Summary
Kycklingembryon, som en klassisk utvecklingsmodell, används i vårt labb för att bedöma utvecklingsmässiga kardiotoxiciteter efter exponering för olika miljöföroreningar. Exponeringsmetoder och etablerade morfologiska/funktionella bedömningsmetoder beskrivs i detta manuskript.
Abstract
Kycklingembryon är en klassisk modell i utvecklingsstudier. Under utvecklingen av kycklingembryon är tidsfönstret för hjärtutveckling väldefinierat, och det är relativt lätt att uppnå exakt och i rätt tid exponering via flera metoder. Dessutom liknar processen för hjärtutveckling i kycklingembryon däggdjur, vilket också resulterar i ett hjärta med fyra kammare, vilket gör det till en värdefull alternativ modell vid bedömning av utvecklingsmässiga kardiotoxiciteter. I vårt labb används kycklingembryonmodellen rutinmässigt vid bedömning av utvecklingskardiotoxiciteter efter exponering för olika miljöföroreningar, inklusive per- och polyfluoralkylämnen (PFAS), partiklar (PMs), dieselavgaser (DE) och nanomaterial. Exponeringstiden kan fritt väljas baserat på behovet, från början av utvecklingen (embryonal dag 0, ED0) hela vägen till dagen före kläckningen. De viktigaste exponeringsmetoderna inkluderar luftcellsinjektion, direkt mikroinjektion och luftcellsinandning (ursprungligen utvecklad i vårt labb), och de för närvarande tillgängliga effektmåtten inkluderar hjärtfunktion (elektrokardiografi), morfologi (histologiska bedömningar) och molekylärbiologiska bedömningar (immunohistokemi, qRT-PCR, western blotting, etc.). Naturligtvis har kycklingembryonmodellen sina egna begränsningar, såsom begränsad tillgång på antikroppar. Ändå, med fler laboratorier som börjar använda denna modell, kan den användas för att göra betydande bidrag till studien av utvecklingsmässiga kardiotoxiciteter.
Introduction
Kycklingembryon är en klassisk utvecklingsmodell, som har använts i över tvåhundra år1. Kycklingembryonmodellen har olika fördelar jämfört med traditionella modeller. Först och främst, så tidigt som för över 70 år sedan, hade den normala utvecklingen av kycklingembryon illustrerats mycket tydligt i Hamburger-Hamilton-iscensättningsguiden2, där totalt 46 steg under kycklingembryonutveckling definierades med exakt tid och morfologiska egenskaper, vilket underlättade upptäckter av onormal utveckling. Dessutom har kycklingembryonmodellen andra egenskaper som att vara relativt billig och överflödig i kvantitet, relativt exakta exponeringsdoskontroller, ett oberoende, slutet system i skalet och enkel manipulering av det utvecklande embryot, som alla garanterar dess potential att användas som en kraftfull toxikologisk bedömningsmodell.
I kardiotoxicitet har kycklingembryon ett fyrakammarhjärta, som liknar däggdjurshjärtan men med tjockare väggar, vilket möjliggör enklare morfologiska bedömningar. Dessutom möjliggör kycklingembryon utvecklingsinandningsexponering, vilket inte är möjligt i däggdjursmodeller: under det senare utvecklingsstadiet kommer kycklingembryon att övergå från intern andning till extern andning (att få syre via lungan); det senare kräver att embryot tränger in i luftcellsmembranet med näbben och börjar andasluft 3, vilket gör luftcellen till en miniinhalationskammare. Med hjälp av detta fenomen kan gasspluerande ämnens toxikologiska effekter på hjärtat (och andra organ) bedömas utan behov av särskilda inhalationskammareinstrument.
I detta manuskript beskrivs flera metoder för bedömning av exponering/slutpunkter, som alla tjänar till att göra kycklingembryon till ett kraftfullt verktyg vid bedömning av utvecklingskardiotoxicitet efter exponering för miljöföroreningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla beskrivna förfaranden godkändes av IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) vid Qingdao University. I vårt labb inkuberades äggen i två inkubatorer. Ägg hölls upprätt i inkubatorn och placerades slumpmässigt på hyllorna. Inkubationsförhållandena för äggen var följande: inkubationstemperaturen började vid 37,9 °C och minskade gradvis till 37,1 °C när inkubationen fortsatte; luftfuktigheten började på 50% och ökade gradvis till 70%.
1. Exponeringsmetoder
OBS: Exponering av miljöföroreningar för kycklingembryon kan uppnås på flera sätt. I det här avsnittet beskrivs tre rutinmässigt använda metoder i detalj.
- Luftcellsinjektion( Figur 1)
OBS: Detta är den klassiska exponeringsmetoden för kycklingembryon4,5,6, lämplig för ett brett spektrum av material, och kan utföras vid ett mycket brett tidsfönster, från början av utvecklingen (embryonal dag noll, ED0) hela vägen till dagen före kläckning (ED20). Solrosolja används som fordon. Tidigare studier har visat att inga signifikanta förändringar i dödlighet, kläckbarhet eller kroppsvikt har observerats mellan obehandlade embryon och embryon som injicerats med solrosolja7.- Förbered följande nödvändiga reagenser/verktyg: 75% etanol, mjukpapper, metallsond (kan ersätta med vass metallnål/pinne/awl), smält paraffin, borste, povidone iodidlösning, pipett, pipettspetsar, kantlampa, dosblandning. Förbered doseringsblandningen med solrosolja (rekommenderas)4. För att använda andra spädningmedel, utför fordonskontroll (jämfört med obehandlade embryon).
- Rengör äggets yta med povidone iodide-lösning (kommersiellt tillgänglig povidone iodidelösning 1:5 utspädd med avjoniserat vatten) och dopptorka äggskalet med vävnadspapper utan skrubbning. Skrubbning bryter skyddsskiktet som täcker utsidan av skalet.
- Stearin äggen i ett mörkt rum och markera luftcellen med blyertspenna. Exkludera ägg med sprickor på skalet. Exkludera ägg med luftceller på sidan istället för trubbig spets, eftersom det är mycket osannolikt att de kläcks normalt.
- Sanera luftcellsområdet med 75% etanol och borra sedan ett litet hål i mitten av luftcellsområdet med metallsonden. Stick inte sonden djupt in i luftcellen eller så kan det inre membranet skadas, utan bryt bara skalet med sondens spets. Om hålet inte är tillräckligt stort för att passa i en fin pipettspets, bryt skalet igen i närheten av befintligt hål tills hålet är tillräckligt stort för att möjliggöra införing av 10 μL pipettspets.
- Virvel dosblandningen kraftigt och dra omedelbart lösningen till pipettspetsen. Den rekommenderade injektionsvolymen är 1 μL per 10 gram ägg (t.ex. 5 μL injektionsvolym för ett 50-grams ägg) eftersom större injektionsvolymer kan skapa hypoxiska eller anoxiska förhållanden för det utvecklande embryot. Beräkna koncentrationen av doseringslösningen för önskad mg/ägg kg dos.
- Sätt in pipettspetsen i hålet, med spetsen vidrör det inre membranet. Mata långsamt ut doseringsblandningen, håll i minst tio sekunder (låt den trögflytande oljan vara helt dispenserad) och ta sedan bort spetsen.
- Försegla hålet med en borste och en droppe smält paraffin. Var försiktig så att du inte droppar smält paraffin på det inre membranet.
- När äggen är förseglade placerar du äggen i inkubatorn tills de når önskat embryonalt stadium. När embryon redan utvecklas, utför hela processen så snart som möjligt för att förhindra potentiell embryoförlust på grund av låga miljötemperaturer.
- Mikroinjektion (figur 2)
OBS: Detta är en mer direkt exponeringsmetod, vilket resulterar i definitiv exponering för det ämne som är av intresse, och särskilt lämplig för föreningar med kort verkningstid (t.ex. lentivirus), eftersom den klassiska luftcellsinjektionen kräver tid för föreningarna att tränga in i det inre membranet. Denna metod kan också provas om tillfredsställande resultat inte kunde uppnås genom luftcellsinjektion. Denna metod är bäst lämpad för tidiga embryon (upp till ED2), men kan också utföras på äldre embryon (med högre risk för embryoförlust).- Förbered följande nödvändiga reagenser/verktyg: 75% etanol, povidone iodidlösning, mikroinjektor (5 μL), metallsond (kan ersätta med alla vassa metallnålar/stick/awl bör fungera), fina tångar, tejp. Förbered doseringsblandningen med steril saltlösning, som också fungerar som en injektionskontroll utan att påverka kläckbarheten avsevärt. Se till att saltlösningen är steril, eftersom en kontaminerad injektion dramatiskt ökar dödligheten.
- Rengör äggen enligt beskrivningen i 1.1.2.
- Tänd äggen enligt beskrivningen i 1.1.3.
- Sanera luftcellsområdet med 75% etanol och borra sedan ett litet hål i mitten av luftcellsområdet med metallsonden. Stick inte sonden djupt in i luftcellen eller så kan det inre membranet skadas, utan bryt bara skalet med sondens spets. Använd sedan de fina tångarna för att försiktigt förstora hålet tills diametern är ca 2 mm, vilket möjliggör visuell bekräftelse av det inre membranet.
- Ladda lösningen i mikroinjektor (maximal injektionsvolym: 0,5 μL/10 g ägg. (t.ex. 2,5 μL för ett 50 g ägg) och för försiktigt in nålen genom hålet i det inre membranet i cirka 2-3 mm. Dispensera försiktigt lösningen och ta bort nålen. Håll nålen så vinkelrät mot membranet som möjligt.
- Försegla hålet med en liten bit tejp. Täck hålet helt för att förhindra embryouttorkning och död under efterföljande inkubation. Undvik dock tejpbitar som är för stora för att förhindra hypoxi.
- När äggen är förseglade placerar du äggen i inkubatorn tills de når önskat embryonalt stadium. När embryon redan utvecklas, utför hela processen så snart som möjligt för att förhindra potentiell embryoförlust på grund av låg miljötemperatur.
- Inandning av luftceller (figur 3)
OBS: Detta är en ny inhalationsmetod som utnyttjar luftcellen, från vilken det sena kycklingembryon börjar andas luft. Den är lämplig för gas- eller aerosolexponeringar och kan uppnå mycket tidiga inhalationsexponeringar och fylla lungorna med målgasen/aerosolen när de öppnas för första gången i livet.- Bered följande nödvändiga reagenser/verktyg: Provtagningspåse (PVF-påse, för lagring av gas/aerosolprov före exponering), kateternål, spruta, metallsond (kan ersätta med vass metallnål/pinne/awl bör fungera), tejp, rökhuv.
- Rengör äggen enligt beskrivningen i 1.1.2 och stearinljus enligt beskrivningen i 1.1.3 (det är inte nödvändigt att märka luftcell före inkubation) och inkubera sedan ägg utan behandling fram till ED17.
- Tänd äggen på ED17 för att markera luftcellsområdet.
- Vid ED18, ta ut ett ägg från inkubatorn, sanera luftcellsområdet med 75% etanol och borra sedan försiktigt två små hål på två sidor av luftcellen. Den ena är för injektion av gas / aerosol, den andra är för utstötning av luft. Kontrollera noggrant hålens storlek så att storleken på injektionshålet är precis tillräckligt för att kateternålen ska sättas in, medan diametern på utstötningshålet är lite större (ca 1 mm).
- Injicera försiktigt 10 ml målgas/aerosol från injektionshålet med en spruta fäst vid kateternålen. Injicera luft för en inhalationskontrollgrupp, som inte bör ha några signifikanta skillnader mot en negativ kontrollgrupp8. Tryck mot kateternålen (med lämplig tryckmängd kan den elastiska nålen tryckas mot skalet) för att minimera läckaget från injektionshålet. Försegla båda hålen omedelbart med tejp efteråt och sätt tillbaka ägget till inkubatorn.
OBS: Denna procedur bör utföras i en rökhuv för att förhindra inandning av gas/aerosol av operatören. - Upprepa den beskrivna proceduren efter en timme för att ytterligare säkerställa att hela luftcellen fylls med målgas/aerosol (valfritt).
- Upprepa den beskrivna proceduren vid ED19 igen (valfritt). Upprepa exponeringen hjälper till att säkerställa konsekvent exponering fram till kläckningen. Registrera kläckningstiden för en ungefärlig uppskattning av exponeringstiden.
- När önskad exponering har utförts och förseglats, placera äggen i inkubatorn för kläckning. Minimera den tid ägget tillbringar utanför inkubatorn för att förhindra dödsfall från låg miljötemperatur.
2. Metoder för slutpunktsbedömning
OBS: Efter exponering av kontaminerande ämnen av intresse för det utvecklande embryot kan flera toxicitetsparametrar utvärderas, inklusive kardiotoxicitet. I det här avsnittet beskrivs två ofta använda specifika metoder i detalj.
- Elektrokardiografi (Figur 4)
OBS: Det är omöjligt att göra icke-invasiv elektrokardiografi hos kläckande kycklingar på grund av närvaron av fjädrar. Således är subkutan implantation av elektroder viktig, vilket kräver anestesi. Dosen som används i labbet är 33 mg/kg pentobarbital via intraperitoneal injektion (vissa kycklingar kan kräva upp till 50% dosökning). Denna metod kommer att resultera i stabil elektrokardiografi hos över 90% av djuren, vilket möjliggör analys av hjärtfrekvensen.- Bered följande nödvändiga reagenser/verktyg: 1% (10 mg/ml) pentobarbital lösning i saltlösning, spruta, elektrisk balans, värmare (vid behov), ett elektrokardiografiinstrument fäst (t.ex. BL-420E+) med tvåkanaliga metallnålelektroder.
- Väg kycklingarna med en balans och beräkna den nödvändiga volymen pentobarbital lösning och injicera kycklingarna. För en kyckling som väger 30 g behövs 0,1 ml pentobarbital lösning. Se till att injektionen görs på bukens laterala sida, eftersom äggulan är placerad i mitten och injektionen där kanske inte är effektiv.
- Vänta tills de injicerade kycklingarna bedövas (håll kycklingen i handen, om nacken inte har någon spänning och huvudet kan svängas fritt, är bedövningen tillräcklig). Placera kycklingar på operationsbordet (värmare är nödvändiga om rumstemperaturen är under 20 °C).
- Sätt in två nålelektroder från två sidor av buken, subkutant. Se till att nålarna inte kommer in i bukhålan genom att lyfta huden lite och sätta in nålen därifrån. När den har satts in, tryck försiktigt nålen framåt tills den når sidan av brösthålan. Se till att nålen inte går djupt in i kroppen eller sticker ut från huden.
- Gör mätningarna med elektrokardiografiinstrumentet. Andra liknande instrument som kan elektrokardiografi kan användas.
- Om kycklingarna ska offras, utför dödshjälp efter elektrokardiografin eftersom de redan är under anestesi. Om kycklingar ska överleva, placera dem tillbaka i sina burar och värm tills de vaknar. Att returnera dem till inkubatorn är ett annat alternativ.
- Histomorfologi (Figur 5)
OBS: En specifik metod utvecklas för att bedöma rätt ventrikulär väggtjocklek i tvärgående delar av hjärtat. Morfologiska bedömning av rätt ventrikel dimension via ekokardiografi är inte 100% korrekt på grund av oregelbundna form av rätt ventrikel, och denna metod kan tjäna som ett bra komplement i morfologiska bedömningar för rätt ventrikel.- Bered följande nödvändiga reagenser/verktyg: 4% fosfatbuffrad formaldehyd, vasst blad, fosfatbuffrad saltlösning, pappershandduk, elektrisk balans, liten sax, allmänna histologiska bearbetningsmedel (graderad etanol, xylen, paraffin).
- När djur offras, använd vatten för att blöta fjädrarna. Detta för att minimera den potentiella föroreningen på grund av flygande fjädrar samtidigt som bröstet öppnas.
- Öppna brösthålan försiktigt utan att skada hjärtat. Använd en liten sax för att skära vaskulaturen och ta försiktigt bort hjärtat från brösthålan. Lämna en liten bit (ca 1-2 mm) vaskulatur fäst vid hjärtat eftersom detta kan vara bekvämt för efterföljande hantering av hjärtat utan att skada hjärtat.
- När du har tagit bort, skölj hjärtat i kall fosfat buffrad saltlösning för att ta bort blod och slappna av i muskeln. Doppa sedan hjärtat på pappershandduken innan du väger för noggrann viktavläsning. Sätt hjärtat i 10x volymfixativ (4% fosfatbuffrad formaldehyd) i 24 timmar vid rumstemperatur. Fasta vävnader kan därefter bearbetas till paraffinblock eller lagras vid 4 °C i flera år (rekommenderas inte om immunohistokemi planeras).
- Innan du bäddar in, skär vävnaderna på cirka 60% längden av hjärtat som räknar från toppen (Figur 5A), för enklare efterföljande bearbetning. Ett mikrotomblad rekommenderas för ett snabbt och vertikalt rent snitt. För kycklingar äldre än en dag, gör ett annat snitt på ungefär 25-30% längd från toppen för enklare paraffinpenetration och för att låta vävnaden passa i vävnadskassetter.
- Bearbeta vävnaderna med följande villkor (justera efter behov): 70% etanol i 1 h, 80% etanol i 1 h, 95% etanol för 1 h x2, 100% etanol i 30 min x2, xylen i 5 min x2, paraffin (smältpunkt 52-54 °C) i 1,5 timmar, paraffin (smältpunkt 62-64 °C) i 1 timme och bädda sedan in vävnaderna i en 3:1 blandning av paraffin (smältpunkt 62-64 °C) och paraffin (smältpunkt 52-54 °C).
- Dela vävnaden med 6 μm tjocklek. Underhåll noggrant identiska relativa positioner av tvärsnitten genom att bekräfta närvaron och storleken på ett anatomiskt landmärke (septomarginal trabecula) i rätt ventrikel. Bekräfta ett landmärke med måttlig längd på varje avsnitt(bild 5B, pil).
- Gör två elektroniska linjaler med Logo-programmerare: Linjal 1 är en rak linje med 7 radiemåttlinjer fästa vid mittpunkten, med 22,5° mellan två intilliggande mätlinjer. Linjal 2 är bara två vinkelräta linjer i T-form (figur 5B).
- Mät med två program: Adobe Photoshop och ImageJ.
- I Photoshop, ändra storlek på linjal 1 (INGEN omformning) för att placera linjalens två ändar på de två ändarna av fri höger ventrikulär vägg, så att de sju mätlinjerna på linjal 1 var och en kommer att uppfylla den inre högra ventrikulära väggen. Använd sedan linjal 2 för att göra vinkelräta mätningar från den inre till yttre ventrikulära väggen (figur 5B).
- Använd ImageJ för att göra de sju mätningarna för varje hjärta.
- Beroende på specifika behov, analysera de sju mätningarna eller genomsnittet för en representativ höger ventrikulär väggtjocklek. Normalisera till hel hjärtvikt för specifika ventrikulära väggtjockleksförändringar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Exponeringsresultat
Luftcellsinjektion
Luftcellsinjektion kan effektivt utsätta utvecklingen av kycklingembryon för olika agenser, som senare kan detekteras i de insamlade proverna (serum, vävnad etc.) av embryon/kläckningshöns. Här är ett exempel, där perfluoroktansyra (PFOA) injicerades luftcell och serum PFOA koncentrationer fastställdes sedan med Ultra-performance flytande kromatografi-masspektrometri. Serumkoncentrationerna motsvarade de injicerade doserna, vilket indikerar effektiviteten av detta förfarande (figur 6).
Mikroinjektion
Mikroinjektion kan utsätta de utvecklande embryona för medel som kanske inte effektivt tränger in i det inre membranet eller med en kort verkningstid, såsom lentivirus. Här är ett exempel, där lentivirus injicerades vid embryonal dag två med denna metod och sedan observerades betydande grön fluorescens i hjärtat av embryonala dag 15-embryon, vilket indikerar effektiviteten av lentivirustransfektion (figur 7).
Infusion av luftceller
Luftcellsinfusion är en ny metod, som kan fungera mycket bra för liten mängd gas/ aerosolinandningsexponering under initieringsstadiet av extern andning. Här är ett exempel, där dieselavgaser infunderades i luftcell på embryonal dag 18 och 19, vilket resulterade i betydande fibrotiska förändringar i hjärt- och lungvävnader (figur 8).
Resultat av slutpunktsutvärdering
Elektrokardiografi resultat
På grund av begränsningen av två elektroder kan endast 3 elektrokardiografikanaler visas. Men de är tillräckliga för att skilja r vågor, så de kan användas för funktionella bedömningar. I ett verkligt exempel angav elektrokardiografi hos kycklingar som exponerats för dieselavgaser signifikant förkortat R-R-intervall, vilket indikerar funktionella förändringar (figur 9).
Histopatologi resultat
Vår metod för rätt ventrikulär vägg tjocklek bedömning användes framgångsrikt i flera studier5,7,8,9,10,11,12. I en av våra tidigare studier resulterade dieselavgasexponering i förtjockad höger ventrikulär vägg (figur 10).
Figur 1:Demonstration av luftcellsinjektion. Ett outvecklade bördiga ägg visas på bilden, men embryon i alla olika stadier kan exponeras med denna metod. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Demonstration av mikroinjektion. Ett tidigt embryo visas på bilden, vilket är den föredragna exponeringstiden för denna metod, men andra tidpunkter kan också provas. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Demonstration av luftcellsinfusion. Ett sent embryo som genomgår intern pipping visas på bilden, vilket är den föredragna exponeringstiden för denna metod. Fyra steg av operationen visades. 1: Intakt embryo. 2: Två hål har gjorts. 3: Infusion utförs. PVF-provtagningspåsen visas också längst ner till vänster. 4: Infusionen är klar, hål förseglade med tejp. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Demonstration av elektrokardiografi. Övre vänstra panelen visade hur en kläckande kyckling bedövades och genomgick elektrokardiografimätning. Övre högra panelen visar elektrokardiografiinstrumentet med elektroderna fästa. Bottenpanelen visar en representativ elektrokardiografi som förvärvats från kycklingarna. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Demonstration av histopatologisk bedömning av höger ventrikulär väggtjocklek (Hematoxylin och eosinfärgning). (A) Demonstration av kycklinghjärtanas skärposition före inbäddning. B)Demonstration av rätt ventrikulär väggtjockleksmätning. Skalstänger representerar 1000 μm. Blå cirklar visar de sju mätpunkterna på den inre högra ventrikulära väggen. Röd cirkel visar en mätpunkt på den yttre högra ventrikulära väggen. Arrow demonstrerar det anatomiska landmärket för lämplig tvärsnittsposition. Denna siffra har modifierats från Jiang et al. Toxikologi. 293 (1-3), 97-106 (2012)7. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6:Serumkoncentration av perfluoroktansyra från kläckande kycklingar efter luftcellsinjektion med 0, 0, 5, 1 eller 2 mg/ägg kg perfluoroktansyra före inkubation. De resulterande serumkoncentrationerna motsvarade de injicerade doserna, vilket indikerar effektiviteten av luftcellsinjektion. Denna siffra har modifierats från Jiang et al. Toxikologi. 293 (1-3), 97-106 (2012)7. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 7: Demonstration av lentivirustransfektionseffekt efter exponering för mikroinjektion (direkt observation efter kryosektionering). Vänster paneler visade ljusfält bilder, medan höger paneler visade grön fluorescens för samma vävnad avsnitt. Embryonala dag två kyckling embryon injicerades med lentivirus eller kontroll, och sedan inkuberades till embryona dag 15. Hjärtan var frusna-sektionerade och direkt visualiserade under fluorescerande mikroskop. (A) Kontrollgrupp, liten grön fluorescens var närvarande. B)Lentivirus exponerad grupp, signifikant grön fluorescens observerades, vilket indikerar effektiviteten av lentivirus transfection efter microinjection. Skalstänger representerar 125 μm. Denna siffra har modifierats från Zhao et al. Miljötoxikologi och farmakologi. 56, 136-144 (2017)11. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 8: Demonstration av luftcellsinfusionens effektivitet. Kycklingembryon infunderades med dieselavgaser på embryonal dag 18 och 19, och sedan hölls de kläckta kycklingarna i 0, 1 eller 2 veckor och offrades sedan. Hjärtvävnaderna bedömdes med Masson Trichrome färgning för fibrotic skador. Pilar visade fibrotic skador (blå färgning). *: statistiskt sett skiljer sig från kontroll (P<0,05 från variansanalys och minst signifikanta differenstester). Skalstänger representerar 150 μm. Denna siffra har ändrats från Jiang et al. Miljöföroreningar. 264, 114718 (2020)8. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 9: Demonstration av elektrokardiografins effektivitet. Kycklingembryon infunderades med dieselavgaser vid embryonal dag 18 och 19, och sedan hölls de kläckta kycklingarna i 0, 1 eller 2 veckor och sedan utfördes elektrokardiografi. Signifikant förkortade R-R-intervall observerades hos kycklingar som exponerades för dieselavgaser via luftcellsinfusion, vilket indikerar metodens effektivitet. *: statistiskt sett skiljer sig från kontroll (P<0,05 från variansanalys och minst signifikanta differenstester). Denna siffra har ändrats från Jiang et al. Miljöföroreningar. 264, 114718 (20208. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 10: Demonstration av effektiviteten hos mätning av höger ventrikulär väggtjocklek (Hematoxylin- och eosinfärgning). Kycklingembryon infunderades med dieselavgaser på embryonal dag 18 och 19, och sedan hölls de kläckta kycklingarna i 1 vecka, och sedan utfördes histologisk bedömning av rätt ventrikulär väggtjocklek. S: Representativa bilder av hjärtats tvärsnitt. Observera närvaron av anatomisk markör i alla rätt ventriklar (Hos äldre kycklingar tenderar markören att vara lite längre vid önskat läge, vilket inte påverkar mätnoggrannheten). B: Kvantifiering av den högra ventrikulära väggtjockleken, som först omvandlades till faktisk längd med standardbilder, och sedan normaliserades med hel hjärtvikt så representerades således i form av um/ug. Blå pilar: två ändar av den fria högra ventrikulära väggen. Röda pilar: mittpunkterna på höger ventrikulär vägg. Svarta pilar: anatomisk markör. *: statistiskt sett skiljer sig från kontroll (P<0,05 från variansanalys och minst signifikanta differenstester). Skalstänger representerar 1000 μm. Denna siffra har ändrats från Jiang et al. Miljöföroreningar. 264, 114718 (2020)8. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kycklingembryon har varit en klassisk modell i utvecklingsstudier i 200 år1. Våra metoder som presenteras i detta manuskript har använts vid bedömning av flera miljöföroreningar, inklusive perfluoroktansyra, partiklar och dieselavgaser med framgång5,7,8,9,10,11,12. Med dessa metoder angavs utvecklingsmässiga cardiotoxicity kostnadseffektivt och tydligt. Dessutom är det inte svårt att exponera kycklingembryon med andra föreningar av intresse och bedöma potentiell utvecklingsmässig kardiotoxicitet.
Luftcellsinjektionsmetoden är en klassisk metod som tidigare använts i mångastudier 13,14,15, vilket är bekvämt och effektivt. Jämfört med andra utvecklingsexponeringsmetoder, såsom gnagaremodeller16,17,18, har den direkt exponering i ett slutet system, vilket kraftigt minskar variationerna på grund av maternell effekt och varierad utsöndring. Mikroinjektion är en förbättring av luftcellsinjektionsmetoden, vilket säkerställer definitiv exponering på eller i närheten av att utveckla tidigt embryo, vilket kan uppnå liknande effekter som in utero-injektioner i gnagaremodeller19,20. Jämfört med in utero injektioner, vår metod möjliggör visuell bekräftelse av injektionen med relativt enkla manipulation steg, och korrekt injektion uppnås lätt genom att kontrollera för äggvikten, vilket inte är möjligt i in utero injektionen, där den faktiska mängden och vikten av embryon inte lätt förvärvas. Infusionsmetoden är huvudsakligen för bedömning av inhalerade medel på lungsystemet, men kardiotoxicitet och lungtoxicitet förekommer ofta. Denna metod drar nytta av luftcellen, i vilken en liten mängd gas eller aerosol infunderas, vilket möjliggör kontinuerlig inandning av gas / aerosol utan behov av specifika inandningskammare. Motpart gnagare modeller måste använda relativt stora mängder gas / aerosol och stora, dyra inandningsinstrument21,22.
De två rutinmässigt testade effektmåtten i vårt labb, elektrokardiografi och histomorfetrisk bedömning av höger ventrikulär väggtjocklek representerar funktionella respektive morfologiska förändringar efter toxikantexponering. Bedömningen av rätt ventrikulär väggtjocklek har specifika fördelar med att få en omfattande förståelse för rätt ventrikulär vägg, eftersom den traditionella ekokardiografibaserade bedömningen på höger ventrikel vanligtvis är utmanande och inte särskilt exakt, på grund av den asymmetriska och komplexa halvmåneformen hos höger ventrikel23. Vår metod kan bidra till att övervinna denna felaktighet genom att komplettera med ytterligare information om rätt ventrikulär väggtjocklek i en representativ position. För närvarande är allt manuellt, i framtiden kan mätningarna göras automatiskt och antalet mätpunkter kan ökas avsevärt, vilket ytterligare förbättrar noggrannheten hos denna metod.
Kycklingembryonbaserade utvecklingsmodeller har flera fördelar i toxikologiska studier, såsom förmågan att leverera en relativt exakt exponeringsdos, ett oberoende exponeringssystem i skalet och enkel manipulering av det utvecklande embryot. När det gäller kardiotoxicitet har kycklingar relativt stora hjärtan och tjocka ventrikulära väggar, vilket möjliggör enkla histomorfetriska bedömningar. Det finns vissa brister, såsom tillgång till antikroppar / primers och extra burutrymmeskrav som jämförs med gnagare om de föder upp kycklingar efter kläckning. Kycklingembryon är dock fortfarande en bra alternativ toxikologisk modell som ska användas för potentiella utvecklingsmässiga kardiotoxicitetsbedömningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (Grant No. 91643203, 91543208, 81502835).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% phosphate buffered formaldehydefixative | Biosharp, Hefei, China | REF: BL539A | |
| 75% ethanol | Guoyao,Shanghai,China | CAS:64-17-5 | |
| Biosignaling monitor BL-420E+ | Taimeng, Chengdu, China | BL-420E+ | |
| Candling lamp | Zhenwei, Dezhou, China | WZ-001 | |
| Disposable syringe | Zhiyu, Jiangsu, China | ||
| Egg incubator | Keyu,Dezhou, China | KFX | |
| Electrical balance | OHAUS, Shanghai, China | AR 224CN | |
| Electro-thermal incubator | Shenxian, Shanghai, China | DHP-9022 | |
| Ethanol absolute | Guoyao,Shanghai,China | CAS:64-17-5 | |
| Fertile chicken egg | Jianuo, Jining, China | ||
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Beyotime, Bejing, China | C0105 | |
| Histology paraffin | Aladdin, Shanghai, China | P100928-500g | Melt point 52~54°C |
| Histology paraffin | Aladdin, Shanghai, China | P100936-500g | Melt point 62~64°C |
| IV catheter | KDL, Zhejiang, China | The catheters have to be soft, plastic ones. | |
| Lentivirus | Genechem, Shanghai, China | The lentivirus were individually designed/synthesized by Genechem. | |
| Masson's trichrome staining kit | Solarbio, Beijing, China | G1340 | |
| Metal probe | Jinuotai, Beijing, China | ||
| Microinjector (5 uL) | Anting,Shanghai, China | ||
| Microscope | CAIKON, Shanghai, China | XSP-500 | |
| Microtome | Leica, Germany | HistoCore BIOCUT | |
| Microtome blade | Leica,Germany | Leica 819 | |
| Pentobarbitual sodium | Yitai Technology Co. Ltd., Wuhan, China | CAS: 57-33-0 | |
| Pipetter(10ul) | Sartorius, Germany | ||
| Povidone iodide | Longyuquan, Taian, China | ||
| Scissor | Anqisheng,Suzhou, China | ||
| Sterile saline | Kelun,Chengdu, China | ||
| Sunflower oil | Mighty Jiage, Jiangsu, China | Any commerical sunflower oil for human consumption should work | |
| Tape | M&G, Shanghai, China | ||
| Tedlar PVF Bag (5L) | Delin, Dalian, China | ||
| Vortex mixer | SCILOGEX, Rocky Hill, CT, US | MX-F | |
| Xylene | Guoyao,Shanghai,China | CAS:1330-20-7 |
References
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).
- Menna, T. M., Mortola, J. P. Effects of posture on the respiratory mechanics of the chick embryo. Journal of Experimental Zoology. 293 (5), 450-455 (2002).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Yamamoto, F. Y., Neto, F. F., Freitas, P. F., Oliveira Ribeiro, C. A., Ortolani-Machado, C. F. Cadmium effects on early development of chick embryos. Environmental Toxicology and Pharmacology. 34 (2), 548-555 (2012).
- Lv, N., et al. The roles of bone morphogenetic protein 2 in perfluorooctanoic acid induced developmental cardiotoxicity and l-carnitine mediated protection. Toxicology and Applied Pharmacology. 352, 68-76 (2018).
- Kmecick, M., Vieira da Costa, M. C., Oliveria Ribeiro, C. A., Ortolani-Machado, C. F. Morphological evidence of neurotoxic effects in chicken embryos after exposure to perfluorooctanoic acid (PFOA) and inorganic cadmium. Toxicology. 4227, 152286 (2019).
- Jiang, Q., Lust, R. M., Strynar, M. J., Dagnino, S., DeWitt, J. C. Perflurooctanoic acid induces developmental cardiotoxicity in chicken embryos and hatchlings. Toxicology. 293 (1-3), 97-106 (2012).
- Jiang, Q., et al. In ovo very early-in-life exposure to diesel exhaust induced cardiopulmonary toxicity in a hatchling chick model. Environmental Pollution. 264, 114718 (2020).
- Jiang, Q., Lust, R. M., DeWitt, J. C. Perfluorooctanoic acid induced-developmental cardiotoxicity: are peroxisome proliferator activated receptor alpha (PPARalpha) and bone morphorgenic protein 2 (BMP2) pathways involved. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 76 (11), 635-650 (2013).
- Jiang, Q., et al. Changes in the levels of l-carnitine, acetyl-l-carnitine and propionyl-l-carnitine are involved in perfluorooctanoic acid induced developmental cardiotoxicity in chicken embryo. Environmental Toxicology and Pharmacology. 48, 116-124 (2016).
- Zhao, M., et al. The role of PPAR alpha in perfluorooctanoic acid induced developmental cardiotoxicity and l-carnitine mediated protection-Results of in ovo gene silencing. Environmental Toxicology and Pharmacology. 56, 136-144 (2017).
- Jiang, Q., et al. Particulate Matter 2.5 Induced Developmental Cardiotoxicity in Chicken Embryo and Hatchling. Front Pharmacol. 11, 841 (2020).
- Molina, E. D., et al. Effects of air cell injection of perfluorooctane sulfonate before incubation on development of the white leghorn chicken (Gallus domesticus) embryo. Environmental Toxicology and Chemistry. 25 (1), 227-232 (2006).
- Crump, D., Chiu, S., Williams, K. L. Bis-(3-allyl-4-hydroxyphenyl) sulfone decreases embryonic viability and alters hepatic mRNA expression at two distinct developmental stages in chicken embryos exposed via egg injection. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (2), 530-537 (2018).
- Franci, C. D., et al. Potency of polycyclic aromatic hydrocarbons in chicken and Japanese quail embryos. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (6), 1556-1564 (2018).
- Rand, M. D., et al. Developmental exposure to methylmercury and resultant muscle mercury accumulation and adult motor deficits in mice. Neurotoxicology. 81, 1-10 (2020).
- Tanaka, T., Suzuki, T., Inomata, A., Moriyasu, T. Combined effects of maternal exposure to fungicides on behavioral development in F1 -generation mice: 2. Fixed-dose study of thiabendazole. Birth Defects Research. , (2020).
- Kofman, O., Lan, A., Raykin, E., Zega, K., Brodski, C. Developmental and social deficits and enhanced sensitivity to prenatal chlorpyrifos in PON1-/- mouse pups and adults. PLoS One. 15 (9), 0239738 (2020).
- Kischel, A., Audouard, C., Fawal, M. A., Davy, A. Ephrin-B2 paces neuronal production in the developing neocortex. BMC Developmental Biology. 20 (1), 12 (2020).
- Okolo, F., Zhang, G., Rhodes, J., Gittes, G. K., Potoka, D. A. Intra-Amniotic Sildenafil Treatment Promotes Lung Growth and Attenuates Vascular Remodeling in an Experimental Model of Congenital Diaphragmatic Hernia. Fetal Diagnosis and Therapy. , 1-13 (2020).
- Vyslouzil, J., et al. Subchronic continuous inhalation exposure to zinc oxide nanoparticles induces pulmonary cell response in mice. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 61, 126511 (2020).
- Wahle, T., et al. Evaluation of neurological effects of cerium dioxide nanoparticles doped with different amounts of zirconium following inhalation exposure in mouse models of Alzheimer's and vascular disease. Neurochemistry International. 138, 104755 (2020).
- Tanabe, K. Three-Dimensional Echocardiography- Role in Clinical Practice and Future Directions. Circ J. 84 (7), 1047-1054 (2020).
