Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Filizlenen Kan Damarlarını İncelemek için Mozaikli İskelelerde Stepwise Hücre Tohumlama

Published: January 14, 2021 doi: 10.3791/61995
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Faculty of Biomedical Engineering, Technion, 2Department of Chemical Engineering and Biointerfaces Institute, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Mühendislik dokuları, hayati besinleri ve gazları sağlamak ve metabolik atıkları gidermek için uygun vasküler ağlara büyük ölçüde güvenir. Bu çalışmada, endotel hücrelerinin ve destek hücrelerinin adım adım tohumlama protokolü, kontrollü bir 3D ortamda gelişen damar davranışını incelemek için yüksek verimli bir platformda son derece organize damar ağları oluşturur.

Abstract

Kardiyovasküler sistem, insan fizyolojisinde önemli bir oyuncudur ve vücuttaki çoğu dokuya beslenme sağlar; damarlar, her bir perfüzyonlu dokuya bağlı olarak farklı boyutlarda, yapılarda, fenotiplerde ve performansta bulunur. Hasarlı veya eksik vücut dokularını onarmayı veya değiştirmeyi amaçlayan doku mühendisliği alanı, mühendislik dokularında uygun bir damarlanma oluşturmak için kontrollü anjiogeneze dayanır. Vasküler bir sistem olmadan, kalın mühendislik yapıları yeterince beslenemez, bu da hücre ölümü, zayıf engraftment ve nihayetinde başarısızlıkla sonuçlanabilir. Bu nedenle, mühendislik kan damarlarının davranışını anlamak ve kontrol etmek sahada olağanüstü bir zorluktur. Bu çalışma, 3D iskele ortamında gemi davranışını incelemek için organize ve tekrarlanabilir gemi ağlarının oluşturulmasına izin veren yüksek verimli bir sistem sunar. Bu iki adımlı tohumlama protokolü, sistem içindeki damarların iskele topografyasına tepki verdiğini ve damarların bulunduğu bölme geometrisine bağlı olarak ayırt edici filizlenen davranışlar sunduğunu göstermektedir. Bu yüksek verim sisteminden elde edilen sonuçlar ve anlayış, hücreselleştirilmiş biyolojik ortamların temeli olarak 3D baskı kullanırken çeşitli 3D geometrilerin imalatının hızla değerlendirilemediği daha iyi 3D biyobaskı iskele yapı tasarımlarını bilgilendirmek için uygulanabilir. Ayrıca, bu yüksek verim sisteminden gelen anlayış, hızlı ilaç taramasının iyileştirilmesi, ortak kültür modellerinin hızlı gelişimi ve damar sistemi bilgisini derinleştirmek için kan damarı oluşumu üzerindeki mekanik uyaranların araştırılması için kullanılabilir.

Introduction

Doku mühendisliği alanı, eksik veya hasarlı organ ve dokuların yerine mühendislik yapılarının imalatı yolunda hızla ilerlemektadır1. Bununla birlikte, doku beslenmesi için operasyonel vasküler ağlar oluşturmak olağanüstü bir zorluk olmaya devam ettiği için, tamamen işlevsel yapılar henüz elde edilmemiştir. Uygun vaskülarizasyon olmadan, mühendislik dokuları oksijen ve besin maddelerinin pasif difüzyon taşınması ile sınırlıdır ve maksimum uygulanabilir doku kalınlığını difüzyon sınırına, yaklaşık 200 μm2ile sınırlar. Bu kalınlıklar, büyük doku kusurlarını onarmak veya fonksiyonel damar ağının varlığını fonksiyonel ve implante edilebilir dokular için zorunlu bir özellik haline getiren tam organ imalatı için uygun değildir3.

Vasküler sistem, konak doku ile sıkı bir şekilde ilişkili farklı boyutlarda, fenotiplere ve organizasyona sahip çok çeşitli kan damarlarından oluşur. Gelişmekte olan ve filizlenen damarlar tarafından verilen davranış, tepki ve göç kararlarını anlamak, mühendislik dokularına entegrasyonlarını sağlayabilir4. Şu anda, in vitro vasküler ağlar oluşturmak için en yaygın yaklaşım, endotel hücrelerini (VC'ler) üç boyutlu bir mikro ortamda tohumlanmış destek hücreleriyle (SBC'ler, duvar hücrelerine farklılaşma yeteneği ile) birleştirmektir. Bu ortam, hücrelerin damar ağlarına bağlanmasına, çoğalmasına ve kendi kendine bir araya toplanmasına izin vermek için kimyasal ve fiziksel ipuçları sağlar2,5,6,7,8. Birlikte kültürlendiğinde, IC'ler tübüler yapıları oluşturan VC'lere mekanik destek sağlarken hücre dışı matris (ECM) proteinleri salgılarlar. Ayrıca, her iki hücre tipi arasındaki çapraz etkileşim tubulogenez, damar filizlenmesi ve göçü teşvik eder, SCs olgunlaşmasına ve α düz kas aktinin ifade eden (αSMA) duvar hücrelerine farklılaşmasına ek olarak4. Gemi ağı geliştirme en yaygın olarak hidrojeller, gözenekli polimerik iskeleler veya bunların bir kombinasyonu kullanılarak oluşturulan 3D ortamlarda incelenir. İkinci seçenek eşit olarak hücre dostu bir ortam ve hem hücreler hem de ECM9için gerekli mekanik desteği sağlar.

Hidrojeller10,hidrojeller-iskele kombinasyonları 11 , 12,2Dplatformlar ve mikroakışkan cihazlar13üzerindeki hücrelerin birlikte kültleştirilmesi de dahil olmak üzere vasküler gelişimi incelemek için büyük miktarda çalışma yapılmıştır. Bununla birlikte, hidrojeller hücre tarafından uygulanan kuvvetler tarafından kolayca deforme edilebilir14, 2D ve mikroakışkan sistemler daha tahmin edilebilir bir yanıt elde etmek için doğaya daha yakın bir ortamı yenidenoluşturamazken 15,16. Gemilerin çevrelerine nasıl tepki verdiğini anlamak, gemi gelişimini öngörülebilir bir şekilde yönlendirme yeteneğine sahip mühendislik ortamlarının üretilmesine izin verebilecek kritik içgörü sağlayabilir. Vasküler oluşum olgularını anlamak, stereolitografi, dijital projeksiyon litografisi, sürekli sıvı arayüz üretimi, 3D eriyik-elektro jetwriting, çözelti tabanlı 3D elektro jet yazma ve ortaya çıkan biyobaskı teknikleri 17 ,18 , 19,20,21gibi mikronden mikron ölçekli imalat tekniklerinin hızla ortaya çıkmasına ayak uydurmak için özellikle kritik öneme sahiptir. Bu mikro üretim tekniklerinin kontrolünü derinleşmiş bir vasküler biyoloji anlayışıyla hizalamak, hedef doku için uygun bir mühendislik vaskülatının oluşturulmasında anahtardır.

Burada, yeni şekillendirme ve filizlenen gemilerin çevredeki iskele geometrisine tepkisini incelemek, filiz kökenlerini gözlemlemek için bir 3D sistem sunuyoruz ve daha sonra göç22. Mozaik bölme geometrili 3D iskeleler ve iki adımlı bir tohumlama tekniği kullanarak, analiz etmesi kolay ve net bir şekilde son derece organize damar ağları oluşturmayı başardık. Mozaikli geometriler, yerel ortamlarına yanıt veren kaplar içeren tek tek birimlerle yüksek verim sistemi sağlar. Çok renkli EC'leri kullanarak, kompartıman geometrisi ve IC'lerin konumu22ile ilişkili filiz oluşum kökenlerini ve sonraki geçiş modellerini izledik.

Önerilen protokol geometrik ipuçlarının damarlanma davranışı üzerindeki etkilerini analiz etmek için hazırlanmış olsa da, bu yaklaşım genişletilebilir ve çeşitli yeni uygulamalara uygulanabilir. Mozaikli iskele ve kolayca görüntülenebilir ağlar, farklı VC'lerin ve SBC'lerin etkileşiminin basit analizine, belirli organ hücrelerinin eklenmesine ve damar ağlarıyla etkileşimlerine, damar ağları üzerindeki ilaç etkisine ve daha fazlasına izin verir. Önerdiğimiz sistem çok yönlü ve basit imalat ve işleme sonuçları.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Mozaikli iskele imalatı

NOT: Fotolithografi, tipik olarak bir nanofabrikasyon tesisinde/laboratuvarında bulunan özel ekipmanlar gerektiren yaygın bir tekniktir. Bu protokolde ortaya konan yöntem izleyiciler için mümkün olduğunca genelleştirilmiştir; ancak, okuyucunun kullanabileceği ekipmana bağlı olarak prosedürlerde küçük değişiklikler gerekebilir. En yüksek proses kalitesini sağlamak için bu prosedürlerin nanofabrikasyon tesisinde temiz bir odada yapılmasını öneririz. Başlamadan önce, bir maske hizalayıcıya (veya bazı UV'ye maruz kalma kurulumuna), bir spin kaplayıcıya, sıcak tabaklara, çözücü yıkama istasyonuna, fotoküme ve plazma temizleyiciye erişin. Prosedürde kullanılan çözücüler ve kimyasallar tehlikelidir, bu nedenle herhangi bir kimyasal maruziyeti önlemek için lütfen en üst özeni göstermeyin. Fotokütleyi tasarlarken, hangi boyutta silikon gofretlerin ve foto maskelerin spin-coater ve maske hizalayıcı ile uyumlu olduğunu belirleyin. Ek olarak, silikon gofretin kenarlarına doğru bulunan fotoresist tipik olarak kullanımdan deforme edilir; bu nedenle, tasarımları gofretin orta alanına doğru yapın.

  1. Seçilen ilgi geometrisine sahip bir fotolithografi tekniği kullanarak iskeleler hazırlayın.
    1. Kaplamayı çevirmeden önce silikon gofreti temizleyin. Bu plazma temizliği veya solvent bazlı bir teknik ile yapılabilir. Plazma temizliğinde, operasyonel ayrıntılar için cihazın standart çalışma prosedürünü izleyin. Sıkıştırılmış azot gazı ile püskürtün ve spin kaplamadan önce döküntü içermemesi için gofreti inceleyin. Bu gofret, iskelelerin oluşturulduğu substrat görevi görecektir.
      NOT: En iyi sonuçlar için taze bir gofretle başlayın. Gofretler yeniden kullanılabilir, ancak eski fotoresist, yüzey kusurları ve döküntülerden arındırılmalıdır. Elleçleme için gofret cımbızı kullanmak yararlıdır.
    2. Bir kılavuz kullanarak spin-coater aynasına silikon bir gofret ortalayın. Gofretin düzgün bir şekilde aynaya ortalandığından emin olmak için kısa bir süre döndürün, düzgün ortalanana kadar gerektiği gibi ayarlayın. Bu, spin-coater'a her gofret yerleştirildiğinde yapılmalıdır. Kaldırma reaktifinin 1-4 mL'lik kısmını gofrete dağıtın (bu gofret boyutuna bağlı olacaktır). Yaklaşık 2 mL kaldırma reaktifi 4 inçlik bir gofret için iyi çalışır.
      1. Spin-coater yayılma hızını 5 saniye boyunca 500 rpm'ye ve spin hızını 30 saniye boyunca 1000 rpm'ye ayarlayın, ardından kaldırma reaktifini döndürün. Gofret boyunca eşit bir kaplamaya sahip olduğundan emin olmak için gofreti inceleyin. Gofrette kalan herhangi bir enkaz bu noktada çok açık olacaktır. Enkaz olan bir bölgedeki herhangi bir iskele muhtemelen kullanılamaz hale gelecektir. Spin kaplamadan sonra, sıcak bir tabağa aktarın ve 200 ° C'de 1 dakika pişirin.
    3. Toplam üç kaplama için önceki adımı iki kez daha tekrarlayın.
    4. Yaklaşık 100 μm kalınlığı elde edene kadar asansör reaktif kaplı silikon gofreti SU-8 2050 fotoresist ile döndürün.
      1. Her 25 mm'lik substrat çapı için 1 mL direnç dağıtın.
        NOT: Direnci dökerken kabarcıklardan kaçınmaya dikkat edin. SU-8 2050 için, 4 inç silikon gofret kullanırken yaklaşık 2 inç çapında bir daire dökmek iyi çalışır.
      2. SU-8 2050'nin spin-coat'u. 5 saniye boyunca 500 rpm hızında yayılın, ardından yaklaşık 100 μm kalınlık elde etmek için 1700 ila 1800 rpm arasında bir dönüş hızı.
      3. İsteğe bağlı: Döndükten sonra, spin kaplı gofretleri ön fırından önce ışıktan korunan bir seviyede bir gecede gazdan arındırın. Bu, herhangi bir kabarcıkların direncini önlemeye yardımcı olabilir ve kusurların seviye atlamasına izin verebilir.
        NOT: Direnç ve sonuç iskelelerinin gerçek kalınlığı kullanıcı hatası ve ekipman parametrelerine göre değişebilir. Bu nedenle, iskelelerin kalınlığı daha sonra, adım 1.6'da doğrulanmalıdır. İstenilen kalınlık elde etmek için spin kaplama prosedürlerini uygun şekilde değiştirin.
    5. Pozlamadan önce, gofretleri 65 °C'de 10 dakika ve ardından 95 °C'de 40-50 dakika önceden pişirin. Pozlamadan önce, artık yapışkan / viskoz olmadığından emin olmak için kenara bir çift cımbızla bastırarak direncin yüzeyini test edin. Gofreti sıcak plakadan çıkarmak ve yapışkanlığı değerlendirmeden önce 0,5-1 dakika soğumasını sağlamak yararlıdır.
      NOT: Yavaş sıcaklık rampa süreleri (ısıtma ve soğutma) iskelelerin çarpık olmasını önlemeye yardımcı olabilir.
  2. Fotoresisti 85 - 110 μm direnç kalınlığı için 215-240 mJ / cm 2 pozlama enerjisine sahip bir foto maskesi aracılığıylaUV ışığına (350-400 nm) maruz kalın. Önerilen maruz kalma enerji kalınlığı korelasyonları için fotoresist üretici yönergelerine bakın.
    1. Pozlamanın, enerjinin doğrulanabilmesi için uygun şekilde kalibre edildiklarından emin olun. İstenilen pozlama enerjisini elde etmek için pozlama süresini gerektiği gibi ayarlayın. Ayrıca, maske hizalayıcıları farklı pozlama modlarına izin verebilir: vakum teması, sert temas, yumuşak temas ve yakınlık teması (belirli terimler değişebilir). Genellikle, bunlar çözünürlüğü ve özellik hizalamasını etkiler. Yazarlar genellikle "sabit temas" modu kullandılar.
    2. Hizalamanın önemli olacağı küçük özellikler veya birden çok katman için pozlama modlarını ve maske hizalama prosedürlerini daha dikkatli düşünün. Kalınlık değerini ayarlarken direncin yüksekliğini göz önünde bulundurduğunuzdan emin olun. İşlem ayrıntıları için maske hizalayıcınızın standart çalışma yordamlarına bakın.
      NOT: Fotokübenin tasarımı, iskele boyutunu, bölme geometrisini ve parti başına elde edilen iskele sayısını belirler. Sert bir cam veya kuvars foto maskesinin kullanılması en yüksek çözünürlüğü sağlayacaktır; bununla birlikte, bu büyük özellik boyutları (>10 μm) için genellikle yumuşak bir polimer şeffaf film foto maskesi kullanılabilir. Bir film-foto maskesinin kullanılması, daha zayıf özellik çözünürlüğünün bir sonucu olarak iskele gözeneklerinin z ekseni boyunca topoğrafik özelliklere yol açabilir. Bunun hücre davranışı üzerinde potansiyel bir etkisi olabilir. İstenen çözünürlüğün elde edildiğinden emin olmak için fotomask üreten 1 1 500 500 500'e danışın.
  3. Gofret UV maruziyetinin hemen ardından 65 °C'de 2-5 dakika, 95 °C'de ise 8-10 dakika pişirin.
  4. Gelişmemiş direnci kaldırmak için iskeleleri geliştirin.
    1. Gelişmemiş dirençleri çözmek için 7-10 dakika boyunca düşük hacimli bir SU-8 geliştirici çözümü kullanarak iskeleleri batırın.
    2. İzopropil alkol (IPA) ile durulayın.
    3. Sıkıştırılmış azotlu kuru gofret.
      NOT: İskelelerin erken salınmasına neden olmamak için 1.4. Bunu başarmak için düşük hacimli geliştirici ve nazik kullanım gereklidir.
  5. Geliştirmeden sonra, gofretleri 150 ° C'de 15 dakika boyunca sert bir şekilde pişirin.
    NOT: Sert fırından sonra, gofretlerin çok yavaş soğumasını sağlamak için ocaktan kapatmak, son iskelelerin bükülmesi/kıvrılmasını önlemede avantajlı olabilir.
  6. İsteğe bağlı: Sert pişirmeyi takiben ve kalkıştan önce, iskelelerin hala gofret yüzeyine hafifçe yapıştırılması gerektiğinden, iskele kalınlığını değerlendirin. Bu yordam için kontak profilometrisi iyi çalışır; ancak, uygun herhangi bir yöntem kullanılabilir.
  7. İskeleleri gofretten kaldırın.
    1. Su-8 geliştiricisindeki iskeleleri batırarak gofreti hemen kaldırmalarına neden olur. İskeleler kalkmazsa, iskeleleri bir çift gofret cımbızla hafifçe itin.
    2. Fazla geliştiriciyi kaldırın.
    3. İskeleleri yeni bir kaba aktarın ve izopropil alkole batırın. Tüm geliştiricilerin kaldırıldığından emin olmak için IPA'da en az 6 kez durulayın.
  8. Kullanımdan önce iskeleleri en az bir hafta kurutun.

2. İskele fibronektin kaplama

  1. Dezenfeksiyon için, iskeleleri en az 15 dakika boyunca% 70 etanol (v / v) içine batırın ve kullanmadan önce fosfat tamponlu salin (PBS) ile 2 kez yıkayın.
    DİkKAT: SU-8 iskeleleri zayıftır ve kolayca kırılabilir. Künt ve kavisli uçlu emişler kullanılarak elleçleme önerilir ve bunlar en üst özenle ele alınmalıdır. İskeleler ile yüzey arasındaki elektrostatik etkileşimleri önlemek için iskeleleri sıvıya batırarak daha kolay kullanım sağlanabilir.
  2. PBS'de 50 μg/mL insan fibronektin seyreltmesi hazırlayın ve iskeleleri protein adsorpsiyonu ile örtün.
    1. Tohumlanacak her iskele başına 28,5 μL PBS ile 1,5 μL fibronektin stok çözeltisini (1 mg/mL) karıştırın. Tercihen, pipetleme hatalarını önlemek için tüm iskeleler için kullanılacak sadece bir fibronektin seyreltmesi hazırlayın.
      1. 10 iskele için, 285 μL PBS'de 15 μL stok fibronektin çözeltisini karıştırın, bu da toplam 300 μL 50 μg / mL fibronektin seyreltme anlamına gelir.
    2. İskeleleri seyrek olarak hidrofobik bir yüzeyin üzerine yerleştirin (yani doku dışı kültür (nonTC) 10 cm'lik bir tabak) ve her iskeleyi adım 2.2.1'de hazırlanan 30 μL fibronektin seyreltme ile kaplayın.
      DİkKAT: İskele bölmelerinde kabarcık sıkışmadığından emin olun. Kabarcıklar varsa, damlacık veya hafif pipet içindeki iskeleyi hafifçe sallayarak çıkarılabilirler.
    3. Plakanın kapağını değiştirin ve fibronektin kaplı iskeleleri en az bir saat boyunca 37 °C ve% 100 nem içeren bir inkübatöre yerleştirin.
    4. İnkübasyondan sonra, fibronektin kalıntılarını çıkarmak için PBS'deki iskeleleri hafifçe durulayın. İskeleler kullanımdan önce bir haftaya kadar PBS'de 4 °C'de tutulabilir.

3. Endotel hücrelerinin tohumlama

  1. Bazal ortamı, üretici tarafından belirtildiği gibi antibiyotik çözeltisi (Pen/Strep), fetal sığır serumu (FBS) ve endotel hücre büyüme takviyeleri de dahil olmak üzere muhabir orta kit bileşenleriyle karıştırarak EC ortamını hazırlayın.
  2. EC ortamında 4 x 106 hücre/mL konsantrasyonda bir insan yağ mikrovasküler endotel hücresi (HAMEC) süspansiyonu yapın.
    NOT: Kullanılan endotel hücreleri daha önce floresan bir proteini ifade etmek için transktriye edilmişse veya toksik olmayan sitoplazmik membran boyası (ayrıca etiketli VC'ler olarak da adlandırılır) kullanılarak önceden boyanmışsa gerçek zamanlı görüntüleme yapılabilir.
  3. Tokmalar kullanarak, bir fibronektin kaplı iskeleyi kuyu başına bir nonTC 24 kuyu plakası kuyusuna yerleştirin.
  4. Her iskeleyi HAMEC süspansiyonunun 25 μL damlacıklarıyla örtün. Süspansiyonun iskeleden akmasına izin vermeyin, çünkü hücre yapışıklıklarını engelleyebilir.
  5. Kapağı tabağa koyun ve 37 °C, %5 CO2 ve %100 nemde bir inkübatöre yerleştirin. En az 60 dakika ve en fazla 90 dakika kuluçkaya bırakın.
    NOT: Kuluçka sırasında, plakayı inkübatör içindeki bir yörüngesel çalkalayıcıya yerleştirmek, iskelenin duvarlarına hücre bağlanmasını iyileştirir. Yörüngesel çalkalayıcı en fazla 5 rpm olarak ayarlanmalıdır.
  6. Kuluçkadan sonra, her kuyuyu pipet kullanarak 700 μL EC ortamı ile doldurun.
    NOT: Hücrelerin bazıları iskeleye bağlanmadığı ve iskelenin boşluklarından düşmediği için KUYUNUN alt kısmında VC'leri görmeyi bekleyin.
  7. Endotelize edilmiş iskeleleri, EC izdihamı, iskelenin duvarlarında floresan mikroskopi (etiketli IC'ler kullanırken) veya 3 gün boyunca (etiketlenmemiş IC'ler kullanırken) gözlemleninceye kadar kuluçkaya yatırın, bu da EC izdihamını elde etmek için yeterli zaman sağlar. Ortamı iki günde bir değiştirin.

4. Hücre tohumlama ve ortak kültürü destekleyin

  1. 500 mL düşük glikozlu Dulbecco'nun modifiye Eagle orta (düşük glikoz DMEM), 57,5 mL FBS karıştırarak diş hamuru kök hücre (DPSC) ortamı (DPSCm) hazırlayın, 5.75 mL esansiyel olmayan amino asit (NEAA), 5.75 mL GlutaMAX ve 5.75 mL penisilin-streptomisin-nystatin çözeltisi.
  2. Endotelize edilmiş iskeleleri, kuyuların tabanına tutturulmuş IC'leri tokmaklar kullanarak atmak için yeni bir NONTC 24 kuyu plakasına aktarın.
    1. 1 mL pipet veya vakum emiş kullanarak mevcut plakadaki tüm ortamları atın. Vakumu doğrudan iskeleye uygulamamaya dikkat edin.
    2. Yüzey gerilimi etkileri nedeniyle duvarlara doğru sıvı akmasını önlemek için kuyu başına bir iskele yerleştirin, tercihen kuyunun ortasına yerleştirin. İskeleyi çevreleyen alanı hafif vakumla kurulayın, ancak iskelenin tamamen kurumasından kaçının.
  3. Fibrin pre-jel çözeltisinde bir DPSC süspansiyon hazırlayın.
    1. 5 U/mL ve 15 mg/mL'lik son konsantrasyon elde edene kadar trombin ve fibrinojen stok çözeltilerini PBS ile seyreltin.
    2. 5 U/mL trombin seyreltmesinde 8 x 106 DPSC/mL süspansiyon hazırlayın ve tohumlanacak iskele başına 12,5 μL'lik bireysel eppendorflarda dağıtın.
    3. 5-50 μL pipet (veya benzeri) 12,5 μL'ye ayarlayın ve 15 mg/mL fibrinojen çözeltisi ile doldurun.
    4. Ucu çıkarmadan pipet 25 μL'ye ayarlayın. Uçtaki malzeme yükselmeli ve uç açıklığa doğru boş bir hacim bırakmalıdır.
    5. Sıvı uç açıklığı gelene kadar piston düğmesine yavaşça basın, ancak dışarı sızmaz. Pistonu bu pozisyonda tutun ve ucu trombin süspansiyonundaki hücreleri içeren mikrosantrifüj tüplerinden birine yerleştirin ve ucun sıvıyla temas halinde olduğundan emin olun.
      DİkKAT: Fibrin çapraz bağlantısı trombin ve fibrinojen temas ettikten hemen sonra başlayacaktır. Aşağıdaki adım hızlı bir şekilde yapılmalıdır.
    6. Piston düğmesini yavaşça bırakın ve hücre süspansiyonunu ucuna çekin. Kabarcık oluşumunu önleyerek her iki malzemeyi de iyice karıştırın.
  4. Karışık malzemeleri endotelize edilmiş bir iskelenin üzerine hızla dağıtın. Her iskele için önceki adımları yineleyin, uç içinde beklenmeyen fibrin jeli oluşumunu önlemek için kullanımlar arasında her zaman ipuçlarını değiştirdiğinden emin olun.
  5. Plaka kapağını değiştirin ve iskeleleri 37 °C, %5 CO2 ve %100 nemde 30 dakika kuluçkaya bırakın.
  6. Kuluçkadan sonra, her kuyuyu 1:1 DPSC ve EC ortamın 1 mL'si ile doldurun.
    1. 1 hafta boyunca kültür, her gün ortam değişiyor.
    2. Kültür sırasında, ortamı kuyudan çıkarın ve vasküler gelişimi veya ilgi çekici başka bir parametreyi incelemek için farklı zaman noktalarında bir konfokal mikroskop kullanarak yapıları görüntüleyin.
      NOT: Bu adım yalnızca deneme etiketli VC'ler kullanılarak gerçekleştirilirse gerçekleştirilebilir. Daha fazla açıklama için Adım 6 - NOT'a bakın.

5. Karakteristik vasküler belirteçler için immünofluoresan boyama

NOT: Aşağıdaki adımlar, yapıların kültürlendiği aynı kuyularda gerçekleştirilebilir. Çözümlerin her zaman iskeleleri tamamen kapladığından emin olmak önemlidir. Ayrıca, mümkün olduğunda, adımların zorunlu olmasa da bir yörünge çalkalayıcı üzerinde gerçekleştirilmesi önerilir.

  1. 7. günde, medyayı kuyulardan atın ve kuyulara PBS ekleyerek ve vakum kullanarak çıkararak iskeleleri durulayın.
  2. 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ekleyerek iskeleleri sabitleyin. PBS'de yıkama başına 3 kez, 5 dakika yıkayın.
  3. PBS 'de (v/v) %0,3 Triton-X kullanarak sabit hücreleri 15 dakika boyunca permeabilize edin. PBS'de yıkama başına 3 kez, 5 dakika yıkayın.
  4. PBS (w/v) engelleme çözeltisinde %5 sığır serum albümini (BSA) hazırlayın ve iskeleleri kapatın. Oda sıcaklığında 1 saat bekletin.
    NOT: Gerekli tüm çözelti miktarları boyanacak iskele sayısına bağlı olacaktır. Belirtilen konsantrasyonları koruyarak çözeltileri gerektiği gibi hazırlayın.
  5. Birincil antikor boyama çözeltisini hazırlayın ve uygulayın.
    1. Taze blokaj çözeltisinde tavşan anti-von Willebrand faktörü (vWF) antikor 1:150 ve fare anti-SMA antikor 1:50 seyreltin.
      NOT: CD31 veya VE-Cadherin gibi diğer endotel hücreleri belirteçleri kullanılabilir.
    2. İskeleleri birincil antikor çözeltisi ile örtün ve gece boyunca 4 °C'de tutun. PBS'de yıkama başına üç kez, 5 dakika yıkayın.
  6. İkincil antikor boyama soluyu hazırlayın ve uygulayın.
    1. PBS'de keçi anti-fare Cy3 antikor 1:150 ve keçi anti-tavşan Alexa-Fluor 488 1:400 seyreltin.
    2. İskeleleri ikincil antikor çözeltisi ile örtün ve oda sıcaklığında veya gece boyunca 4 °C'de en az 3 saat kuluçkaya yatırın. PBS'de 3 kez, yıkama başına 5 dakika yıkayın. Lekeli iskeleyi PBS'de (v/v) %0,3 PFA'da bir aya kadar saklayın.

6. İskele konfokal görüntüleme ve damar geliştirme analizi

NOT: Aşağıdaki adımlar, seçilen son zaman noktasındaki sabit ve lekeli iskelelerde veya floresan hücreler kullanılmışsa, hücre kültürü döneminde deneyi sonlandırmaya gerek kalmadan gerçekleştirilebilir. İkincisi için, belirli zaman noktalarının ayarlanın; Bu çalışma, 0. günü (SBC tohumlamadan önce) ve CS tohumlamadan sonraki 1, 3, 5 ve 7. günleri gösterir (Şekil 3A).

  1. İskeleleri 5X lensli ve 0,5 yakınlaştırmalı bir konfokal mikroskop kullanarak ve iskelenin tam z aralığını görüntüleyin. Bu, kareli ve dairesel geometriler için 9 ayrı bölme veya altıgen geometri için 8 tam bölme yakalamaya izin verecektir. Hem damar ağ yapısını hem de bölme geometrisini elde etmek için floresan sinyalini ve iletilen ışığı görüntüleyin (Şekil 3A).
  2. ImageJ (veya başka bir görüntü işleme yazılımı) kullanarak, her bir bölmeyi kırp; bu işlem için sadece vasküler ağ belirteçleri geçerlidir. Bölme alanının içinde olmayan herhangi bir kabı çıkarın. Maksimum yoğunluk projeksiyonu oluşturun ve kırpılan her bölmeyi TIFF görüntüsü olarak kaydedin.
    1. ImageJ'de Dosya > Aç'a basın ve birkaç bölme içeren istediğiniz TIFF görüntüsünü seçin. Görüntü en az iki kanala, floresan damar ağına ve iletilen ışık görüntüsüne sahip olmalıdır.
    2. Araç çubuğundan Çokgen seçim aracını seçin. İletilen ışık kanalını seçin. Altıgen bölmenin köşelerinden birine tıklayın, bölme alanı ile iskele duvarı arasındaki arayüzde, bu maske tanımını başlatacaktır. İlk köşe seçilene kadar sonraki köşelere sıralı olarak tıklamaya devam edin ve maskeyi kapatın.
      NOT: Bu açıklama altıgen bölme için geçerlidir. Bölme kare veya dairesel olduğunda, uygun bir maske oluşturmak için sırasıyla Dikdörtgen veya Oval araçları kullanın. Şekli ne olursa olsun, maskeyi her zaman iskelenin iç duvarını takip edecek şekilde takın.
    3. Yatırım Getirisi Yöneticisi > > Araçları Çözümle 'yetıklayın. Yatırım getirisi yöneticisinde (yatırım getirisi, ilgi alanı), oluşturulan maskeyi kaydetmek için Ekle düğmesini tıklatın. Yeni maske sol taraftaki listede görünecektir. Bu adım, analizin farklı görüntüler arasında tutarlı olmasını sağlar.
      NOT: Yatırım getirisi yöneticisinde, Diğer > Kaydet 'e tıklayarak oluşturulan tüm maskelerle bir dosyayı kaydetmek mümkündür. Seçim kaydet penceresinde, bir ad ve konum seçin ve .roi dosyasını kaydedin. Maskeyi almak için, yatırım getirisi yöneticisinde, Aç'> Fazlası'na tıklayın ve istediğiniz .roi dosyasını seçin.
    4. Floresan damar ağı görüntüsünü seçin ve Dışarıda Düzenle > Temizle 'yetıklayın. Sadece maskenin içinde bulunan görüntü kalırken, geri kalanı ortadan kaldırılacaktır.
    5. Temizlenen ağ görüntüsü açıkken, Görüntü > Çoğalt 'ıtıklatın. Çoğalt açılır penceresinde, görüntünün adını yazın. Çoğalt hiper çantası seçiliyse, seçimini kaldırın ve Tamam 'ı tıklatın. Yalnızca kırpılmış floresan damar ağlarını içeren yeni bir görüntü oluşturulacaktır.
    6. Dosya > > Tiff Olarak Kaydet 'itıklatarak kırpılan görüntüyü kaydedin. Adı ve dizini seçin ve Tamam 'ıtıklatın.
  3. Kırpılmış görüntülerdeki damar gelişimini analiz edin.
    1. Çeşitli vasküler parametreleri ölçmek için nicel araçlar sağlayan analitik ücretsiz yazılım AngioTool'u indirin ve yükleyin. Yazılım aşağıdaki adresten https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home edinilebilir.
    2. Milimetre cinsinden sonuç elde etmek ve bir görüntü yüklemek için görüntülerin ölçek değerini ayarlayın.
      1. Ayar sekmesine tıklayın ve Uzaklığı piksel cinsinden, Uzaklığı ise mm cinsinden, çekilen görüntülerdeki temsili değerlerle doldurun. Yukarıda belirtilen görüntüleme parametrelerini kullanarak doldurulacak değerler 1 mm başına 400 pikseldir.
      2. Resmi aç düğmesine basın ve ilgi çekici görüntüye göz atın.
    3. Analiz sekmesinde gemi gelişimini ölçmek için analiz parametrelerini seçin.
      1. Gemi çapı ve yoğunluğu alanının altında, mevcut işaretleyicilerin seçimini üst aralık seçiciden kaldırın ve 3 sayısını temsil eden işaretçiyi etkinleştirin.
      2. Gemi çapı ve yoğunluğu alanının altında, alt aralık seçicisinde, alt aralık işaretçisini 60'a taşıyın ve yüksek korucu üreticisini 255'te bırakın.
      3. Küçük parçacıkları kaldır kutusunu etkinleştirin ve işaretçiyi 100 olarak ayarlayın.
      4. Kaydetme tercihlerialanının altında, sonuçların kaydedileceği forma sayfası dosyasının adını ve konumunu seçin ve Analiz çalıştır düğmesine basın. Sonuç görüntüsünü kaydet kutusu seçilirse, Angiotool gemi ağı nicel parametrelerini gösteren yeni bir jpeg görüntüsü oluşturur ve kaydeder.
        NOT: Forma sayfası dosya adını değiştirmeden gerçekleştirilen her analiz için, dosyanın altına yeni alınan sonuçlarla birlikte yeni bir satır eklenir.
  4. Verileri düzenleyin ve istatistiksel bir analiz çalıştırın.
    1. İşlenen tüm görüntüler için, spread sayfasından ilgi çekici parametreyi seçin (örneğin, toplam gemi uzunluğu ve Gemi alanı)ve elde edilen sonuçları düzgün bir şekilde incelemek için istatistiksel bir analiz yazılımına girin ( Şekil3C).

7. Filizlenen orijin tespiti ve geçiş takibi için zaman atlamalı görüntüleme

  1. Alternatif olarak, 4.6.
    1. Tamamen tohumlu iskeleleri içeren plakayı konfokal mikroskop haznesine koyun ve görüntüleme parametrelerini istenilen değerlere ayarlayın.
    2. Görüntü alma aralığını 30 dakikaya ve toplam görüntüleme süresini 72 saate ayarlayın. Bu, orta bir değişikliğe gerek kalmadan zaman atlamalıyı tamamen çalıştırmayı sağlayacaktır.
      DİkKAT: Daha uzun bir zaman atlamalı görüntüleme isteniyorsa, orta değişiklikler plakanın konfokal inkübatörden ve steril biyolojik davlumbazdan çıkarılmasını gerektirdiğinden, orijinal görüntüleme konumunu alabilmek için dikkatli bir konum kalibrasyonu yapılmalıdır.
      NOT: VC'lerin iskele duvarlarından ve borulu yapı oluşumundan kopuşu, RC tohumlamadan sonraki ilk saat içinde başlayacaktır (adım 4) ve tamamlanması 50 saate kadar sürebilir. İlk tüp oluşumundan sonra, yeni filizler çevredeki damarlardan bölmeye göç etmeye başlayacaktır. Filizlenen ve sonraki ağ tadilatı, gemi ağlarının stabil hale geldiği 10 güne kadar deney boyunca devamedecektir 22. Zaman atlamalı başlangıç noktasını ve zaman adımını buna göre seçmek için bu bilgileri kullanın.
  2. Zaman atlamalı film dosyasının tamamını TIFF dizisi olarak kaydedin.
  3. ImageJ'i açın ve Görüntü > İçe Aktar > Dosya'yı tıklatın ve dosyalarınızı seçin. Bu, TIFF dizinizi bir film olarak açacaktır.
  4. Eklentiler > Manuel İzleme 'yetıklayarak Manuel takip eklentisini açın. Bu, İzleme penceresini açar.
  5. Filmi gözlemleyin ve izlenecek gemiyi seçin. Kökenine ve göçüne dikkat edin.
  6. Parametreleri göster kutusunu etkinleştirin ve Zaman aralığıiçin 30 dakika girin. x/y kalibrasyonu görüntüleme sırasında seçilen piksel miktarına bağlı olacaktır.
  7. Filizlenen gemileri iskele konturundan manuel olarak izlemeye devam edin.
    1. Parça ekle düğmesine basın. Filmin ilk karesinde, izlenecek geminin konumuna basın. Bundan sonra, film otomatik olarak bir sonraki kareye değişecektir.
    2. Geminin bulunduğu ikinci karenin görüntüsüne tıklayın. Yine, film otomatik olarak bir sonraki kareye değişecektir.
    3. Tam geçiş takibi tamamlanana kadar aynı gemiyle devam edin.
    4. İzleme penceresinde, filmdeki gemi geçişinin görsel bir yolunu yazdırmak için Kaplama Noktaları ve Çizgileri'ne tıklayın. Bu, izleyicinin geçerli konumunu temsil eden bir nokta ve önceki yolu gösteren bir çizgi ile filmin bir kopyasını açar.
    5. Mevcut gemi hareketini kaydetmeyi sonlandırmak için Parçayı Sonlandır düğmesine tıklayın.
    6. Yeni bir gemiyle baştan başlamak için parça ekle düğmesine tekrar tıklayın. Bunu yaparken, çizgi ve nokta işaretleyicileri yeni gemi için renklerini otomatik olarak değiştirir. İstenilen tüm gemiler izlenene kadar tekrarlayın.
      NOT: x/y konumu, gemi hızı ve hareket mesafesi açılır pencereden alınabilir Sonuçlar. Her gemi en soldaki sütundaki parça numarasıyla tanımlanacak. Bu veriler daha fazla analiz yapmak için kopyalanabilir ve bir forma sayfasına yapıştırılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sunulan protokol, stereolitografi teknikleri kullanılarak, SU-8 fotoresistlerinden yapılmış mozaikli iskelelerin imal edilmesine izin verir. Farklı bölme geometrilerine (kareler, altıgenler ve daireler) sahip iskeleler ve son derece doğru ve tekrarlanabilir özellikler elde edilmiştir (Şekil 1).

Figure 1
Şekil 1: Mozaiklenmiş kare, dairesel ve altıgen iskele geometrilerinin (ölçek çubuğu = 500 μm) temsili tarama elektron mikroskopi görüntüleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Adım adım hücre tohumlama (adım 2 ila 4) ile, fabrikasyon iskeleler son derece organize vasküler ağlar oluşturmak için kullanılmıştır. Hem VC'lerin hem de SBC'lerin geleneksel eşzamanlı tohumlamasını kullanırken, ortaya çıkan gemiler net bir organizasyondan yoksundu. Bunun için iskele fibronektin kaplaması yapıldı (adım 2), iskele endotelizasyon adımı atlandı (adım 3) ve DPSC ve HAMEC aynı anda fibrin jelinde eş tohumlandı (adım 4). Bu şekilde, hücreler iskele üzerinde homojen bir şekilde dağıtılır (Şekil 2, üst sıra), çevredeki iskele ile etkileşime girmemiş gibi görünmeyen öngörülemeyen ve dağınık gelişmiş damar ağları ile sonuçlanır. Aksine, öncelikle IC'lerin iskele duvarlarına tohumlaması, doğru bir ilk endotel hücre deseni sağlar. Daha sonra bir fibrin jel içine IC eklenmesi, iskele duvarının şeklini yakından takip eden damarlar oluşturan ve bölme boşluğuna göç eden yeni damarların filizlendiği öngörülebilir bir tubulogenez fenomeni ile sonuçlanır(Şekil 2, alt sıra).

Figure 2
Şekil 2: Eş zamanlı ve adım adım hücre tohumlama arasında vaskülarizasyon karşılaştırması. 1 ve 5. günlerde VC'lerin (kırmızı) ve SBC'lerin (yeşil) eşzamanlı (üst sıra) hücre tohumlaması ve adım adım hücre tohumlama (alt sıra) için mozaikli iskelelerde damar gelişiminin temsili görüntüleri. Adım adım tohumlama, iskele duvarlarını takip eden ve bölme boşluğuna filizlenen organize vasküler ağlara neden olur (ölçek çubuğu: 100 μm). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Transfected veya boyalı floresan IC'ler kullanırken, damarlar her zaman noktası için deneyi düzeltmeye ve sonlandırmaya gerek kalmadan gerçek zamanlı olarak görüntülenebilir. VC'leri (RFP-EC) ifade eden kırmızı floresan protein altıgen iskelelerde kültürlendi ve tohumlamadan sonra görüntülendi(Şekil 3A,gün 0). 1. günde, SC'ler eklendi ve damar gelişimini ölçmek için damar ağları her gün görüntülendi(Şekil 3A, gün 1, 3, 5 ve 7). Her zaman noktası için, tüm iskelenin geniş görüntüleri çekildi (Şekil 3B). Her bölme için, damarlar esas olarak hapsedilmiş ve hapsedilmiş hücrelerde bulunan hücrelerle etkileşime girdi. Bu nedenle, her bölme izole edildi ve bölmenin dışındaki gereksiz kaplar ImageJ kullanılarak çıkarıldı. Temiz, tek bölmeli görüntüler daha sonra Angiotool kullanılarak analiz edildi. Anjiyotool, birkaç damar parametresi içeren bir yayılma sayfası dosyası ve iskelet, kesişim noktaları ve damar yüzeyi gibi ana ağ özelliklerinin görsel bir gösterimini döndürür. Elde edilen veriler istatistiksel analiz yazılımı Prizma kullanılarak analiz edilmiş ve deney süresi boyunca toplam damar uzunluğu ve alanı için net bir damar büyümesi gözlenmiştir(Şekil 3C). 1 haftalık bir deney sırasında, gemilerin Şekil 3A ve Şekil 2C'degösterildiği gibi daha da gelişmesi ve uzatılması beklenmektedir. Gemi uzunluğunun veya alanının azaltılması, 3. güne kadar damarların oluşturulamaması veya Şekil 2'nin üst sırasında gösterildiği gibi oluşan damarlar başarısız deneyler olarak yorumlanabilir.

Figure 3
Şekil 3: Organize vasküler ağların temsili gelişim görüntüleri ve analizi. (A) VC'ler (kırmızı) IC'lerin daha sonra tohumlandırıldığı iskele duvarında birleştiğine ulaşır; SCS eklemesi denemenin 0. IC'lerin tohumlaşışının ardından 1. (B) Vasküler ağ analizi için konfokal görüntü işleme adımları (i) Birkaç bölme içeren geniş bir konfokal görüntü alınır, (ii) tek bir bölme kırpılır (beyaz kesikli altıgen ile işaretlenir), (iii) daha sonra vasküler ağ kanalı ayrılır ve bölme duvarlarının dışındaki tüm damarlar kırpılır. Tek bölmeli görüntü Angiotool kullanılarak analiz edilir ve damar bölgesi (sarı ile özetlenmiş), damar uzunluğu (yeşil çizgilerle görüntülenir) ve kesişim noktaları (mavi noktalar olarak işaretlenmiştir) gibi görsel işaretleyicilerle tamamlanan vasküler parametrelerin bir listesini döndürür. (C) Toplam damar uzunluğunun ve altıgen bölmeler içindeki toplam damar alanının farklı zaman noktalarında karşılaştırmalı sonuçları (sonuçlar SD, n > 6± ortalama olarak sunulur; tüm ölçek çubukları: 200 μm). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tek hücreli tanımlamayı kolaylaştırmak için çok renkli VC'ler kullanılarak, tek damar takibine izin vermek için konfokal görüntüleme süresi gecikmesi gerçekleştirildi (Tamamlayıcı Video 1). Gemiler Manuel İzleme ImageJ eklentisi kullanılarak gözlemlendi ve izlendi. Filmin her karesi için uç hücresi seçildi (Şekil 4A) ta ki damar çevredeki vaskülatla anastomos olana kadar. Sonuç olarak, Manuel Takip eklentisi, gemi geçişini gözlemlemeye izin veren gemi yolunu gerçek zamanlı olarak oluşturdu (Şekil 4B).

Figure 4
Şekil 4: Temsili filizlenen gemi takibi. (A) Tek damar tanımlamasını kolaylaştırmak için çok renkli BIR VC (yeşil, kırmızı ve mavi) zaman atlamalı kullanılır. Bir filizlenen gemi, ImageJ eklentisi Manuel İzleme kullanılarak tanımlanır ve izlenir. Geminin uç tarafı, gerçek zamanlı olarak izlemek için her zaman noktası için işaretlenir; seçilen damar uç noktasını göstermek için siyah-beyaz işaretleyici eklendi. (B) ImageJ eklentisi tarafından işlenen, noktalı en uzak noktayı ve çizgili oluşturulan yolu gösteren geminin elde edilen 2D takibi (ölçek çubuğu = 200 μm). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

SMA+ SC'lerin varlığı ile temsil edilen gemi olgunlaşması, önerilen platformda kolayca gözlemlenebilir. Daha yüksek sayıda SMA + SC sunan vaskülatlar daha olgun bir ağı temsil eder, çünkü SMA ifadesi zamanla damar stabilizasyonu ileilişkilidir 23. Dairesel, altıgen ve kare bölmeler için, SMA + SC miktarı zamanla artar (Şekil 5A). 3. güne kadar, tüm şekiller dağınık SMA + SC'ler ve çok az filizli veya hiç filizsiz sıkıştırılmamış damarlar gösterdi. 7. güne gelindiğinde, tüm şekiller damarları çevreleyen SMA + VC'lerin daha yüksek bir varlığı ile zengin ve karmaşık bir damar ağı gösterdi. Ayrıca, daha yüksek büyütme görüntüleri, oluşan damarlarla birlikte lokalize daha yoğun bir SMA + SCS varlığını ortaya koymakta, SBC'lerin işe alımını ve damar yapılarını çevreleyen farklılaşmayı ortaya koymaktadır (Şekil 5B).

Figure 5
Şekil 5: SMA+ SBC'ler ve kan damarları zamanla artar. A) Düz kas aksin (kırmızı) ve vWF (damarlar, yeşil) vasküler ağlar için 3. ve 7. Hem vaskülat uzatma hem de SMA ekspresyonu destek hücreleri (SMA + SCs) zamanla artarak daha yüksek bir damar olgunlaşması ve karmaşıklığına işaret ediyor (ölçek çubuğu = 200 μm). B)7. günde SMA+ IC'lerin damarların etrafında daha yoğun birikmesinin temsili görüntüleri. Kompozit görüntüdeki çekirdek (mavi), SMA proteinini ifade etmeyen RC'lerin varlığını ortaya koymaktadır (ölçek çubuğu = 50 μm). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 1: Gemi geçiş takibi için çok renkli VC'ler zaman atlamalı. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.  

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mühendislik dokularına gömülü zengin bir vaskülat ihtiyacı, yapı sağkalım ve uygun işlev için kritik öneme sahiptir1. Vasküler sistemin mühendisliği çok miktarda araştırmanın odak noktası olmasına rağmen, araştıracak ve anlayacak çok şey kaldı24. Özellikle, belirli bir dokuyu yeniden canlandırırken, mikrovasküler yapılıp buna göre düzenlenmelidir12. Mikrovessel üretimi için en yaygın yaklaşım, endotel tohumlama ve hücre bağlanması, çoğalma ve damar oluşumu için uyumlu uygun bir 3D ortamda hücreleri desteklemektir25. Bu metodoloji genellikle büyük ölçüde örgütsüz ağlarla sonuçlanır, bu da mikrovasküler davranışı incelemeyi zorlaştırır22. Burada, sunulan protokol, gelişimlerini ve davranışlarını incelemek için zaman içinde kolayca izlenebilen ve izlenebilen damarlarla, yüksek verimli bir sistemde son derece organize damar ağları üreten yeni bir araçsağlar. VC'lerin adım adım tohumlanabilmesi (adım 2-3), ardından SBC'ler (adım 4), bu tür organize ağlara ulaşmak için kritik adımlardır22. Ek olarak, bu teknik, damarların üç boyutta göç edebileceği ve ilgili yapılar oluşturabileceği vasküler modeller için gerçek bir 3D ortam sunar. Buna karşılık, mikroakışkan sistemleri gibi vasküler modelleme için daha popüler yöntemler, sadece 2.5D doku gösterimisunar 26.

Önerilen yöntem kolayca değiştirilebilir ve gemi ağı gelişimini ve davranışını etkileyen birçok farklı faktörü incelemek için uygulanabilir. Fotolithografik SU-8 reçine iskele imalatı, alveoller veya nefrotik birim gibi karmaşık yerel yapılara benzeyen yapılar tasarlama potansiyeline sahip çok çeşitli şekiller26,27oluşturmayı sağlayan etkileyici bir çok yönlülüğe sahip yaygın bir tekniktir. Bununla birlikte, SU-8 kullanmanın bir dezavantajı düşük biyoabsorbability27Platformu implante edilebilir bir doku yerine esas olarak bir araştırma aracı haline getirir. Bununla birlikte, bu, UV / görünür ışık aydınlatması altında çapraz bağlantı yapabilen biyouyumlu malzemeler kullanılarak ve stereolitografi29gibi doğru teknikler kullanılarak 3D baskı kullanılarak geliştirilebilir. Elde edilen damarlı yapılar daha sonra bir hayvan modeli30'ayerleştirilecektir. Sistemin bir diğer sınırlaması, stereolitografik teknik31ile sınırlı olan yüksek ayrıntı doğruluğuna sahip iskele maksimum ulaşılabilir kalınlığıdır. Önerilen protokol, doğal doku boyutlarını temsil edebilecek ince iskele oluşturmak için uygundur.

Bu platform, damarlanma olaylarını etkileyen çeşitli değişkenleri araştırma potansiyeli sunar4,32. İlk olarak, farklı TIP VC'ler ve VC'ler arasındaki etkileşimler ve farklı doku kökenlerinden hücreler kullanırken farklı olduğu bilinen damar oluşumu, gelişimi ve olgunlaşma yetenekleri33. İkincisi, büyüme faktörlerinin, küçük moleküllerin ve inhibitörlerin vaskülür üzerindeki etkisi, etkilerinin gerçek zamanlı olarak net bir şekilde görselleştirilmesini sağlar34,35. Üçüncüsü, diğer hücre tiplerinin, küresellerin veya organoidlerin eklenmesi ve oluşturan damarlarla iletişim ve etkileşimleri36. Bunun için önerilen sistem, mikrovasküler sistemi araştırmak için güçlü bir aracı temsil eder.

Gelecekteki adımlar, geçiş akışı ve mekanik germe37 , 38gibi mekanik uyaranların gelişmekte olan vaskülat üzerindeki etkisini araştırmak için önerilen sistemden yararlanacaktır. Bu, vasküler mekanobiyolojinin güncel bilgisini ve son teknoloji araştırmalarını genişletecek yeni yönlere ışık tutacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu araştırma Michigan Üniversitesi - İsrail Araştırma Ortaklığı'ndan sağlanan fonla desteklendi. Yazarlar, Uri Merdler, Lior Debbi ve Galia Ben David'e büyük yardımları ve destekleri için, Michigan Üniversitesi Lurie Nanofabrication Tesisi DoktoraSı Nadine Wang, Ph.D. ve Pilar Herrera-Fierro'ya ve fotolithografi tekniklerinin aydınlatıcı tartışmaları için Luis Solorio'ya teşekkür etmek istiyor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Angiotool freeware NIH-CCR Free download at https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home
Bovine albumin serum Probumin Millipore 82-045-1
Dental pulp stem cells Lonza PT-5025
ECM media + bullet kit Sciencell #1001
Ethanol 96% Gadot-Group 64-17-5
Evicel fibrin sealant Johnson&Johnson EVB05IL Provides both thrombin and fibrinogen (BAC2) solutions
GlutaMAX Gibco 35050061
Goat anti-mouse Cy3 antibody Jackson 115-166-072
Goat anti-rabbit Alexa-Fluor 488 Thermo- Fisher Scientific A11034
Human adipose microvascular cells Sciencell #7200
Human fibronectin Sigma F0895-5MG Stock concentration: 1 mg/mL
ImageJ NIH Free download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Isopropyl alcohol Gadot-Group 67-63-0
Lift-off reagent Kayaku Advanced Materials, Inc G112850 Commercial name Omnicoat
Low-glucose DMEM Biological Industries 01-050-1A
Mouse anti-SMA antibody Dako M0851
NEAA Gibco 11140068
Paraformaldehyde solution 4% in PBS ChemCruz SC-281692
Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution Biological Industries 03-032-1B
Phospate buffered saline (PBS) Sigma P5368-10PAK
Rabbit anti-vWF antibody Abcam ab9378
Silicon wafer Silicon Valley Microelectronics (SVM) Wafers 4", Type N-1-10, 500-550 microns thick
SU-8 2050 photoresist Kayaku Advanced Materials, Inc Y11058
SU-8 developer Kayaku Advanced Materials, Inc Y020100
Tryton-X 100 BioLab LTD 57836

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4), 300-311 (2011).
  2. Landau, S., Guo, S., Levenberg, S. Localization of Engineered Vasculature within 3D Tissue Constructs. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 2 (2018).
  3. Griffith, C. K., et al. Diffusion Limits of an in Vitro Thick Prevascularized Tissue. Tissue Engineering. 11 (12), (2005).
  4. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
  5. Landau, S., et al. Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation. Biomaterials. 122, 72-82 (2017).
  6. Lesman, A., et al. Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs. Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).
  7. Richards, D., Jia, J., Yost, M., Markwald, R., Mei, Y. 3D Bioprinting for Vascularized Tissue Fabrication. Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 132-147 (2017).
  8. Levenberg, S., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nature Biotechnology. 23 (7), 879-884 (2005).
  9. Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
  10. Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11, (2012).
  11. Gariboldi, M. I., Butler, R., Best, S. M., Cameron, R. E. Engineering vasculature Architectural effects on microcapillary-like structure self-assembly. PLOS ONE. 14 (1), 1-13 (2019).
  12. Blache, U., Guerrero, J., Güven, S., Klar, A. S., Scherberich, A. Microvascular Networks and Models, In vitro Formation. Vascularization for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. , 1-40 (2018).
  13. Wong, K. H. K., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. Microfluidic Models of Vascular Functions. Annual Review of Biomedical Engineering. 14 (1), 205-230 (2012).
  14. Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress. Biophysical Journal. 105 (10), 2240-2251 (2013).
  15. Pollet, A. M. A. O., den Toonder, J. M. J. Recapitulating the vasculature using Organ-on-Chip technology. Bioengineering. 7 (1), (2020).
  16. Hasan, A., et al. Microfluidic techniques for development of 3D vascularized tissue. Biomaterials. 35 (26), 7308-7325 (2014).
  17. Jordahl, J. H., et al. 3D Jet Writing: Functional Microtissues Based on Tessellated Scaffold Architectures. Advanced Materials. 30 (14), 1707196 (2018).
  18. Gauvin, R., et al. Microfabrication of complex porous tissue engineering scaffolds using 3D projection stereolithography. Biomaterials. 33 (15), 3824-3834 (2012).
  19. Coscoy, S., et al. Microtopographies control the development of basal protrusions in epithelial sheets. Biointerphases. 13 (4), 041003 (2018).
  20. Kaplan, B., et al. Rapid prototyping fabrication of soft and oriented polyester scaffolds for axonal guidance. Biomaterials. , (2020).
  21. Steier, A., Muñiz, A., Neale, D., Lahann, J. Emerging Trends in Information-Driven Engineering of Complex Biological Systems. Advanced Materials. 31 (26), 11806898 (2019).
  22. Szklanny, A. A., et al. High-Throughput Scaffold System for Studying the Effect of Local Geometry and Topology on the Development and Orientation of Sprouting Blood Vessels. Advanced Functional Materials. , 1901335 (2019).
  23. Welti, J., Loges, S., Dimmeler, S., Carmeliet, P. Recent molecular discoveries in angiogenesis and antiangiogenic therapies in cancer. Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3190-3200 (2013).
  24. Gui, L., Niklason, L. E. Vascular Tissue Engineering: Building Perfusable Vasculature for Implantation. Current Opinion in Chemical Engineering. 3, 68-74 (2014).
  25. Blache, U., Ehrbar, M. Inspired by nature: Hydrogels as versatile tools for vascular engineering. Advances in Wound Care. 7 (7), 232-246 (2018).
  26. Cochrane, A., et al. Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).
  27. Nemani, K. V., Moodie, K. L., Brennick, J. B., Su, A., Gimi, B. In vitro and in vivo evaluation of SU-8 biocompatibility. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 33 (7), 4453-4459 (2013).
  28. Mathew, R., Ravi Sankar, A. A Review on Surface Stress-Based Miniaturized Piezoresistive SU-8 Polymeric Cantilever Sensors. Nano-Micro Letters. 10 (2), 1-41 (2018).
  29. Knowlton, S., Yenilmez, B., Anand, S., Tasoglu, S. Photocrosslinking-based bioprinting: Examining crosslinking schemes. Bioprinting. 5, 10-18 (2017).
  30. Redd, M. A., et al. Patterned human microvascular grafts enable rapid vascularization and increase perfusion in infarcted rat hearts. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
  31. Zhu, Y., et al. SU-8 Photoresist. Encyclopedia of Nanotechnology. , 2530-2543 (2012).
  32. Zheng, F., et al. Organ-on-a-Chip Systems: Microengineering to Biomimic Living Systems. Small. 12 (17), 2253-2282 (2016).
  33. Freiman, A., et al. Adipose-derived endothelial and mesenchymal stem cells enhance vascular network formation on three-dimensional constructs in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 5 (2016).
  34. van Duinen, V., et al. Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform. Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).
  35. Nguyen, D. -H. T., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (17), 6712-6717 (2013).
  36. Nashimoto, Y., et al. Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).
  37. Rosenfeld, D., et al. Morphogenesis of 3D vascular networks is regulated by tensile forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3215-3220 (2016).
  38. Neto, F., et al. and TAZ regulate adherens junction dynamics and endothelial cell distribution during vascular development. bioRxiv. , 174185 (2017).

Tags

Biyomühendislik Sayı 167 Mikrovaskülür damar göçü analitik araç yüksek verimli test anjiogenez analizi doku mühendisliği
Filizlenen Kan Damarlarını İncelemek için Mozaikli İskelelerde Stepwise Hücre Tohumlama
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Szklanny, A. A., Neale, D. B.,… More

Szklanny, A. A., Neale, D. B., Lahann, J., Levenberg, S. Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels. J. Vis. Exp. (167), e61995, doi:10.3791/61995 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter