Denne protokollen beskriver en metode for å generere store mengder lipid innkapslede decafluorobutane mikrobubbles ved hjelp av sondespiss sonikering og deretter kondensere dem til fase-skift nanodroplets ved hjelp av høytrykk ekstrudering og mekanisk filtrering.
Det er mange metoder som kan brukes til produksjon av fordampende faseskiftdråper for avbildning og terapi. Hver metode bruker forskjellige teknikker og varierer i pris, materialer og formål. Mange av disse fabrikasjonsmetodene resulterer i polydisperse populasjoner med ikke-ensartede aktiveringsterskler. I tillegg krever kontroll av dråpestørrelsene vanligvis stabile perfluorkarbonvæsker med høye aktiveringsterskler som ikke er praktiske in vivo. Å produsere ensartede dråpestørrelser ved hjelp av lavkokende punktgasser vil være gunstig for in vivo-avbildnings- og terapieksperimenter. Denne artikkelen beskriver en enkel og økonomisk metode for dannelsen av størrelsesfiltrerte lipidstabiliserte faseskift nanodråper med lavkokende punkt decafluorobutane (DFB). En vanlig metode for å generere lipidmikrobobler er beskrevet, i tillegg til en ny metode for å kondensere dem med høytrykksekstrudering i et enkelt trinn. Denne metoden er utformet for å spare tid, maksimere effektiviteten og generere større mengder mikrobubble- og nanodropletløsninger for et bredt spekter av applikasjoner ved hjelp av vanlig laboratorieutstyr som finnes i mange biologiske laboratorier.
Ultralydkontrastmidler (UCAer) vokser raskt i popularitet for avbildnings- og terapiapplikasjoner. Mikrobobler, de opprinnelige UCAene, er for tiden de vanlige agentene som brukes i kliniske diagnostiske applikasjoner. Mikrobobler er gassfylte sfærer, vanligvis 1-10 μm i diameter, omgitt av lipid-, protein- eller polymerskall1. Imidlertid kan deres størrelse og in vivo-stabilitet begrense funksjonaliteten i mange applikasjoner. Faseskift nanodråper, som inneholder en overopphetet væskekjerne, kan overvinne noen av disse begrensningene på grunn av deres mindre størrelse og forbedret sirkulasjonslevetid2. Når den utsettes for varme eller akustisk energi, fordampes den overopphetde væskekjernen for å danne en gassmikrobubble2,3,4,5. Siden fordampningsterskelen er direkte relatert til dråpestørrelse5,6, vil det være svært ønskelig å formulere dråpesuspensjoner med jevn størrelse for å oppnå konsistente aktiveringsterskler. Formuleringsmetoder som produserer ensartede dråpestørrelser er ofte komplekse og kostbare, mens mer kostnadseffektive tilnærminger resulterer i polydisperse løsninger7. En annen begrensning er evnen til å generere stabile faseskiftdråper med lavkokende perfluorkarbongasser (PFC), noe som er avgjørende for effektiv aktivering i vivo8. I dette manuskriptet er det beskrevet en protokoll for å generere stabile filtrerte lavkokende punkter som fordamper faseskiftdråper for in vivo-avbildning og terapiapplikasjoner.
Det er mange metoder for å produsere monodispersed submikron fase-skift dråper7. En av de mest robuste metodene for å kontrollere størrelsen er bruk av mikrofluidiske enheter. Disse enhetene kan være kostbare, ha langsomme priser på dråpeproduksjon (~ 104-106 dråper / s) 7, og krever omfattende opplæring. Mikrofluidiske enheter krever også generelt høykokende punktgasser for å unngå spontan fordampning og tilstopping av systemet7. En nylig studie av de Gracia Lux et al.9 viser imidlertid hvordan kjøling av en mikrofluidisator kan brukes til å generere høye konsentrasjoner av submikronfaseskift (1010-1012/ml) ved hjelp av lavkokende punkt decafluorobutane (DFB) eller octafluoropropane (OFP).
Generelt er lavkokende punktgasser som DFB eller OFP lettere å håndtere ved hjelp av forhåndsformede gassbobler. Vaporizable dråper kan produseres fra forløper lipidstabiliserte bobler ved å kondensere gassen ved hjelp av lave temperaturer og forhøyet trykk5,10. Konsentrasjonen av dråper produsert ved hjelp av denne metoden avhenger av forløper mikrobubble konsentrasjon og effektivitet av konvertering av bobler til dråper. Konsentrerte mikrobobler er rapportert fra spiss sonikering nærmer seg > 1010 MB / ml11, mens en egen studie har rapportert dråpekonsentrasjoner fra ~ 1-3 x1011 dråper / ml fra kondensert OFP og DFP bobler12. Når monodisperserte dråper ikke er en bekymring, er kondensmetoder de mest enkle og rimeligste metodene for å generere lipidstabiliserte faseskiftdråper ved hjelp av lavkokende punkt PFCer. Metoder for å generere bobler i jevn størrelse før kondens kan bidra til å skape mer monodisperse populasjoner av dråper. Det er imidlertid også vanskelig å generere monodisperse forløperbobler, noe som krever dyrere tilnærminger som mikrofluidikk eller gjentatte differensialsentrifugeringsteknikker11. En alternativ tilnærming til produksjon av DFB og OFB nanodråper har nylig blitt publisert ved hjelp av spontan kjernedannelse av dråper i liposomer13. Denne metoden, ved hjelp av en “Ouzo” -effekt, er en enkel måte å generere lavkokende PFC-dråper uten å måtte kondensere bobler. Størrelsesfordelingen av PFC-dråpene kan styres av delikat titrering og blanding av PFC-, lipid- og etanolkomponenter som brukes til å starte kjernedannelse av dråpene. Det er også verdt å merke seg at blanding av perfluorkarboner kan brukes til å kontrollere stabilitets- og aktiveringsterskler av nanodråper14,15. Nyere arbeid av Shakya et al. demonstrerer hvordan nanodropletaktivering kan stilles inn ved å emulgere høykokende PFCer i et hydrokarbon endoskeleton for å lette heterogen kjernedannelse i dråpekjernen16, som er en tilnærming som kan vurderes sammen med andre former for dråpestørrelsesfiltrering.
Når de er dannet, kan faseskiftdråper ekstruderes etter dannelse for å skape flere monodispersiske populasjoner. Faktisk har en lignende protokoll til metoden beskrevet her blitt publisert tidligere av Kopechek et al.17 ved hjelp av høy kokepunkt dodecofluorpentane (DDFP) som dråpekjerne. Lesere som ønsker å bruke faseskiftdråper med høykokende punktperfluorkarboner (stabile ved romtemperatur) bør referere artikkelen ovenfor i stedet. Generering og ekstrudering av dråper med lave kokepunktgasser, som DFB og OFP, er mer komplisert og nærmer seg best ved å kondensere preformerte gassbobler.
I denne protokollen beskrives en vanlig metode for å generere forhåndsformede lipidmikrobobler med en DFB-gasskjerne ved hjelp av sondespiss sonikering. Deretter brukes en kommersiell ekstruder til å kondensere forhåndsformede mikrobobler til submikronfase-skift nanodråper (figur 1). De resulterende dråpene er da aktivatable av varme og ultralyd. Denne metoden kan produsere større mengder nanodropletløsning enn konvensjonelle kondensmetoder med smalere størrelsesfordelinger uten behov for dyre mikrofluidiske enheter. Produksjon av nanodropletløsninger med smale størrelsesfordelinger kan sannsynligvis generere mer ensartede fordampningsterskler. Dette vil maksimere potensialet for mange applikasjoner som avbildning, ablasjon, legemiddellevering og embolisering1,3,4,6.
Figur 1: Skjematisk for ekstruderingsoppsett med høyt trykk for kondensering av forhåndsformede mikrobobler i nanodråper med faseskift. Mikrobubble-løsningen legges til og finnes i ekstruderkammeret, og 250 psi, fra nitrogentanken, påføres gjennom kammerinntaksventilen. Nitrogengassen vil skyve mikrobubble-løsningen gjennom filteret ved bunnen av kammeret, og kondensere prøven til nanodråper. Løsningen skyves til slutt ut av ekstruderen gjennom prøveuttaksrøret og samles inn. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
En omfattende litteratur er tilgjengelig som diskuterer formulering, fysikk og potensielle anvendelser av mikrobobler og faseskiftdråper for in vivo-avbildning og terapi. Denne diskusjonen gjelder eksplisitt å generere lipidmikrobobler og konvertere dem til submikronfase-skiftdråper ved hjelp av et lavt kokepunkt DFB gass og høytrykksekstrudering. Metoden som er skissert her er ment å gi en relativt enkel metode for å produsere store mengder lipidmikrobobler og DFB faseskiftdråper ved å kombinere tidligere mikrob…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil takke Dominique James i Dr. Ken Hoyts laboratorium for å gi TRSP-analyse av fordampende faseskift nanodråper
15 mL Centrifuge Tubes | Falcon | 352095 | Collecting and centrifuging droplets |
200 nm polycarbonate filter | Whatman | 110606 | Extruder filters |
2-methylbutane | Fisher Chemical | 03551-4 | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion |
3-prong clamps X2 | Fisher | 02-217-002 | Holding scintilation vials in place for probe tip sonication |
400W Analog Probe Tip Sonicator with Horn | Branson | 101-063-198R | Used to generate lipid microbubbles from lipid solution |
Bath Sonicator | Fisher Scientific | 15337402 | Used to help breakdown liposomes into unilamellar vesicles |
Chloroform | Fisher Bioreagents | C298-4 | Used to make lipid film for microbubble preperation |
Decafluorobutane (Perfluorobutane) Gas | FluoroMed L.P. | 1 kg | generating microbubbles via probe tip sonication |
Dry Ice | – | – | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion |
DSPC Lipid Powder | NOF America | COATSOME MC-8080 | Component of lipid film |
DSPE-PEG-2K Lipid Powder | NOF America | SUNBRIGHT DSPE-020CN | Component of lipid film |
General Thermometer | – | – | Used to measure ice bath temperature and 2-methylbutane temperature ( needs to accommodate -20C temperatures) |
Glass Syringes | Hamilton | 81139 | Used to mix lipids in chloroform |
Glycerol | Fisher Bioreagents | BP229-1 | Reduces freezing temperature of PBS solution |
Heating Block | VWR Scientific Products | Heating lipid films and vaporizing droplets | |
Lipex 10 mL Extruder | Evonik | Commercial high-pressure extrusion system | |
Mini Vortex Mixer | Fisher brand | 14-955-151 | Used to remove excess chloroform from lipid films |
Nitrogen Tank | – | – | Used to operate extruder |
Phosphate Buffer Saline | Fisher Scientific | Hydrate lipid films and washing droplets | |
Polyester Drain Disk | Whatman | 230600 | Provides support for polycarbonate filter |
Polypropylene Caps | Fisher Scientific | 298417 | Used for solution storage |
Propylene Glycol | Fisher Chemical | P355-1 | Reduces freezing temperature of PBS solution |
Scintiliation Vials | DWK Life Sciences Wheaton | 986532 | Used for lipid films and microbubble generation |
Small hammer | – | – | Used to break apart dry ice for cooling methylbutane |
Sonicator Microtip Attachment | Branson | 101148070 | Used to generate microbubbles from lipid solution |
Steel Container | Medegen | 79310 | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion ( any container rated to -20C will work) |
Vacuume Dessicator | Bel-Art SP Scienceware | 08-648-100 | Removes excess chloroform from lipid films |
2mL Centrifuge Tube | Fisher | 02682004 | Used for concentrating nanodroplets |