Summary
यह प्रोटोकॉल जांच-टिप sonication का उपयोग करके लिपिड encapsulated decafluorobutane microbubbles की बड़ी मात्रा उत्पन्न करने की एक विधि का वर्णन करता है और बाद में उच्च दबाव बाहर निकालना और यांत्रिक निस्पंदन का उपयोग करके उन्हें चरण-शिफ्ट नैनोड्रॉपलेट में संघनित करता है।
Abstract
कई तरीके हैं जिनका उपयोग इमेजिंग और थेरेपी के लिए वाष्पीकरणीय चरण-शिफ्ट बूंदों के उत्पादन के लिए किया जा सकता है। प्रत्येक विधि विभिन्न तकनीकों का उपयोग करती है और मूल्य, सामग्री और उद्देश्य में भिन्न होती है। इन निर्माण विधियों में से कई के परिणामस्वरूप गैर-समान सक्रियण थ्रेसहोल्ड के साथ पॉलीडिस्पर्स आबादी होती है। इसके अतिरिक्त, ड्रॉपलेट आकारों को नियंत्रित करने के लिए आमतौर पर उच्च सक्रियण थ्रेसहोल्ड के साथ स्थिर परफ्लोरोकार्बन तरल पदार्थ की आवश्यकता होती है जो विवो में व्यावहारिक नहीं हैं। कम-क्वथनांक गैसों का उपयोग करके एक समान बूंद आकार का उत्पादन विवो इमेजिंग और थेरेपी प्रयोगों में फायदेमंद होगा। यह आलेख आकार-फ़िल्टर किए गए लिपिड-स्थिर चरण-शिफ्ट नैनोड्रॉपलेट्स के गठन के लिए एक सरल और किफायती विधि का वर्णन करता है जिसमें कम-क्वथनांक डेकाफ्लोरोब्यूटेन (DFB) होता है। लिपिड माइक्रोबबल्स उत्पन्न करने की एक सामान्य विधि का वर्णन किया गया है, एक ही चरण में उच्च दबाव वाले एक्सट्रूज़न के साथ उन्हें संघनित करने की एक उपन्यास विधि के अलावा। इस विधि को समय बचाने, दक्षता को अधिकतम करने और कई जैविक प्रयोगशालाओं में पाए जाने वाले सामान्य प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करके विभिन्न प्रकार के अनुप्रयोगों के लिए माइक्रोबबल और नैनोड्रॉपलेट समाधानों की बड़ी मात्रा उत्पन्न करने के लिए डिज़ाइन किया गया है।
Introduction
अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट (यूसीए) इमेजिंग और थेरेपी अनुप्रयोगों के लिए लोकप्रियता में तेजी से बढ़ रहे हैं। Microbubbles, मूल यूसीए, वर्तमान में नैदानिक नैदानिक अनुप्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले मुख्यधारा के एजेंट हैं। माइक्रोबबल्स गैस से भरे गोले होते हैं, आमतौर पर व्यास में 1-10 μm, लिपिड, प्रोटीन या बहुलक गोले से घिरा होता है। हालांकि, उनका आकार और विवो स्थिरता में कई अनुप्रयोगों में उनकी कार्यक्षमता को सीमित कर सकते हैं। फेज-शिफ्ट नैनोड्रॉपलेट्स, जिसमें एक सुपरहीटेड तरल कोर होता है, अपने छोटे आकार और बेहतर परिसंचरण-जीवन 2 के कारण इनमें से कुछ सीमाओं को दूर कर सकता है। जब गर्मी या ध्वनिक ऊर्जा के संपर्क में आता है, तो सुपरहीटेड तरल कोर एक गैस माइक्रोबबल 2,3,4,5 बनाने के लिए वाष्पीकृत होता है। चूंकि वाष्पीकरण थ्रेशोल्ड सीधे बूंद आकार 5,6 से संबंधित है, इसलिए समान आकार के साथ ड्रॉपलेट निलंबन तैयार करना लगातार सक्रियण थ्रेसहोल्ड प्राप्त करने के लिए अत्यधिक वांछनीय होगा। एक समान बूंद आकार का उत्पादन करने वाले सूत्रीकरण विधियां अक्सर जटिल और महंगी होती हैं, जबकि अधिक लागत प्रभावी दृष्टिकोण के परिणामस्वरूप पॉलीडिस्पर्स समाधान 7 होता है। एक अन्य सीमा कम-क्वथनांक perfluorocarbon (PFC) गैसों के साथ स्थिर चरण-शिफ्ट बूंदों को उत्पन्न करने की क्षमता है, जो vivo8 में कुशल सक्रियण के लिए महत्वपूर्ण है। इस पांडुलिपि में, विवो इमेजिंग और थेरेपी अनुप्रयोगों में स्थिर फ़िल्टर किए गए कम-क्वथनांक वाष्पीकरणीय चरण-शिफ्ट बूंदों को उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है।
मोनोडिस्पर्स्ड सबमाइक्रोन फेज-शिफ्ट ड्रॉपलेट्स 7 के उत्पादन के कई तरीके हैं। आकार को नियंत्रित करने के सबसे मजबूत तरीकों में से एक माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का उपयोग है। ये उपकरण महंगे हो सकते हैं, बूंद उत्पादन की धीमी दर (~ 104-106 बूंदों / एस) 7, और व्यापक प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों को आमतौर पर सिस्टम 7 के सहज वाष्पीकरण और क्लॉगिंग से बचने के लिए उच्च-क्वथनांक गैसों की आवश्यकता होती है। हालांकि, डी ग्रासिया लक्स एट अल.9 द्वारा हाल ही में किए गए एक अध्ययन से पता चलता है कि माइक्रोफ्लुइडाइज़र को ठंडा करने का उपयोग कम-क्वथनांक डेकाफ्लोरोब्यूटेन (डीएफबी) या ऑक्टाफ्लोरोप्रोपेन (ओएफपी) का उपयोग करके उप-माइक्रोन फेज-शिफ्ट (1010-1012 / एमएल) की उच्च सांद्रता उत्पन्न करने के लिए कैसे किया जा सकता है।
सामान्य तौर पर, कम क्वथनांक गैसों जैसे कि डीएफबी या ओएफपी को पूर्वनिर्मित गैस बुलबुले का उपयोग करके संभालना आसान होता है। Vaporizable बूंदों को अग्रदूत लिपिड-स्थिर बुलबुले से कम तापमान और ऊंचा दबाव 5,10 का उपयोग करके गैस को संघनित करके उत्पादित किया जा सकता है। इस विधि का उपयोग करके उत्पादित बूंदों की एकाग्रता अग्रदूत माइक्रोबबल एकाग्रता और बूंदों में बुलबुले के रूपांतरण की दक्षता पर निर्भर करती है। केंद्रित microbubbles टिप sonication से 1010 MB / mL11 > आ रहा है से सूचित किया गया है, जबकि एक अलग अध्ययन में संघनित OFP और DFP बुलबुले 12 से ~ 1-3 x1011 बूंदों / mL से लेकर बूंद सांद्रता की सूचना दी गई है। जब मोनोडिस्पर्स्ड ड्रॉपलेट्स चिंता का विषय नहीं होते हैं, तो संक्षेपण विधियां कम-क्वथनांक PFCs का उपयोग करके लिपिड-स्थिर चरण-शिफ्ट बूंदों को उत्पन्न करने के सबसे सरल और सबसे कम लागत वाले तरीके हैं। संघनन से पहले समान आकार के बुलबुले उत्पन्न करने के तरीके बूंदों की अधिक मोनोडिस्पर्स आबादी बनाने में मदद कर सकते हैं। हालांकि, मोनोडिस्पर्स अग्रदूत बुलबुले उत्पन्न करना भी मुश्किल है, जिसमें माइक्रोफ्लुइडिक्स या दोहराए गए विभेदक सेंट्रीफ्यूजेशन तकनीकों जैसे अधिक महंगे दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है। DFB और OFB nanodroplets के उत्पादन के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण हाल ही में liposomes13 में बूंदों के सहज न्यूक्लिएशन का उपयोग करके प्रकाशित किया गया है। यह विधि, एक "ओज़ो" प्रभाव का उपयोग करते हुए, बुलबुले को संघनित करने की आवश्यकता के बिना कम-क्वथनांक पीएफसी बूंदों को उत्पन्न करने का एक सरल तरीका है। पीएफसी बूंदों के आकार-वितरण को नाजुक अनुमापन द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है और पीएफसी, लिपिड और इथेनॉल घटकों को मिलाकर किया जा सकता है जो बूंदों के न्यूक्लिएशन को शुरू करने के लिए उपयोग किए जाते हैं। यह भी ध्यान देने योग्य है कि परफ्लोरोकार्बन के मिश्रण का उपयोग नैनोड्रॉपलेट्स 14,15 की स्थिरता और सक्रियण थ्रेसहोल्ड को नियंत्रित करने के लिए किया जा सकता है। शाक्य एट अल द्वारा हाल ही में किए गए काम से पता चलता है कि कैसे नैनोड्रॉपलेट सक्रियण को हाइड्रोकार्बन एंडोस्केलेटन के भीतर उच्च उबलते-बिंदु पीएफसी को इमल्सीफाइंग करके ट्यून किया जा सकता है ताकि ड्रॉपलेट कोर 16 के भीतर हेटरोजेनस न्यूक्लिएशन की सुविधा हो सके, जो एक ऐसा दृष्टिकोण है जिसे बूंद आकार निस्पंदन के अन्य रूपों के साथ माना जा सकता है।
एक बार बनने के बाद, अधिक मोनोडिस्पर्स आबादी बनाने के लिए गठन के बाद फेज-शिफ्ट बूंदों को बाहर निकाला जा सकता है। वास्तव में, यहां वर्णित विधि के समान प्रोटोकॉल को पहले कोपेचेक एट अल.17 द्वारा प्रकाशित किया गया है, जिसमें ड्रॉपलेट कोर के रूप में उच्च क्वथनांक डोडेकोफ्लोरपेंटेन (डीडीएफपी) का उपयोग किया गया है। उच्च-क्वथनांक perfluorocarbons (कमरे के तापमान पर स्थिर) के साथ चरण-शिफ्ट बूंदों का उपयोग करने की मांग करने वाले पाठकों को इसके बजाय ऊपर दिए गए लेख का संदर्भ देना चाहिए। कम उबलते बिंदु गैसों के साथ बूंदों को उत्पन्न करना और बाहर निकालना, जैसे कि डीएफबी और ओएफपी, अधिक जटिल है और पूर्वनिर्मित गैस बुलबुले को संघनित करके सबसे अच्छा संपर्क किया जाता है।
इस प्रोटोकॉल में, एक DFB गैस कोर के साथ preformed लिपिड microbubbles उत्पन्न करने की एक आम विधि जांच टिप sonication का उपयोग कर वर्णित है. इसके बाद, एक वाणिज्यिक extruder का उपयोग पूर्वनिर्मित माइक्रोबबल्स को सबमाइक्रोन फेज-शिफ्ट नैनोड्रॉपलेट्स (चित्रा 1) में संघनित करने के लिए किया जाता है। परिणामस्वरूप बूंदों तो गर्मी और अल्ट्रासाउंड द्वारा सक्रिय कर रहे हैं. यह विधि महंगे माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों की आवश्यकता के बिना संकीर्ण आकार-वितरण के साथ पारंपरिक संघनन विधियों की तुलना में नैनोड्रॉपलेट समाधान की बड़ी मात्रा का उत्पादन कर सकती है। संकीर्ण आकार के वितरण के साथ नैनोड्रॉपलेट समाधानों का उत्पादन संभवतः अधिक समान वाष्पीकरण थ्रेसहोल्ड उत्पन्न कर सकता है। यह इमेजिंग, एब्लेशन, दवा वितरण, और embolization1,3,4,6 जैसे कई अनुप्रयोगों के लिए उनकी क्षमता को अधिकतम करेगा।
चित्रा 1: चरण-शिफ्ट नैनोड्रॉपलेट्स में पूर्वनिर्मित माइक्रोबबल्स को संघनित करने के लिए उच्च दबाव एक्सट्रूज़न सेटअप की योजनाबद्ध। Microbubble समाधान के लिए जोड़ा जाता है और extruder कक्ष में निहित है, और 250 साई, नाइट्रोजन टैंक से, कक्ष इनलेट वाल्व के माध्यम से लागू किया जाता है। नाइट्रोजन गैस कक्ष के आधार पर फिल्टर के माध्यम से माइक्रोबबल समाधान को धक्का देगी, नमूने को नैनोड्रॉपलेट्स में संघनित करेगी। समाधान अंत में नमूना आउटलेट ट्यूब के माध्यम से extruder से बाहर धकेल दिया है और एकत्र किया. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Protocol
1. लिपिड फिल्मों बनाना
- निम्नलिखित दिशाओं का उपयोग करके लिपिड को सही अनुपात में मिलाकर 90% DSPC और 10% DSPE-PEG2K का उपयोग करके माइक्रोबबल पीढ़ी के लिए लिपिड फिल्में तैयार करें:
- क्लोरोफॉर्म में DSPC और DSPE-PEG2K के स्टॉक लिपिड बनाएं। अलग शीशियों में प्रत्येक लिपिड पाउडर के 50 मिलीग्राम वजन। 1 एमएल ग्लास सिरिंज का उपयोग करके प्रत्येक शीशी में क्लोरोफॉर्म के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
- DSPC स्टॉक के 287 μL और DSPE-PEG2K स्टॉक के 113 μL (दोनों 50 mg / mL) को एक ग्लास सिरिंज का उपयोग करके 20 mL scintillation शीशी में जोड़ें।
- नाइट्रोजन का उपयोग करके क्लोरोफॉर्म को हटाने के लिए मिश्रित लिपिड को सुखाएं। घर नाइट्रोजन से जुड़े टयूबिंग की एक उपयुक्त लंबाई का उपयोग करते हुए, मिश्रण करते समय शीशी के हेडस्पेस पर नाइट्रोजन गैस को हल्के से प्रवाहित करें। तब तक जारी रखें जब तक कि कोई क्लोरोफॉर्म नहीं मनाया जाता है, और शेष लिपिड फिल्म सफेद होना शुरू हो जाती है। पॉलीप्रोपाइलीन स्क्रू कैप्स का उपयोग करें, हेडस्पेस में नाइट्रोजन पेश करते समय नमूने को कवर करें।
- किसी भी अवशिष्ट क्लोरोफॉर्म को हटाने के लिए एक वैक्यूम डेसिकेटर का उपयोग करके रात भर वैक्यूम के नीचे शीशियों को रखें। एक पतली पारभासी फिल्म बनी रहेगी जो शीशी के नीचे कोट करती है।
- आवश्यकता होने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर शीशियों को स्टोर करें।
2. लिपिड फिल्मों से microbubbles उत्पन्न
- Microbubbles बनाने के लिए, एक सूखी लिपिड फिल्म के लिए 20% v / v Propylene Glycol और 20% v / v ग्लिसरॉल (अंतिम pH 7.2-7.4) युक्त 1x फॉस्फेट बफर खारा (PBS) के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
- एक हीटिंग ब्लॉक (या गर्म पानी के स्नान) पर 30 मिनट के लिए नमूने और गर्म नमूने को 65 डिग्री सेल्सियस पर फिर से कैप करें।
- जबकि नमूना गर्म हो रहा है, स्नान के तापमान को 65 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ाकर स्नान सोनिकेटर तैयार करें।
नोट: यह प्रक्रिया तेज है यदि पानी को स्नान सोनिकेटर में रखने से पहले माइक्रोवेव या हॉटप्लेट में प्रीहीट किया जाता है। - स्नान sonicator में गर्म नमूने युक्त scintillation शीशी रखें ताकि लिपिड समाधान युक्त शीशी का केवल हिस्सा पानी के स्नान में डूबा हुआ है।
- कम से कम 15 मिनट के लिए गर्म लिपिड समाधान sonicate. सुनिश्चित करें कि पानी का तापमान 65 डिग्री सेल्सियस पर बना रहे। समाधान पूरी तरह से स्पष्ट होने तक 10-15 मिनट के अंतराल में sonicate करने के लिए जारी रखें (चित्रा 2)।
नोट: यदि एक स्नान sonicator उपलब्ध नहीं है, समाधान टिप sonicated किया जा सकता है 10% शक्ति पर जब तक स्पष्ट. हालांकि, माइक्रोटिप जल्दी से बाहर पहन जाएगा और बदलने के लिए अधिक महंगा है।
चित्रा 2: हाइड्रेटेड लिपिड फिल्मों का उदाहरण। हाइड्रेटेड लिपिड फिल्म (ए) से पहले और (बी) के बाद स्नान sonication के बाद का उदाहरण यूनि-लैमेलर पुटिकाओं को बनाने के लिए। स्नान sonication के बाद, लिपिड समाधान एक और अधिक अपारदर्शी से पारभासी समाधान के लिए स्थानांतरित करना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
- जबकि अभी भी गर्म है, टोपी को हटा दें और शीशी को सोनिकेटर के साउंडप्रूफ बाड़े में दबाएं ताकि सोनिकेटर का माइक्रोटिप लगाव हवा / तरल इंटरफ़ेस (चित्रा 3) के नीचे डूब जाए।
- sonicator के साउंडप्रूफ बाड़े के बगल में decafluorobutane के टैंक रखें।
- एक बर्फ स्नान तैयार करें और इसे साउंडप्रूफ बाड़े के बगल में रखें। यह बाद में चरण 2.14 में उपयोग किया जाएगा।
- sonicator के लिए पावर स्विच चालू करें।
- सिस्टम के प्रारंभ होने के बाद, पावर स्तर को 70% पर सेट करें। माइक्रोटिप अनुलग्नक के साथ 70% आयाम से अधिक न करें। इस समय sonicator शुरू न करें।
- बाड़े में आयोजित गर्म लिपिड समाधान में DFB टैंक आउटलेट से गैस का मार्गदर्शन करने के लिए टयूबिंग की एक उचित लंबाई संलग्न करें। ट्यूब को सिर्फ शीशी की गर्दन में रखा जाना चाहिए ताकि गैस को sonication (चित्रा 3) के दौरान हेडस्पेस में प्रवाहित करने की अनुमति मिल सके।
- टैंक वाल्व को धीरे-धीरे खोलें जब तक कि गैस को लिपिड समाधान पर बहते हुए नहीं देखा जा सकता है। यह तरल की सतह पर मामूली तरंगों का कारण बनेगा। यदि गैस प्रवाह बहुत अधिक है, तो माइक्रोबबल फॉर्मूलेशन के दौरान समाधान ओवरफ्लो हो जाएगा।
- sonicator शुरू करें और microbubbles उत्पन्न करने के लिए लगातार 10 s के लिए चलाने के लिए। यदि बुलबुला समाधान sonication के दौरान अतिप्रवाह करने के लिए शुरू होता है, तो तुरंत sonicator बंद करो।
- sonicator बंद करें और तुरंत DFB टैंक वाल्व बंद करें।
- जल्दी से microbubble समाधान कैप और बर्फ स्नान में शीशी डूब 55 डिग्री सेल्सियस (DSPC के कांच संक्रमण तापमान) के नीचे नमूने को ठंडा करने के लिए नमूना ठंडा करने के लिए
- जरूरत होने तक बर्फ के स्नान में माइक्रोबबल नमूनों को छोड़ दें।
चित्रा 3: माइक्रोबबल गठन को अनुकूलित करने के लिए लिपिड समाधान में जांच टिप का प्लेसमेंट। ध्यान रखें कि जांच की नोक को कांच को छूने की अनुमति न दें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
3. microbubble संघनन के लिए extruder तैयार करना
- एक 200 एनएम सिरेमिक फिल्टर (निर्माता से आपूर्ति) का उपयोग कर उपयोगकर्ता के मैनुअल में विस्तृत के रूप में उच्च दबाव extruder इकट्ठा।
- एक watertight कंटेनर के केंद्र में extruder रखें ताकि नमूना आउटलेट ट्यूब पक्ष के खिलाफ दबाया या crimped नहीं है।
- निर्माता द्वारा आपूर्ति किए गए एडाप्टर का उपयोग करके नाइट्रोजन गैस टैंक के लिए एक्सट्रूडर जोड़ें।
- 400 मिलीलीटर पानी और 10 ग्राम सोडियम क्लोराइड का उपयोग करके एक्सट्रूडर के चारों ओर वाटरटाइट कंटेनर में एक -2 डिग्री सेल्सियस नमकीन बर्फ स्नान करें।
- बहिष्कृत नमूने को इकट्ठा करने के लिए आउटलेट ट्यूब के अंत को एक सिंटिलेशन शीशी में रखें।
नोट: टेप के साथ कंटेनर के लिए ट्यूब को सुरक्षित करें यदि यह फ्लैट नहीं रखता है या शीशी के भीतर नहीं रहता है।
4. microbubble संघनन के लिए extruder भड़काना
- यह सुनिश्चित करने के लिए रिलीज वाल्व को खोलें और बंद करें कि एक्सट्रूडर के भीतर कोई दबाव नहीं है।
- कक्ष ढक्कन निकालें और extruder कक्ष के लिए 1x PBS के 5 मिलीलीटर जोड़ें।
- ढक्कन को बदलें यह सुनिश्चित करें कि यह सुरक्षित रूप से वापस जगह में क्लिक करता है।
- नाइट्रोजन गैस टैंक खोलें ताकि दबाव गेज 250 साई पढ़ता है। सुनिश्चित करें कि दबाव नियंत्रण वाल्व बंद स्थिति में है।
- गैस टैंक को बंद करें और एक्सट्रूडर चैंबर इनलेट वाल्व खोलें। पीबीएस समाधान प्रणाली के माध्यम से धक्का दिया जाएगा और नमूना आउटलेट ट्यूब को सिंटिलेशन शीशी में बाहर निकाल दिया जाएगा।
- जब केवल गैस टयूबिंग से बाहर निकल रही है, तो रिलीज वाल्व खोलें और दबाव को 0 साई तक गिरने की अनुमति दें।
- scintillation शीशी निकालें।
5. एक्सट्रूज़न के लिए पूर्व शीतलन microbubbles
- यह सुनिश्चित करने के लिए रिलीज वाल्व को खोलें और बंद करें कि एक्सट्रूडर के भीतर कोई दबाव नहीं है। आउटलेट ट्यूब के अंत में एक नई सिंटिलेशन शीशी रखें।
- 2-मिथाइल ब्यूटेन के साथ एक स्टील कंटेनर भरें और तापमान को -18 डिग्री सेल्सियस तक लाने के लिए सूखी बर्फ जोड़ें।
- ठंडा 2-मिथाइल ब्यूटेन में माइक्रोबबल समाधान डालें ताकि नमूना 2 मिनट के लिए जलमग्न हो जाए। धीरे बुलबुले मिश्रण करने के लिए 2 मिनट भर में scintillation शीशी ले जाएँ. -15 और -18 डिग्री सेल्सियस के बीच तापमान बनाए रखने के लिए आवश्यकतानुसार सूखी बर्फ जोड़ें। सावधान रहें कि -20 डिग्री सेल्सियस से अधिक न हो या एक्सिपिएंट समाधान फ्रीज हो जाएगा और बुलबुला नमूना को नष्ट कर देगा।
नोट: चरण 5.2 और 5.3 भी एक अधिक विस्तारित समय अवधि में एक प्रयोगशाला फ्रीजर में बुलबुला नमूना ठंडा करके किया जा सकता है। हालांकि, सावधानी से फ्रीजर के तापमान की निगरानी करने और नमूने को ठंडा करने से बचने के लिए सावधानी बरतनी चाहिए। - 2 मिनट के बाद, ठंडा 2-मिथाइल ब्यूटेन से माइक्रोबबल्स को हटा दें, धीरे से माइक्रोबबल्स को मिलाने के लिए शीशी को हिलाएं और एक्सट्रूडर में समाधान को स्थानांतरित करने के लिए एक ठंडी 10 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करें।
- Extruder कक्ष ढक्कन निकालें और धीरे-धीरे सिरिंज पर प्लंजर धक्का देकर कक्ष के लिए microbubble समाधान जोड़ें। Extruder टोपी को बदलें यह सुनिश्चित करने के लिए कि यह सुरक्षित रूप से वापस जगह में क्लिक करता है।
- सत्यापित करें कि दबाव नियंत्रण वाल्व और extruder के रिलीज वाल्व बंद स्थिति में हैं।
- नाइट्रोजन गैस टैंक को तब तक खोलें जब तक कि दबाव गेज 250 साई नहीं पढ़ता है, गैस टैंक को बंद कर देता है, और दबाव नियंत्रण वाल्व को खुली स्थिति में बदल देता है।
- जब समाधान ने निकास टयूबिंग पर सिंटिलेशन शीशी को भर दिया है, और केवल गैस ट्यूब से बाहर निकल रही है, तो धीरे-धीरे दबाव रिलीज वाल्व खोलें और दबाव को 0 साई तक गिरने की अनुमति दें।
- भंडारण के लिए एक बर्फ स्नान या फ्रिज में scintillation शीशी रखें।
- लंबे समय तक भंडारण और सहज वाष्पीकरण को कम करने के लिए, नमूने को एक मानक फ्रीजर में संग्रहीत करें। सुनिश्चित करें कि नमूना को ठंडा करने से बचने के लिए तापमान -20 डिग्री सेल्सियस या उससे अधिक है (20% पीपीजी और 20% ग्लिसरॉल का एक्सिपिएंट समाधान नमूने को अधिकांश प्रयोगशाला फ्रीजर में ठंड से बचाएगा)।
6. centrifugation द्वारा liposomes से बूंदों को अलग
- एक 15 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के लिए extruded बूंद समाधान के 10 mL स्थानांतरण.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1,500 x g पर extruded नमूने centrifuge. DFB nanodroplets से मिलकर एक गोली ट्यूब के नीचे स्पष्ट हो जाएगा (चित्रा 4). अनायास वाष्पीकृत बूंदें समाधान के शीर्ष पर दिखाई देंगी और उन्हें छोड़ दिया जाना चाहिए।
चित्रा 4: चरण-शिफ्ट DFB बूंदों का उदाहरण centrifugation के बाद छर्रे. DFB nanodroplets liposomes की तुलना में अधिक घने हैं और एक गोली, (लाल बॉक्स) में सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के तल पर इकट्ठा होगा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
- supernatant निकालें और 20% ग्लिसरॉल और 20% प्रोपलीन ग्लाइकोल के साथ 1x PBS के 2 mL में गोली resuspend।
- एक सजातीय समाधान प्राप्त करने के लिए ट्यूब को धीरे से मिलाएं और बूंदों को एक छोटे 2 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- 2 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में दो और बार नमूना धोएं।
- अंतिम धोने के बाद, 20% ग्लिसरॉल और 20% प्रोपलीन ग्लाइकोल के साथ 1x PBS के 100 μL में गोली को फिर से निलंबित करें और आवश्यकता होने तक बर्फ पर या फ्रीजर में स्टोर करें।
7. बूंद वाष्पीकरण की माइक्रोस्कोपी सत्यापन
- 1x PBS के 7.5 μl करने के लिए केंद्रित बूंदों के 2.5 μl जोड़कर एक पतला बूंद समाधान बनाओ।
- पतला नमूना के 10 μl के साथ एक माइक्रोस्कोप स्लाइड तैयार करें। एक 40x उद्देश्य का उपयोग करके, नमूना का निरीक्षण करें और छवियों को सहेजें।
- माइक्रोस्कोप से स्लाइड को हटा दें और माइक्रोबबल्स में नैनोड्रॉपलेट्स को वाष्पित करने के लिए इसे 1 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस गर्मी प्लेट पर रखें।
- बूंद वाष्पीकरण को सत्यापित करने के लिए हीटिंग के बाद नमूने का निरीक्षण करने के लिए एक ही 40x उद्देश्य का उपयोग करें।
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Representative Results
आकार वितरण के प्रतिनिधि परिणामों को गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन (डीएलएस) और ट्यूनेबल प्रतिरोधी पल्स सेंसिंग (टीआरएसपी) विश्लेषण का उपयोग करके शामिल किया गया है। चित्रा 5 के साथ और बाहर निकालना के बिना संघनित बुलबुला समाधान के आकार वितरण से पता चलता है. एक्सट्रूज़न के बिना, प्रोटोकॉल चरण 5.3 पर समाप्त होता है। ठंडा बुलबुले ठंडे होने के दौरान वायुमंडलीय दबाव के लिए नमूने को वेंटेड करके संघनित होते हैं। संघनित केवल नमूने में 400 एनएम के पास केंद्रित एक बहुत व्यापक वितरण होता है। बहिष्कृत नमूने में 200 एनएम पर केंद्रित एक संकीर्ण वितरण है। दोनों नमूनों में लिपोसोम और ड्रॉपलेट्स दोनों शामिल हैं, जो डीएलएस का उपयोग करके समझदार नहीं हैं। चित्रा 6 चरण-शिफ्ट बूंदों का एक प्रतिनिधि नमूना दिखाता है जब उन्हें अतिरिक्त लिपोसोम (चरण 6.7) को हटाने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा धोया गया है। टीआरपीएस का उपयोग इस विश्लेषण के लिए अकेले बूंदों के आकार वितरण और एकाग्रता दोनों का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। डीएलएस के समान, टीआरपीएस 200 एनएम के पास बूंद आकार दिखाता है। सांद्रता 1011-1012 बूंदों प्रति एमएल के बीच होती है, जो 1 एमएल में अंतिम बूंद समाधान के सभी 100 μL को फिर से निलंबित करने के बाद होती है। टीआरपीएस डेटा प्रति नमूना तीन मापों का औसत है।
चित्रा 7 गर्म होने पर नैनोड्रॉपलेट वाष्पीकरण के प्रतिनिधि माइक्रोस्कोपी डेटा को दर्शाता है। चित्रा 7A (वाष्पीकरण से पहले) में, कुछ माइक्रोबबल्स दृश्य (सफेद तीर) के क्षेत्र में स्पष्ट हैं। यह सुपरहीटेड नैनोड्रॉपलेट्स के सहज वाष्पीकरण के कारण होता है क्योंकि माइक्रोस्कोप स्लाइड तैयार किए जाते हैं और कमरे के तापमान पर चित्रित किए जाते हैं। हीटिंग के बाद, बड़े माइक्रोबबल्स देखे जाते हैं (चित्रा 7 बी)। यहां डेटा वाष्पीकरण के तुरंत बाद बुलबुले पर कब्जा नहीं करता है। यह संभावना है कि बुलबुले का सम्मिलन वाष्पीकरण के बाद होता है इससे पहले कि उन्हें फिर से चित्रित किया जा सके। यह रणनीति टीआरपीएस के आकार या विवो में उपयोग से पहले नैनोड्रॉपलेट्स की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए उपयोगी है।
संक्षेपण से पहले बुलबुले को ठंडा करना ड्रॉपलेट उपज को अधिकतम करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। चित्रा 8 वाष्पीकरण के बाद बूंदों की प्रतिनिधि छवियों को दिखाता है जब कोई शीतलन नहीं किया जाता है (चित्रा 8 ए), एक्सट्रूडर को 0 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा किया जाता है, लेकिन माइक्रोबबल्स को -18 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 8 बी) तक ठंडा नहीं किया जाता है, और जब प्रोटोकॉल का ठीक से पालन किया जाता है (चित्रा 8 सी)।
इस प्रोटोकॉल को भी लागू किया गया था, जैसा कि लिखा गया है, कम-क्वथनांक ओएफपी बुलबुले को संघनित करने के लिए। चित्रा 9 गर्मी से वाष्पीकरण से पहले और बाद में ओएफपी बूंदों की प्रतिनिधि छवियों को दर्शाता है। DFB बूंदों के साथ के रूप में, हीटिंग के बाद सम्मिलन की एक महत्वपूर्ण राशि की संभावना है। इस प्रकार, बुलबुला आकार वाष्पीकरण पर प्रारंभिक बूंदों या बुलबुले के प्रतिनिधि होने की संभावना नहीं है। पैलेटिंग और माइक्रोस्कोपी फेज-शिफ्ट ओएफपी बूंदों की उपस्थिति और गतिविधि की पुष्टि करते हैं।
चित्रा 5: गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन डेटा ड्रॉपलेट निलंबन की तुलना (ठोस रेखा) के साथ और बिना (धराशायी रेखा) बाहर निकालना। नमूनों को एक डीएलएस प्रकाश प्रकीर्णन प्रणाली का उपयोग करके संघनित और बाहर निकालने के तुरंत बाद मापा गया था। यहां दिखाया गया डेटा प्रति नमूना तीन मापों का औसत है। विश्लेषण धोने से पहले किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 6: आकार का आकार वितरण- TRPS विश्लेषण से फ़िल्टर डेकैफ्लोरोब्यूटेन बूंदों फ़िल्टर किया गया। डेटा एक ही नमूने पर तीन मापों के औसत से है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र7: वाष्पीकरण से पहले और बाद में फेज-शिफ्ट डेकाफ्लोरोब्यूटेन बूंदों की उदाहरण माइक्रोस्कोपी छवियां। (A) वाष्पीकरण से पहले कुछ बुलबुले देखे जा सकते हैं, संभवतः बुलबुले में कम-क्वथनांक DFB बूंदों के सहज वाष्पीकरण के कारण (कमरे के तापमान पर की गई माइक्रोस्कोपी)। (बी) हीटिंग के बाद माइक्रोबबल्स में एक महत्वपूर्ण वृद्धि देखी जाती है। स्केल बार 10 μm हैं। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र8: अलग-अलग तापमान पर संघनित फेज-शिफ्ट बूंदों के वाष्पीकरण के बाद उदाहरण माइक्रोस्कोपी छवियां। (A) माइक्रोबबल्स को पहले से ठंडा किए बिना सीधे एक्सट्रूडर में डाला जाता है। (B) एक्सट्रूडर को बर्फ के स्नान में 0 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा किया जाता है और माइक्रोबबल्स को कक्ष में डाला जाता है और 2 मिनट के लिए संतुलित करने की अनुमति दी जाती है। (C) एक्सट्रूडर को बर्फ के स्नान में 0 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा किया जाता है और एक्सट्रूडर में रखे जाने से पहले माइक्रोबबल्स को 2 मिनट के लिए -18 डिग्री सेल्सियस तक पूर्व-ठंडा किया जाता है। प्री-कूल्ड माइक्रोबबल्स में आमतौर पर छोटे आकार और बूंदों की उच्च उपज होगी। स्केल बार 10 μm हैं। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 9: उदाहरण माइक्रोस्कोपी छवियों चरण शिफ्ट ऑक्टोफ्लोरोप्रोपेन बूंदों से पहले और वाष्पीकरण के बाद। स्केल बार 10 μm हैं। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
साहित्य का एक व्यापक शरीर उपलब्ध है जो विवो इमेजिंग और थेरेपी में माइक्रोबबल्स और फेज-शिफ्ट बूंदों के निर्माण, भौतिकी और संभावित अनुप्रयोगों पर चर्चा करता है। यह चर्चा स्पष्ट रूप से लिपिड माइक्रोबबल्स उत्पन्न करने और उन्हें कम क्वथनांक डीएफबी गैस और उच्च दबाव एक्सट्रूज़न का उपयोग करके उप-माइक्रोन फेज-शिफ्ट बूंदों में परिवर्तित करने से संबंधित है। यहां उल्लिखित विधि एक ही चरण में ड्रॉपलेट एक्सट्रूज़न के साथ पिछले माइक्रोबबल संघनन विधियों के संयोजन से लिपिड माइक्रोबबल्स और डीएफबी फेज-शिफ्ट बूंदों की बड़ी मात्रा में उत्पादन करने की अपेक्षाकृत सरल विधि प्रदान करने के लिए है। इस विधि में फिल्टर चयन के आधार पर संकीर्ण आकार वितरण के साथ DFB बूंदों को बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले बुलबुले की उच्च सांद्रता उत्पन्न करने का लाभ है। परिणामस्वरूप सुसंगत नमूना वाष्पीकरण थ्रेसहोल्ड के कारण संकीर्ण आकार वितरण महत्वपूर्ण है। यह विधि एक संकीर्ण आकार वितरण उत्पन्न करने के लिए उपयोग की जाने वाली अन्य सामान्य विधियों की तुलना में सरल और कम महंगी है। इसके अलावा, समाधान की संभावित मात्रा अन्य तुलनीय विधियों की तुलना में अधिक है। प्रोटोकॉल को तीन प्रमुख श्रेणियों में विभाजित किया जा सकता है: (1) लिपिड माइक्रोबबल्स उत्पन्न करना, (2) माइक्रोबबल्स को संघनित करना और बाहर निकालना, (3) सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा लिपोसोम से फेज-शिफ्ट बूंदों को अलग करना।
जांच टिप sonication का उपयोग Microbubble पीढ़ी लिपिड microbubbles बनाने के अधिक आम तरीकों में से एक है. ऐसे कई प्रकाशन हैं जो इस प्रक्रिया का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल Feshitan et al.11 से अनुकूलित है और माइक्रोबबल समाधान है, जो बेंच-टॉप extruder की अधिकतम क्षमता है के 10 mL बनाने के लिए अनुकूलित किया गया है। इस विधि को माइक्रोटिप अनुलग्नक को हटाकर और लिपिड समाधान की मात्रा को 100 मिलीलीटर या उससे अधिक तक बढ़ाकर लिपिड माइक्रोबबल्स समाधान की बड़ी मात्रा उत्पन्न करने के लिए भी बढ़ाया जा सकता है, जैसा कि फेशिटन एट अल 11 द्वारा प्रदर्शित किया गया है। इसी तरह, बड़े वाणिज्यिक पैमाने पर एक्सट्रूडर जो 100 मिलीलीटर से 800 मिलीलीटर तक की मात्रा को समायोजित करते हैं, का उपयोग बढ़ी हुई माइक्रोबबल मात्रा को समायोजित करने के लिए किया जा सकता है, इस प्रकार ड्रॉपलेट उत्पादन को अधिकतम किया जा सकता है। विधि के परिणाम केवल उपयोग किए जाने वाले उपकरणों द्वारा सीमित होते हैं, जिन्हें तदनुसार मात्रा बढ़ाने के लिए संशोधित किया जा सकता है। आकार-फ़िल्टर्ड ड्रॉपलेट उत्पादन अधिक समान वाष्पीकरण थ्रेसहोल्ड के कारण विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए फायदेमंद है। प्रोटोकॉल में भविष्य के संशोधनों को विशिष्ट आवश्यकताओं के लिए परिणामों को व्यक्तिगत बनाने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि एंटीबॉडी लोडिंग और आणविक लक्ष्यीकरण के लिए माइक्रोबबल और ड्रॉपलेट गोले को कार्यात्मक बनाना।
यहाँ उपयोग की जाने वाली बाहर निकालना की विधि आमतौर पर monodispersed liposome तैयारी के लिए उपयोग किया जाता है। इसी तरह की विधि का उपयोग अतीत में उच्च क्वथनांक DDFP बूंदों का उपयोग करके चरण-शिफ्ट बूंदों को उत्पन्न करने के लिए भी किया गया है। इस वर्णित पद्धति में कुछ महत्वपूर्ण अंतर हैं, अर्थात् (1) कम-क्वथनांक गैसों (डीएफबी) के साथ पूर्वनिर्मित माइक्रोबबल्स उत्पन्न करना, (2) बुलबुला समाधान और एक्सट्रूडर सिस्टम को कुशलतापूर्वक बूंदों को बनाने के लिए ठंडा करना और (3) बूंद संघनन दक्षता को अधिकतम करने और बुलबुला गैस विघटन से बचने के लिए दबाव का तेजी से आवेदन।
बाहर निकालना के लिए microbubble नमूना ठंडा स्थिर DFB बूंदों की उच्च सांद्रता उत्पन्न करने में एक महत्वपूर्ण कदम है. इस प्रोटोकॉल में, पूरे एक्सट्रूडर को बर्फ स्नान वाले नमक में रखा जाता है और -2 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाता है। Extruder में अधिक कुशल और तेजी से ठंडा करने के लिए तरल पदार्थ को परिचालित करने के लिए इनलेट और आउटलेट पोर्ट होते हैं, जिससे एक परिसंचारी पंप की आवश्यकता होती है। DFB बूंद उत्पादन के लिए, बूंदों की उच्च सांद्रता (1011-1012 बूंदों / एमएल) को परिसंचारी जल प्रणाली के बिना उत्पन्न किया जा सकता है। हालांकि, यह उम्मीद की जाती है कि एक ठंडा परिसंचारी स्नान को शामिल करके बूंद उत्पादन दक्षता में और भी सुधार किया जा सकता है, जिससे ठंडा करने के लिए प्रतीक्षा समय कम हो जाता है। इस सटीक प्रोटोकॉल का उपयोग ओएफपी माइक्रोबबल्स के लिए भी किया गया है। दिलचस्प बात यह है कि माइक्रोस्कोपी (चित्रा 9) का उपयोग करके देखे जाने पर ओएफपी बुलबुले अधिक संख्या में और छोटे दिखाई देते हैं, हालांकि छर्रे को धोने और इकट्ठा करने के बाद बूंदों की उपज काफी कम होती है। Extruder को और भी ठंडा करना और नाइट्रोजन टैंक से दबाव बढ़ाने से ओएफपी ड्रॉपलेट उत्पादन में सुधार होगा। ओएफपी बूंदें भी कुख्यात रूप से अस्थिर होती हैं और सहज वाष्पीकरण को कम करने के लिए कोमल हैंडलिंग और उचित भंडारण स्थितियों की आवश्यकता होती है।
दबाव का तेजी से अनुप्रयोग इस प्रक्रिया में एक और महत्वपूर्ण कदम है। इस प्रोटोकॉल में बाहर निकालना का उपयोग दबाव के निर्माण और एक्सट्रूडर कक्ष में माइक्रोबबल्स के लिए उस दबाव के तत्काल आवेदन पर निर्भर करता है। मानक लिपिड एक्सट्रूज़न प्रोटोकॉल में, दबाव धीरे-धीरे बढ़ जाता है जब तक कि नमूना झिल्ली फिल्टर से गुजरना शुरू नहीं करता है। प्रयोगात्मक टिप्पणियों ने संकेत दिया कि दबाव के धीमे आवेदन से बुलबुले के बूंदों में संघनन के बजाय, बुलबुला कोर से गैस विघटन हो सकता है। इसलिए, गैस इनलेट वाल्व को बंद करके और टैंक के दबाव को 250 साई पर सेट करके नाइट्रोजन गैस के साथ एक्सट्रूडर इनलेट ट्यूबों को "प्राइम" करने का निर्णय लिया गया था। टैंक को तब इनलेट वाल्व को एक्सट्रूडर में खोलने से पहले बंद कर दिया जाना चाहिए। प्रक्रिया के इस हिस्से का पालन करने में विफलता के परिणामस्वरूप तेजी से निष्कासन और एक्सट्रूडर के आउटलेट से नमूने का नुकसान होगा। 250 साई से अधिक दबाव भी नमूने के तेजी से निष्कासन के कारण नमूना हानि का कारण बन सकता है, भले ही टैंक ठीक से बंद हो गया हो। जब prepping, चरणों को पूरा करने, या किसी भी तरह से extruder का उपयोग कर, दबाव गेज और वाल्व की जांच करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। यदि दबाव शून्य पर नहीं गिरता है या समाधान अपेक्षा के अनुसार एक्सट्रूडर से बाहर नहीं निकलता है, तो पहले जांचें कि सभी वाल्व उचित स्थिति में हैं; दबाव रिलीज वाल्व हमेशा कक्ष सामग्री को प्रभावित किए बिना दबाव जारी करने के लिए खोला जा सकता है। गैस से बचने के लिए सुनना और दबाव गेज को देखना भी महत्वपूर्ण है जब दबाव को एक्सट्रूडर पर लागू किया जाता है। आम तौर पर अगर दबाव लागू किया जाता है तो या तो बाहर निकलने वाली टयूबिंग से समाधान बाहर आने लगेगा या फिर सिस्टम में रिसाव होने लगेगा। हमेशा यह सुनिश्चित करने के लिए सिस्टम को प्राइम करना सुनिश्चित करें कि एक्सट्रूडर को कक्ष में माइक्रोबबल समाधान जोड़ने से पहले सही ढंग से इकट्ठा किया गया है। समय के साथ ओ-रिंग्स नीचे पहन सकते हैं और सिस्टम को सही ढंग से सील करने से रोक सकते हैं। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, सुनिश्चित करें कि सभी भाग ठीक से काम करते हैं और एक तंग सील बनाई जाती है। यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल में, केवल एक ही एक्सट्रूज़न किया गया था। ड्रॉपलेट नमूने को एक्सट्रूडर में फिर से पेश करके और एकाधिक एक्सट्रूज़न चरणों (आमतौर पर 5 और 10 के बीच) का प्रदर्शन करके आकार-वितरण को और संकीर्ण करना संभव है। एकाधिक बाहर निकालना संभवतः बूंदों की कुल उपज को कम कर देगा। डीएलएस और टीआरएसपी से आकार वितरण को देखते हुए, अधिकांश अनुप्रयोगों के लिए एक एकल एक्सट्रूज़न की संभावना पर्याप्त है। अंत में, इस प्रोटोकॉल को 200 एनएम फिल्टर के लिए अनुकूलित किया गया है। दबाव ों को संभवतः बड़े या छोटे फ़िल्टर आकारों के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी।
नमूना सफलतापूर्वक बाहर निकाला गया है के बाद, यह जांचने के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए कि क्या बुलबुले ठीक से बूंदों में संघनित थे। सबमाइक्रोन बूंदें मानक प्रकाश इमेजिंग तकनीकों का उपयोग करके दिखाई नहीं देती हैं, इसलिए उन्हें पहले अधिक दृश्यमान बनने के लिए वाष्पीकृत किया जाना चाहिए6। माइक्रोबबल्स की अनुपस्थिति को सत्यापित करने या बूंदों को गर्म करने से पहले सहज वाष्पीकरण के स्तर को निर्धारित करने के लिए वाष्पीकरण से पहले नमूने की छवि बनाना अभी भी महत्वपूर्ण है। इमेजिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग अप्रत्यक्ष रूप से नैनोड्रॉपलेट्स पर डेटा प्रदान करने के लिए छवि में माइक्रोबबल्स की गिनती और आकार देने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि वाष्पीकरण के बाद, बुलबुले वार्मिंग के दौरान तेजी से इकट्ठा होंगे। इस प्रकार, बुलबुला आकार और माइक्रोस्कोपी विश्लेषण से गिनती संभवतः प्रारंभिक बूंद आकार और सांद्रता को प्रतिबिंबित नहीं करती है। बूंद वितरण और एकाग्रता के प्रत्यक्ष माप सबसे अच्छा tunable प्रतिरोधी नाड़ी संवेदन (TRPS) का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे हैं यदि उपलब्ध है. TRSP से प्रतिनिधि ड्रॉपलेट वितरण डेटा प्रदान किया गया है (चित्रा 6)।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
हम डॉ केन होयट की प्रयोगशाला में डोमिनिक जेम्स को वाष्पीकरणीय चरण-शिफ्ट नैनोड्रोप्लेट्स के टीआरएसपी विश्लेषण प्रदान करने के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Falcon | 352095 | Collecting and centrifuging droplets |
| 200 nm polycarbonate filter | Whatman | 110606 | Extruder filters |
| 2-methylbutane | Fisher Chemical | 03551-4 | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion |
| 3-prong clamps X2 | Fisher | 02-217-002 | Holding scintilation vials in place for probe tip sonication |
| 400W Analog Probe Tip Sonicator with Horn | Branson | 101-063-198R | Used to generate lipid microbubbles from lipid solution |
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | 15337402 | Used to help breakdown liposomes into unilamellar vesicles |
| Chloroform | Fisher Bioreagents | C298-4 | Used to make lipid film for microbubble preperation |
| Decafluorobutane (Perfluorobutane) Gas | FluoroMed L.P. | 1 kg | generating microbubbles via probe tip sonication |
| Dry Ice | - | - | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion |
| DSPC Lipid Powder | NOF America | COATSOME MC-8080 | Component of lipid film |
| DSPE-PEG-2K Lipid Powder | NOF America | SUNBRIGHT DSPE-020CN | Component of lipid film |
| General Thermometer | - | - | Used to measure ice bath temperature and 2-methylbutane temperature ( needs to accommodate -20C temperatures) |
| Glass Syringes | Hamilton | 81139 | Used to mix lipids in chloroform |
| Glycerol | Fisher Bioreagents | BP229-1 | Reduces freezing temperature of PBS solution |
| Heating Block | VWR Scientific Products | Heating lipid films and vaporizing droplets | |
| Lipex 10 mL Extruder | Evonik | Commercial high-pressure extrusion system | |
| Mini Vortex Mixer | Fisher brand | 14-955-151 | Used to remove excess chloroform from lipid films |
| Nitrogen Tank | - | - | Used to operate extruder |
| Phosphate Buffer Saline | Fisher Scientific | Hydrate lipid films and washing droplets | |
| Polyester Drain Disk | Whatman | 230600 | Provides support for polycarbonate filter |
| Polypropylene Caps | Fisher Scientific | 298417 | Used for solution storage |
| Propylene Glycol | Fisher Chemical | P355-1 | Reduces freezing temperature of PBS solution |
| Scintiliation Vials | DWK Life Sciences Wheaton | 986532 | Used for lipid films and microbubble generation |
| Small hammer | - | - | Used to break apart dry ice for cooling methylbutane |
| Sonicator Microtip Attachment | Branson | 101148070 | Used to generate microbubbles from lipid solution |
| Steel Container | Medegen | 79310 | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion ( any container rated to -20C will work) |
| Vacuume Dessicator | Bel-Art SP Scienceware | 08-648-100 | Removes excess chloroform from lipid films |
| 2mL Centrifuge Tube | Fisher | 02682004 | Used for concentrating nanodroplets |
References
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