Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Trinnvis cellesåing på flislagte stillaser for å studere spirende blodårer

Published: January 14, 2021 doi: 10.3791/61995
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Faculty of Biomedical Engineering, Technion, 2Department of Chemical Engineering and Biointerfaces Institute, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Konstruert vev er sterkt avhengig av riktige vaskulære nettverk for å gi vitale næringsstoffer og gasser og fjerne metabolsk avfall. I dette arbeidet skaper en trinnvis såingsprotokoll av endotelceller og støtteceller svært organiserte vaskulære nettverk i en høygjennomstrømningsplattform for å studere utvikling av fartøysadferd i et kontrollert 3D-miljø.

Abstract

Kardiovaskulærsystemet er en nøkkelspiller i menneskelig fysiologi, og gir næring til de fleste vev i kroppen; fartøy er til stede i forskjellige størrelser, strukturer, fenotyper og ytelse avhengig av hvert bestemt perfused vev. Feltet vevsteknikk, som tar sikte på å reparere eller erstatte skadet eller manglende kroppsvev, er avhengig av kontrollert angiogenese for å skape en riktig vaskularisering i det konstruerte vevet. Uten et vaskulært system kan tykke konstruerte konstruksjoner ikke være tilstrekkelig næret, noe som kan føre til celledød, dårlig engraftment og til slutt feil. Dermed er det en enestående utfordring i feltet å forstå og kontrollere oppførselen til konstruerte blodkar. Dette arbeidet presenterer et høygjennomstrømningssystem som gjør det mulig å skape organiserte og repeterbare fartøynettverk for å studere fartøysadferd i et 3D stillasmiljø. Denne to-trinns såingsprotokollen viser at fartøy i systemet reagerer på stillastopografien, og presenterer særegne spirende atferd avhengig av romgeometrien der fartøyene ligger. De oppnådde resultatene og forståelsen fra dette høye gjennomstrømningssystemet kan brukes for å informere bedre 3D bioprinted stillas konstruksjon design, hvor fabrikasjon av ulike 3D geometrier ikke kan raskt vurderes ved bruk av 3D-utskrift som grunnlag for cellulære biologiske miljøer. Videre kan forståelsen fra dette høye gjennomstrømningssystemet brukes til forbedring av rask legemiddelscreening, rask utvikling av samkulturmodeller og undersøkelse av mekaniske stimuli på blodkardannelse for å utdype kunnskapen om det vaskulære systemet.

Introduction

Feltet vevsteknikk utvikler seg raskt mot fabrikasjon av konstruerte konstruksjoner for å erstatte manglende eller skadede organer og vev1. Imidlertid har fullt funksjonelle konstruksjoner ennå ikke oppnådd, delvis, siden generering av operasjonelle vaskulære nettverk for vevsnæring fortsatt er en enestående utfordring. Uten riktig vaskularisering er konstruert vev begrenset til en passiv diffusjonstransport av oksygen og næringsstoffer, noe som begrenser maksimal levedyktig vevstykkelse til diffusjonsgrensen, ca. 200 μm2. Slike tykkelser er ikke egnet til å reparere store vevsfeil eller for full organproduksjon, noe som gjør tilstedeværelsen av funksjonelt vaskulært nettverk en obligatorisk egenskap for funksjonelle og implanterbare vev3.

Det vaskulære systemet består av et bredt utvalg av blodkar, med forskjellige størrelser, fenotyper og organisering, tett relatert til vertsvevet. Å forstå atferds-, respons- og migrasjonsbeslutningene som er tatt av utviklings- og spirefartøyene, kan instruere deres integrasjon i konstruert vev4. For tiden er den vanligste tilnærmingen for å lage in vitro vaskulære nettverk å kombinere endotelceller (ECs) med støtteceller (SCer, med muligheten til å skille seg ut i veggmalericeller), sådd i et tredimensjonalt mikromiljø. Dette miljøet gir kjemiske og fysiske signaler slik at cellene kan feste, spre seg og montere seg selv i fartøysnettverk2,5,6,7,8. Når de er samkulturerte, skiller SCs ut ekstracellulære matriseproteiner (ECM) samtidig som de gir mekanisk støtte til ECene, som danner de rørformede strukturene. Videre fremmer en kryssinteraksjon mellom begge celletypene tubulogenesis, karspirering og migrasjon, i tillegg til SCs modning og differensiering i α glatt muskel actin-uttrykkende (αSMA) veggmaleri celler4. Utvikling av fartøynettverk studeres oftest i 3D-miljøer opprettet ved hjelp av hydrogeler, porøse polymere stillaser eller en kombinasjon av disse. Sistnevnte alternativ gir også et cellevennlig miljø og nødvendig mekanisk støtte for både cellene og ECM9.

Det er utført en stor mengde arbeid for å studere vaskulær utvikling, inkludert kokulturering av cellene på hydrogeler10, hydrogels-stillaskombinasjoner11,12,2D-plattformer og mikrofluidiske enheter13. Hydrogeler kan imidlertid enkelt deformeres av de celleutøvde kreftene14, mens 2D- og mikrofluidikksystemer ikke klarer å gjenskape et miljø som er nærmere naturen for å oppnå en mer ekstrapolerbar respons15,16. Å forstå hvordan forming av fartøy reagerer på omgivelsene kan gi kritisk innsikt som kan muliggjøre fabrikasjon av konstruerte miljøer med evne til å lede fartøyutviklingen på en forutsigbar måte. Å forstå vaskulære formasjonsfenomener er spesielt viktig for å holde tritt med den raske fremveksten av submikron-til-mikron-skaleringsproduksjonsteknikker, for eksempel stereolitografi, digital projeksjonslitografi, kontinuerlig produksjon av flytende grensesnitt, 3D-smelteelektronstråleskriving, løsningsbasert 3D-elektrostråleskriving og nye bioprintteknikker17,18,19,20,21. Å justere kontrollen av disse mikroproduksjonsteknikkene med en dypere forståelse av vaskulær biologi er nøkkelen til etableringen av en passende konstruert vaskulatur for et målvev.

Her presenterer vi et 3D-system for å studere responsen til nye formings- og spirefartøy til den omkringliggende stillasgeometrien, observere deres spire opprinnelse og påfølgende migrasjon22. Ved å bruke 3D stillaser med flislagte romgeometrier, og en to-trinns såingsteknikk, klarte vi å skape høyt organiserte vaskulære nettverk på en klar og enkel å analysere måte. De flislagte geometriene gir et høyt gjennomstrømningssystem med individuelle enheter som inneholder fartøy som reagerer på deres lokale miljø. Ved hjelp av flerfargede ECer sporet vi spireformasjonsopprinnelse og påfølgende migrasjonsmønstre, korrelert med romgeometrien og SCs-plasseringen22.

Selv om den foreslåtte protokollen er forberedt på å analysere effekten av geometriske signaler på vaskulariseringsatferd, kan denne tilnærmingen utvides og brukes på en rekke nye applikasjoner. Det flislagte stillaset og de lett bildebare nettverkene muliggjør enkel analyse av ulike ECs og SCs interaksjon, tillegg av spesifikke organceller og deres interaksjon med vaskulære nettverk, narkotikaeffekt på vaskulære nettverk og mer. Vårt foreslåtte system resulterer svært allsidig og av enkel fabrikasjon og prosessering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Flislagt stillas fabrikasjon

MERK: Fotolithografi er en utbredt teknikk som krever spesialutstyr som vanligvis ligger i et nanofabrikasjonsanlegg / laboratorium. Metoden som er lagt ut i denne protokollen ble generalisert så mye som mulig for publikum; Det kan imidlertid være nødvendig med små endringer i prosedyrene avhengig av utstyret som er tilgjengelig for leseren. Vi anbefaler å utføre disse prosedyrene i et rent rom på et nanofabrikasjonsanlegg for å sikre høyeste prosesskvalitet. Før du begynner, få tilgang til en maske-justering (eller noen UV-eksponering oppsett), en spin coater, varme plater, en løsemiddel vaskestasjon, en fotomaske, og en plasma renere. Løsemidler og kjemikalier som brukes i prosedyren er farlige, så vær så snill å være mest forsiktig for å unngå kjemisk eksponering. Når du designer fotomasken, må du identifisere hvilken størrelse silisiumskiver og fotomasker som er kompatible med spin-coater og maske-aligner. I tillegg er fotoresisten plassert mot kantene på silisiumskiven vanligvis deformert fra håndtering; Derfor gjør designene mot midtområdet av waferen.

  1. Forbered stillaser ved hjelp av en fotolitografiteknikk med den valgte geometrien av interesse.
    1. Før spin belegg, rengjør silisiumskiven. Dette kan gjøres med plasmarengjøring eller en løsningsmiddelbasert teknikk. Hvis plasmarengjøring, følg standard driftsprosedyre for instrumentet for driftsdetaljer. Spray med komprimert nitrogengass og inspiser skiven for å sikre at den er fri for rusk før spin-belegg. Denne skiven vil tjene som substratet som stillasene er opprettet på.
      MERK: For best resultat, start med en frisk wafer. Wafers kan brukes på nytt, men bør være fri for gammel fotoresist, overflatefeil og rusk. Det er nyttig å bruke wafer-pinsett for håndtering.
    2. Sentrer en silisiumskive på spin-coater chucken ved hjelp av en guide. Snurr kort på skiven for å sikre at den er riktig sentrert på chucken, juster etter behov til den er riktig sentrert. Dette må gjøres hver gang en wafer plasseres på spin-coateren. Dispenser 1-4 ml av løftereagenset på skiven (dette vil avhenge av størrelsen på skiven). Omtrent 2 ml løftereagens fungerer bra for en 4-tommers wafer.
      1. Sett spin-coater spredningshastighet på 500 rpm i 5 sekunder, og spin-speed til 1000 rpm i 30 sekunder, og spinn deretter lift-off reagenset. Inspiser skiven for å sikre at den har et jevnt belegg over skiven. Eventuelle rusk igjen på waferen vil være veldig åpenbare på dette tidspunktet. Eventuelle stillaser i et område med rusk vil sannsynligvis være ubrukelige. Etter spinnbelegg, overfør til en varm plate og bake i 1 minutt ved 200 °C.
    3. Gjenta det forrige trinnet to ganger til for totalt tre belegg.
    4. Spin-coat den løftede reagensbelagte silisiumskiven med SU-8 2050 fotoresist til den får en tykkelse på ca. 100 μm.
      1. Dispenser 1 ml motstand for hver 25 mm substratdiameter.
        MERK: Vær forsiktig så du unngår bobler mens du heller på motstanden. For SU-8 2050 fungerer det bra å helle omtrent en sirkel med 2 tommer diameter når du bruker en 4-tommers silisiumskive.
      2. Spin-coat SU-8 2050. Spred med en hastighet på 500 rpm i 5 sekunder, etterfulgt av en spinnhastighet mellom 1700 og 1800 rpm for å oppnå omtrent 100 μm tykkelse.
      3. Valgfritt: Etter at du har spinnet, la spinnbelagte wafere avgasse over natten på en jevn overflate beskyttet mot lys før forbakingen. Dette kan bidra til å kvitte seg med eventuelle bobler og la feilene flate ut.
        MERK: Den faktiske tykkelsen på motstanden og de resulterende stillasene kan variere med brukerfeil og utstyrsparametere. Derfor bør tykkelsen på stillasene verifiseres senere, i trinn 1.6. Endre spinnbeleggprosedyrer tilsvarende for å oppnå ønsket tykkelse.
    5. Før eksponering, pre-bake wafers ved 65 °C i 10 min og deretter 95 °C i 40-50 min. Før eksponering, test overflaten av motstanden ved å trykke på kanten med et par pinsett for å sikre at den ikke lenger er klebrig / viskøs. Det er nyttig å trekke skiven av varmeplaten og la den avkjøles i 0,5-1 min før du vurderer klebrigheten.
      MERK: Rampetider ved langsom temperatur (oppvarming og kjøling) kan bidra til å forhindre fordreining av stillasene.
  2. Utsett fotoresisten for UV-lys (350-400 nm) gjennom en fotomaske med en eksponeringsenergi på 215-240 mJ/cm2 for en motstandstykkelse på 85 - 110 μm. Se retningslinjer fra fotoresistprodusenten for anbefalte eksponeringskorrelasjoner for energitykkelse.
    1. Forsikre deg om at eksponeringen er riktig kalibrert slik at energien er verifisert. Juster eksponeringstiden etter behov for å oppnå ønsket eksponeringsenergi. Videre kan maskejusteringer tillate forskjellige eksponeringsmoduser: vakuumkontakt, hard kontakt, myk kontakt og nærhetskontakt (spesifikke vilkår kan variere). Vanligvis vil disse påvirke oppløsning og funksjonsjustering. Forfatterne brukte vanligvis en "hard kontakt" -modus.
    2. For små funksjoner eller flere lag, der justeringen vil ha betydning, bør du vurdere eksponeringsmoduser og maskejusteringsprosedyrer mer nøye. Pass på å vurdere høyden på motstanden når du justerer tykkelsesverdien. Se standard driftsprosedyrer for maskejusteringen for driftsdetaljer.
      MERK: Utformingen av fotomasken vil bestemme stillasstørrelsen, romgeometrien og antall stillaser oppnådd per batch. Bruken av en hard glass- eller kvartsfotomaske vil gi den høyeste oppløsningen; Imidlertid kan en myk polymer gjennomsiktig filmfotomaske generelt brukes til disse store funksjonsstørrelsene (>10 μm). Bruken av en filmfotomaske kan føre til topografiske trekk langs z-aksen til stillasporene som følge av dårligere funksjonsoppløsning. Dette kan potensielt ha innvirkning på celleatferd. Kontroller ønsket oppløsning, rådfør deg med den som produserer fotomasken for å sikre at ønsket oppløsning oppnås.
  3. Stek skiven umiddelbart etter UV-eksponering ved 65 °C i 2-5 minutter og deretter ved 95 °C i 8–10 minutter.
  4. Utvikle stillasene for å fjerne uutviklet motstand.
    1. Senk stillasene ned med et lavt volum SU-8 utviklerløsning i 7-10 minutter for å oppløse uutviklet motstand.
    2. Skyll med isopropylalkohol (IPA).
    3. Tørrskive med komprimert nitrogen.
      MERK: Vær forsiktig i trinn 1.4 for ikke å forårsake for tidlig frigjøring av stillasene. Lave mengder utvikler og skånsom håndtering er nødvendig for å oppnå dette.
  5. Etter utvikling, hard bake wafers ved 150 °C i 15 min.
    MERK: Etter hardbaking kan det være en fordel å slå av varmeplaten slik at skivene avkjøles svært sakte for å forhindre fordreining/krølling av de endelige stillasene.
  6. Valgfritt: Etter den harde steken og før løfting, vurder stillastykkelsen siden stillasene fortsatt skal festes forsiktig til overflaten av skiven. For denne prosedyren fungerer kontaktprofilerometri bra; Enhver passende metode kan imidlertid brukes.
  7. Løft stillasene av skiven.
    1. Senk stillasene i SU-8-utvikleren for å få dem til å løfte av skiven umiddelbart. Hvis stillasene ikke løfter av, skyver du forsiktig stillasene med et par wafer-pinsett.
    2. Fjern overflødig utvikler.
    3. Overfør stillasene til ny beholder og senk i isopropylalkohol. Skyll i IPA i minst 6 ganger for å sikre at alle utviklere er fjernet.
  8. Lufttørk stillasene i minst en uke før bruk.

2. Stillas fibronectin belegg

  1. For desinfeksjon, senk stillasene i 70% etanol (v / v) i minst 15 minutter, og vask 2 ganger i fosfatbufret saltvann (PBS) før bruk.
    FORSIKTIG: SU-8 stillasene er skrøpelige og kan lett gå i stykker. Håndtering anbefales ved hjelp av stumpe og buede spiss tang, og de bør håndteres med største forsiktighet. Enklere håndtering kan oppnås ved å senke stillasene ned i væske, for å unngå elektrostatiske interaksjoner mellom stillasene og overflaten.
  2. Forbered en fortynning av 50 μg/ml human fibronektin i PBS og dekk stillasene ved protein adsorpsjon.
    1. Bland 1,5 μL fibronektinbestandsoppløsning (1 mg/ml) med 28,5 μL PBS per hvert stillas som skal frøs. Fortrinnsvis, forberede bare en fibronectin fortynning som skal brukes til alle stillaser for å unngå pipetteringsfeil.
      1. For 10 stillaser, bland 15 μL lagerfibronektinoppløsning i 285 μL PBS, som utgjør totalt 300 μL 50 μg / ml fibronektinfortynning.
    2. Plasser stillasene sparsomt på toppen av en hydrofob overflate (dvs. ikke-vevskultur (nonTC) 10 cm tallerken) og dekk hvert stillas med 30 μL fibronektinfortynning fremstilt i trinn 2.2.1.
      FORSIKTIG: Pass på at ingen bobler sitter fast i stillasrommene. Hvis det er bobler til stede, kan de fjernes ved å riste stillaset forsiktig i dråpen eller lett pipettering.
    3. Sett på plass lokket på platen og plasser de fibronektindekkede stillasene i en inkubator med 37 °C og 100 % fuktighet i minst en time.
    4. Etter inkubasjon, skyll stillasene lett i PBS for å fjerne fibronectinrester. Stillasene kan oppbevares i PBS ved 4 °C i opptil en uke før bruk.

3. Endotelceller sådd

  1. Forbered EC medium ved å blande basalmediet med sine korrespondent medium kit komponenter, inkludert en antibiotika løsning (Pen / Strep), foster bovint serum (FBS), og endotelcelle vekst kosttilskudd, som angitt av produsenten.
  2. Lag en human fettmikrovaskulær endotelcelle (HAMEC) suspensjon i EC-medium med en konsentrasjon på 4 x 106 celler / ml.
    MERK: Sanntidsavbildning kan utføres hvis de brukte endotelcellene tidligere er transfektert for å uttrykke et fluorescerende protein, eller pre-farget ved hjelp av et ikke-giftig cytoplasmisk membranfargestoff (nærmere referert som merket ECs).
  3. Bruk tang, plasser ett fibronectinbelagt stillas per brønn på en ikkeTC 24-brønns platebrønn.
  4. Dekk hvert stillas med 25 μL dråper av HAMEC-fjæringen. Pass på å ikke la suspensjonen strømme bort fra stillaset, siden det kan hindre celleadhesjon.
  5. Sett lokket på platen og legg det i en inkubator ved 37 °C, 5 % CO2 og 100 % fuktighet. La inkubere i minst 60 minutter og maksimalt 90 minutter.
    MERK: Under inkubasjon forbedrer plassering av platen på en orbital shaker i inkubatoren cellefestet på stillasets vegger. Orbital shaker bør settes til ikke mer enn 5 rpm.
  6. Etter inkubasjon fyller du hver brønn med 700 μL EC-medium ved hjelp av en pipette.
    MERK: Forvent å se ECs på bunnen av brønnen, siden noen av cellene ikke fester seg til stillaset og faller gjennom stillasets hulrom.
  7. Inkuber de endotelialiserte stillasene til EC-sammenløp kan observeres ved hjelp av fluorescerende mikroskopi på stillasets vegger (ved bruk av merkede ECer), eller i 3 dager (ved bruk av ikke-merkede ECer), noe som gir nok tid til å oppnå EC-sammenløp. Endre mediet annenhver dag.

4. Støtt cellesåing og samkultur

  1. Forbered dentalmasse stamcelle (DPSC) medium (DPSCm) ved å blande 500 ml lavglukose Dulbeccos modifiserte Eagle medium (lavglukose DMEM), 57,5 ml FBS, 5,75 ml ikke-essensielle aminosyrer (NEAA), 5,75 ml GlutaMAX og 5,75 ml penicillin-streptomycin-nystatinoppløsning.
  2. Overfør de endoteliserte stillasene til en ny ikkeTC 24-brønnsplate for å kaste ECer festet til brønnens bunn ved hjelp av tang.
    1. Kast alle medier fra strømplaten med en 1 ml pipette eller vakuumsuging. Pass på at du ikke påfører vakuum rett på stillaset.
    2. Plasser ett stillas per brønn, helst i midten av brønnen for å unngå å løpe væske mot veggene på grunn av overflatespenningseffekter. Tørk området rundt stillaset med lett vakuum, men unngå fullstendig tørking av stillaset.
  3. Forbered en DPSC-suspensjon i fibrin pre-gel løsning.
    1. Fortynn trombin- og fibrinogenbestandsløsninger med PBS til du får en endelig konsentrasjon på henholdsvis 5 U/ml og 15 mg/ml.
    2. Forbered en 8 x 106 DPSC / ml suspensjon i 5 U / ml trombinfortynning og fordel i individuelle eppendorfs 12,5 μL nevnte suspensjon per stillas som skal frøes.
    3. Sett en 5-50 μL pipette (eller lignende) til 12,5 μL og fyll den med 15 mg / ml fibrinogenoppløsning.
    4. Uten å fjerne spissen, sett pipetten til 25 μL. Materialet i spissen skal stige og etterlate et tomt volum mot spissåpningen.
    5. Trykk stempelknappen langsomt til væsken når spissåpningen, men lekker ikke ut. Hold stempelet i denne posisjonen og legg spissen i et av mikrosenterrørene som inneholder cellene i trombinfjæring, og sørg for at spissen er i kontakt med væsken.
      FORSIKTIG: Den fibrin krysskoblingen begynner umiddelbart etter at trombin og fibrinogen kommer i kontakt. Følgende trinn bør gjøres raskt.
    6. Slipp stempelknappen forsiktig og trekk celleopphenget inn i spissen. Bland begge materialene grundig, unngå bobledannelse.
  4. Dispenser raskt de blandede materialene på toppen av et endotelialisert stillas. Gjenta de forrige trinnene for hvert stillas, og sørg for å alltid endre tips mellom bruksområder for å unngå uventet fibringeldannelse i spissen.
  5. Skift ut platelokket og inkuber stillasene ved 37 °C, 5 % CO2 og 100 % fuktighet i 30 minutter.
  6. Etter inkubasjon fyller du hver brønn med 1 ml 1:1 DPSC og EC-medium.
    1. Kultur i 1 uke, skiftende medium annenhver dag.
    2. Under kultur, fjern mediet fra brønnen og bilde konstruksjonene ved hjelp av et konfokalt mikroskop på forskjellige tidspunkter for å studere vaskulær utvikling eller annen interesseparameter.
      MERK: Dette trinnet kan bare utføres hvis eksperimentet utføres med merkede ECer. Se trinn 6 - MERKNAD for ytterligere avklaring.

5. Immunfluorescent farging for karakteristiske vaskulære markører

MERK: Følgende trinn kan utføres i de samme brønnene der konstruksjonene ble dyrket. Det er viktig å alltid sørge for at løsningene dekker stillasene helt. Videre, når det er mulig, anbefales det å utføre trinnene på en orbital shaker, men ikke obligatorisk.

  1. På dag 7, kast mediet fra brønnene og skyll stillasene ved å legge PBS til brønnene og fjerne det ved hjelp av vakuum.
  2. Fest stillasene ved å legge til 4% paraformaldehyd i 20 minutter. Vask i PBS 3 ganger, 5 minutter per vask.
  3. Permeabiliser de faste cellene ved hjelp av 0,3% Triton-X i PBS (v / v) i 15 minutter. Vask i PBS 3 ganger, 5 minutter per vask.
  4. Forbered en 5% bovint serumalbumin (BSA) i PBS (w / v) blokkeringsløsning og dekk stillasene. La ved romtemperatur i 1 time.
    MERK: Alle nødvendige løsningsmengder vil avhenge av antall stillaser som skal farges. Forbered løsningene etter behov for å holde de angitte konsentrasjonene.
  5. Forbered og påfør den primære antistofffargingsløsningen .
    1. Fortynn kanin anti-von Willebrand faktor (vWF) antistoff 1:150 og mus anti-SMA antistoff 1:50 i fersk blokkering løsning.
      MERK: Andre endotelceller, for eksempel CD31 eller VE-Cadherin, kan brukes.
    2. Dekk stillasene med den primære antistoffløsningen og hold den ved 4 °C over natten. Vask i PBS tre ganger, 5 minutter per vask.
  6. Forbered og påfør den sekundære antistofffargingsløsningen.
    1. Fortynn geit antimus Cy3 antistoff 1:150 og geit anti-kanin Alexa-Fluor 488 1:400 i PBS.
    2. Dekk stillasene med den sekundære antistoffløsningen og inkuber i minst 3 timer ved romtemperatur, eller ved 4 °C over natten. Vask 3 ganger i PBS, 5 minutter per vask. Hold farget stillas i 0,3% PFA i PBS (v / v) i opptil en måned.

6. Stillas konfikal bildebehandling og fartøyutviklingsanalyse

MERK: Følgende trinn kan utføres på de faste og fargede stillasene på det valgte siste tidspunktet, eller, hvis fluorescerende celler ble brukt, i løpet av cellekulturperioden uten å måtte avslutte eksperimentet. For sistnevnte anbefales det å angi bestemte tidspunkter; Dette arbeidet viser dag 0 (før SCs-såing) og dag 1, 3, 5 og 7 etter SCs-sådd (Figur 3A).

  1. Bilde stillasene ved hjelp av et konfokalt mikroskop med en 5X linse og en zoom på 0,5 og hele z-serien av stillaset. Dette vil tillate å fange 9 separate rom for de kvadrerte og sirkulære geometriene, eller 8 fulle rom for sekskantet geometri. Bilde fluorescerende signal og det overførte lyset for å få både karnettverksstrukturen og romgeometrien (Figur 3A).
  2. Bruke ImageJ (eller annen programvare for bildebehandling), beskjære hvert enkelt rom; For denne prosessen er bare de vaskulære nettverksmarkørene relevante. Fjern eventuelt fartøy som ikke er plassert inne i kupéområdet. Opprett en maksimal intensitetsprojeksjon, og lagre hvert enkelt beskåret rom som et TIFF-bilde.
    1. I ImageJ trykker du på Fil > Åpne og velger ønsket TIFF-bilde som inneholder flere avdelinger. Bildet skal ha minst to kanaler, det fluorescerende karnettverket og det overførte lysbildet.
    2. Velg markeringsverktøyet Mangekant på verktøylinjen. Velg den overførte lyskanalen. Klikk på et av hjørnene i sekskantet rom, ved grensesnittet mellom romområdet og stillasveggen, dette vil starte maskedefinisjonen. Fortsett å klikke på de neste hjørnene i sekvensiell rekkefølge til det første hjørnet er valgt, og lukk masken.
      MERK: Denne forklaringen gjelder for et sekskantet rom. Når rommet er firkantet eller sirkulært, bruker du henholdsvis rektangel- eller ellipseverktøyene til å opprette en passende maske. Uansett form, pass alltid på masken for å følge stillasets indre vegg.
    3. Klikk Analyser > verktøy > ROI-behandling. I ROI manager (ROI, interesseområde) klikker du Legg til for å lagre den opprettede masken. Den nye masken vises i listen til venstre. Dette trinnet gjør at analysen kan være konsekvent mellom forskjellige bilder.
      MERK: I ROI manager er det mulig å lagre en fil med alle opprettede masker ved å klikke på Mer > Lagre. Velg et navn og en plassering i vinduet Lagre merket område, og lagre ROI-filen. For å hente masken, klikk på Mer > Åpne i ROI-behandling og velg ønsket ROI-fil.
    4. Velg det fluorescerende karnettverksbildet og klikk på Rediger > Fjern utenfor. Bare bildet i masken forblir, mens resten blir eliminert.
    5. Når det slettede nettverksbildet er åpent, klikker du Bilde > Dupliser. Skriv navnet på bildet i popup-vinduet Dupliser. Hvis Dupliser hyperstakk er valgt, opphever du merkingen og klikker OK. Et nytt bilde som bare inneholder de beskårne fluorescerende fartøysnettverkene vil bli opprettet.
    6. Lagre det beskårne bildet ved å klikke Lagre som > Lagre som > Tiff. Velg navn og katalog, og klikk OK.
  3. Analyser den vaskulære utviklingen på de beskårne bildene.
    1. Last ned og installer den analytiske gratisprogramvaren AngioTool, som gir kvantitative verktøy for å kvantifisere en rekke vaskulære parametere. Programvaren kan fås fra følgende adresse https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home.
    2. Angi skaleringsverdien for bildene for å oppnå resultater i millimeterenheter og laste inn et bilde.
      1. Klikk på Innstilling-fanen og fyll Avstand i piksler og Avstand i mm med representative verdier fra de tatt bildene. Ved hjelp av bildeparameterne nevnt ovenfor er verdiene som skal fylles, 400 piksler per 1 mm.
      2. Trykk på Åpne bilde-knappen og bla gjennom etter bildet av interesse.
    3. Velg analyseparameterne for å kvantifisere fartøyutvikling i analysefanen.
      1. Under fartøyets diameter og intensitetsfelt fjerner du merket for en hvilken som helst markør fra toppmarkøren, og aktiverer markøren som representerer tallet 3.
      2. Under fartøyets diameter- og intensitetsfelt, på nedre rekkeviddevelger, flytt den nedre områdemarkøren til 60, og la den høye rangerprodusenten være 255.
      3. Aktiver boksen Fjern små partikler og sett markøren på 100.
      4. Under feltet Lagringsinnstillinger velger du navnet og plasseringen til oppslagsarkfilender resultatene skal lagres, og trykker Kjør analyse -knappen. Hvis det er merket av for Lagre resultatbilde , genererer og lagrer Angiotool et nytt jpeg-bilde som viser karnettverkets kvantifiserte parametere.
        MERK: For hver utførte analyse uten å endre filnavnet på oppslagsarket, legges det til en ny rad nederst i filen, med de nylig anskaffede resultatene.
  4. Organiser dataene og kjør en statistisk analyse.
    1. For alle de bearbeidede bildene velger du interesseparameteren fra oppslagsarket (f.eks. total fartøylengde og fartøyområde) og legger dem inn i en statistisk analyseprogramvare for å studere de oppnådde resultatene på riktig måte (figur 3C).

7. Tidsforløpavbildning for spiring av opprinnelsesdeteksjon og migreringssporing

  1. Alternativt, for å dyrke stillasene i inkubatoren som beskrevet i trinn 4.6, sett et konfokalt mikroskopkulturkammer til 37 °C, 5 % CO2 og 100 % fuktighet.
    1. Sett platen som inneholder de fullt frøede stillasene i det konfikale mikroskopkammeret og sett bildeparametrene til ønsket verdi.
    2. Sett bildeintervallet til 30 minutter, og den totale bildetiden på 72 timer. Dette vil gjøre det mulig å kjøre tidsforløpet helt uten behov for en middels endring.
      FORSIKTIG: Hvis det ønskes lengre tidsforløpavbildning, bør det utføres en nøye posisjonskalibrering for å kunne hente det opprinnelige bildestedet, siden middels endringer krever at platen fjernes fra den konfokale inkubatoren og inn i den sterile biologiske hetten.
      MERK: ECs løsrivelse fra stillasveggene og rørformede strukturer formasjon vil starte innen den første timen etter SCs såing (trinn 4) og kan ta opptil 50 timer å fullføre. Etter første rørdannelse vil nye spirer begynne å migrere inn i rommet fra de omkringliggende karene. Spiring og påfølgende nettverksoppussing vil fortsette gjennom hele eksperimentet omtrent til dag 10, når fartøysnettverkene blir stabile22. Bruk denne informasjonen til å velge startpunkt og tidstrinn for tidsforløp i henhold til dette.
  2. Lagre hele tidsforløpfilmfilen som en TIFF-sekvens.
  3. Åpne ImageJ, og klikk Fil > Importer > bildesekvens og velg filene dine. Dette åpner TIFF-sekvensen som en film.
  4. Åpne plugin-modulen manuell sporing ved å klikke på Plugins > Manuell sporing. Dette åpner Sporing -vinduet.
  5. Vær oppmerksom på filmen og velg fartøyet som skal spores. Vær oppmerksom på opprinnelsen og migrasjonen.
  6. Aktiver boksen Vis parametere , og skriv inn de 30 minuttene for Tidsintervall. x/y-kalibreringen avhenger av pikselmengden som ble valgt under bildebehandling.
  7. Fortsett å spore spirefartøyene manuelt fra stillaskonturen.
    1. Trykk legg til spor-knappen. På filmens første ramme trykker du på plasseringen av fartøyet som skal spores. Etter dette endres filmen automatisk til neste bilde.
    2. Klikk på bildet av den andre rammen der fartøyet ligger. Igjen, filmen vil endres til neste bilde automatisk.
    3. Fortsett med samme fartøy til hele migreringssporingen er fullført.
    4. I Sporing-vinduet klikker du på Overlay Dots &Lines for å avtrykke en visuell bane for fartøymigreringen på filmen. Dette åpner en kopi av filmen med en prikk som representerer den gjeldende plasseringen til sporingen, og en linje som viser den forrige banen.
    5. Klikk på Avslutt spor-knappen for å fullføre registreringen av gjeldende fartøybevegelse.
    6. Klikk på Legg til spor-knappen igjen for å starte på nytt med et nytt fartøy. Når du gjør dette, vil linje- og prikkmarkørene automatisk endre fargen på det nye fartøyet. Gjenta til alle ønskede fartøy spores.
      MERK: X/y-plasseringen, fartøyets hastighet og flyttet avstand kan hentes fra popup-vinduet Resultater. Hvert fartøy vil bli identifisert med spornummeret i kolonnen lengst til venstre. Disse dataene kan kopieres og limes inn i et oppslagsark for å utføre videre analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den presenterte protokollen, ved hjelp av stereolitografiteknikker, muliggjør fabrikasjon av flislagte stillaser laget av SU-8 fotoresist. Stillaser med distinkte romgeometrier (firkanter, sekskanter og sirkler) og svært nøyaktige og repeterbare funksjoner ble oppnådd (figur 1).

Figure 1
Figur 1: Representative skanning elektronmikroskopibilder av de flislagte kvadratiske, sirkulære og sekskantede stillasgeometriene (skalastang = 500 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Med en trinnvis cellesåing (trinn 2 til 4) ble de fabrikkerte stillasene brukt til å skape svært organiserte vaskulære nettverk. Ved bruk av tradisjonell samtidig såing av både ECs og SCer manglet de resulterende fartøyene en klar organisasjon. For dette ble stillasfibronectinbelegget utført (trinn 2), stillasen endotelialiseringstrinnet ble hoppet over (trinn 3), og DPSC og HAMEC ble samtidig co-seedet i fibringel (trinn 4). På denne måten fordeles cellene homogent over stillaset (figur 2, øverste rad), noe som resulterer i uforutsigbare og uorganiserte utviklede vaskulære nettverk som ikke ser ut til å samhandle med det omkringliggende stillaset. Derimot gir for det første såing av ECene på stillasveggene en nøyaktig innledende endotelcellemønster. Det senere tilskuddet av SCer i en fibringel resulterer i et forutsigbart tubulogenesisfenomen, med dannende fartøy som følger nøye med på stillasveggens form, og spirer nye fartøy som migrerer inn i romrommet (Figur 2, nederste rad).

Figure 2
Figur 2: Vaskulær sammenligning mellom samtidig kontra trinnvis cellesåing. Representative bilder av vaskulær utvikling i flislagte stillaser for en samtidig (øverste rad) cellesåing av ECs (rød) og SCs (grønn) og trinnvis cellesåing (nederste rad) på dag 1 og 5. Den trinnvise såingen resulterer i organiserte vaskulære nettverk som følger stillasveggene og spire inn i romrommet (skalastang: 100 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Ved bruk av fluorescerende ECer, enten transfektert eller farget, kan karene avbildes i sanntid uten å måtte fikse og avslutte eksperimentet for hvert tidspunkt. Rødt fluorescerende protein som uttrykker ECs (RFP-ECs) ble dyrket på sekskantede stillaser og avbildet etter sådd (Figur 3A, dag 0). På dag 1 ble SC-ene lagt til, og de vaskulære nettverkene ble avbildet annenhver dag for å kvantifisere fartøyutviklingen (Figur 3A, dag 1, 3, 5 og 7). For hvert tidspunkt ble det tatt brede bilder av hele stillaset (Figur 3B). For hvert rom organiserte og samhandlet fartøyene hovedsakelig med celler som ligger innenfor deres innesperring. Derfor ble hvert rom isolert og de overflødige fartøyene utenfor rommet ble fjernet ved hjelp av ImageJ. De rene bildene med ett rom ble deretter analysert ved hjelp av Angiotool. Angiotool returnerte en oppslagsarkfil som inneholdt flere fartøyparametere, og en visuell representasjon av hovednettverksegenskapene, for eksempel skjelett, skjæringspunkt og karoverflate. De innhentede dataene ble analysert ved hjelp av den statistiske analyseprogramvaren Prism, og det ble observert en klar fartøysvekst for total fartøylengde og -areal i løpet av eksperimentets tidsramme (figur 3C). I løpet av et 1-ukers eksperiment forventes fartøy å videreutvikles og utvides som vist i figur 3A og figur 2C. Avtagende fartøylengde eller areal, unnlatelse av å danne fartøy etter dag 3 eller fartøy som dannes som vist i øverste rad i figur 2, kan tolkes som mislykkede eksperimenter.

Figure 3
Figur 3: Representative utviklingsbilder og analyse av organiserte vaskulære nettverk. (A) ECs (rød) når samløp på stillasveggen der SCer etterpå blir sådd; SCs tillegg representerer dag 0 av eksperimentet. På dag 1 etter SCs sådd løsner ECene til romrommet og begynner å danne fartøy som vil fortsette å spire og koble til på ytterligere dager. (B) Konfokale bildebehandlingstrinn for vaskulær nettverksanalyse (i) Et bredt konfokalt bilde som inneholder flere rom er tatt, (ii) et enkelt rom beskjæres (merket av den hvite stiplede sekskanten), (iii) deretter skilles den vaskulære nettverkskanalen, og alle fartøy utenfor kupéveggene beskjæres. Bildet med ett rom analyseres ved hjelp av Angiotool, og returnerer en liste over vaskulære parametere supplert med visuelle markører, for eksempel karområdet (skissert i gult), karlengden (vist med grønne linjer) og skjæringspunktpunktene (merket som blå prikker). (C) Komparative resultater av den totale fartøylengden og det totale fartøyområdet innenfor sekskantede rom på forskjellige tidspunkter (resultatene presenteres som gjennomsnittlig ± SD, n > 6; alle skalastenger: 200 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Ved hjelp av flerfargede ECer for å lette identifisering av enkeltceller ble det utført en konfokal bildebehandlingstid for å tillate sporing av enkeltfartøy (Tilleggsvideo 1). Fartøyene ble observert og sporet ved hjelp av Manual Tracking ImageJ plugin. Spisscellen ble valgt for hver ramme av filmen (Figur 4A) til fartøyet anastomosed med den omkringliggende vaskulaturen. Som et resultat genererte plugin-modulen Manuell sporing fartøyets bane i sanntid, som tillot å observere fartøymigrasjonen ( Figur4B).

Figure 4
Figur 4: Representativ sporing av spirefartøy. (A) En flerfarget ECs (grønn, rød og blå) tidsforløp brukes til å lette identifisering av enkeltfartøy. Et spirende fartøy identifiseres og spores ved hjelp av ImageJ plugin Manuell sporing. Endesiden av fartøyet er merket for hvert tidspunkt punkt å spore i sanntid; Den svarte i hvitt-markøren ble lagt til for å vise det valgte fartøyets sluttpunkt. (B) Den resulterende 2D-sporingen av fartøyet, som behandlet av ImageJ-pluginet, viser det lengste punktet med en prikk, og den dannede banen med en linje (skalalinje = 200 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Karmodning, representert ved tilstedeværelse av SMA + SCer, kan lett observeres i den foreslåtte plattformen. Vaskulaturer som presenterer høyere antall SMA + SCer representerer et mer modent nettverk, siden SMA-uttrykk korrelerer med karstabilisering over tid23. For sirkulære, sekskantede og kvadrerte rom øker mengden SMA+-SCer over tid (figur 5A). På dag 3 viste alle former spredte SMA + SCer og ukomprimære fartøy med få eller ingen spirer overhodet. På dag 7 viste alle former et rikt og komplekst vaskulært nettverk, med høyere tilstedeværelse av SMA + SCer rundt fartøyene. Videre viser høyere forstørrelsesbilder en tettere SMA + SCs tilstedeværelse samlokalisert med dannede fartøy, som viser SCs rekruttering og differensiering rundt vaskulære strukturer (Figur 5B).

Figure 5
Figur 5: SMA+-SCer og blodårer øker over tid. A) Glatt muskel aktin (rød) og vWF (kar, grønn) er vist for vaskulære nettverk i sirkulære, kvadrerte og sekskantede rom på dag 3 og dag 7. Både vaskulær forlengelse og SMA-uttrykkende støtteceller (SMA + SCer) øker over tid, noe som betyr høyere karmodning og kompleksitet (skalastang = 200 μm). B) Representative bilder av SMA + SCs tettere akkumulering rundt fartøy på dag 7. Kjernene (blå) i det sammensatte bildet avslører tilstedeværelsen av SCer som ikke uttrykker SMA-proteinet (skalastang = 50 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsvideo 1: Tidsforløp for flerfargede ECer for sporing av fartøymigrasjon. Klikk her for å laste ned denne videoen.  

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Behovet for en rik vaskulatur i innebygd i konstruert vev er avgjørende for å konstruere overlevelse og riktig funksjon1. Selv om ingeniørarbeid det vaskulære systemet har vært fokus for en stor mengde forskning, er mye igjen å undersøke og forstå24. Spesielt når du gjenskaper et bestemt vev, bør mikrovaskulaturen oppføre seg og organisere tilsvarende12. Den vanligste tilnærmingen for mikrovesselsgenerering er co-seeding endotelial og støtte celler i et passende 3D-miljø som er kompatibelt for cellevedlegg, spredning og kardannelse25. Denne metoden resulterer ofte i sterkt uorganiserte nettverk, noe som gjør det vanskelig å studere mikrovaskulær oppførsel22. Her gir den presenterte protokollen et nytt verktøy som genererer svært organiserte vaskulære nettverk i et høygjennomstrømningssystem, med fartøy som enkelt kan spores og overvåkes over tid, for å studere deres utvikling og oppførsel. Den trinnvise såingen av ECene (trinn 2-3), etterfulgt av SCene (trinn 4), er viktige trinn for å oppnå slike organiserte nettverk22. I tillegg presenterer denne teknikken et ekte 3D-miljø for vaskulære modeller, der fartøy kan migrere i de tre dimensjonene og skape relevante strukturer. I motsetning tilbyr mer populære metoder for vaskulær modellering, for eksempel mikrofluidikksystemer, bare en 2,5D vevsrepresentasjon26.

Den foreslåtte metoden kan enkelt modifiseres og brukes til å studere mange forskjellige faktorer som påvirker fartøyets nettverksutvikling og oppførsel. Fotolithographic SU-8 harpiks stillas fabrikasjon er en vanlig teknikk med en imponerende allsidighet som gjør det mulig å skape et bredt utvalg av former26,27, med potensial til å designe strukturer som ligner komplekse innfødte konstruksjoner, for eksempel alveoli eller nefrotisk enhet. Likevel er en ulempe ved å bruke SU-8 den lave bioabsorbabiliteten27, noe som gjør plattformen hovedsakelig til et forskningsverktøy, i stedet for et implanterbart vev. Dette kan imidlertid forbedres ved å bruke biokompatible materialer som kan krysskoble under UV/synlig lysbelysning, og 3D-utskrift ved hjelp av nøyaktige teknikker som stereolitografi29. De resulterende vaskulære konstruksjonene kan deretter implanteres i en dyremodell30. En annen begrensning i systemet er stillaset maksimal oppnåelig tykkelse med høy detaljnøyaktighet, begrenset av stereolitografisk teknikk31. Den foreslåtte protokollen er egnet for å skape tynt stillas som kan representere innfødte vevsstørrelser.

Denne plattformen tilbyr potensialet til å undersøke flere variabler som påvirker vaskulariseringsfenomenene4,32. For det første samspillet mellom ulike typer ECs og SCs, og deres fartøydannelse, utvikling og modningsevner, som er kjent for å variere når du bruker celler fra forskjellige vevsopprinnelse33. For det andre, effekten av vekstfaktorer, små molekyler og inhibitorer på vaskulaturen, noe som gir en klar visualisering av deres innvirkning i sanntid34,35. For det tredje, tilsetning av andre celletyper, sfæroider eller organoider og deres kommunikasjon og interaksjon med formingskarene36. For dette representerer det foreslåtte systemet et kraftig verktøy for å undersøke mikrovaskulærsystemet.

Fremtidige trinn vil dra nytte av det foreslåtte systemet for å undersøke effekten av mekaniske stimuli, for eksempel interstitiell strømning og mekaniskstrekking 37,38, på utviklingsvaskulaturen. Dette vil forhåpentligvis belyse nye aspekter som vil utvide dagens kunnskap og toppmoderne forskning på vaskulær mekanobiologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av finansiering fra University of Michigan - Israel Partnership for Research. Forfatterne vil takke Uri Merdler, Lior Debbi og Galia Ben David for deres gode hjelp og støtte, Nadine Wang, Ph.D. og Pilar Herrera-Fierro, ph.d. ved Lurie Nanofabrication Facility ved University of Michigan, samt Luis Solorio, Ph.D. for opplysende diskusjoner om fotolitografiteknikker.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Angiotool freeware NIH-CCR Free download at https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home
Bovine albumin serum Probumin Millipore 82-045-1
Dental pulp stem cells Lonza PT-5025
ECM media + bullet kit Sciencell #1001
Ethanol 96% Gadot-Group 64-17-5
Evicel fibrin sealant Johnson&Johnson EVB05IL Provides both thrombin and fibrinogen (BAC2) solutions
GlutaMAX Gibco 35050061
Goat anti-mouse Cy3 antibody Jackson 115-166-072
Goat anti-rabbit Alexa-Fluor 488 Thermo- Fisher Scientific A11034
Human adipose microvascular cells Sciencell #7200
Human fibronectin Sigma F0895-5MG Stock concentration: 1 mg/mL
ImageJ NIH Free download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Isopropyl alcohol Gadot-Group 67-63-0
Lift-off reagent Kayaku Advanced Materials, Inc G112850 Commercial name Omnicoat
Low-glucose DMEM Biological Industries 01-050-1A
Mouse anti-SMA antibody Dako M0851
NEAA Gibco 11140068
Paraformaldehyde solution 4% in PBS ChemCruz SC-281692
Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution Biological Industries 03-032-1B
Phospate buffered saline (PBS) Sigma P5368-10PAK
Rabbit anti-vWF antibody Abcam ab9378
Silicon wafer Silicon Valley Microelectronics (SVM) Wafers 4", Type N-1-10, 500-550 microns thick
SU-8 2050 photoresist Kayaku Advanced Materials, Inc Y11058
SU-8 developer Kayaku Advanced Materials, Inc Y020100
Tryton-X 100 BioLab LTD 57836

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4), 300-311 (2011).
  2. Landau, S., Guo, S., Levenberg, S. Localization of Engineered Vasculature within 3D Tissue Constructs. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 2 (2018).
  3. Griffith, C. K., et al. Diffusion Limits of an in Vitro Thick Prevascularized Tissue. Tissue Engineering. 11 (12), (2005).
  4. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
  5. Landau, S., et al. Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation. Biomaterials. 122, 72-82 (2017).
  6. Lesman, A., et al. Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs. Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).
  7. Richards, D., Jia, J., Yost, M., Markwald, R., Mei, Y. 3D Bioprinting for Vascularized Tissue Fabrication. Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 132-147 (2017).
  8. Levenberg, S., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nature Biotechnology. 23 (7), 879-884 (2005).
  9. Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
  10. Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11, (2012).
  11. Gariboldi, M. I., Butler, R., Best, S. M., Cameron, R. E. Engineering vasculature Architectural effects on microcapillary-like structure self-assembly. PLOS ONE. 14 (1), 1-13 (2019).
  12. Blache, U., Guerrero, J., Güven, S., Klar, A. S., Scherberich, A. Microvascular Networks and Models, In vitro Formation. Vascularization for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. , 1-40 (2018).
  13. Wong, K. H. K., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. Microfluidic Models of Vascular Functions. Annual Review of Biomedical Engineering. 14 (1), 205-230 (2012).
  14. Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress. Biophysical Journal. 105 (10), 2240-2251 (2013).
  15. Pollet, A. M. A. O., den Toonder, J. M. J. Recapitulating the vasculature using Organ-on-Chip technology. Bioengineering. 7 (1), (2020).
  16. Hasan, A., et al. Microfluidic techniques for development of 3D vascularized tissue. Biomaterials. 35 (26), 7308-7325 (2014).
  17. Jordahl, J. H., et al. 3D Jet Writing: Functional Microtissues Based on Tessellated Scaffold Architectures. Advanced Materials. 30 (14), 1707196 (2018).
  18. Gauvin, R., et al. Microfabrication of complex porous tissue engineering scaffolds using 3D projection stereolithography. Biomaterials. 33 (15), 3824-3834 (2012).
  19. Coscoy, S., et al. Microtopographies control the development of basal protrusions in epithelial sheets. Biointerphases. 13 (4), 041003 (2018).
  20. Kaplan, B., et al. Rapid prototyping fabrication of soft and oriented polyester scaffolds for axonal guidance. Biomaterials. , (2020).
  21. Steier, A., Muñiz, A., Neale, D., Lahann, J. Emerging Trends in Information-Driven Engineering of Complex Biological Systems. Advanced Materials. 31 (26), 11806898 (2019).
  22. Szklanny, A. A., et al. High-Throughput Scaffold System for Studying the Effect of Local Geometry and Topology on the Development and Orientation of Sprouting Blood Vessels. Advanced Functional Materials. , 1901335 (2019).
  23. Welti, J., Loges, S., Dimmeler, S., Carmeliet, P. Recent molecular discoveries in angiogenesis and antiangiogenic therapies in cancer. Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3190-3200 (2013).
  24. Gui, L., Niklason, L. E. Vascular Tissue Engineering: Building Perfusable Vasculature for Implantation. Current Opinion in Chemical Engineering. 3, 68-74 (2014).
  25. Blache, U., Ehrbar, M. Inspired by nature: Hydrogels as versatile tools for vascular engineering. Advances in Wound Care. 7 (7), 232-246 (2018).
  26. Cochrane, A., et al. Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).
  27. Nemani, K. V., Moodie, K. L., Brennick, J. B., Su, A., Gimi, B. In vitro and in vivo evaluation of SU-8 biocompatibility. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 33 (7), 4453-4459 (2013).
  28. Mathew, R., Ravi Sankar, A. A Review on Surface Stress-Based Miniaturized Piezoresistive SU-8 Polymeric Cantilever Sensors. Nano-Micro Letters. 10 (2), 1-41 (2018).
  29. Knowlton, S., Yenilmez, B., Anand, S., Tasoglu, S. Photocrosslinking-based bioprinting: Examining crosslinking schemes. Bioprinting. 5, 10-18 (2017).
  30. Redd, M. A., et al. Patterned human microvascular grafts enable rapid vascularization and increase perfusion in infarcted rat hearts. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
  31. Zhu, Y., et al. SU-8 Photoresist. Encyclopedia of Nanotechnology. , 2530-2543 (2012).
  32. Zheng, F., et al. Organ-on-a-Chip Systems: Microengineering to Biomimic Living Systems. Small. 12 (17), 2253-2282 (2016).
  33. Freiman, A., et al. Adipose-derived endothelial and mesenchymal stem cells enhance vascular network formation on three-dimensional constructs in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 5 (2016).
  34. van Duinen, V., et al. Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform. Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).
  35. Nguyen, D. -H. T., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (17), 6712-6717 (2013).
  36. Nashimoto, Y., et al. Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).
  37. Rosenfeld, D., et al. Morphogenesis of 3D vascular networks is regulated by tensile forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3215-3220 (2016).
  38. Neto, F., et al. and TAZ regulate adherens junction dynamics and endothelial cell distribution during vascular development. bioRxiv. , 174185 (2017).

Tags

Bioengineering Utgave 167 Mikrovaskulatur fartøymigrasjon analyseverktøy høygjennomstrømningsanalyse angiogeneseanalyse vevsteknikk
Trinnvis cellesåing på flislagte stillaser for å studere spirende blodårer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Szklanny, A. A., Neale, D. B.,… More

Szklanny, A. A., Neale, D. B., Lahann, J., Levenberg, S. Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels. J. Vis. Exp. (167), e61995, doi:10.3791/61995 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter