル追跡を使用して識別され、追跡されます。容器の端側は、リアルタイムで追跡するために、すべての時間ポイントのためにマークされています。選択した船舶の終点を示すために、白色の黒色マーカーが追加されました。(B)結果として得られた容器の2D追跡は、ImageJプラグインによって処理されるとおり、ドットで最も遠い点を示し、そして形成された経路を線(スケールバー=200μm)で示した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
SMA+ SCの存在によって表される血管成熟は、提案されたプラットホームで容易に観察することができる。SMA+ SCの数が多い血管構造は、SMA発現が経時23の血管安定化と相関するため、より成熟したネットワークを表します。円形、六角形、二乗コンパートメントの場合、SMA+ SC の量は時間の経過とともに増加します (図 5A)。3日目までに、すべての形状は散在したSMA + SCと、芽がほとんどまたはまったくない非複雑な血管を示した。7日目までに、すべての形状は、血管を取り巻くSMA +SCの高い存在を有する、豊かで複雑な血管ネットワークを示した。さらに、より高い倍率画像は、形成された血管と共局化したより高いSMA+SC存在を明らかにし、SCの採用および血管構造を取り巻く分化を明らかにする(図5B)。
図5: SMA+ SCと血管は時間の経過とともに増加する。A) 平滑筋アクチン(赤)とvWF(血管、緑色)は、3日目と7日目に円形、二乗および六角形のコンパートメントの血管ネットワークに対して示されている。血管拡張とSMA発現サポートセル(SMA+SC)の両方が時間の経過とともに増加し、より高い血管成熟と複雑性(スケールバー= 200 μm)を意味します。B)SMA+ SC の代表的な画像は、7 日目の船舶の周囲に蓄積する密度が高い。合成画像中の核(青色)は、SMAタンパク質を発現していないSCの存在を明らかにします(スケールバー= 50μm)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足ビデオ1:船舶移動追跡のための多色のICのタイムラプス。 こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。
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Discussion
設計された組織に埋め込まれた中で豊かな血管系の必要性は、構築の生存と適切な機能1のために重要です。血管系のエンジニアリングは膨大な研究の焦点となってきましたが、24を調査して理解するために多くが残されています。特に、特定の組織を再作成する場合、マイクロバスキュアチュアは12に応じて動作し、整理する必要があります。マイクロ血管の生成のための最も一般的なアプローチは、細胞の付着、増殖、および血管形成に適合する適切な3D環境内での内皮および支持細胞の共播であり、血管形成25。この方法論は、多くの場合、非常に組織化されていないネットワークをもたらし、微小血管挙動22を研究することが困難になる。ここでは、提示されたプロトコルは、高度に組織化された血管ネットワークをハイスループットシステムで生成する新しいツールを提供し、時間を通じて容易に追跡および監視できる血管を有し、その発達および挙動を研究する。 ECの段階的なシード処理(ステップ2-3)、続いてSC(ステップ4)は、このような組織化されたネットワーク22を達成するための重要なステップである。さらに、この技術は血管モデルのための実際の3D環境を提示し、血管は3次元で移動し、関連する構造を作成することができる。対照的に、微小流体システムのような血管モデリングのためのより一般的な方法は、2.5D組織表現26のみを提供する。
提案された方法は容易に変更され、容器ネットワークの発達および行動に影響を与える多くの異なった要因を調査するために適用することができる。フォトリソグラフィーSU-8樹脂足場製作は、アルベオリやネフローティックユニットなどの複雑なネイティブコンストラクトに似た構造を設計する可能性を持つ、多種多様な形状26、27を作成することを可能にする印象的な汎用性を備えた一般的な技術です。それにもかかわらず、SU-8を使用することの欠点は、その低い生体吸収性27であり、プラットフォームは、移植可能な組織の代わりに、主に研究ツールになります。しかし、UV/可視光照明下で架橋できる生体適合性材料を利用し、立体撮影29のような正確な技術を用いて3Dプリントすることで、これを改善できる。得られた血管化構造は、次いで動物モデル30に移植することができる。システムのもう一つの制限は、足場最大達成可能な厚さを高い詳細精度で、立体式図法31によって制限される。提案されたプロトコルは、ネイティブの組織サイズを表す可能性のある薄い足場を作成するのに適しています。
このプラットフォームは、血管化現象4,32に影響を及ぼすいくつかの変数を調査する可能性を提供します。第1に、異なるタイプのECとSCとの相互作用と、それらの血管形成、発達および成熟能力と、異なる組織起源由来の細胞を使用する場合に異なることを知られている。第二に、成長因子、小分子、および阻害剤が血管系に及ぼす影響により、リアルタイム34,35での影響を明確に可視化できる。第3に、他の細胞型、スフェロイド、またはオルガノイドの添加と、それらの形成容器36とのコミュニケーションおよび相互作用が含まれます。このために、提案されたシステムは、微小血管系を調査するための強力なツールを表す。
今後のステップは、提案されたシステムを利用して、間質流や機械的伸張37,38などの機械的刺激が発達する血管構造に及ぼす影響を調査する。これは、血管メカノバイオロジーの現在の知識と最先端の研究を拡大する新しい側面に光を当てることを願っています。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、ミシガン大学- イスラエル研究パートナーシップからの資金によって支えられました。著者らは、ウリ・メルドラー、リオール・デビ、ガリア・ベン・デイビッドの大きな支援と支援、ミシガン大学ルーリー・ナノファブリケーション・ファシリティのナディーン・ワン博士とピラール・エレーラ・フィエロ博士、ルイス・ソロリオ博士のフォトリソグラフィー技術の議論に感謝したいと考えています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angiotool freeware | NIH-CCR | Free download at https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home | |
| Bovine albumin serum Probumin | Millipore | 82-045-1 | |
| Dental pulp stem cells | Lonza | PT-5025 | |
| ECM media + bullet kit | Sciencell | #1001 | |
| Ethanol 96% | Gadot-Group | 64-17-5 | |
| Evicel fibrin sealant | Johnson&Johnson | EVB05IL | Provides both thrombin and fibrinogen (BAC2) solutions |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| Goat anti-mouse Cy3 antibody | Jackson | 115-166-072 | |
| Goat anti-rabbit Alexa-Fluor 488 | Thermo- Fisher Scientific | A11034 | |
| Human adipose microvascular cells | Sciencell | #7200 | |
| Human fibronectin | Sigma | F0895-5MG | Stock concentration: 1 mg/mL |
| ImageJ | NIH | Free download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Isopropyl alcohol | Gadot-Group | 67-63-0 | |
| Lift-off reagent | Kayaku Advanced Materials, Inc | G112850 | Commercial name Omnicoat |
| Low-glucose DMEM | Biological Industries | 01-050-1A | |
| Mouse anti-SMA antibody | Dako | M0851 | |
| NEAA | Gibco | 11140068 | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | SC-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma | P5368-10PAK | |
| Rabbit anti-vWF antibody | Abcam | ab9378 | |
| Silicon wafer | Silicon Valley Microelectronics (SVM) | Wafers 4", Type N-1-10, 500-550 microns thick | |
| SU-8 2050 photoresist | Kayaku Advanced Materials, Inc | Y11058 | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials, Inc | Y020100 | |
| Tryton-X 100 | BioLab LTD | 57836 |
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