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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Semina cellulare graduale su impalcature tassellate per studiare i vasi sanguigni germogliati

Published: January 14, 2021 doi: 10.3791/61995
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Faculty of Biomedical Engineering, Technion, 2Department of Chemical Engineering and Biointerfaces Institute, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

I tessuti ingegnerizzati si affidano fortemente a reti vascolari adeguate per fornire nutrienti e gas vitali e rimuovere i rifiuti metabolici. In questo lavoro, un protocollo di semina graduale di cellule endoteliali e cellule di supporto crea reti vascolari altamente organizzate in una piattaforma ad alta produttività per lo studio dello sviluppo del comportamento dei vasi in un ambiente 3D controllato.

Abstract

Il sistema cardiovascolare è un attore chiave nella fisiologia umana, fornendo nutrimento alla maggior parte dei tessuti del corpo; i vasi sono presenti in diverse dimensioni, strutture, fenotipi e prestazioni a seconda di ogni tessuto perfuso specifico. Il campo dell'ingegneria tissutale, che mira a riparare o sostituire i tessuti corporei danneggiati o mancanti, si basa sull'angiogenesi controllata per creare una corretta vascolarizzazione all'interno dei tessuti ingegnerizzati. Senza un sistema vascolare, i costrutti ingegnerizzati spessi non possono essere sufficientemente nutriti, il che può causare morte cellulare, scarso innesto e, in ultima analisi, fallimento. Pertanto, comprendere e controllare il comportamento dei vasi sanguigni ingegnerizzati è una sfida eccezionale sul campo. Questo lavoro presenta un sistema ad alta produttività che consente la creazione di reti di navi organizzate e ripetibili per lo studio del comportamento della nave in un ambiente di impalcature 3D. Questo protocollo di semina in due fase mostra che i vasi all'interno del sistema reagiscono alla topografia dell'impalcatura, presentando comportamenti di germogliatura distintivi a seconda della geometria del compartimento in cui risiedono i vasi. I risultati ottenuti e la comprensione da questo sistema ad alta produttività possono essere applicati al fine di informare meglio i progetti di costrutti di impalcature biostampate 3D, in cui la fabbricazione di varie geometrie 3D non può essere rapidamente valutata quando si utilizza la stampa 3D come base per ambienti biologici cellularizzati. Inoltre, la comprensione da questo sistema ad alta produttività può essere utilizzata per il miglioramento dello screening rapido dei farmaci, il rapido sviluppo di modelli di co-colture e lo studio di stimoli meccanici sulla formazione dei vasi sanguigni per approfondire la conoscenza del sistema vascolare.

Introduction

Il campo dell'ingegneria tissutale sta rapidamente progredendo verso la fabbricazione di costrutti ingegnerizzati per sostituire organi e tessuti mancanti odanneggiati 1. Tuttavia, i costrutti pienamente funzionali devono ancora essere raggiunti, in parte, poiché generare reti vascolari operative per il nutrimento dei tessuti rimane una sfida eccezionale. Senza un'adeguata vascolarizzazione, i tessuti ingegnerizzati sono limitati a un trasporto passivo di diffusione di ossigeno e sostanze nutritive, vincolando lo spessore massimo vitale del tessuto al limite di diffusione, circa 200 μm2. Tali spessori non sono adatti a riparare grandi difetti tissutali o per la fabbricazione completa di organi, il che rende la presenza di rete vascolare funzionale una caratteristica obbligatoria per i tessuti funzionali e impiantabili3.

Il sistema vascolare è composto da un'ampia varietà di vasi sanguigni, con diverse dimensioni, fenotipi e organizzazione, strettamente correlati al tessuto ospite. Comprendere il comportamento, la risposta e le decisioni di migrazione prese dai vasi in via di sviluppo e germogliazione può istruire la loro integrazione nei tessutiingegnerizzati 4. Attualmente, l'approccio più comune per la creazione di reti vascolari in vitro è la combinazione di cellule endoteliali (EC) con cellule di supporto (SC, con la capacità di differenziarsi in cellule murali), sementi all'interno di un micro-ambiente tridimensionale. Questo ambiente fornisce segnali chimici e fisici per consentire alle cellule di attaccarsi, proliferare e auto-assemblarsi nelle retidi recipienti 2,5,6,7,8. Quando co-coltivati, i SCs secernono proteine della matrice extracellulare (ECM) fornendo al contempo supporto meccanico agli EC, che formano le strutture tubolari. Inoltre, un'interazione incrociata tra entrambi i tipi di cellule promuove la tubulogenesi, la germogliazione e la migrazione dei vasi, oltre alla maturazione e differenziazione delle SCs in cellule murali ad azione muscolare α lisce (αSMA)4. Lo sviluppo della rete di navi è più comunemente studiato in ambienti 3D creati utilizzando idrogel, impalcature polimeriche porose o una loro combinazione. Quest'ultima opzione fornisce allo stesso modo un ambiente adatto alle celle e il supporto meccanico richiesto sia per le celle che per l'ECM9.

È stato svolto un grande lavoro per studiare lo sviluppo vascolare, tra cui la co-ristrutturazione delle cellule su idrogel10,combinazioni idrogel-impalcature11,12,piattaforme 2D e dispositivi microfluidici13. Tuttavia, gli idrogel possono essere facilmente deformati dalle forze esercitate dalle cellule14, mentre i sistemi 2D e microfluidica non riescono a ricreare un ambiente più vicino alla natura per ottenere una risposta più estrapolabile15,16. Comprendere come i vasi di formatura reagiscono all'ambiente circostante può fornire informazioni critiche che potrebbero consentire la fabbricazione di ambienti ingegnerizzati con la capacità di guidare lo sviluppo della nave in modo prevedibile. Comprendere i fenomeni di formazione vascolare è particolarmente fondamentale per tenere il passo con la rapida comparsa di tecniche di fabbricazione su scala submicron-a-micron, come stereolitografia, litografia a proiezione digitale, produzione di interfaccia liquida continua, fusione-elettro jetwriting 3D, scrittura elettro getto 3D basata su soluzione e tecniche di biostampa emergenti17,18,19,20,21. Allineare il controllo di queste tecniche di microproduttore con una comprensione approfondita della biologia vascolare è fondamentale per la creazione di una vascolarizzazione ingegnerizzata appropriata per un tessuto bersaglio.

Qui presentiamo un sistema 3D per studiare la risposta dei nuovi vasi di formatura e germogliazione alla geometria circostante dell'impalcatura, osservandone l'origine del germoglio e la successivamigrazione 22. Utilizzando impalcature 3D con geometrie di compartimenti tassellati e una tecnica di semina in due fase, siamo riusciti a creare reti vascolari altamente organizzate in modo chiaro e facile da analizzare. Le geometrie tassellate forniscono un sistema ad alta produttività con singole unità contenenti vasi che rispondono al loro ambiente locale. Utilizzando ec multicolori, abbiamo monitorato le origini di formazione del germoglio e i successivi modelli di migrazione, correlati alla geometria del compartimento e alla posizione dei SCs22.

Sebbene il protocollo proposto sia stato preparato per analizzare gli effetti dei segnali geometrici sul comportamento di vascolarizzazione, questo approccio può essere ampliato e applicato a una varietà di nuove applicazioni. L'impalcatura tassellata e le reti facilmente identificabili consentono l'analisi diretta delle diverse interazioni di ECs e SCs, l'aggiunta di cellule d'organo specifiche e la loro interazione con le reti vascolari, l'effetto farmaco sulle reti vascolari e altro ancora. Il nostro sistema suggerito risulta molto versatile e di semplice fabbricazione e lavorazione.

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Protocol

1. Fabbricazione di impalcature tassellate

NOTA: La fotolitografia è una tecnica diffusa che richiede apparecchiature specializzate tipicamente alloggiate all'interno di un impianto /laboratorio di nanofabbricazione. Il metodo previsto da questo protocollo è stato generalizzato il più possibile per il pubblico; tuttavia, possono essere necessarie lievi modifiche alle procedure a seconda delle attrezzature a disposizione del lettore. Si consiglia di eseguire queste procedure in una stanza pulita presso una struttura di nanofabbricazione per garantire la massima qualità del processo. Prima di iniziare, ottenere l'accesso a un allineatore di maschere (o a qualche set-up di esposizione ai raggi UV), a uno spin coater, a piastre calde, a una stazione di lavaggio con solvente, a una maschera fotografica e a un detergente per plasma. I solventi e le sostanze chimiche utilizzati nella procedura sono pericolosi, quindi si prega di prestare la massima attenzione per evitare qualsiasi esposizione chimica. Quando si progetta la maschera fotografica, identificare quali wafer e fotomaschere in silicio di dimensioni sono compatibili con lo spin-coater e l'allineatore di maschere. Inoltre, il fotoresist situato verso i bordi del wafer di silicio è tipicamente deformato dalla manipolazione; quindi, fare i disegni verso l'area centrale del wafer.

  1. Preparare impalcature utilizzando una tecnica di fotolitografia con la geometria di interesse selezionata.
    1. Prima del rivestimento di rotazione, pulire il wafer di silicio. Questo può essere fatto con la pulizia del plasma o una tecnica a base di solvente. Se si pulisce il plasma, seguire la procedura operativa standard dello strumento per i dettagli operativi. Spruzzare con gas azoto compresso e ispezionare il wafer per assicurarsi che sia privo di detriti prima dello spin-coating. Questo wafer fungerà da substrato su cui vengono create le impalcature.
      NOTA: Per ottenere i migliori risultati inizia con un wafer fresco. I wafer possono essere ri-utilizzati ma dovrebbero essere esistiti da vecchi fotoresist, difetti superficiali e detriti. È utile utilizzare una pinzetta per wafer per la manipolazione.
    2. Centrare un wafer di silicio sul mandrino spin-coater utilizzando una guida. Ruotare brevemente il wafer per assicurarsi che sia stato centrato correttamente sul mandrino, regolare se necessario fino a quando non è centrato correttamente. Questo deve essere fatto ogni volta che un wafer viene posizionato sullo spin-coater. Erogare 1-4 mL del reagente lift-off sul wafer (questo dipenderà dalle dimensioni del wafer). Circa 2 mL di reagente lift-off funzionano bene per un wafer da 4 pollici.
      1. Impostare la velocità di diffusione dello spin-coater a 500 giri/min per 5 secondi e la velocità di rotazione a 1000 giri/min per 30 secondi, quindi ruotare il reagente lift-off. Ispezionare il wafer per assicurarsi che abbia un rivestimento uniforme attraverso il wafer. Eventuali detriti rimasti sul wafer saranno molto evidenti a questo punto. Eventuali impalcature in un'area con detriti saranno probabilmente inutilizzabili. Dopo il rivestimento di rotazione, trasferire su una piastra calda e cuocere per 1 minuto a 200 °C.
    3. Ripetere il passaggio precedente altre due volte per un totale di tre rivestimenti.
    4. Spin-coat il wafer di silicio rivestito di reagente lift-off con fotoresist SU-8 2050 fino ad ottenere uno spessore di circa 100 μm.
      1. Erogare 1 mL di resistenza per ogni 25 mm di diametro del substrato.
        NOTA: Fare attenzione a evitare bolle durante il versamento della resistenza. Per SU-8 2050, versare circa un cerchio di diametro di 2 pollici, quando si utilizza un wafer di silicio da 4 pollici funziona bene.
      2. Spin-coat il SU-8 2050. Stendere ad una velocità di 500 giri/min per 5 secondi, seguita da una velocità di rotazione compresa tra 1700 e 1800 giri/min per ottenere uno spessore di circa 100 μm.
      3. Facoltativo:dopo la filatura, lasciare i wafer rivestiti di spin per de-gas durante la notte su una superficie piana protetta dalla luce prima della pre-cottura. Questo può aiutare a liberare la resistenza da eventuali bolle e consentire ai difetti di livellare.
        NOTA: Lo spessore effettivo della resistenza e le impalcature risultanti possono variare in base all'errore dell'utente e ai parametri dell'apparecchiatura. Pertanto, lo spessore delle impalcature deve essere verificato in un secondo momento, al passaggio 1.6. Modificare di conseguenza le procedure di rivestimento di rotazione per ottenere lo spessore desiderato.
    5. Prima dell'esposizione, pre-cuocere i wafer a 65 °C per 10 minuti e poi 95 °C per 40-50 min. Prima dell'esposizione, testare la superficie della resistenza premendo sul bordo con un paio di pinzette per assicurarsi che non sia più di cattivo gusto / viscoso. È utile estrarre il wafer dalla piastra calda e lasciare raffreddarlo per 0,5-1 minuti prima di valutare la tackiness.
      NOTA: I tempi lenti della rampa di temperatura (riscaldamento e raffreddamento) possono aiutare a prevenire la dedichiarazione delle impalcature.
  2. Esporre il fotoresist alla luce UV (350-400 nm) attraverso una maschera fotografica con un'energia di esposizione di 215-240 mJ/cm2 per uno spessore di resistenza di 85 - 110 μm. Fare riferimento alle linee guida del produttore di fotoresist per le correlazioni consigliate di spessore energetico dell'esposizione.
    1. Assicurarsi che l'esposizione sia calibrata correttamente in modo tale che l'energia sia verificata. Regolare il tempo di esposizione in base alle esigenze per ottenere l'energia di esposizione desiderata. Inoltre, gli allineatori di maschere possono consentire diverse modalità di esposizione: contatto sottovuoto, contatto duro, contatto morbido e contatto di prossimità (i termini specifici possono variare). In genere, questi avranno un impatto sulla risoluzione e sull'allineamento delle funzionalità. Gli autori in genere usavano una modalità di "contatto rigido".
    2. Per le piccole feature o più livelli, in cui l'allineamento sarà importante, considerare le modalità di esposizione e le procedure di allineamento delle maschere con maggiore attenzione. Assicurarsi di considerare l'altezza della resistenza quando si regola il valore dello spessore. Per informazioni dettagliate sull'operazione, fare riferimento alle procedure operative standard dell'allineatore maschera.
      NOTA: Il design della maschera fotografica determinerà le dimensioni delle impalcature, la geometria del compartimento e il numero di ponteggi ottenuti per lotto. L'uso di una fotomaschera in vetro duro o quarzo produrrà la massima risoluzione; tuttavia, una morbida maschera fotografica a film trasparente polimerica generalmente può essere utilizzata per queste grandi dimensioni di caratteristiche (>10 μm). L'uso di una maschera film-fotomaschera può portare a caratteristiche topografiche lungo l'asse z dei pori dell'impalcatura a causa della risoluzione delle feature più scarsa. Questo potrebbe potenzialmente avere un'influenza sul comportamento delle cellule. Verificare la risoluzione desiderata consultare chiunque produca la maschera fotografica per garantire il consevio della risoluzione desiderata.
  3. Cuocere il wafer subito dopo l'esposizione ai raggi UV a 65 °C per 2-5 minuti e poi a 95 °C per 8-10 minuti.
  4. Sviluppare le impalcature per rimuovere la resistenza non sviluppata.
    1. Immergere le impalcature utilizzando un basso volume di soluzione per sviluppatori SU-8 per 7-10 minuti per sciogliere qualsiasi resistenza non sviluppata.
    2. Risciacquare con alcol isopropile (IPA).
    3. Wafer secco con azoto compresso.
      NOTA: Fare attenzione durante il passaggio 1.4 a non causare il rilascio prematuro delle impalcature. Per raggiungere questo obiettivo sono necessari bassi volumi di sviluppo e una gestione delicata.
  5. Dopo lo sviluppo, cuocere duramente i wafer a 150 °C per 15 minuti.
    NOTA: Dopo la cottura dura, spegnere la piastra calda per consentire ai wafer di raffreddarsi molto lentamente può essere vantaggioso per prevenire la curvatura / arricciatura delle impalcature finali.
  6. Facoltativo:dopo la cottura dura e prima del decollo, valutare lo spessore dell'impalcatura poiché le impalcature devono comunque essere delicatamente aderenti alla superficie del wafer. Per questa procedura, il contatto profilometria funziona bene; tuttavia, potrebbe essere utilizzato qualsiasi metodo appropriato.
  7. Sollevare le impalcature dal wafer.
    1. Immergere le impalcature nello sviluppatore SU-8 per farle sollevare immediatamente dal wafer. Se le impalcature non si sollevano, spingere delicatamente le impalcature con un paio di pinzette per wafer.
    2. Rimuovere lo sviluppatore in eccesso.
    3. Trasferire le impalcature in un nuovo contenitore e immergersi nell'alcol isopropile. Risciacquare in IPA per un minimo di 6 volte per assicurarsi che tutti gli sviluppatori siano stati rimossi.
  8. Asciugare all'aria le impalcature per un minimo di una settimana prima dell'uso.

2. Rivestimento di fibronectina impalcatura

  1. Per la disinfezione, immergere le impalcature in etanolo al 70% (v/v) per un minimo di 15 minuti e lavare 2 volte in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) prima dell'uso.
    ATTENZIONE: Le impalcature SU-8 sono fragili e possono rompersi facilmente. La manipolazione è consigliata utilizzando forcep smussati e a punta curva e devono essere maneggiati con la massima cura. Una manipolazione più semplice può essere ottenuta immergendo le impalcature in liquido, per evitare interazioni elettrostatiche tra le impalcature e la superficie.
  2. Preparare una diluizione di 50 μg/mL di fibronectina umana nel PBS e coprire le impalcature mediante adsorbimento proteico.
    1. Mescolare 1,5 μL di soluzione di fibronectina (1 mg/mL) con 28,5 μL di PBS per ogni impalcatura da seminare. Preferibilmente, preparare una sola diluizione di fibronectina da utilizzare per tutte le impalcature per evitare errori di pipettaggio.
      1. Per 10 ponteggi, mescolare 15 μL di soluzione di fibronectina in 285 μL di PBS, per un totale di 300 μL di diluizione di fibronectina da 50 μg/mL.
    2. Posizionare le impalcature scarsamente sopra una superficie idrofobica (cioè coltura non tissutale (nonTC) 10 cm piatto) e coprire ogni impalcatura con 30 μL della diluizione di fibronectina preparata nella fase 2.2.1.
      ATTENZIONE: Assicurarsi che nessuna bolla sia intrappolata nei compartimenti delle impalcature. Se sono presenti bolle, possono essere rimosse scuotendo delicatamente l'impalcatura all'interno della goccia o della pipettazione leggera.
    3. Sostituire il coperchio della piastra e posizionare le impalcature coperte di fibronectina in un'incubatrice con 37 °C e umidità al 100% per un minimo di un'ora.
    4. Dopo l'incubazione, sciacquare leggermente le impalcature in PBS per rimuovere i resti di fibronectina. Le impalcature possono essere conservate in PBS a 4 °C per un massimo di una settimana prima dell'uso.

3. Semina di cellule endoteliali

  1. Preparare il mezzo EC mescolando il mezzo basale con i suoi componenti corrispondenti del kit medio, tra cui una soluzione antibiotica (Pen/Strep), siero bovino fetale (FBS) e integratori per la crescita delle cellule endoteliali, come indicato dal produttore.
  2. Effettuare una sospensione della cellula endoteliale microvascolare adiposa umana (HAMEC) in mezzo CE con una concentrazione di 4 x 106 cellule/mL.
    NOTA: L'imaging in tempo reale può essere eseguito se le cellule endoteliali usate sono precedentemente trasfetate per esprimere una proteina fluorescente o pre-macchiate utilizzando un colorante a membrana citoplasmatica non tossico (ulteriormente indicato come EC etichettato).
  3. Utilizzando le forcep, posizionare un'impalcatura rivestita con fibronectina per pozzo su un pozzo di piastra nonTC da 24 po '.
  4. Coprire ogni impalcatura con goccioline da 25 μL della sospensione HAMEC. Fai attenzione a non lasciare che la sospensione fluisca lontano dall'impalcatura, poiché può ostacolare l'adesione cellulare.
  5. Mettere il coperchio sul piatto e metterlo in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 e 100% di umidità. Lasciare incubare per un minimo di 60 minuti e un massimo di 90 minuti.
    NOTA: Durante l'incubazione, posizionare la piastra su uno shaker orbitale all'interno dell'incubatore migliora l'attacco cellulare sulle pareti dell'impalcatura. Lo shaker orbitale deve essere impostato a non più di 5 giri/min.
  6. Dopo l'incubazione, riempire ogni bene con 700 μL di mezzo EC utilizzando una pipetta.
    NOTA: Aspettatevi di vedere gli EC nella parte inferiore del pozzo, poiché alcune delle celle non si attaccano all'impalcatura e cadono attraverso i vuoti dell'impalcatura.
  7. Incubare le impalcature endotelializzate fino a quando non si può osservare la confluenza EC usando la microscopia fluorescente sulle pareti dell'impalcatura (quando si utilizzano EC etichettati) o per 3 giorni (quando si utilizzano EC non etichettati), che fornisce abbastanza tempo per ottenere la confluenza EC. Cambia il mezzo a giorni dall'altra.

4. Sostenere la semina cellulare e la co-coltura

  1. Preparare il mezzo di cellule staminali della polpa dentale (DPSC) (DPSCm) mescolando 500 mL di mezzo Eagle modificato di Dulbecco a basso glucosio (DMEM a basso glucosio), 57,5 mL di FBS, 5,75 mL di amminoacidi non essenziali (NEAA), 5,75 mL di GlutaMAX e 5,75 mL di soluzione di penicillina-streptomicina-nystatina.
  2. Trasferire le impalcature endotelializzate in una nuova piastra nonTC a 24 pozza per scartare i HC attaccati al fondo dei pozzi utilizzando le forcep.
    1. Scartare tutti i supporti dalla piastra corrente utilizzando una pipetta da 1 mL o un'aspirazione sottovuoto. Fare attenzione a non applicare il vuoto direttamente sull'impalcatura.
    2. Posizionare un'impalcatura per pozzo, preferibilmente al centro del pozzo per evitare di correre liquido verso le pareti a causa di effetti di tensione superficiale. Asciugare l'area circostante l'impalcatura con vuoto leggero ma evitare la completa asciugatura dell'impalcatura.
  3. Preparare una sospensione DPSC in soluzione pre-gel fibrina.
    1. Diluire le soluzioni di stock di trombina e fibrinogeno con PBS fino ad ottenere una concentrazione finale rispettivamente di 5 U/mL e 15 mg/mL.
    2. Preparare una sospensione 8 x 106 DPSC/mL nella diluizione di trombina da 5 U/mL e distribuire in singoli eppendorf 12,5 μL di detta sospensione per impalcatura da seminare.
    3. Impostare una pipetta da 5-50 μL (o simile) a 12,5 μL e riempirla con la soluzione di fibrinogeno da 15 mg/mL.
    4. Senza rimuovere la punta, impostare la pipetta su 25 μL. Il materiale nella punta dovrebbe alzarsi e lasciare un volume vuoto verso l'apertura della punta.
    5. Premere lentamente il pulsante dello stantuffo fino a quando il liquido non raggiunge l'apertura della punta ma non perde. Tenere lo stantuffo in questa posizione e mettere la punta in uno dei tubi di microcentrifugo contenenti le celle in sospensione trombina, assicurandosi che la punta sia a contatto con il liquido.
      ATTENZIONE: Il collegamento incrociato della fibrina inizierà immediatamente dopo che la trombina e il fibrinogeno entrano in contatto. Il seguente passo dovrebbe essere fatto rapidamente.
    6. Rilasciare delicatamente il pulsante dello stantuffo e disegnare la sospensione cellulare nella punta. Mescolare accuratamente entrambi i materiali, evitando la formazione di bolle.
  4. Erogare rapidamente i materiali misti sopra un'impalcatura endoteliale. Ripetere i passaggi precedenti per ogni impalcatura, assicurandosi di cambiare sempre le punte tra gli usi per evitare una formazione imprevista di gel di fibrina all'interno della punta.
  5. Sostituire il coperchio della piastra e incubare le impalcature a 37 °C, 5% CO2 e 100% di umidità per 30 minuti.
  6. Dopo l'incubazione, riempire ogni bene con 1 mL di 1:1 DPSC e mezzo EC.
    1. Cultura per 1 settimana, cambiando mezzo a giorni diversi.
    2. Durante la coltura, rimuovere il mezzo dal pozzo e l'immagine dei costrutti utilizzando un microscopio confocale in diversi punti di tempo per studiare lo sviluppo vascolare o qualsiasi altro parametro di interesse.
      NOTA: questo passaggio può essere eseguito solo se l'esperimento viene eseguito utilizzando ec etichettati. Vedi passaggio 6 - NOTA per ulteriori chiarimenti.

5. Colorazione immunofluorescente per marcatori vascolari caratteristici

NOTA: I seguenti passaggi possono essere eseguiti negli stessi pozzi in cui i costrutti sono stati coltivati. È fondamentale assicurarsi sempre che le soluzioni coprano completamente le impalcature. Inoltre, quando possibile, si consiglia di eseguire i passaggi su uno shaker orbitale, anche se non obbligatorio.

  1. Al giorno 7, scartare il supporto dai pozzi e sciacquare le impalcature aggiungendo PBS ai pozzi e rimuovendolo usando il vuoto.
  2. Fissare le impalcature aggiungendo il 4% di paraformaldeide per 20 minuti. Lavare in PBS 3 volte, 5 minuti per lavaggio.
  3. Permeabilizzare le celle fisse utilizzando lo 0,3% di Tritone-X in PBS (v/v) per 15 minuti. Lavare in PBS 3 volte, 5 minuti per lavaggio.
  4. Preparare un'albumina di siero bovino al 5% (BSA) in soluzione di blocco PBS (w/v) e coprire le impalcature. Lasciare a temperatura ambiente per 1 ora.
    NOTA: Tutti gli importi della soluzione richiesti dipenderanno dal numero di impalcature da macchiare. Preparare le soluzioni in base alle esigenze mantenendo le concentrazioni dichiarate.
  5. Preparare e applicare la soluzione di colorazione degli anticorpi primari .
    1. Diluire l'anticorpo del fattore anti-von Willebrand del coniglio (vWF) 1:150 e l'anticorpo anti-SMA del topo 1:50 in soluzione di blocco fresco.
      NOTA: Possono essere utilizzati altri marcatori di cellule endoteliali, come CD31 o VE-Cadherin.
    2. Coprire le impalcature con la soluzione di anticorpi primari e conservare a 4 °C durante la notte. Lavare in PBS tre volte, 5 minuti per lavaggio.
  6. Preparare e applicare la soluzione di colorazione degli anticorpi secondari.
    1. Diluire l'anticorpo Cy3 anti-topo di capra 1:150 e l'anti-coniglio di capra Alexa-Fluor 488 1:400 in PBS.
    2. Coprire le impalcature con la soluzione di anticorpi secondari e incubare per un minimo di 3 ore a temperatura ambiente o a 4 °C durante la notte. Lavare 3 volte in PBS, 5 minuti per lavaggio. Mantenere l'impalcatura macchiata nello 0,3% di PFA in PBS (v/v) per un massimo di un mese.

6. Imaging confocale dell'impalcatura e analisi dello sviluppo dei vasi

NOTA: I seguenti passaggi possono essere eseguiti sulle impalcature fisse e macchiate nel punto di tempo finale scelto o, se sono state utilizzate celle fluorescenti, durante il periodo di coltura cellulare senza la necessità di terminare l'esperimento. Per quest'ultimo, si consiglia di impostare punti di tempo specifici; questo lavoro mostra il giorno 0 (prima della semina dei SCs) e i giorni 1, 3, 5 e 7 dopo la semina dei SCs (Figura 3A).

  1. Immagine delle impalcature utilizzando un microscopio confocale con un obiettivo 5X e uno zoom di 0,5 e l'intera gamma z dell'impalcatura. Ciò consentirà di catturare 9 scomparti separati per le geometrie squadrate e circolari, o 8 scomparti completi per la geometria esagonale. Immagine del segnale fluorescente e della luce trasmessa, per ottenere sia la struttura della rete del contenitore che la geometria del compartimento (Figura 3A).
  2. Utilizzando ImageJ (o qualsiasi altro software di elaborazione delle immagini), ritagliare ogni singolo compartimento; per questo processo, solo i marcatori delle reti vascolari sono rilevanti. Rimuovere qualsiasi nave non posizionata all'interno dell'area del compartimento. Create una proiezione di intensità massima e salvate ogni singolo compartimento ritagliato come immagine TIFF.
    1. In ImageJ, premete File > Apri e selezionate l'immagine TIFF desiderata contenente diversi scomparti. L'immagine dovrebbe avere almeno due canali, la rete di vasi fluorescenti e l'immagine luminosa trasmessa.
    2. Sulla barra degli strumenti selezionare lo strumento di selezione Poligono. Selezionare il canale di luce trasmesso. Clicca su uno degli angoli del compartimento esagonale, all'interfaccia tra l'area del compartimento e la parete dell'impalcatura, inizierà la definizione della maschera. Continuare a fare clic sugli angoli successivi in ordine sequenziale fino a selezionare l'angolo iniziale, chiudendo la maschera.
      NOTA: Questa spiegazione si applica a un compartimento esagonale. Quando il compartimento è quadrato o circolare, utilizzate rispettivamente gli strumenti Rettangolo o Ovale per creare una maschera appropriata. Indipendentemente dalla forma, adattare sempre la maschera per seguire la parete interna dell'impalcatura.
    3. Fare clic su Analizza > strumenti > gestore del ROI. Nel gestore del ROI (ROI, area di interesse), fare clic sul pulsante Aggiungi per salvare la maschera creata. La nuova maschera verrà visualizzato nell'elenco dei lati sinistro. Questo passaggio consente all'analisi di essere coerente tra immagini diverse.
      NOTA: nel gestore del ROI, è possibile salvare un file con tutte le maschere create facendo clic su Altro > Salva. Nella finestra Salva selezione scegliere un nome e un percorso e salvare il file ROI. Per recuperare la maschera, in Gestione ROI fare clic su Altre > Apri e scegliere il file ROI desiderato.
    4. Selezionare l'immagine di rete del recipiente fluorescente e fare clic su Modifica > cancella all'esterno. Rimarrà solo l'immagine contenuta nella maschera, mentre il resto verrà eliminato.
    5. Con l'immagine di rete cancellata aperta, fare clic su Immagine > duplicato. Nella finestra popup Duplica scrivere il nome dell'immagine. Se è selezionata l'opzione Iperstack duplicato, deselezionarla e fare clic su OK. Verrà creata una nuova immagine contenente solo le reti di recipienti fluorescenti ritagliate.
    6. Salvare l'immagine ritagliata facendo clic su File > Salva con nome > Tiff. Scegliere il nome e la directory e fare clic su OK.
  3. Analizza lo sviluppo vascolare sulle immagini ritagliate.
    1. Scarica e installa il software libero analitico AngioTool, che fornisce strumenti quantitativi per quantificare una varietà di parametri vascolari. Il software può essere ottenuto dal seguente indirizzo https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home.
    2. Impostare il valore di scala delle immagini per ottenere risultati in unità millimetriche e caricare un'immagine.
      1. Fare clic sulla scheda Impostazione e riempire la distanza in pixel e la distanza in mm con i valori rappresentativi delle immagini acquisite. Utilizzando i parametri di imaging sopra menzionati, i valori da riempire sono 400 pixel per 1 mm.
      2. Premere il pulsante Apri immagine e cercare l'immagine di interesse.
    3. Selezionate i parametri di analisi per quantificare lo sviluppo del contenitore nella scheda Analisi (Analysis).
      1. Sotto il campo Diametro e intensità del recipiente, deselezionate qualsiasi marcatore presente dal selettore di fascia superiore e attivate il marcatore che rappresenta il numero 3.
      2. Sotto il campo Diametro e intensità del recipiente, sul selettore dell'intervallo inferiore, spostare il marcatore dell'intervallo inferiore a 60 e lasciare il produttore di ranger alto a 255.
      3. Attivate la casella Rimuovi piccole particelle e impostate il marcatore su 100.
      4. Nel campo Preferenze di salvataggioselezionare il nome e il percorso del file del foglio di diffusione in cui verranno salvati i risultati e premere il pulsante Esegui analisi. Se la casella Salva immagine risultato è selezionata, Angiotool genererà e salverà una nuova immagine jpeg che mostra i parametri quantificati della rete di recipienti.
        NOTA: per ogni analisi eseguita senza modificare il nome del file del foglio di diffusione, verrà aggiunta una nuova riga nella parte inferiore del file, con i risultati appena acquisiti.
  4. Organizzare i dati ed eseguire un'analisi statistica.
    1. Per tutte le immagini elaborate, scegliere il parametro di interesse dalla scheda di diffusione (ad esempio lunghezza totale della nave e area della nave)e immetterle in un software di analisi statistica per studiare correttamente i risultati ottenuti (Figura 3C).

7. Imaging time lapse per il rilevamento delle origini e il monitoraggio della migrazione

  1. In alternativa, per coltivare le impalcature nell'incubatore come descritto nella fase 4.6, impostare una camera di coltura al microscopio confocale a 37 °C, 5% CO2 e 100% di umidità.
    1. Mettere la piastra contenente le impalcature completamente sementi nella camera del microscopio confocale e impostare i parametri di imaging sui valori desiderati.
    2. Impostare l'intervallo di acquisizione dell'immagine su 30 minuti e il tempo totale di imaging di 72 ore. Ciò consentirà di eseguire completamente il lapse senza la necessità di un cambiamento medio.
      ATTENZIONE: Nel caso in cui si desideri un'immagine a termine più lungo, è necessario eseguire un'attenta calibrazione della posizione per poter recuperare la posizione di imaging originale, poiché i cambiamenti medi richiedono la rimozione della piastra dall'incubatore confocale e nella cappa biologica sterile.
      NOTA: Il distacco dei PAESI EC dalle pareti dell'impalcatura e dalla formazione di strutture tubolari inizierà entro la prima ora dalla semina dei SCs (fase 4) e potrebbe richiedere fino a 50 ore per essere completato. Dopo la formazione iniziale del tubo, nuovi germogli inizieranno a migrare nel compartimento dalle navi circostanti. La germinazione e il successivo rimodellamento della rete proseguiranno durante l'esperimento approssimativamente fino al giorno 10, quando le reti delle navi diventerannostabili 22. Utilizzare queste informazioni per scegliere di conseguenza il punto di partenza e il passo dell'ora di time lapse.
  2. Salvate il file filmato time lapse completo come sequenza TIFF.
  3. Apri ImageJ e fate clic su File > Importa > sequenza immagine e selezionate i file. Questo aprirà la sequenza TIFF come film.
  4. Aprire il plug-in Tracciamento manuale facendo clic su Plugin > Manual Tracking. In questo modo si aprirà la finestra Rilevamento.
  5. Osservare il filmato e selezionare la nave da tracciare. Prestare attenzione alla sua origine e migrazione.
  6. Attivare la casella Mostra parametri e immettere i 30 minuti per l'intervallo di tempo. La calibrazione x/y dipenderà dalla quantità di pixel selezionata durante l'imaging.
  7. Procedere a tracciare manualmente i vasi di germogliazione dal contorno dell'impalcatura.
    1. Premere il pulsante Aggiungi traccia. Sul primo fotogramma del film, premere la posizione della nave da tracciare. Successivamente, il filmato cambierà automaticamente nel fotogramma successivo.
    2. Clicca sull'immagine del secondo fotogramma in cui si trova la nave. Ancora una volta, il filmato cambierà automaticamente nel fotogramma successivo.
    3. Procedere con la stessa nave fino al completamento del monitoraggio completo della migrazione.
    4. Nella finestra Tracking, fare clic sulla sovrapposizione Dots & Lines per imprimere un percorso visivo della migrazione della nave sul filmato. Verrà aperta una copia del filmato con un punto che rappresenta la posizione corrente del tracker e una linea che mostra il percorso precedente.
    5. Fate clic sul pulsante Traccia finale (End Track) per finalizzare la registrazione del movimento corrente della nave.
    6. Clicca di nuovo sul pulsante Aggiungi traccia per ricominciare con una nuova nave. In questo modo, i marcatori linea e punto cambieranno automaticamente il loro colore per la nuova nave. Ripetere fino a quando tutte le navi desiderate non vengono tracciate.
      NOTA: la posizione x/y, la velocità del contenitore e la distanza spostata possono essere recuperate dalla finestra popup Risultati. Ogni nave sarà identificata dal suo numero di binario nella colonna più a sinistra. Questi dati possono essere copiati e incollati in una scheda di diffusione per eseguire ulteriori analisi.

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Representative Results

Il protocollo presentato, utilizzando tecniche stereolitografiche, consente la fabbricazione di impalcature tassellate realizzate in fotoresist SU-8. Sono state ottenute impalcature con geometrie distinte del compartimento (quadrati, esagoni e cerchi) e caratteristiche altamente accurate e ripetibili (Figura 1).

Figure 1
Figura 1: Immagini rappresentative di microscopia elettronica a scansionedelle geometrie delle impalcature quadrate, circolari ed esagonali tassellate (barra di scala = 500 μm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Con una semina cellulare graduale (passaggi da 2 a 4), le impalcature fabbricate sono state utilizzate per creare reti vascolari altamente organizzate. Quando si utilizza una semina simultanea tradizionale sia di ECs che di SCs, le navi risultanti mancavano di un'organizzazione chiara. Per questo, è stato eseguito il rivestimento di fibronectina dell'impalcatura (fase 2), la fase di endotelializzazione dell'impalcatura è stata saltata (fase 3) e il DPSC e l'HAMEC sono stati simultaneamente co-seminati in gel di fibrina (fase 4). In questo modo, le cellule sono distribuite in modo omogeneo sull'impalcatura (Figura 2, riga superiore), risultando in reti vascolari sviluppate imprevedibili e disorganizzate che non sembrano interagire con l'impalcatura circostante. Al contrario, la prima semina degli EC sulle pareti dell'impalcatura fornisce un accurato modello di cellule endoteliali iniziali. La successiva aggiunta di SC all'interno di un gel di fibrina si traduce in un prevedibile fenomeno di tubulogenesi, con la formazione di vasi che seguono da vicino la forma della parete dell'impalcatura e la navigazione di nuove navi che migrano nello spazio delcompartimento (Figura 2, fila inferiore).

Figure 2
Figura 2: Confronto della vascolarizzazione tra semina simultanea e semina di cellule stepwise. Immagini rappresentative dello sviluppo vascolare nelle impalcature tassellate per una semina simultanea (in alto fila) di EC (rosso) e SCs (verde) e semina cellulare step-wise (riga inferiore) ai giorni 1 e 5. La semina graduale si traduce in reti vascolari organizzate che seguono le pareti dell'impalcatura e germogliano nello spazio del compartimento (barra di scala: 100 μm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Quando si utilizzano EC fluorescenti, trasfettato o tinto, i recipienti possono essere immagini in tempo reale senza la necessità di correggere e terminare l'esperimento per ogni punto di tempo. Le proteine fluorescenti rosse che esprimono EC (RFP-EC) sono state coltivate su impalcature esagonali e immagini dopo la semina(Figura 3A,giorno 0). Al primo giorno sono stati aggiunti i SCs e le reti vascolari sono state immagini a giorni nostri per quantificare lo sviluppo della nave(figura 3A,giorni 1, 3, 5 e 7). Per ogni punto di tempo sono state scattate ampie immagini dell'intera impalcatura (figura 3B). Per ogni compartimento, i vasi organizzavano e interagivano principalmente con le cellule situate all'interno del loro confinamento. Quindi, ogni compartimento è stato isolato e i vasi superflui all'esterno del compartimento sono stati rimossi utilizzando ImageJ. Le immagini pulite e monosciparto sono state quindi analizzate utilizzando Angiotool. Angiotool restituì un file di foglio di diffusione contenente diversi parametri del contenitore e una rappresentazione visiva delle principali caratteristiche della rete, come scheletro, punti di intersezione e superficie del contenitore. I dati ottenuti sono stati analizzati utilizzando il software di analisi statistica Prism e si è osservata una chiara crescita della nave per la lunghezza totale del recipiente e l'area durante il periodo di tempo dell'esperimento(figura 3C). Nel corso di un esperimento di 1 settimana, si prevede che le navi si svilupperanno ed estenderà ulteriormente, come mostrato nella figura 3A e nella figura 2C. La diminuzione della lunghezza o della superficie del recipiente, la mancata formazione di navi entro il giorno 3 o la formazione di recipienti come mostrato nella riga superiore della figura 2 possono essere interpretate come esperimenti falliti.

Figure 3
Figura 3: Immagini rappresentative di sviluppo eanalisi delle reti vascolari organizzate. (A) I PAESI ECs (rosso) raggiungono la confluenza sulla parete dell'impalcatura su cui vengono successivamente seminati i CS; l'aggiunta di SCs rappresenta il giorno 0 dell'esperimento. Il primo giorno dopo la semina dei CCI, i PAESI Ecs si staccano nello spazio del compartimento e iniziano a formare navi che continueranno a germogliare e connettersi in altri giorni. (B) Fasi di elaborazione delle immagini confocali per l'analisi vascolare della rete (i) Viene scattata un'ampia immagine confocale contenente più compartimenti, (ii) viene ritagliato un unico compartimento (demarcato dall'esagono tratteggiato bianco), iii) quindi il canale di rete vascolare viene separato e tutti i vasi al di fuori delle pareti del compartimento vengono ritagliati. L'immagine a compartimento singolo viene analizzata utilizzando Angiotool, restituendo un elenco di parametri vascolari integrati con marcatori visivi, come l'area del vaso (delineata in giallo), la lunghezza dei vasi (visualizzata con linee verdi) e i punti di intersezione (contrassegnati come punti blu). (C) Risultati comparativi della lunghezza totale del recipiente e della superficie totale del recipiente all'interno di compartimenti esagonali in diversi punti di tempo (i risultati sono presentati come media ± SD, n > 6; tutte le barre di scala: 200 μm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Utilizzando ec multicolori per facilitare l'identificazione a singola cella, è stato eseguito un lapse confocale per consentire il tracciamento di una singola nave (Video supplementare 1). Le navi sono state osservate e tracciate utilizzando il plugin Manual Tracking ImageJ. La cella della punta è stata selezionata per ogni fotogramma del filmato (Figura 4A) fino a quando il recipiente non si è azzasato con la vascucolatura circostante. Di conseguenza, il plug-in Tracciamento manuale ha generato il percorso della nave in tempo reale, che ha permesso di osservare la migrazione della nave (Figura 4B).

Figure 4
Figura 4: Tracciamento rappresentativo delle navi germoglia. (A) Un lapse multicolore (verde, rosso e blu) viene utilizzato per facilitare l'identificazione di una singola nave. Un recipiente di germogliazione viene identificato e monitorato utilizzando il plug-in ImageJ Manual Tracking. Il lato finale della nave è contrassegnato per ogni punto di tempo per tracciare in tempo reale; il marcatore in bianco e nero è stato aggiunto per mostrare il punto finale della nave selezionata. (B) Il tracciamento 2D risultante della nave, elaborato dal plugin ImageJ, che mostra il punto più lontano con un punto e il percorso formato con una linea (barra di scala = 200 μm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La maturazione dei vasi, rappresentata dalla presenza di SMA+ SCS, può essere facilmente osservata nella piattaforma proposta. Le vasculure che presentano un numero maggiore di SMA+ SCs rappresentano una rete più matura, poiché l'espressione SMA è correlata alla stabilizzazione dei vasi nel tempo23. Per i compartimenti circolari, esagonali e squadrati, la quantità di SMA+ SCS aumenta nel tempo (Figura 5A). Al giorno 3, tutte le forme mostravano SMA+ SC sparsi e vasi non complessi con pochi o nessun germoglio di sorta. Al giorno 7, tutte le forme mostravano una rete vascolare ricca e complessa, con una maggiore presenza di SMA + SCS che circondavano le navi. Inoltre, immagini di ingrandimento più elevate rivelano una presenza più densa di SMA+ SCS co-localizzata con vasi formati, che mostra il reclutamento e la differenziazione delle SCs che circondano le strutture vascolari (Figura 5B).

Figure 5
Figura 5: SMA+ SCS e vasi sanguigni aumentano nel tempo. A) Actina muscolare liscia (rosso) e vWF (vasi, verde) sono mostrati per le reti vascolari in compartimenti circolari, squadrati ed esagonali al giorno 3 e al giorno 7. Sia l'estensione della vascucolatura che le cellule di supporto che esprimono SMA (SMA+ SCs) aumentano nel tempo, il che significa una maggiore maturazione e complessità del vaso (barra di scala = 200 μm). B)Immagini rappresentative dei PAESI SMA+ I nuclei (blu) nell'immagine composita rivelano la presenza di SC che non esprimono la proteina SMA (barra di scala = 50 μm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video supplementare 1: Time lapse dei PAESI ECS multicolori per il monitoraggio della migrazione delle navi. Clicca qui per scaricare questo video.  

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Discussion

La necessità di una ricca vascucolatura all'interno incorporata nei tessuti ingegnerizzati è fondamentale per costruire la sopravvivenza e la corretta funzione1. Sebbene l'ingegneria del sistema vascolare sia stata al centro di una grande quantità di ricerche, molto è rimasto da indagare e capire24. In particolare, quando si ricrea un tessuto specifico, la microvascolarizzazione dovrebbe comportarsi e organizzarsi di conseguenza12. L'approccio più comune per la generazione di microvessel è la co-semina di cellule endoteliali e di supporto all'interno di un ambiente 3D adatto compatibile per l'attacco cellulare, la proliferazione e la formazione divasi 25. Questa metodologia spesso si traduce in reti molto disorganizzate, rendendo difficile lo studio del comportamento microvascolare22. Qui, il protocollo presentato fornisce un nuovo strumento che genera reti vascolari altamente organizzate in un sistema ad alta produttività, con vasi che possono essere facilmente monitorati e monitorati nel tempo, per studiarne lo sviluppo e il comportamento. La semina graduale dei PAESI (fase 2-3), seguita daiCS (fase 4), sono passi fondamentali per realizzare tali reti organizzate22. Inoltre, questa tecnica presenta un vero ambiente 3D per i modelli vascolari, in cui i vasi possono migrare nelle tre dimensioni e creare strutture pertinenti. Al contrario, metodi più popolari per la modellazione vascolare, come i sistemi di microfluidica, offrono solo una rappresentazione tissutale 2.5D26.

Il metodo proposto può essere facilmente modificato e applicato per studiare molti fattori diversi che influenzano lo sviluppo e il comportamento della rete di navi. La fabbricazione fotolitografica di impalcature in resina SU-8 è una tecnica comune con un'impressionante versatilità che consente di creareun'ampia varietà di forme 26,27,con la possibilità di progettare strutture simili a complessi costrutti nativi, come gli alveoli o l'unità nefrotica. Tuttavia, uno svantaggio dell'utilizzo di SU-8 è la sua bassa bioassorbibilità27, rendendo la piattaforma principalmente uno strumento di ricerca, invece di un tessuto impiantabile. Tuttavia, questo potrebbe essere migliorato utilizzando materiali biocompatibili che possono reticolare sotto l'illuminazione UV / luce visibile e stampati in 3D utilizzando tecniche accurate come la stereolitografia29. I costrutti vascolarizzati risultanti potrebbero quindi essere impiantati in un animale modello30. Un'altra limitazione del sistema è l'impalcatura massimo ottenibile spessore con elevata precisione di dettaglio, limitata dalla tecnica stereolitografica31. Il protocollo proposto è adatto per la creazione di impalcature sottili che potrebbero rappresentare dimensioni dei tessuti nativi.

Questa piattaforma offre il potenziale per indagare diverse variabili che influenzano i fenomeni divascolarizzazione 4,32. In primo luogo, le interazioni tra diversi tipi di ECs e SCs e le loro capacità di formazione, sviluppo e maturazione dei vasi, che sono note per differire quando si utilizzano cellule di diverse originitissutali 33. In secondo luogo, l'effetto di fattori di crescita, piccole molecole e inibitori sulla vascucolatura, consentendo una chiara visualizzazione del loro impatto intempo reale 34,35. In terzo luogo, l'aggiunta di altri tipi di cellule, sferoidi o organoidi e la loro comunicazione e interazione con i recipienti diformatura 36. Per questo, il sistema proposto rappresenta un potente strumento per indagare il sistema microvascolare.

Le misure future approfitteranno del sistema proposto per studiare l'effetto degli stimoli meccanici, come il flusso interstiziale e lo stiramentomeccanico 37,38, sulla vascucolatura in via di sviluppo. Speriamo che ciò faccia luce su nuovi aspetti che amplieranno le attuali conoscenze e ricerche all'avanguardia della meccanobiologia vascolare.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata sostenuta dai finanziamenti dell'Università del Michigan - Israel Partnership for Research. Gli autori ringraziano Uri Merdler, Lior Debbi e Galia Ben David per la loro grande assistenza e supporto, Nadine Wang, Ph.D. e Pilar Herrera-Fierro, Ph.D. del Lurie Nanofabrication Facility presso l'Università del Michigan, nonché Luis Solorio, Ph.D. per aver illuminato le discussioni sulle tecniche di fotolitografia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Angiotool freeware NIH-CCR Free download at https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home
Bovine albumin serum Probumin Millipore 82-045-1
Dental pulp stem cells Lonza PT-5025
ECM media + bullet kit Sciencell #1001
Ethanol 96% Gadot-Group 64-17-5
Evicel fibrin sealant Johnson&Johnson EVB05IL Provides both thrombin and fibrinogen (BAC2) solutions
GlutaMAX Gibco 35050061
Goat anti-mouse Cy3 antibody Jackson 115-166-072
Goat anti-rabbit Alexa-Fluor 488 Thermo- Fisher Scientific A11034
Human adipose microvascular cells Sciencell #7200
Human fibronectin Sigma F0895-5MG Stock concentration: 1 mg/mL
ImageJ NIH Free download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Isopropyl alcohol Gadot-Group 67-63-0
Lift-off reagent Kayaku Advanced Materials, Inc G112850 Commercial name Omnicoat
Low-glucose DMEM Biological Industries 01-050-1A
Mouse anti-SMA antibody Dako M0851
NEAA Gibco 11140068
Paraformaldehyde solution 4% in PBS ChemCruz SC-281692
Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution Biological Industries 03-032-1B
Phospate buffered saline (PBS) Sigma P5368-10PAK
Rabbit anti-vWF antibody Abcam ab9378
Silicon wafer Silicon Valley Microelectronics (SVM) Wafers 4", Type N-1-10, 500-550 microns thick
SU-8 2050 photoresist Kayaku Advanced Materials, Inc Y11058
SU-8 developer Kayaku Advanced Materials, Inc Y020100
Tryton-X 100 BioLab LTD 57836

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References

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