Summary
Kyllingembryoer, som en klassisk utviklingsmodell, brukes i laboratoriet vårt for å vurdere utviklingsmessige kardiotoksisiteter etter eksponering for ulike miljøgifter. Eksponeringsmetoder og morfologiske/funksjonelle vurderingsmetoder som er etablert er beskrevet i dette manuskriptet.
Abstract
Kyllingembryoer er en klassisk modell i utviklingsstudier. Under utviklingen av kyllingembryoer er tidsvinduet for hjerteutvikling veldefinert, og det er relativt enkelt å oppnå presis og rettidig eksponering via flere metoder. Videre er prosessen med hjerteutvikling i kyllingembryoer lik pattedyr, noe som også resulterer i et firekammeret hjerte, noe som gjør det til en verdifull alternativ modell i vurderingen av utviklingsmessige kardiotoksisiteter. I laboratoriet vårt brukes kyllingembryomodellen rutinemessig i vurderingen av utviklingsmessige kardiotoksisiteter etter eksponering for ulike miljøgifter, inkludert per- og polyfluoroalkyle stoffer (PFAS), svevestøv (PMs), dieseleksos (DE) og nanomaterialer. Eksponeringstiden kan velges fritt basert på behovet, fra begynnelsen av utviklingen (embryonal dag 0, ED0) helt til dagen før luke. De viktigste eksponeringsmetodene inkluderer luftcelleinjeksjon, direkte mikroinjeksjon og luftcelleinnånding (opprinnelig utviklet i laboratoriet vårt), og de tilgjengelige endepunktene inkluderer hjertefunksjon (elektrokardiografi), morfologi (histologiske vurderinger) og molekylære biologiske vurderinger (immunohistokjemi, qRT-PCR, vestlig blotting, etc.). Selvfølgelig har kyllingembryomodellen sine egne begrensninger, for eksempel begrenset tilgjengelighet av antistoffer. Likevel, med flere laboratorier som begynner å bruke denne modellen, kan den brukes til å gi betydelige bidrag til studiet av utviklingsmessige kardiotoksisiteter.
Introduction
Kyllingembryoet er en klassisk utviklingsmodell, som har blitt brukt i over to hundre år1. Kyllingembryomodellen har forskjellige fordeler sammenlignet med tradisjonelle modeller. Først av alt, så tidlig som for over 70 år siden, hadde den normale utviklingen av kyllingembryoet blitt illustrert veldig tydelig i Hamburger-Hamilton iscenesettelsesguide2, der totalt 46 stadier under kyllingembryoutvikling ble definert med presis tid og morfologiske egenskaper, noe som letter deteksjon av unormal utvikling. I tillegg har kyllingembryomodellen andre funksjoner som å være relativt lavkostnads og overflødig i mengde, relativt nøyaktige eksponeringsdosekontroller, et uavhengig, lukket system i skallet og enkel manipulering av det utviklende embryoet, som alle garanterer sitt potensial til å bli brukt som en kraftig toksikologiske vurderingsmodell.
Ved kardiotoksisitet har kyllingembryoet et firekammeret hjerte, som ligner pattedyrhjerter, men med tykkere vegger, noe som gir lettere morfologiske vurderinger. I tillegg tillater kyllingembryoet utviklingsinhalasjonseksponering, noe som ikke er mulig i pattedyrmodeller: i løpet av det senere utviklingsstadiet vil kyllingembryoet gå over fra intern åndedrett til ekstern åndedrett (få oksygen via lungen); sistnevnte krever at embryoet trenger inn i luftcellemembranen med nebbet, og begynner å puste luft3, noe som gjør luftcellen til et miniinnåndingskammer. Ved hjelp av dette fenomenet kan de toksikologiske effektene av gassforurensninger på hjertet (og andre organer) vurderes uten behov for dedikerte innåndingskammerinstrumenter.
I dette manuskriptet beskrives flere vurderingsmetoder for eksponering/endepunkt, som alle tjener til å gjøre kyllingebryoet til et kraftig verktøy i vurderingen av utviklings kardiotoksisitet etter eksponering for miljøgifter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som er beskrevet ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Qingdao University. I laboratoriet vårt ble eggene inkubert i to inkubatorer. Egg ble holdt oppreist i inkubatoren og tilfeldig plassert på hyllene. Inkubasjonsforholdene for eggene var som følger: inkubasjonstemperaturen startet ved 37,9 °C, og ble gradvis redusert til 37,1 °C etter hvert som inkubasjonen fortsatte; fuktigheten startet på 50% og økte gradvis til 70%.
1. Eksponeringsmetoder
MERK: Eksponering av miljøgifter for kyllingebryoer kan oppnås på flere måter. I denne delen er tre rutinemessig brukte metoder beskrevet i detalj.
- Luftcelleinjeksjon (figur 1)
MERK: Dette er den klassiske eksponeringsmetoden for kyllingembryoer4,5,6, egnet for et bredt spekter av materialer, og kan utføres på et svært bredt tidsvindu, fra begynnelsen av utviklingen (embryonal dag null, ED0) helt til dagen før luke (ED20). Solsikkeolje brukes som kjøretøy. Tidligere studier har vist at det ikke er observert signifikante endringer i dødelighet, lukkbarhet eller kroppsvekt mellom ubehandlede embryoer og embryoer injisert med solsikkeolje7.- Forbered følgende nødvendige reagenser/verktøy: 75% etanol, silkepapir, metallsonde (kan erstatte med enhver skarp metallnål / pinne / øl), smeltet parafin, børste, povidonjodoppløsning, pipette, pipettespisser, kandlingslampe, doseringsblanding. Forbered doseringsblandingen med solsikkeolje (anbefales)4. For å bruke andre fortynningsstoffer, utfør kjøretøykontroll (versus ubehandlede embryoer).
- Rengjør overflaten av eggene med povidonjodoppløsning (kommersielt tilgjengelig povidonjodoppløsning 1:5 fortynnet med deionisert vann), og dypp eggeskallet med vevspapir uten skrubbing. Skrubbing vil bryte det beskyttende lagbelegget utsiden av skallet.
- Stearinlys eggene i et mørkt rom og merk luftcellen med blyant. Utelukke egg med sprekker på skallet. Utelat egg med luftceller på siden i stedet for stump spiss, da det er svært usannsynlig å luke normalt.
- Desinfiser luftcelleområdet med 75% etanol, og bor deretter et lite hull i midten av luftcelleområdet med metallsonden. Ikke stikk sonden dypt inn i luftcellen, ellers kan den indre membranen bli skadet, i stedet må du bare bryte skallet med probespissen. Hvis hullet ikke er stort nok til å passe i en fin pipettespiss, bryter du skallet igjen i nærheten av eksisterende hull, til hullet er stort nok til å tillate innsetting av 10 μL pipettespiss.
- Virvel doseringsblandingen kraftig, og trekk straks løsningen til pipettespissen. Det anbefalte injeksjonsvolumet er 1 μL per 10 gram egg (f.eks. 5 μL injeksjonsvolum for et egg på 50 gram) da større injeksjonsvolumer kan skape hypoksiske eller anoksiske forhold for det utviklende embryoet. Beregn konsentrasjonen av doseringsoppløsningen for ønsket mg/egg kg dose.
- Sett pipettespissen inn i hullet, med spissen som berører den indre membranen. Ta langsomt ut doseringsblandingen, hold i minst ti sekunder (la den viskøse oljen bli fullstendig dispensert), og fjern deretter spissen.
- Forsegle hullet med en børste og en dråpe smeltet parafin. Pass på at du ikke drypper smeltet paraffin på den indre membranen.
- Når de er forseglet, plasser eggene i inkubatoren til de når ønsket embryonal stadium. På allerede utviklende embryoer, utfør hele prosessen så snart som mulig for å forhindre potensielt embryotap på grunn av lave miljøtemperaturer.
- Mikroinjeksjon (figur 2)
MERK: Dette er en mer direkte eksponeringsmetode, noe som resulterer i definitiv eksponering for stoffet av interesse, og spesielt egnet for forbindelser med kort virkningstid (f.eks. lentivirus), siden den klassiske luftcelleinjeksjonen krever tid for forbindelsene til å trenge inn i den indre membranen. Denne metoden kan også prøves hvis tilfredsstillende resultater ikke kunne oppnås ved luftcelleinjeksjon. Denne metoden er best egnet for tidlige embryoer (opptil ED2), men kan også utføres på eldre embryoer (med høyere risiko for embryotap).- Forbered følgende nødvendige reagenser/verktøy: 75% etanol, povidonjodoppløsning, mikroinjektor (5 μL), metallprobe (kan erstatte med enhver skarp metallnål / pinne / øl skal fungere), fine tang, tape. Forbered doseringsblandingen med steril saltvann, som også fungerer som en injeksjonskontroll uten å påvirke lukkbarheten betydelig. Sørg for saltvanns steriliteten, da en forurenset injeksjon vil øke dødeligheten dramatisk.
- Rengjør eggene som beskrevet i 1.1.2.
- Stearinlys eggene som beskrevet i 1.1.3.
- Desinfiser luftcelleområdet med 75% etanol, og bor deretter et lite hull i midten av luftcelleområdet med metallsonden. Ikke stikk sonden dypt inn i luftcellen, ellers kan den indre membranen bli skadet, i stedet må du bare bryte skallet med probespissen. Bruk deretter de fine tangene til å forstørre hullet forsiktig til diameteren er ca. 2 mm, slik at visuell bekreftelse av den indre membranen.
- Legg oppløsningen i mikroinjektor (maksimalt injeksjonsvolum: 0,5 μL/10 g egg. (f.eks. 2,5 μL for et egg på 50 g) og sett nålen forsiktig gjennom hullet i den indre membranen i ca. 2-3 mm. Dispenser oppløsningen forsiktig og fjern nålen. Hold nålen så vinkelrett på membranen som mulig.
- Forsegle hullet med et lite stykke tape. Dekk hullet helt for å forhindre embryodehydrering og død under etterfølgende inkubasjon. Likevel, unngå biter av tape som er for store til å forhindre hypoksi.
- Når de er forseglet, plasser eggene i inkubatoren til de når ønsket embryonal stadium. På allerede utviklende embryoer, utfør hele prosessen så snart som mulig for å forhindre potensielt embryotap på grunn av lav miljøtemperatur.
- Innånding av luftceller (figur 3)
MERK: Dette er en ny innåndingsmetode som utnytter luftcellen, hvorfra det sene kyllingembryoet begynner å puste luft. Den er egnet for gass- eller aerosoleksponeringer og kan oppnå svært tidlig inhalasjonseksponering, og fylle lungene med målgassen / aerosolen når de åpner for første gang i livet.- Forbered følgende nødvendige reagenser/verktøy: Prøvetakingspose (PVF-pose, for lagring av gass/aerosolprøve før eksponering), katetersål, sprøyte, metallprobe (kan erstatte med enhver skarp metallnål/-pinne/øl skal fungere), tape, avtrekkshette.
- Rengjør eggene som beskrevet i 1.1.2 og stearinlys dem som beskrevet i 1.1.3 (det er ikke nødvendig å markere luftcelle før inkubasjon), og inkuber deretter egg uten behandling til ED17.
- Stearinlys eggene på ED17 for å markere luftcelleområdet.
- Ved ED18, ta et egg ut av inkubatoren, desinfiser luftcelleområdet med 75% etanol, og bor deretter forsiktig to små hull på to sider av luftcellen. Den ene er til injeksjon av gass / aerosol, den andre er for utvisning av luft. Kontroller forsiktig størrelsen på hullene slik at størrelsen på injeksjonshullet er akkurat nok til at kateternålen kan settes inn, mens diameteren på utvisningshullet er litt større (ca. 1 mm).
- Injiser forsiktig 10 ml målgass/aerosol fra injeksjonshullet med en sprøyte festet til katetersålen. Injiser luft for en innåndingskontrollgruppe, som ikke skal ha signifikante forskjeller i en negativ kontrollgruppe8. Påfør trykk mot katetersålen (med riktig mengde trykk kan den elastiske nålen skyves mot skallet) for å minimere lekkasjen fra injeksjonshullet. Forsegle begge hullene umiddelbart med tape etterpå, og returner egget til inkubator.
MERK: Denne prosedyren bør utføres i en avtrekkshette for å forhindre innånding av gass/aerosol av operatøren. - Gjenta den beskrevne prosedyren etter en time for ytterligere å sikre at hele luftcellen er fylt opp med målgass / aerosol (valgfritt).
- Gjenta den beskrevne prosedyren ved ED19 på nytt (valgfritt). Gjentakelse av eksponeringen bidrar til å sikre konsistent eksponering til luke. Registrer luketiden for en omtrentlig estimering av eksponeringsvarigheten.
- Når ønskede eksponeringer er utført og forseglet, plasser eggene i inkubatoren for klekking. Minimer tiden egget tilbringer utenfor inkubatoren for å forhindre død fra lav miljøtemperatur.
2. Metoder for sluttpunktvurdering
MERK: Etter eksponering av forurensning av interesse for det utviklende embryoet, kan flere toksisitetsparametere evalueres, inkludert kardiotoksisitet. I denne delen er to ofte brukte spesifikke metoder beskrevet i detalj.
- Elektrokardiografi (figur 4)
MERK: Det er umulig å gjøre ikke-invasiv elektrokardiografi i hatchling kyllinger på grunn av tilstedeværelsen av fjær. Dermed er subkutan implantasjon av elektroder viktig, noe som krever anestesi. Dosen som brukes i laboratoriet er 33 mg/kg pentobarbital via intraperitoneal injeksjon (noen kyllinger kan kreve opptil 50% doseøkning). Denne metoden vil resultere i stabil elektrokardiografi hos over 90% av dyrene, noe som muliggjør analyse av hjertefrekvens.- Klargjør følgende nødvendige reagenser/verktøy: 1 % (10 mg/ml) pentobarbital oppløsning i saltvann, sprøyte, elektrisk balanse, varmeapparat (om nødvendig), et elektrokardiografiinstrument festet (f.eks. BL-420E+) med tokanals metallnålelektroder.
- Vei kyllingene med en balanse og beregn det nødvendige volumet av pentobarbital løsning og injiser kyllingene. For en kylling som veier 30 g, er det nødvendig med 0,1 ml pentobarbital løsning. Pass på at injeksjonen er gjort på siden av magen, da eggeplommen ligger i midten og injeksjonen kan det ikke være effektivt.
- Vent til de injiserte kyllingene er bedøvet (hold kyllingen i hånden, hvis nakken ikke har spenning og hodet kan svinges fritt, er bedøvelsen tilstrekkelig). Plasser kyllinger på operasjonsbordet (varmeovner er nødvendige hvis romtemperaturen er under 20 °C).
- Sett inn to nåleelektroder fra to sider av magen, subkutant. Pass på at nålene ikke kommer inn i bukhulen ved å løfte huden litt og sette inn nål derfra. Når den er satt inn, skyver du nålen forsiktig fremover til den når siden av brysthulen. Pass på at nålen ikke går dypt inn i kroppen eller stikker ut av huden.
- Gjør målingene med elektrokardiografiinstrumentet. Andre lignende instrumenter som er i stand til elektrokardiografi kan brukes.
- Hvis kyllingene skal ofres, utfør eutanasi etter elektrokardiografien siden de allerede er under anestesi. Hvis kyllinger skal overleve, plasser dem tilbake i burene og varm til de våkner. Å returnere dem til inkubatoren er et annet alternativ.
- Histomorfometri (figur 5)
MERK: En spesifikk metode er utviklet for å vurdere riktig ventrikkelveggtykkelse i tverrgående deler av hjertet. Morfologisk vurdering av høyre ventrikeldimensjon via ekkokardiografi er ikke 100% nøyaktig på grunn av den uregelmessige formen på høyre ventrikel, og denne metoden kan tjene som et godt supplement i de morfologiske vurderingene for riktig ventrikel.- Forbered følgende nødvendige reagenser/verktøy: 4% fosfatbufret formaldehyd, skarpt blad, fosfatbufret saltvann, papirhåndkle, elektrisk balanse, liten saks, generelle histologiske prosesseringsmidler (gradert etanol, xylen, paraffin).
- Når dyr er ofret, bruk vann for å våte fjærene. Dette er for å minimere potensiell forurensning på grunn av flygende fjær mens du åpner brystet.
- Åpne brysthulen forsiktig uten å skade hjertet. Bruk liten saks til å kutte vaskulaturen og fjern forsiktig hjertet fra brysthulen. La et lite stykke (ca. 1-2 mm) vaskulatur festet til hjertet, da dette kan være praktisk for etterfølgende håndtering av hjertet uten å skade hjertet.
- Når du er fjernet, skyll hjertet i kaldt fosfatbufret saltvann for å fjerne blod og slappe av i muskelen. Dypp deretter hjertet på papirhåndkleet før du veier for nøyaktig vektavlesning. Sett hjertet i 10x volumfiksativ (4% fosfatbufret formaldehyd) i 24 timer ved romtemperatur. Faste vev kan deretter behandles til parafinblokker, eller lagres ved 4 °C i årevis (anbefales ikke hvis immunhiistokjemi er planlagt).
- Før du legger inn, kutt vevet med omtrent 60% lengde av hjertetellingen fra toppen (figur 5A), for enklere etterfølgende behandling. Et mikrotomblad anbefales for et raskt og vertikalt rent kutt. For kyllinger eldre enn en dag, gjør et nytt kutt på ca 25-30% lengde fra toppen for enklere parafin penetrasjon og for å tillate vevet å passe i vev kassetter.
- Behandle vevet med følgende forhold (juster etter behov): 70% etanol i 1 time, 80% etanol i 1 t, 95% etanol i 1 t x2, 100% etanol i 30 min x2, xylen i 5 min x2, parafin (smeltepunkt 52-54 °C) i 1,5 timer, parafin (smeltepunkt 62-64 °C) i 1 t, og legg deretter inn vevet i en 3:1 blanding av parafin (smeltepunkt 62-64 °C) og parafin (smeltepunkt 52-54 °C).
- Seksjon vevet på 6 μm tykkelse. Oppretthold nøye identiske relative posisjoner i tverrsnittene ved å bekrefte tilstedeværelsen og størrelsen på et anatomisk landemerke (septomarginal trabecula) i høyre ventrikel. Bekreft et landemerke med moderat lengde på hver del (Figur 5B, pil).
- Lag to elektroniske linjaler med Logo programmerer: Ruler 1 er en rett linje med 7 radiusmållinjer festet til midtpunktet, med 22,5° mellom to tilstøtende mållinjer. Linjal 2 er bare to vinkelrette linjer i en T -figur (Figur 5B).
- Mål med to programmer: Adobe Photoshop og ImageJ.
- I Photoshop endrer du størrelsen på linjalen 1 (INGEN omforming) for å plassere de to endene av linjalen i de to endene av fri høyre ventrikkelvegg, slik at de sju mållinjene på linjal 1 hver oppfyller den indre høyre ventrikkelveggen. Bruk deretter linjal 2 til å foreta vinkelrette målinger fra den indre til eksterne ventrikkelveggen (Figur 5B).
- Bruk ImageJ til å gjøre de syv målingene for hvert hjerte.
- Avhengig av spesifikke behov, analyser de syv målingene eller gjennomsnittet for en representativ høyre ventrikkelveggtykkelse. Normaliser til hel hjertevekt for spesifikke ventrikulære veggtykkelsesendringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultater av eksponering
Injeksjon av luftceller
Luftcelleinjeksjon kan effektivt utsette utvikling av kyllingembryoer til ulike midler, som senere kan oppdages i de innsamlede prøvene (serum, vev, etc.) av embryoer / hatchling kyllinger. Her er et eksempel, der perfluorooctanoic acid (PFOA) ble luftcelle injisert, og serum PFOA konsentrasjoner ble deretter bestemt med Ultra-ytelse flytende kromatografi-masse spektrometri. Serumkonsentrasjonene korresponderte med de injiserte dosene, noe som indikerer effektiviteten av denne prosedyren (figur 6).
Mikroinjeksjon
Mikroinjeksjon kan utsette de utviklende embryoene for midler som kanskje ikke effektivt trenger inn i den indre membranen, eller med kort virkningstid, for eksempel lentivirus. Her er et eksempel, der lentivirus ble injisert på embryonal dag to med denne metoden, og deretter ble det observert betydelig grønn fluorescens i hjertet av embryonal dag 15 embryoer, noe som indikerer effektiviteten av lentivirustransfeksjon (Figur 7).
Infusjon av luftceller
Luftcelleinfusjon er en ny metode, som kan fungere veldig bra for liten mengde gass / aerosolinnåndingseksponering under initieringsfasen av ekstern åndedrett. Her er et eksempel, der dieseleksos ble infundert i luftcellen på embryonal dag 18 og 19, noe som resulterte i betydelige fibrotiske endringer i hjertet så vel som lungevev (Figur 8).
Resultater av sluttpunktvurdering
Resultater av elektrokardiografi
På grunn av begrensningen av to elektroder, kan bare 3 kanaler med elektrokardiografi vises. Men de er tilstrekkelige til å skille r-bølger, og dermed kan de brukes til funksjonelle vurderinger. I et reelt eksempel indikerte elektrokardiografi av kyllinger utsatt for dieseleksos betydelig forkortet R-R-intervall, noe som indikerer funksjonelle endringer (figur 9).
Histopatologi resultater
Vår metode for riktig ventrikulær veggtykkelsesvurdering ble vellykket brukt i flere studier5,7,8,9,10,11,12. I en av våre tidligere studier resulterte dieseleksoseksponering i fortykket høyre ventrikkelvegg (figur 10).
Figur 1: Demonstrasjon av luftcelleinjeksjon. Et uutviklet fruktbart egg er vist på bildet, men embryoer i alle forskjellige stadier kan bli utsatt med denne metoden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Demonstrasjon av mikroinjeksjon. Et tidlig embryo er vist på bildet, som er det foretrukne eksponeringstidspunktet for denne metoden, men andre tidspunkter kan også prøves. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Demonstrasjon av luftcelleinfusjon. Et senfaset embryo som gjennomgår intern pipping er vist på bildet, som er det foretrukne eksponeringstidspunktet for denne metoden. Fire stadier av operasjonen ble vist. 1: Intakt embryo. 2: To hull er laget. 3: Infusjon utføres. PVF-prøvetakingsposen vises også nederst til venstre. 4: Infusjonen er ferdig, hull forseglet med tape. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Demonstrasjon av elektrokardiografi. Øverste venstre panel viste hvordan en hatchling kylling ble bedøvet og gjennomgår elektrokardiografimåling. Øverst til høyre viser elektrokardiografiinstrumentet med elektrodene festet. Bunnpanelet viser en representativ elektrokardiografi anskaffet fra kyllingene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Demonstrasjon av histopatisk vurdering av høyre ventrikulær veggtykkelse (Hematoksylin og eosinfarging). (A) Demonstrasjon av skjæreposisjonen til kyllinghjerter før innbygging. (B) Demonstrasjon av måling av høyre ventrikkelveggtykkelse. Skalastenger representerer 1000 μm. Blå sirkler demonstrerer de syv målepunktene på den indre høyre ventrikkelveggen. Rød sirkel demonstrerer et målepunkt på den ytre høyre ventrikkelveggen. Arrow demonstrerer det anatomiske landemerket for riktig tverrsnittsposisjon. Denne figuren er endret fra Jiang et al. Toksikologi. 293 (1-3), 97-106 (2012)7. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Serumkonsentrasjon av perfluorooctanoinsyre fra hatchling kyllinger etter luftcelleinjeksjon med 0, 0,5, 1 eller 2 mg/egg kg perfluorooctanoic acid før inkubasjon. De resulterende serumkonsentrasjonene korresponderte med de injiserte dosene, noe som indikerer effektiviteten av luftcelleinjeksjon. Denne figuren er endret fra Jiang et al. Toksikologi. 293 (1-3), 97-106 (2012)7. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Demonstrasjon av transfeksjonseffekt av lentivirus etter mikroinjeksjonseksponering (Direkte observasjon etter kryo-seksjonering). Venstre paneler viste lysfeltbilder, mens høyre paneler viste grønn fluorescens for de samme vevsdelene. Embryonal dag to kyllingembryoer ble injisert med lentivirus eller kontroll, og deretter inkubert til embryonal dag 15. Hjertene ble frosset-seksjonert og direkte visualisert under fluorescerende mikroskop. (A) Kontrollgruppe, liten grønn fluorescens var til stede. (B) Lentivirus eksponert gruppe, signifikant grønn fluorescens ble observert, noe som indikerer effektiviteten av lentivirustransfeksjon etter mikroinjeksjon. Skalastenger representerer 125 μm. Denne figuren er endret fra Zhao et al. Miljøtoksikologi og farmakologi. 56, 136-144 (2017)11. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Demonstrasjon av effektiviteten av luftcelleinfusjon. Kyllingembryoer ble infundert med dieseleksos på embryonal dag 18 og 19, og deretter ble de klekkede kyllingene holdt i 0, 1 eller 2 uker og deretter ofret. Hjertevevet ble vurdert med Masson Trichrome farging for fibrotiske lesjoner. Piler viste fibrotiske lesjoner (blå farging). *: statistisk forskjellig fra kontroll (P<0,05 fra variansanalyse og minst signifikante differansetester). Skalastenger representerer 150 μm. Denne figuren er endret fra Jiang et al. Environmental Pollution. 264, 114718 (2020)8. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Demonstrasjon av effektiviteten av elektrokardiografi. Kyllingembryoer ble infundert med dieseleksos på embryonal dag 18 og 19, og deretter ble de klekkede kyllingene holdt i 0, 1 eller 2 uker og deretter ble elektrokardiografi utført. Betydelig forkortede R-R-intervaller ble observert hos kyllingene utsatt for dieseleksos via luftcelleinfusjon, noe som indikerer effektiviteten av metoden. *: statistisk forskjellig fra kontroll (P<0,05 fra variansanalyse og minst signifikante differansetester). Denne figuren er endret fra Jiang et al. Environmental Pollution. 264, 114718 (20208. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10: Demonstrasjon av effektiviteten av høyre ventrikulær veggtykkelsesmåling (Hematoksylin og eosinfarging). Kyllingembryoer ble infundert med dieseleksos på embryonal dag 18 og 19, og deretter ble de klekkede kyllingene holdt i 1 uke, og deretter ble histologisk vurdering av riktig ventrikulær veggtykkelse utført. Svar: Representative bilder av hjertekrysset. Legg merke til tilstedeværelsen av anatomisk markør i alle de riktige ventriklene (Hos eldre kyllinger har markøren en tendens til å være litt lengre i ønsket posisjon, noe som ikke påvirker nøyaktigheten av målinger). B: Kvantifisering av høyre ventrikkelveggtykkelse, som først ble konvertert til faktisk lengde med standard lysbilder, og deretter normalisert med hel hjertevekt, ble dermed representert i form av um / ug. Blå piler: to ender av den frie høyre ventrikkelveggen. Røde piler: midtpunktene på høyre ventrikkelvegg. Svarte piler: anatomisk markør. *: statistisk forskjellig fra kontroll (P<0,05 fra variansanalyse og minst signifikante differansetester). Skalastenger representerer 1000 μm. Denne figuren er endret fra Jiang et al. Environmental Pollution. 264, 114718 (2020)8. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kyllingembryoet har vært en klassisk modell i utviklingsstudier i 200 år1. Våre metoder presentert i dette manuskriptet har blitt brukt i vurderingen av flere miljøgifter, inkludert perfluorooctanoic acid, svevestøv og dieseleksos med suksess5,7,8,9,10,11,12. Med disse metodene ble utviklingsmessig kardiotoksisitet indikert kostnadseffektivt og tydelig. Videre er det ikke vanskelig å eksponere kyllingembryoer med andre forbindelser av interesse og vurdere potensiell utviklings kardiovaskulær toksisitet.
Luftcelleinjeksjonsmetoden er en klassisk metode som tidligere ble brukt i mange studier13,14,15, som er praktisk og effektiv. Sammenlignet med andre utviklingsmetoder, for eksempel gnagermodeller16,17,18, har den direkte eksponering i et lukket system, noe som i stor grad reduserer variabilities på grunn av mors effekter og variert utskillelse. Mikroinjeksjon er en forbedring av luftcelleinjeksjonsmetoden, som sikrer definitiv eksponering på eller i nærheten av å utvikle tidlig embryo, noe som kan oppnå lignende effekter som i utero-injeksjoner i gnagermodeller19,20. Sammenlignet med i utero-injeksjoner, tillater vår metode visuell bekreftelse av injeksjonen med relativt enkle manipulasjonstrinn, og nøyaktig injeksjon oppnås lett ved å kontrollere for eggvekten, noe som ikke er mulig i in utero-injeksjonen, hvor den faktiske mengden og vekten av embryoer ikke lett oppnås. Infusjonsmetoden er hovedsakelig for vurdering av inhalerte midler på lungesystemet, men kardiotoksisitet og lungetoksisitet forekommer ofte samtidig. Denne metoden drar nytte av luftcellen, der en liten mengde gass eller aerosol infunderes, slik at kontinuerlig innånding av gass / aerosol uten behov for spesifikke innåndingskamre. Motpart gnagermodeller må bruke relativt store mengder gass / aerosol og store, dyre innåndingsinstrumenter21,22.
De to rutinemessig testede endepunktene i laboratoriet vårt, elektrokardiografi og histomorfometrisk vurdering av høyre ventrikulær veggtykkelse representerer funksjonelle og morfologiske endringer etter henholdsvis toksisk eksponering. Vurderingen av høyre ventrikulær veggtykkelse har spesifikke fordeler ved å få en omfattende forståelse av høyre ventrikkelvegg, da den tradisjonelle ekkokardiografibaserte vurderingen på høyre ventrikel vanligvis er utfordrende og ikke veldig nøyaktig, på grunn av den asymmetriske og komplekse halvmåneformen til høyre ventrikel23. Vår metode kan bidra til å overvinne denne unøyaktigheten ved å supplere med tilleggsinformasjon om riktig ventrikkelveggtykkelse i en representativ stilling. For tiden er det alt manuelt, i fremtiden kan målingene gjøres automatisk, og antall målepunkter kan økes betydelig, noe som ytterligere forbedrer nøyaktigheten til denne metoden.
Kylling embryobaserte utviklingsmodeller har flere fordeler i toksikologiske studier, for eksempel evnen til å levere en relativt nøyaktig eksponeringsdose, et uavhengig eksponeringssystem i skallet og enkel manipulering av det utviklende embryoet. Med hensyn til kardiotoksisitet har kyllinger relativt store hjerter og tykke ventrikkelvegger, noe som gir enkle histomorfometriske vurderinger. Det er noen mangler, for eksempel tilgjengeligheten av antistoffer / primere og ekstra krav til burplass sammenlignet med gnagere hvis oppdrett av kyllinger etter luke. Likevel er kyllingembryoet fortsatt en god alternativ toksikologiske modell som skal brukes til potensielle utviklingsmessige kardiotoksisitetsvurderinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (Grant No. 91643203, 91543208, 81502835).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% phosphate buffered formaldehydefixative | Biosharp, Hefei, China | REF: BL539A | |
| 75% ethanol | Guoyao,Shanghai,China | CAS:64-17-5 | |
| Biosignaling monitor BL-420E+ | Taimeng, Chengdu, China | BL-420E+ | |
| Candling lamp | Zhenwei, Dezhou, China | WZ-001 | |
| Disposable syringe | Zhiyu, Jiangsu, China | ||
| Egg incubator | Keyu,Dezhou, China | KFX | |
| Electrical balance | OHAUS, Shanghai, China | AR 224CN | |
| Electro-thermal incubator | Shenxian, Shanghai, China | DHP-9022 | |
| Ethanol absolute | Guoyao,Shanghai,China | CAS:64-17-5 | |
| Fertile chicken egg | Jianuo, Jining, China | ||
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Beyotime, Bejing, China | C0105 | |
| Histology paraffin | Aladdin, Shanghai, China | P100928-500g | Melt point 52~54°C |
| Histology paraffin | Aladdin, Shanghai, China | P100936-500g | Melt point 62~64°C |
| IV catheter | KDL, Zhejiang, China | The catheters have to be soft, plastic ones. | |
| Lentivirus | Genechem, Shanghai, China | The lentivirus were individually designed/synthesized by Genechem. | |
| Masson's trichrome staining kit | Solarbio, Beijing, China | G1340 | |
| Metal probe | Jinuotai, Beijing, China | ||
| Microinjector (5 uL) | Anting,Shanghai, China | ||
| Microscope | CAIKON, Shanghai, China | XSP-500 | |
| Microtome | Leica, Germany | HistoCore BIOCUT | |
| Microtome blade | Leica,Germany | Leica 819 | |
| Pentobarbitual sodium | Yitai Technology Co. Ltd., Wuhan, China | CAS: 57-33-0 | |
| Pipetter(10ul) | Sartorius, Germany | ||
| Povidone iodide | Longyuquan, Taian, China | ||
| Scissor | Anqisheng,Suzhou, China | ||
| Sterile saline | Kelun,Chengdu, China | ||
| Sunflower oil | Mighty Jiage, Jiangsu, China | Any commerical sunflower oil for human consumption should work | |
| Tape | M&G, Shanghai, China | ||
| Tedlar PVF Bag (5L) | Delin, Dalian, China | ||
| Vortex mixer | SCILOGEX, Rocky Hill, CT, US | MX-F | |
| Xylene | Guoyao,Shanghai,China | CAS:1330-20-7 |
References
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).
- Menna, T. M., Mortola, J. P. Effects of posture on the respiratory mechanics of the chick embryo. Journal of Experimental Zoology. 293 (5), 450-455 (2002).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Yamamoto, F. Y., Neto, F. F., Freitas, P. F., Oliveira Ribeiro, C. A., Ortolani-Machado, C. F. Cadmium effects on early development of chick embryos. Environmental Toxicology and Pharmacology. 34 (2), 548-555 (2012).
- Lv, N., et al. The roles of bone morphogenetic protein 2 in perfluorooctanoic acid induced developmental cardiotoxicity and l-carnitine mediated protection. Toxicology and Applied Pharmacology. 352, 68-76 (2018).
- Kmecick, M., Vieira da Costa, M. C., Oliveria Ribeiro, C. A., Ortolani-Machado, C. F. Morphological evidence of neurotoxic effects in chicken embryos after exposure to perfluorooctanoic acid (PFOA) and inorganic cadmium. Toxicology. 4227, 152286 (2019).
- Jiang, Q., Lust, R. M., Strynar, M. J., Dagnino, S., DeWitt, J. C. Perflurooctanoic acid induces developmental cardiotoxicity in chicken embryos and hatchlings. Toxicology. 293 (1-3), 97-106 (2012).
- Jiang, Q., et al. In ovo very early-in-life exposure to diesel exhaust induced cardiopulmonary toxicity in a hatchling chick model. Environmental Pollution. 264, 114718 (2020).
- Jiang, Q., Lust, R. M., DeWitt, J. C. Perfluorooctanoic acid induced-developmental cardiotoxicity: are peroxisome proliferator activated receptor alpha (PPARalpha) and bone morphorgenic protein 2 (BMP2) pathways involved. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 76 (11), 635-650 (2013).
- Jiang, Q., et al. Changes in the levels of l-carnitine, acetyl-l-carnitine and propionyl-l-carnitine are involved in perfluorooctanoic acid induced developmental cardiotoxicity in chicken embryo. Environmental Toxicology and Pharmacology. 48, 116-124 (2016).
- Zhao, M., et al. The role of PPAR alpha in perfluorooctanoic acid induced developmental cardiotoxicity and l-carnitine mediated protection-Results of in ovo gene silencing. Environmental Toxicology and Pharmacology. 56, 136-144 (2017).
- Jiang, Q., et al. Particulate Matter 2.5 Induced Developmental Cardiotoxicity in Chicken Embryo and Hatchling. Front Pharmacol. 11, 841 (2020).
- Molina, E. D., et al. Effects of air cell injection of perfluorooctane sulfonate before incubation on development of the white leghorn chicken (Gallus domesticus) embryo. Environmental Toxicology and Chemistry. 25 (1), 227-232 (2006).
- Crump, D., Chiu, S., Williams, K. L. Bis-(3-allyl-4-hydroxyphenyl) sulfone decreases embryonic viability and alters hepatic mRNA expression at two distinct developmental stages in chicken embryos exposed via egg injection. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (2), 530-537 (2018).
- Franci, C. D., et al. Potency of polycyclic aromatic hydrocarbons in chicken and Japanese quail embryos. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (6), 1556-1564 (2018).
- Rand, M. D., et al. Developmental exposure to methylmercury and resultant muscle mercury accumulation and adult motor deficits in mice. Neurotoxicology. 81, 1-10 (2020).
- Tanaka, T., Suzuki, T., Inomata, A., Moriyasu, T. Combined effects of maternal exposure to fungicides on behavioral development in F1 -generation mice: 2. Fixed-dose study of thiabendazole. Birth Defects Research. , (2020).
- Kofman, O., Lan, A., Raykin, E., Zega, K., Brodski, C. Developmental and social deficits and enhanced sensitivity to prenatal chlorpyrifos in PON1-/- mouse pups and adults. PLoS One. 15 (9), 0239738 (2020).
- Kischel, A., Audouard, C., Fawal, M. A., Davy, A. Ephrin-B2 paces neuronal production in the developing neocortex. BMC Developmental Biology. 20 (1), 12 (2020).
- Okolo, F., Zhang, G., Rhodes, J., Gittes, G. K., Potoka, D. A. Intra-Amniotic Sildenafil Treatment Promotes Lung Growth and Attenuates Vascular Remodeling in an Experimental Model of Congenital Diaphragmatic Hernia. Fetal Diagnosis and Therapy. , 1-13 (2020).
- Vyslouzil, J., et al. Subchronic continuous inhalation exposure to zinc oxide nanoparticles induces pulmonary cell response in mice. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 61, 126511 (2020).
- Wahle, T., et al. Evaluation of neurological effects of cerium dioxide nanoparticles doped with different amounts of zirconium following inhalation exposure in mouse models of Alzheimer's and vascular disease. Neurochemistry International. 138, 104755 (2020).
- Tanabe, K. Three-Dimensional Echocardiography- Role in Clinical Practice and Future Directions. Circ J. 84 (7), 1047-1054 (2020).
