Summary
تقدم هذه الدراسة تطبيق شرائح أنسجة البنكرياس الحية لدراسة فسيولوجيا الجزيرة وتفاعلات الخلايا المناعية الجزيرية.
Abstract
شرائح أنسجة البنكرياس الحية تسمح لدراسة فسيولوجيا الجزيرة وظيفة في سياق محيط جزيرة صغيرة سليمة. يتم إعداد شرائح من أنسجة البنكرياس البشرية والفأرة الحية جزءا لا يتجزأ من agarose وقطع باستخدام هزاز. تسمح هذه الطريقة للأنسجة بالحفاظ على مقومات البقاء والوظيفة بالإضافة إلى الحفاظ على الأمراض الأساسية مثل النوع 1 (T1D) وداء السكري من النوع 2 (T2D). طريقة شريحة تمكن اتجاهات جديدة في دراسة البنكرياس من خلال الحفاظ على الهياكل المعقدة والتفاعلات بين الخلايا المختلفة التي تشكل الغدد الصماء والأنسجة الخارجية للبنكرياس. يوضح هذا البروتوكول كيفية إجراء تلطيخ ومجهر الفاصل الزمني للخلايا المناعية الذاتية الحية داخل شرائح البنكرياس جنبا إلى جنب مع تقييمات فسيولوجيا الجزيرة. علاوة على ذلك ، يمكن صقل هذا النهج لتمييز مجموعات الخلايا المناعية المحددة لمضادات خلايا الجزيرة باستخدام الكواشف المعقدة متعددة ال مرسلات الهستوباتية الرئيسية.
Introduction
مشاركة البنكرياس هو pathognomonic لأمراض مثل التهاب البنكرياس, T1D, و T2D1,2,3. دراسة وظيفة في الجزر المعزولة وعادة ما ينطوي على إزالة الجزر من البيئة المحيطة بها4. تم تطوير طريقة شريحة أنسجة البنكرياس الحية للسماح لدراسة أنسجة البنكرياس مع الحفاظ على البيئة الدقيقة للجزر سليمة وتجنب استخدام إجراءات عزل الجزر المجهدة5،6،7. وقد استخدمت بنجاح شرائح أنسجة البنكرياس من الأنسجة المانحة البشرية لدراسة T1D وأظهرت عمليات فقدان خلايا بيتا والخلل الوظيفي بالإضافة إلى تسلل الخلايا المناعية8,9,10,11,12,13. يمكن تطبيق طريقة شريحة أنسجة البنكرياس الحية على كل من أنسجة البنكرياس الماوس والإنسان5,6,8. يتم الحصول على شرائح أنسجة البنكرياس البشرية من الأنسجة المانحة للأعضاء من خلال التعاون مع شبكة المتبرعين بأعضاء البنكرياس المصابين بالسكري (nPOD). يمكن إنشاء شرائح الماوس من مجموعة متنوعة من سلالات الماوس المختلفة.
سيركز هذا البروتوكول على إعادة دمج السكري غير البدين لتفعيل الجينات-1-null (NOD. Rag1-/-) ومستقبلات الخلايا التائية المعدلة وراثيا (AI4) (NOD. Rag1-/-. AI4 α/β) سلالات الماوس. موافقه. راغ1/- الفئران غير قادرة على تطوير الخلايا T و B بسبب اضطراب في الجين تنشيط إعادة التركيب 1 (Rag1)14. موافقه. Rag1-/-. تستخدم الفئران AI4 α/β كنموذج لمرض السكري من النوع 1 المتسارع لأنها تنتج استنساخ خلية T واحدة تستهدف سطح الأنسولين ، مما يؤدي إلى تسلل جزيرة ثابتة وتطور سريع للأمراض15. يصف البروتوكول المعروض هنا إجراءات الدراسات الوظيفية والمناعية باستخدام شرائح البنكرياس البشرية والفأرة الحية من خلال تطبيق نهج المجهر الكونفوكوكال. وتشمل التقنيات الموصوفة هنا تقييمات الجدوى، وتحديد الجزيرة وموقعها، وتسجيلات Ca2+ السيتوسوليك، فضلا عن تلطيخ وتحديد مجموعات الخلايا المناعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظات: تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية باستخدام الفئران من قبل لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة فلوريدا (201808642). تم الحصول على أقسام البنكرياس البشري من المتبرعين بالأنسجة من كلا الجنسين عن طريق شبكة المتبرعين بأعضاء البنكرياس المصابين بالسكري (nPOD) بنك الأنسجة، جامعة فلوريدا. تم حصاد pancreata الإنسان من المتبرعين بالأعضاء الجثث من قبل منظمات شراء الأعضاء المعتمدة الشراكة مع nPOD وفقا لقوانين وأنظمة التبرع بالأعضاء وتصنيفها على أنها "مواضيع غير بشرية" من قبل مجلس المراجعة المؤسسية في جامعة فلوريدا (IRB No. 392-2008) ، مع التنازل عن الحاجة إلى الموافقة. تمت الموافقة على أنسجة nPOD المستخدمة خصيصا لهذا المشروع على أنها غير بشرية من قبل جامعة فلوريدا IRB (IRB20140093). أهداف الأقسام 1-3 من هذا البروتوكول هي شرح كيفية تشريح الماوس بنجاح، وإعداد ومعالجة البنكرياس، وتوليد شرائح أنسجة البنكرياس الحية. وينبغي إعداد الحلول في وقت مبكر، ويمكن العثور على وصفات في الجدول التكميلي 1. الوقت هو العامل الأكثر أهمية أثناء هذه الخطوات البروتوكول. بمجرد التضحية بالفأر، ستبدأ صلاحية الأنسجة في الانخفاض. يجب إكمال الأجزاء الثلاثة من هذا البروتوكول في أسرع وقت ممكن حتى يتم إنشاء كافة الشرائح الضرورية.
1. التحضير لتوليد شرائح البنكرياس الماوس
- المشبك شفرة على حامل شفرة هزاز، ولكن لا نعلق عليه هزاز حتى الآن.
- تذوب 100 مل من 1.25٪ ث / الخامس منخفضة نقطة انصهار agarose في الميكروويف. تشغيل الميكروويف في فترات 1 دقيقة، ووقف الميكروويف لمدة 10 ثانية إذا كان الحل agarose يبدأ في الغليان. كرر هذه العملية حتى يذوب الآغاروز، ويتم إنتاج حل متجانس. ضع الزجاجة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
ملاحظة: تركيز agarose منخفضة هو لحساب الكثافة المنخفضة للبنكرياس الماوس. - ملء 10 مل لوير قفل حقنة مع 3 مل من الآغروز الدافئ. تناسب إبرة 27 G 25 ملم على الحقنة. احتفظ بالحقنة مع الإبرة المرفقة المتوجة في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى يتم حقن المحلول.
ملاحظة: يفضل إبرة 27 G لأنها تناسبها بشكل آمن في القناة الصفراوية المشتركة للفئران بين 10-25 غرام في وزن الجسم ويسمح بتدفق محلول الآجاروز اللزج للغاية. في حين يمكن اختيار الإبر الكبيرة لاستخدامها ، لا يوصى بالإبر الأصغر (أكبر مقياس) لأنها قد تكون مسدودة بسهولة أكبر بمحلول الآجاروز. - أضف 20 مل من محلول خارج الخلية المبرد (ECS) إلى طبق بيتري 10 سم.
ملاحظة: لا يحتاج ECS إلى bubbled في أي نقطة. - ملء اثنين من 10 سم غير المعالجة أطباق بيتري مع 15 مل من كريبس-رينغر بيكربونات العازلة (KRBH) التي تحتوي على 3 MM D-الجلوكوز وفول الصويا تريبسين مثبط بتركيز 0.1 ملغم / مل لكل طبق.
ملاحظة: في جميع أنحاء هذا البروتوكول, من الضروري أن جميع الحلول المستخدمة للحفاظ على شرائح تحتوي على مثبطات فول الصويا تريبسين لمنع تلف الأنسجة الناجمة عن proteases الجهاز الهضمي البنكرياس.
2. استئصال البنكرياس الماوس ومعالجة الأنسجة
ملاحظة: يتم تعديل بروتوكول استئصال البنكرياس ومعالجة الأنسجة وتوليد شرائح من Marciniak et al5. لضمان صلاحية الأنسجة، قلل من الوقت بين إزالة البنكرياس وتوليد الشرائح. وينبغي إعداد جميع المعدات اللازمة مسبقا وتوجيهها بطريقة تسمح بالتقدم السريع من خلال الخطوات التالية. يتم إجراء القناة الصفراوية الحقن وكذلك استئصال البنكرياس أفضل تحت مجسمة.
- يتم تخدير الفأر بعمق مع isoflurane والتضحية بها عن طريق خلع عنق الرحم.
ملاحظة: Isoflurane هو أسلوب التخدير المفضل. تركيز 5٪ ايزوفلوران يجب أن تستخدم. على سبيل المثال، يجب استخدام 0.26 مل مع غرفة L 16. لوحظ انخفاض في قابلية البقاء في أنسجة البنكرياس عند استخدام ثاني أكسيد الكربون. - رش الماوس مع 70٪ v/v الإيثانول بحرية للحد من تلوث الأنسجة مع الفراء أثناء تشريح واستئصال. ضع الماوس في الظهر لأسفل، اتجاه البطن لأعلى مع الجانب الأمامي إلى اليسار.
- باستخدام مقص، افتح الصفاق وإزالة القفص الصدري، مع الحرص على عدم ثقب القلب أو الأوعية المجاورة. استخدم ملقط لقلب الكبد في تجويف الصدر، ونقل الأمعاء من تجويف الجسم لفضح القناة الصفراوية الشائعة. استخدام المشبك البلدغ جونز هوبكنز لحصر أمبولا من فاتر.
- استرداد 10 مل لوير قفل حقنة محملة مسبقا مع 3 مل من محلول الآغروز الدافئ من حمام الماء 37 درجة مئوية.
ملاحظة: بمجرد إزالة الحقنة مع الآغاروز من حمام الماء ، يجب إجراء حقن البنكرياس بسرعة قبل أن يبرد الآغاروز وي مجموعات في الحقنة. - عقد ملقط في اليد اليسرى، واستخدامها لدعم بلطف وتحقيق الاستقرار في القناة الصفراوية للحقن.
- عقد الحقنة في اليد اليمنى، إدراج إبرة شطبة الجانب حتى في القناة الصفراوية. حقن البنكرياس ببطء وثبات. بمجرد بدء الحقن ، لا يمكن إيقاف التدفق دون تصلب الآغاروز في الحقنة وفي البنكرياس.
ملاحظة: تعتمد وحدة التخزين المستخدمة على وزن الماوس. بناء على الخبرة، فمن المستحسن أن 1 مل من محلول الآغاروز يمكن استخدامها لكل 10 غرام من وزن جسم الماوس مع الحد الأقصى لحجم 2 مل. البنكرياس يجب أن تبدو مبالغ فيها قليلا مع هيكل أكثر حسما، ولكن ليس الإفراط في التوسع. الإفراط في حقن النتائج في الجزر التي تصبح منفصلة عن أنسجة الغدد الصماء التي لها مظهر "تفجير التدريجي" في شرائح. - استئصال البنكرياس المملوء بالأغاروز من الفأر. باستخدام ملقط ومقص، وقطع البنكرياس بعيدا، بدءا من المعدة، والانتقال إلى الأمعاء، وتنتهي عند الطحال. قطع مرة واحدة بعيدا، وإزالة البنكرياس حقن بلطف مع ملقط، ووضعها في طبق بيتري 10 سم مليئة ECS المبردة.
- استخدم مقصا لإزالة الأنسجة الدهنية والكوادية والأنسجة الليفية وأجزاء البنكرياس التي لا يتم حقنها بالغاروز.
ملاحظة: أجزاء من الأنسجة التي ينبغي إزالتها لن يكون لها هياكل راسخة بقوة وسوف تظهر الجيلاتينية إلى حد ما. - بعد تشذيب الأنسجة، استخدم مقصا لقطعها إلى أقسام أصغر يبلغ قطرها حوالي 5 مم مع تركها مغمورة تحت ECS. قطع الأنسجة بعناية، مع الحرص على عدم دفع agarose من الأنسجة.
- إزالة قطعة من الأنسجة من ECS، ووضعها على ممسحة اثنين من ply (انظر جدول المواد). لفة بلطف لهم على ممسحة باستخدام ملقط لإزالة السائل الزائد.
- باستخدام ملقط، ضع بعناية قطعة من الأنسجة في طبق بيتري 35 ملم مع ما لا يزيد عن 4 قطع لكل لوحة. ضع الجانب المسطح من كتلة الأنسجة التي تواجه لأسفل. اضغط برفق على الأنسجة باستخدام ملقط.
ملاحظة: تأكد من وجود مسافة، على الأقل بضعة ملليمترات، بين قطع الأنسجة، وأنها لا تلمس حافة اللوحة. - صب ببطء agarose 37 درجة مئوية في الطبق، مع الحرص على عدم صب مباشرة على الأنسجة. صب ما يكفي بحيث يتم تغطية قطع الأنسجة تماما. تأكد من وجود طبقة من الآغاروز فوق قطع الأنسجة حيث سيتم لصق هذا الجزء على حامل العينة.
- نقل الطبق بعناية مع قطع من الأنسجة إلى الثلاجة للسماح للgarose لتعيين. تأكد من أن قطع الأنسجة لا تتغير أو تبدأ في الطفو. إذا فعلوا ذلك ، بسرعة إعادة ضبطها باستخدام ملقط.
ملاحظة: إعداد agarose يجب أن يستغرق سوى بضع دقائق. - مرة واحدة وقد وضعت agarose، استخدم مشرط لقطع حول الأنسجة في خطوط مستقيمة لجعل كتل agarose كما لو جعل شبكة بين قطعة من الأنسجة. تأكد من ترك بضعة ملليمترات من الآجروز المحيطة بجميع جوانب الأنسجة.
ملاحظة: لا ينبغي أن يكون هناك أي نسيج جاحظ من الآغاروز. يجب أن يكون كل كتلة مكعب من حوالي 5 مم × 5 مم × 5 مم حجم. - استخدام مشرط الوجه من أقسام فارغة من الآغاروز التي قطعت حول حواف لوحة. إزالة الكتل مع الأنسجة من الطبق عن طريق رفعها بعناية مع ملقط.
3. الماوس شريحة البنكرياس جيل
- باستخدام ملقط، وترتيب كتل على حامل العينة؛ وضعها جانبية، مع الأخذ في الاعتبار أنها سوف انقلبت على الغراء السوبر. ترتيب الكتل بحيث لا تمتد أبعد من عرض النصل. كما يتحرك الهزاز ببطء، وترتيب الكتل بحيث النصل يجب أن تتحرك إلى الأمام على مسافة أقل قدر ممكن.
ملاحظة: صفين من ثلاث أو أربع كتل مع كل ملليمترات قليلة بين الصفوف يعمل بشكل جيد. يمكن للكتل داخل الصف نفسه لمس بعضها البعض، ولكن عندما يلمس كلا الصفين، قد يكون من الصعب استرداد الشرائح عند نزولها من الكتل. - تطبيق خط من الغراء السوبر على حامل العينة، واستخدام نهاية موزع الغراء لنشر الغراء إلى طبقة رقيقة. الوجه كتل الأنسجة على الغراء بحيث الجانب الأقرب إلى الأنسجة يواجه صعودا. دفع بلطف إلى أسفل على كتل، والسماح للغراء الجاف لمدة ثلاث دقائق.
- إرفاق حامل النصل ولوحة إلى الهزاز، وعادة مع المسمار أو المغناطيس، اعتمادا على نموذج هزاز. ضبط ارتفاع النصل والمسافة المقطوعة بحيث ينتقل النصل على طول الكتل وبالكاد فوقها.
ملاحظة: ملقط يمكن أن تكون مفيدة أثناء ضبط ارتفاع النصل. يمكن وضعها على رأس كتلة الأنسجة للمساعدة في وضع النصل أقرب إلى الجزء العلوي من الكتلة قدر الإمكان دون لمس الكتلة. - تأكد من أن الغراء قد جفت عن طريق دفع بلطف كتل مع ملقط، وملء صينية هزاز مع ECS المبردة حتى يتم تغطية النصل. تعيين الهزاز لجعل شرائح سمك 120 ميكرومتر بسرعة 0.175 ملم / ثانية، تردد 70 هرتز، وسعة 1 ملم.
ملاحظة: يمكن ضبط سرعة الهزاز اعتمادا على سهولة قطع الأنسجة. - بدء الهزاز، ومشاهدة عندما تبدأ شرائح الخروج من كتل الأنسجة. استخدام ملقط Graefe 10 سم أو فرشاة الطلاء الصغيرة رقم 4 لإزالة بعناية شرائح بمجرد أن تطفو قبالة كتلة، ووضعها في لوحات 10 سم مع KRBH تحتوي على 3 MM D-الجلوكوز ومثبطات تريبسين. التقاط شرائح عن طريق وضع فرشاة الطلاء أو ملقط تحتها ورفع شرائح بلطف. لا تحتضن أكثر من 15 شريحة معا في طبق واحد.
ملاحظة: من الطبيعي أن يكون الهزاز بضعة يمر فوق الكتل حيث يتم إجراء أي شرائح، ولكن يجب تقليل هذه للوقت. يكون مقص جاهزة في حالة شرائح لا تنفصل تماما عن كتل الأنسجة. إذا حدث هذا، سيتم تمسك زاوية أو حافة الشريحة إلى الكتلة بعد تمرير شفرة الهزاز. لا تسحب الشريحة أو الكتلة عند إزالة الشريحة العالقة. - وضع لوحات مع شرائح على الروك في درجة حرارة الغرفة وفي 25 دورة في الدقيقة. دع الشرائح ترتاح في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة. إذا كانت ستترك لفترة أطول، ضع الشرائح في 15 مل من شريحة الثقافة المتوسطة (انظر الجدول التكميلي 1) في حاضنة. شرائح الحضانة المعدة للدراسات في نفس اليوم عند 37 درجة مئوية، وشرائح الثقافة التي يتم استزراعها بين عشية وضحاها عند 24 درجة مئوية، ونقلها إلى 37 درجة مئوية على الأقل ساعة واحدة قبل التجارب.
ملاحظة: على المدى الطويل، شرائح لها قدرة أفضل على البقاء عندما مثقف في 24 درجة مئوية، على الرغم من أن 37 درجة مئوية هو أقرب إلى بيئتها الفسيولوجية الأصلية، وربما يرجع ذلك إلى انخفاض نشاط إنزيمات البروتيز تفرز في درجة حرارة أقل. يتم استزراع شرائح أنسجة البنكرياس الفأرية والبشرية في نفس درجة الحرارة وبحد أقصى 15 شريحة لكل طبق. ومع ذلك ، تختلف وصفات الوسائط لشرائح الإنسان والفأر. وترد كلتا الصيغتين في الجدول التكميلي 1. بالإضافة إلى ذلك، الإجراء هو نفسه لتوليد شرائح الماوس والإنسان باستثناء البنكرياس الماوس التي تتطلب الحقن مع agarose لتحقيق الاستقرار. يتم الحصول على شرائح الإنسان من خلال برنامج شريحة البنكرياس nPOD. كل من الماوس وشرائح الإنسان هي 120 ميكرومتر سميكة. ويمكن إجراء مجموعة متنوعة من التجارب على شرائح; اختيار لوحات تلطيخ التي تعمل بشكل أفضل للتجارب المخطط لها.
4. إعداد شرائح لإجراءات تلطيخ
- زراعة الشرائح عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل التجارب المخطط لها. KRBH دافئ يحتوي على 3 MM D-الجلوكوز في حمام الماء 37 درجة مئوية. نقل 2 مل من KRBH تحتوي على 3mM D-الجلوكوز في طبق 35 ملم، واستخدام فرشاة لوضع بلطف شريحة في الطبق.
- إذا تم نقل الشريحة من المتوسط، اغسلها مرتين مع KRBH التي تحتوي على 3 MM D-الجلوكوز. يستنشق بعناية KRBH مع 3 MM D-الجلوكوز باستخدام ماصة نقل أو ماصة باستور، مع الحرص على عدم تعكير صفو الشريحة. احتفظ بالشريحة في الطبق مع KRBH التي تحتوي على 3 MM D-الجلوكوز في حين يتم إعداد لوحات تلطيخ.
5. ديثيزون تلطيخ
ملاحظة: على الرغم من أن dithizone يمكن استخدامها لتلطيخ الجزر الحمراء، فإنه سيتم قتل شريحة كما تم العثور على أن تكون سامة للخلايا إلى الجزر17.
- قياس 12.5 ملغ من dithizone، إضافته إلى 1.25 مل من ثنائي ميثيل سلفوإكسيد، واتخاذ هذا الخليط حتى في حقنة 50 مل. املأ المحاقن بحجم 25 مل باستخدام محلول الملح المتوازن Hanks Balanced Salt Solution، وأرفق فلتر بنهاية الحقنة. Aliquot 2 مل من KRBH مع 3 MM D-الجلوكوز، وإضافة 2 قطرات من محلول dithizone المصفاة من حقنة 50 مل في طبق 35 ملم.
- باستخدام فرشاة الطلاء، ضع بعناية شريحة في طبق بتري 35 ملم. صورة شريحة مع الجزر المشار إليها بواسطة تلطيخ dithizone الأحمر باستخدام مجسم.
6. تلطيخ الجدوى
ملاحظة: يصف هذا القسم من البروتوكول كيفية تقييم صلاحية الشريحة باستخدام calcein-AM والأزرق-الفلورسنت SYTOX الأزرق (راجع جدول المواد). يجب استخدام Calcein-AM بتركيز 4 ميكرومتر و SYTOX Blue عند 1 ميكرومتر.
- Aliquot 2 مل من KRBH تحتوي على 3 MM D-الجلوكوز، وإضافة 2 ميكرولتر من صبغ كالسين-AM والأزرق SYTOX لفصل aliquots. دوامة الخلائط لمدة 5 ق.
- إضافة 200 ميكرولتر من KRBH تحتوي على 3 MM D-الجلوكوز وصبغ calcein-AM إلى كل بئر من زجاج تغطية 8 غرف جيدا.
ملاحظة: يمكن استخدام لوحات بديلة و/أو غرف تصوير غير زجاج تغطية 8 غرف بشكل جيد. - باستخدام فرشاة الطلاء، ضع بعناية شريحة في كل بئر من الطبق، ونقل لوحة مع شرائح إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. غسل شرائح مرتين مع KRBH تحتوي على 3 MM D-الجلوكوز. يستنشق بعناية KRBH باستخدام نقل أو باستور ماصة، مع الحرص على عدم إزعاج الشريحة.
- ضع الشريحة في طبق بيتري ذو قاع غطاء 35 مم يحتوي على 2 مل من KRBH مع 3 mM D-glucose و 2 ميكرولتر من SYTOX Blue بتركيز 1 ميكرولتر لكل 1 مل من المحلول. تغطية شريحة مع مرساة شريحة، وضمان أن الجانب مع القيثارة يواجه إلى أسفل. التقاط صور للشريحة.
ملاحظة: إذا استمر مرساة الشريحة في الطفو، قم بتبليلها على كلا الجانبين مع KRBH التي تحتوي على 3 mM D-glucose لغمرها في المحلول. من المهم الحفاظ دائما على الشرائح في المحاليل التي تحتوي على مثبط البروتيز ، حتى أثناء تحميل الصبغة. يمكن تكييف بقع الجدوى المستخدمة لتجربة محددة أو إعداد المجهر.
7. شريحة Ca2 + مؤشر تلطيخ
ملاحظة: يصف هذا القسم من البروتوكول كيفية وصمة عار شرائح التسجيلات Ca2 + باستخدام Oregon الأخضر 488 BAPTA-1، AM و SYTOX الأزرق في شرائح الماوس (انظر جدول المواد). وينبغي استخدام أوريغون الأخضر 488 BAPTA-1، AM بتركيز 5.6 ميكرومتر والأزرق SYTOX في 1 ميكرومتر. في شرائح الإنسان، يجب استخدام فلوو-4-AM بتركيز 6.4 ميكرومتر.
- Aliquot 2 مل من KRBH تحتوي على 3 MM D-الجلوكوز، إضافة 7 ميكرولتر من الأخضر ولاية أوريغون 488 BAPTA-1، AM ودوامة الخليط لمدة 5 ثانية.
ملاحظة: لشرائح الأنسجة البشرية، استخدم Fluo-4-AM بدلا من OREGON Green 488 BAPTA-1، AM. وFluo-4-AM هو الأفضل لأنه أكثر إشراقا عندما يزيد تركيز Ca2 + داخل الخلية; ومع ذلك, فإنه لا يتم تحميل جيدا في أنسجة البنكرياس الماوس. البروتوكول هو نفسه كما هو موضح أعلاه لFluo-4-AM باستثناء أن Fluo-4-AM يحتاج فقط إلى احتضان لمدة 30 دقيقة. - إضافة 200 ميكرولتر من KRBH تحتوي على 3mM D-الجلوكوز وصبغ إلى كل بئر من زجاج تغطية 8 غرف جيدا. باستخدام فرشاة الطلاء، ضع بعناية شريحة في كل بئر من زجاج الغطاء المغرغر. نقل زجاج الغطاء المغرض مع شرائح إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
- غسل شرائح مرتين مع KRBH تحتوي على 3 MM D-الجلوكوز. يستنشق بعناية KRBH مع 3 MM D-الجلوكوز باستخدام نقل أو باستور ماصة, مع الحرص على عدم تعكير صفو شريحة.
- ضع شريحة في لوحة تصوير أو غرفة مع KRBH تحتوي على 3 mM D-الجلوكوز والأزرق SYTOX بتركيز 1 ميكرولتر لكل 1 مل، وتغطي مع مرساة شريحة، وضمان أن القيثارة يواجه إلى أسفل. التقاط صور للشريحة.
ملاحظة: في هذا البروتوكول، طبق 35 مم مملوءة 2 مل من KRBH تحتوي على 3 MM D-الجلوكوز و 2 ميكرولتر من SYTOX الأزرق تم استخدامها. إذا استمر مرساة الشريحة في الطفو، فبلها على كلا الجانبين مع KRBH التي تحتوي على 3 MM D-Glucose لغمرها في المحلول.
8. الماوس شريحة Ca2 + التسجيلات
ملاحظات: يصف القسم التالي كيفية تنفيذ تسجيلات Ca2+ على شرائح أنسجة البنكرياس الماوس باستخدام الأخضر أوريغون 488 BAPTA-1, AM والأزرق SYTOX. تم إجراء التصوير على مجهر مسح ليزر كونفوج (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل). وكانت أشعة الليزر المستخدمة 405 نانومتر للأزرق SYTOX, 488 نانومتر لولاية أوريغون الأخضر 488 BAPTA-1, AM, و 638 نانومتر للعكس. تم استخدام كاشف هايد لولاية أوريغون الأخضر 488 BAPTA-1، صباحا. تم استخدام كاشفات أنبوب التمائم الضوئي (PMT) للعكس والأزرق SYTOX. بروتوكول التصوير Ca2 + هو نفسه بالنسبة لشرائح أنسجة البنكرياس البشرية إلا أن Fluo-4-AM تم استخدامه كمؤشر. يجب تعديل مستويات الطاقة بالليزر، والكسب، وحجم الثقب استنادا إلى العينة والخريلية المعينة المصورة. عادة، ثقب من 1.5 وحدات متجدد الهواء وقوة الليزر من 1٪ هي نقاط انطلاق جيدة.
- على الأقل 1 ساعة قبل التسجيل، قم بتشغيل المجهر وتوازن الحاضنة على شكل خشبة المسرح أو القفص إلى 37 درجة مئوية. ضع طبق بيتري ذو القاع الزجاجي مقاس 35 مم الذي يحتوي على الشريحة على المسرح بعد إزالة الغطاء. التركيز عن طريق وضع المجهر إلى الهدف 10x ووضع brightfield. حدد موقع الجزر باستخدام brightfield من خلال البحث عن البيضاوي البرتقالي والبني داخل الشريحة.
- بمجرد تحديد موقع جزيرة محتملة، قم بتبديل المجهر إلى وضع التصوير البؤري. لتأكيد الجزر عن طريق العاكسة، قم بتشغيل ليزر 638 نانومتر، وحدد قوة الليزر بين 1٪ و 2٪، واطفأ مرشح 638 نانومتر من شأنه أن يزيل عادة الضوء المكثر. تعيين حدود الكشف على كاشف PMT لعرض نطاق ترددي يبلغ حوالي 20 نانومتر متمركز حول 638 نانومتر.
ملاحظة: توخي الحذر كما تشغيل المجهر في وضع انعكاس يمكن أن تلحق الضرر كاشف. نظرا لارتفاع حبيبة أنسجة الغدد الصماء ، يمكن الآن استخدام الضوء المنعكس لتحديد موقع الجزر. ستظهر الجزر كجماعات من الخلايا الحبيبية المترنحة بشكل مشرق على قناة الانعكاس هذه. - لعرض SYTOX Blue، قم بتشغيل ليزر 405 نانومتر وكاشف PMT، وحدد طاقة الليزر بين 1٪ و 2٪. مركز جزيرة الاهتمام في مجال الرؤية باستخدام المقابض X و Y من وحدة تحكم المرحلة. مرة واحدة يقع جزيرة من الاهتمام وأكد من قبل backscatter، والتحول إلى الهدف 20x، والتكبير في ذلك الجزيرة يستغرق معظم الإطار.
- خذ كومة z من الجزيرة بحجم z-step يبلغ 1.5 ميكرومتر. العثور على أفضل قسم البصرية من الجزيرة حيث معظم الخلايا على قيد الحياة (سلبية للأزرق SYTOX) ومحملة بشكل جيد مع الأخضر ولاية أوريغون 488 BAPTA-1، صباحا أو فلو-4-AM.
ملاحظة: ليس من غير المألوف أن نرى الخلايا التي هي مثقلة كمية كبيرة من الصبغة التي هي مشرقة جدا. قد تكون هذه خلايا البنكرياس الموت التي Ca2 + التخزين في الشبكية endoplasmic قد يكون أفرج عنه, مما أدى إلى مستويات عالية من التحميل; هذه ليست خلايا مثالية للتسجيل. ابحث عن الخلايا التي حملت الصبغة بوضوح ، ولكنها لا تفرط في تشبع الكاشف بحيث تكون الزيادة في السطوع التي تحدث عندما تتقلب مستويات Ca2 + السيتوسوليك مرئية. تحميل صبغ الجزر داخل شرائح متغير; ومع ذلك ، فإن الصبغة عادة ما تحمل بشكل جيد من خلال ~ 10-15 ميكرومتر من الجزيرة. ومع ذلك، يمكن تحميل صبغ يكون من الصعب تصور إذا كانت الخلايا عميقة في الأنسجة. - لمنع تلاشي الصبغة أثناء التسجيل، تأكد من أن طاقة الليزر على قناة 488 نانومتر لا تتجاوز 2٪. زيادة الثقب إلى 2 وحدات متجدد الهواء لجمع المزيد من الإشارة مع انخفاض قوة الإثارة.
- تعيين المجهر لتسجيل في وضع XYZT. تحسين الإعدادات لتقليل معدل الإطار إلى 2 s أو أقل لكل إطار.
ملاحظة: تتضمن تعديلات الإعدادات التي يمكن إجراؤها للمساعدة في تقليل معدل الإطار تشغيل المسح ثنائي الاتجاه، وتقليل متوسط الخط أو إيقاف تشغيله، وزيادة سرعة المسح الضوئي. - بمجرد تحسين الإعدادات، سجل عدة دقائق من النشاط القاعدي.
ملاحظة: مؤشر جيد آخر على صلاحية الأنسجة هو إذا كانت الخلايا تبدو نشطة وتومض بشكل واضح أثناء هذا التسجيل للنشاط القاعدي. - إضافة 100 ميكرولتر من الجلوكوز المركز 20x وKCl في KRBH إلى لوحة باستخدام ميكروبايت 200 ميكرولتر في نقاط زمنية معينة لتحقيق تركيز النهائي من الجلوكوز 16.7 mM أو 30 MCL.
ملاحظات: أضف الحلول بعناية، مع الحرص على عدم إزعاج الشريحة أثناء التسجيل. تأكد من عدم عثرة لوحة مع micropipette. ومن المعتاد أن نرى العقد الأنسجة استجابة لهذه التحفيزات. تمت معالجة تسجيلات التدفق Ca2+ وقياسها كميا في ImageJ18. باستخدام برنامج ImageJ ، وكثافة تلطيخ ولاية أوريغون الأخضر 488 BAPTA - 1 ، تم قياس AM في الخلايا عن طريق اختيار المناطق ذات الاهتمام يدويا (ROIs). تم حساب كثافة الفلورسينس من هذه ال ROIs بقسمة قيم الفلورسينس في النقاط الزمنية اللاحقة على قيم الفلورسينس الأولية للخلايا (F/F0). ويمكن استخدام نظام التشويش جنبا إلى جنب مع غرفة التصوير المتخصصة لإدارة الحلول لشرائح ديناميكيا بدلا من إضافتها يدويا. يمكن العثور على نظام التغلغل وتوصيات غرفة التصوير في جدول المواد.
9. تلطيخ الخلايا تي الماوس في شرائح البنكرياس الحية
ملاحظة: يصف هذا القسم من البروتوكول كيفية وصمة عار الخلايا المناعية داخل شرائح الماوس. سلالة الماوس المستخدمة هي NOD. Rag1-/-. AI4 α/β كما يتطور هذا النموذج باستمرار المرض مع التهاب الأمعاء كبيرة. تستهدف خلايا CD8+ T في هذا الماوس جميعا كمية من الأنسولين ، مما يسمح باستخدام فيكوريثرين (PE) المسمى الأنسولين -Db tetramer15. يجب استخدام الأجسام المضادة CD8 بتركيز 1:20 ورابع كلوريد الأنسولين في الساعة 1:50.
- Aliquot 100 μL من KRBH تحتوي على 3 MM D-الجلوكوز، إضافة 2 ميكرولتر من رباعي الأنسولين PE و 5 ميكرولتر من الأجسام المضادة CD8 الفيزيقي (APC)، ودوامة الخليط لمدة 5 ثانية.
- أضف 100 ميكرولتر من KRBH تحتوي على 3 MM D-الجلوكوز والتترامر والأجسام المضادة إلى بئر من زجاج تغطية 8 غرف جيدا. باستخدام فرشاة الطلاء، ضع بعناية شريحة في بئر زجاج الغطاء المغرغر. نقل زجاج الغطاء المغرض مع شريحة إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- غسل شريحة مرتين مع 2 مل KRBH تحتوي على 3 MM D-الجلوكوز. يستنشق بعناية KRBH مع 3 MM D-الجلوكوز باستخدام نقل أو باستور ماصة, مع الحرص على عدم تعكير صفو شريحة.
- ضع الشريحة في طبق بيتري ذو قاع غطاء 35 مم يحتوي على KRBH مع 3 mM D-Glucose والأزرق SYTOX بتركيز 1 ميكرولتر لكل 1 مل ، وغطيه بمرساة شريحة ، مع وضع الجانب مع القيثارة التي تواجه لأسفل. التقاط صور للشريحة.
ملاحظة: إذا استمر مرساة الشريحة في الطفو، قم بتبليلها على كلا الجانبين مع KRBH التي تحتوي على 3 mM D-glucose لغمرها في المحلول. يمكن إعادة استخدام الأجسام المضادة المخففة والتترامر مرة واحدة. بعد تلطيخ شريحتين ، يجب إجراء خليط من الأجسام المضادة الطازجة.
10. تسجيل الخلايا المناعية الماوس
ملاحظة: يصف القسم التالي كيفية إجراء تسجيلات الخلايا المناعية على شرائح أنسجة البنكرياس الماوس باستخدام الأجسام المضادة CD8، PE الأنسولين tetramer، والأزرق SYTOX. إعداد التصوير كما هو موضح في القسم 8. تم إجراء التسجيلات بدقة 800 × 800 بكسل. وكانت أشعة الليزر المستخدمة 405 نانومتر للأزرق SYTOX، 488 نانومتر لرباعي الأنسولين، و 638 نانومتر للأجسام المضادة CD8 وانعكاس. واستخدمت أجهزة الكشف عن الهيد للأجسام المضادة CD8 وPE رباعي الأنسولين. واستخدمت أجهزة الكشف PMT لعكس والأزرق SYTOX. بروتوكول تصوير الخلايا المناعية هو نفسه بالنسبة لشرائح أنسجة البنكرياس البشرية باستثناء استخدام الأجسام المضادة المختلفة ومضادات متعددة HLA المعقدة للأنسجة البشرية. لكل من رباعي الانسولين تلطيخ في أنسجة الماوس وHLA-multimer تلطيخ في الأنسجة البشرية, وينبغي استخدام خلية المناعة شارك وصمة عار للتحقق من وجود خلايا تي مستضد رد الفعل محددة. هنا، تم استخدام مضاد CD8. كما يمكن استخدام الأجسام المضادة، مثل مكافحة CD3 أو مكافحة CD4، اعتمادا على عدد الخلايا المستهدفة.
- على الأقل 1 ساعة قبل التسجيل، والتبديل على المجهر، وتتوازن الحاضنة المرحلة الأعلى إلى 37 درجة مئوية. تأمين 35 ملم coverglass القاع طبق بيتري التي تحتوي على شريحة على خشبة المسرح. ركز المجهر عن طريق وضع هدف 10x في وضع brightfield. حدد موقع الجزر باستخدام وضع brightfield من خلال البحث عن بيضاويات برتقالية اللون بنية اللون داخل الشريحة.
- قم بتبديل المجهر إلى التصوير البؤري عن طريق الضغط على زر CS على وحدة تحكم الشاشة التي تعمل باللمس بالمجهر. لعرض الجزر بواسطة العاكسة، قم بتشغيل كاشف الليزر وPMT 638، وحدد طاقة الليزر بين 1٪ و 2٪، وإيقاف تشغيل مرشحات الشق.
ملاحظة: نظرا لزيادة حبيبة أنسجة الغدد الصماء، يمكن الآن استخدام الضوء المنعكس لتحديد موقع الجزر. ستظهر الجزر كجماعات من الخلايا الحبيبية الساطعة على هذه القناة. - لعرض SYTOX Blue، والأجسام المضادة CD8، ورابع كلوريد الأنسولين، تحقق من أن طاقة الليزر تتراوح بين 1٪ و 2٪. استخدم الإعدادات التالية لعرض كل من الثلاثة: بالنسبة إلى SYTOX Blue، قم بتشغيل جهاز الليزر 405 نانومتر وكاشف PMT؛ للأجسام المضادة CD8، قم بتشغيل كاشف HyD؛ ولعرض رباعي الأنسولين، قم بتشغيل ليزر 488 نانومتر وكاشف HyD.
- مركز جزيرة الاهتمام في مجال الرؤية باستخدام المقابض X و Y من وحدة تحكم المرحلة. بمجرد أن تقع جزيرة ذات أهمية ، قم بالتبديل إلى هدف 20x ، واتكبير بحيث تشغل الجزيرة معظم الإطار. خذ كومة z من الجزيرة بحجم z-step يبلغ 1.5 ميكرومتر. العثور على أفضل المقاطع البصرية (سلسلة من بين 5 إلى 10 أقسام) من الجزيرة حيث معظم الخلايا على قيد الحياة (سلبية للأزرق SYTOX) وأي خلايا المناعة المحيطة بها هي في التركيز.
ملاحظة: حاول العثور على إطارات حيث توجد خلايا متعددة إيجابية CD8 والأنسولين رباعية الأرجل المحيطة أو التسلل إلى الجزيرة. - تعيين المجهر لتسجيل في وضع XYZT. تحسين الإعدادات لتسجيل Z-كومة من الخطوات المحددة كل 20 دقيقة على مدى عدة ساعات.
ملاحظة: إذا كان ذلك ممكنا، فمن الأفضل القيام بهذه التسجيلات في غرفة التصوير حيث يمكن التحكم في درجة الحرارة ومستويات ثاني أكسيد الكربون، لا سيما عند التسجيل لأكثر من أربع ساعات. في حالة التسجيل بين عشية وضحاها ، يمكن إضافة الأجسام المضادة الزائدة إلى وسائل الإعلام للتعويض عن ركوب الدراجات مستقبلات الخلايا التائية وتلاشي الصبغة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام الفلوروفوريس المختلفة للأجسام المضادة للخلايا التائية. استنادا إلى الخبرة، تعمل الأجسام المضادة في المدى الأحمر البعيد بشكل أفضل للخلايا التائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هذا البروتوكول سوف تسفر شرائح أنسجة البنكرياس الحية مناسبة لكل من الدراسات وظائف وتسجيلات الخلايا المناعية. تظهر شريحة المظهر في كل من brightfield وتحت الضوء المنعكس في الشكل 1A، B. كما نوقش، يمكن العثور على الجزر في شرائح باستخدام الضوء المنعكس بسبب زيادة الحبيبية التي تحدث بسبب محتواها من الأنسولين (الشكل 1C) ويلاحظ بوضوح بالمقارنة مع أنسجة الخلفية عند استخدام الضوء المنعكس. وينبغي تقييم الجدوى بعد توليد الشرائح، ولا ينبغي تسجيل الجزر إذا كان أكثر من 20٪ من الجزيرة غير قابلة للحياة. تظهر جزيرة ذات قابلية عالية للاستمرار في الشكل 1D، في حين يظهر مثال على شريحة سيئة المعالجة في الشكل التكميلي 1. الجزر ذات الجدوى المنخفضة سيكون لها تلطيخ أزرق SYTOX ثقيل ، وسيتم تغطية الأنسجة بالنوى الملطخة للخلايا الميتة. بالإضافة إلى ذلك، كالسين-AM و Ca2+ مؤشرات مثل أوريغون الأخضر 488 BAPTA-1، AM المستخدمة هنا وFluo-4-AM لن تحميل جيدا في الخلايا الميتة. يجب اختيار الجزر لتسجيلات Ca2+ إذا كانت قابلة للتطبيق وإذا تم تحميل المؤشر في جميع أنحاء الجزيرة. Ca2 + تحميل المؤشر يدل على صلاحية الخلية كما يتم تحميل كل من مؤشرات Ca2 + مناقشتها في هذا البروتوكول (الأخضر أوريغون 488 BAPTA-1، AM وFluo-4-AM) في الخلايا من خلال نفس آلية صبغة البقاء، كالسين-AM.
لكل من الأصباغ مؤشر Ca2 + والكالسين-AM، عندما يتم تحميل البقع في الخلايا، واستر acetoxymethyl هو hydrolyzed داخل الخلية، ويصبح جزيء غشاء impermemethyl19. مؤشر إيجابي آخر لقابلية البقاء هو النشاط القاعدي الملحوظ في جميع أنحاء الجزيرة مع الخلايا تومض وإيقاف تشغيله. وينبغي أيضا أن يكون النشاط القاعدي ملحوظ في أنسجة الغدد الصماء بدرجة أقل. على الرغم من أن أنسجة الماوس تميل إلى أن يكون النشاط القاعدي أقل وضوحا من الأنسجة البشرية، فإنه لا يزال موجودا. جزيرة من شريحة مصنوعة من NOD. يظهر البنكرياس Rag1/- الماوس في الشكل 2A. كما ذكر أعلاه، والأخضر ولاية أوريغون 488 BAPTA-1، AM المستخدمة هنا لديه زيادة كثافة مضان أقل على ملزمة Ca2 + (~ 14 أضعاف) من فلوو-4 (~ 100 أضعاف). ومع ذلك، فإن ولاية أوريغون الأخضر 488 BAPTA-1، AM لديه ميزة انخفاض ثابت فصام الكالسيوم (KD = 170 nM) من فلوو-4 (KD = 335 nM)، مما أدى إلى الأخضر ولاية أوريغون 488 BAPTA-1، AM يجري أكثر حساسية لتركيزات أقل من Ca2 ca2 السيتوسولي+. غير أن الاستجابات لا تزال قابلة للقياس الكمي، كما يبين الشكل 2B. وترد أمثلة من جزيرة داخل شريحة أنسجة البنكرياس الإنسان السيطرة في بقية واحدة تظهر استجابة الجلوكوز عالية قوية في الشكل 2C والفيديو التكميلي 1. يتم تحميل Fluo-4-AM صبغة بشكل جيد ومرئية في جميع أنحاء الجزيرة بتركيزات الجلوكوز منخفضة. كما هو موضح أعلاه، حدوث نموذجي هو بالنسبة المئوية للخلايا لتحميل كميات كبيرة من الصبغة وتظهر مشرقة جدا. وعلاوة على ذلك، تم تعيين المعلمات صورة لهذا التسجيل بحيث معظم الخلايا داخل الجزيرة لا تظهر مشرقة جدا في تركيزات الجلوكوز منخفضة. وهذا يمكن الكاشف من التقاط الزيادات في السطوع التي تحدث أثناء التغيرات في تركيزات Ca2+ داخل الخلايا استجابة لمستويات الجلوكوز العالية. يظهر القياس الكمي لفلورة الخلايا الفردية أثناء هذه الاستجابة في الشكل 2D ، مع الذروة المتوقعة بعد تحفيز الجلوكوز العالي. تم استخدام برنامج ImageJ لحساب كثافة تلطيخ فلوو-4-AM والأخضر أوريغون 488 BAPTA-1، صباحا عن طريق اختيار ROIs يدويا. تم حساب الزيادة في كثافة الفلورسينس لكل عائد استثمار عن طريق تطبيع قيم الفلورسينس في النقاط الزمنية اللاحقة باستخدام قيم الفلورسينس الأولية للخلايا (F/F0).
Dithizone البقع الجزر الحمراء ومرئية تحت مجسمة برايتفيلد. ويمكن ملاحظة الجزر والجزر الصغيرة السليمة التي بدأت تنهار بسبب ظهور T1D باستخدام هذه الصبغة (الشكل 3A، B). يمكن العثور على الجزر باستخدام الضوء المنعكس (الشكل 3C) وقد تبدأ في فقدان الحبيبية بسبب تسلل الخلايا المناعية وموت الخلية (الشكل 3D). يمكن رؤية خلايا متعددة إيجابية CD3 تتسلل إلى الجزيرة في الشكل 3D. يمكن تحديد مجموعات الخلايا المناعية بشكل أكثر تحديدا باستخدام الأجسام المضادة CD8 وتلطيخ الأنسولين-tetramer. ويمكن بعد ذلك تطبيق التصوير لتحديد الخلايا التي تشارك في وصمة عار لكلا العلامات (الشكل 3E). يشير التلطيخ المشترك للخلايا المناعية التي تتسلل إلى الجزيرة في الشكل 3D إلى أن الخلايا هي الخلايا التائية التأثيرية التي تستهدف على وجه التحديد مستضد الأنسولين. وصمة عار COC8 ضروري للتمييز بين أن المناطق التي وصمة عار إيجابية لرباعيمر هي الخلايا المناعية. لا ينبغي أن تستخدم رباعي وحدها دون خلية المناعة شارك وصمة عار. مقارنة تلطيخ من الأجسام المضادة CD8 الماوس والتحكم isotype الجرذ IgG2a, κ يمكن العثور عليها في الشكل التكميلي 2. يمكن العثور على مقارنة إضافية من رباعي السيطرة لفيروس التهاب المشيمة الليمفاوية (LCMV) tetramer وترامر الأنسولين في الشكل التكميلي 3. تبقى بعض الخلايا التائية ثابتة طوال التسجيل ، ويتحرك العديد منها قليلا داخل منطقة صغيرة من الجزيرة ، والبعض الآخر متحرك جدا ويمكن رؤيته يتحرك في جميع أنحاء الجزيرة وأنسجة الغدد الصماء. ليس من غير المألوف أن نرى الخلايا التائية تظهر أنواع التنقل متعددة داخل نفس التسجيل.
الشكل 1: نظرة عامة على الشرائح والجزر الصغيرة الفردية. (أ) صورة مجسمة Darkfield لشريحة أنسجة البنكرياس البشرية الحية مع الجزر المشار إليها بالسهام الحمراء. (ب) صورة ضوئية منعكسة لشريحة أنسجة البنكرياس البشرية الحية مع الجزر المشار إليها بالسهام البيضاء. (ج) صورة ضوئية منعكسة ل جزيرة (موضحة باللون الأرجواني) داخل شريحة أنسجة البنكرياس البشرية الحية. (د) تلطيخ صلاحية جزيرة عالية الجدوى (موضحة باللون الأرجواني) داخل شريحة أنسجة البنكرياس البشرية الحية. ويشار إلى الخلايا الحية في الخلايا الخضراء والميتة باللون الأزرق. أشرطة المقياس (A, B) = 1 مم؛ أشرطة المقياس (C، D) = 50 ميكرومتر. اختصار: AM = أستر أسيتوكسي ميثيل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تسجيلات التغيرات في تركيزات Ca2+ داخل الخلايا والاستجابات لتركيز الجلوكوز العالي في NOD الحي. Rag1-/- الماوس شريحة أنسجة البنكرياس وشريحة أنسجة البنكرياس البشري من متبرع دون مرض السكري. (أ) صور جزيرة داخل NOD حية. Rag1-/- الماوس شريحة البنكرياس محملة أوريغون الأخضر 488 BAPTA-1, AM (انظر جدول المواد) يخضع لتحفيز الجلوكوز. من اليسار إلى اليمين، صورة ضوئية منعكسة للخزفة، الجزيرة في انخفاض الجلوكوز، وال جزيرة في ارتفاع الجلوكوز. (ب) آثار فلورسينس للاستجابة Ca2 + من جزيرة داخل NOD حية. شريحة أنسجة Rag1-/- مع الاستجابة المتوقعة لتركيز الجلوكوز العالي [KRBH مع 16.7 mM D-الجلوكوز (16.7G)] وKCl [KRBH مع 30 M M KCl و 3 MM D-الجلوكوز]. (ج) صور جزيرة داخل شريحة البنكرياس البشري الحية المحملة فلوو-4-AM يخضع لتحفيز الجلوكوز. من اليسار إلى اليمين، صورة ضوئية منعكسة للخزفة، الجزيرة في انخفاض الجلوكوز، وال جزيرة في ارتفاع الجلوكوز. (د) آثار فلورسينس للاستجابة Ca2 + من جزيرة داخل شريحة أنسجة البنكرياس البشري الحية مع الاستجابة المتوقعة لKRBH مع 16.7 mM D-الجلوكوز (16.7G). أشرطة المقياس (A) = 100 ميكرومتر؛ أشرطة المقياس (C) = 50 ميكرومتر. الاختصارات: KRBH = كريبس-رينغر بيكربونات العازلة; KCl = كلوريد البوتاسيوم. موافقه. Rag1-/- = غير بدين السكري-إعادة التركيب تنشيط الجينات-1-null; موافقه. Rag1-/-. AI4 α/β = T مستقبلات الخلايا المعدلة وراثيا (AI4) سلالة الماوس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحديد الجزر وخلايا المناعة في NOD. Rag1-/- و نود. Rag1-/-. AI4 α/β شرائح الماوس. (أ) تلطيخ Dithizone من الجزر في NOD. شريحة الماوس Rag1/- مع الجزر المشار إليها باللون الأحمر. (ب) تلطيخ Dithizone من الجزر في NOD. Rag1-/-. AI4 α/β شريحة الماوس مع الجزر المشار إليها باللون الأحمر. الجزر تفقد شكلها بسبب ظهور المرض. (ج) صورة ضوئية منعكسة ل جزيرة في نود. شريحة الماوس Rag1/- . (د) صورة ضوئية منعكسة ل جزيرة في نود. Rag1-/-. AI4 α/β شريحة الماوس مع تلطيخ الأجسام المضادة CD3 (أخضر). (ه) تلطيخ صلاحية الخلايا الميتة (الأزرق) وتلطيخ الخلايا المناعية (CD8 باللون الأخضر ورابع كلوريد الأنسولين باللون الأحمر) في NOD. Rag1-/-. AI4 α/β شريحة الماوس. أشرطة المقياس (A) = 500 ميكرومتر؛ أشرطة المقياس (B) = 50 ميكرومتر؛ أشرطة المقياس (C) = 100 ميكرومتر. Rag1-/- = غير بدين السكري-إعادة التركيب تنشيط الجينات-1-null; موافقه. Rag1-/-. AI4 α/β = T مستقبلات الخلايا المعدلة وراثيا (AI4) سلالة الماوس; CD = مجموعة من التمايز؛ الأنسولين تيت = رباعي الأنسولين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: NOD. Rag1-/- الماوس شريحة البنكرياس بعد إعداد غير لائق دون مثبط تريبسين واحتضان بين عشية وضحاها في 37 °C. (A) صورة مجسمة Darkfield من NOD الحية. Rag1-/- الماوس شريحة أنسجة البنكرياس; شريط مقياس = 1 مم (ب) صورة الضوء المنعكس من شريحة النسيج البنكرياس الماوس الحية; شريط مقياس = 50 ميكرومتر (C) تلطيخ صلاحية الأنسجة منخفضة الجدوى. ويشار إلى الخلايا الميتة باللون الأزرق؛ شريط المقياس = 50 ميكرومتر. اختصار: NOD. Rag1-/- = غير بدين السكري-إعادة التركيب تفعيل الجينات-1-null. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الشكل التكميلي 2: الجرذ IgG2a، κ isotype التحكم الأجسام المضادة (يسار) والجرذان المضادة للفأرة CD8 الأجسام المضادة (يمين) مقارنة تلطيخ في NOD. Rag1-/-. AI4 α/β شرائح الماوس. (A) تعكس صور ضوئية من NOD الحية. Rag1-/-. AI4 α/β شرائح أنسجة البنكرياس الماوس تظهر جزيرة (يسار) والأوعية الدموية (يمين). (ب) تلطيخ الأجسام المضادة من NOD الحية. Rag1-/-. AI4 α/β شرائح أنسجة البنكرياس الماوس. (ج) تراكب قنوات الضوء المنعكس والأجسام المضادة. أشرطة مقياس للأجسام المضادة للتحكم (اللوحات اليسرى) = 20 ميكرومتر؛ أشرطة مقياس للأجسام المضادة CD8 (لوحات الحق) = 50 ميكرومتر. اختصارات: NOD. Rag1-/- = غير بدين السكري-إعادة التركيب تنشيط الجينات-1-null; موافقه. Rag1-/-. AI4 α/β = T مستقبلات الخلايا المعدلة وراثيا (AI4) سلالة الماوس; CD = مجموعة من التمايز؛ IgG = الغلوبولين المناعي G. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الشكل التكميلي 3: فيروس التهاب المشيمة الليمفاوي رباعي (يسار) ورابع كلوريد الأنسولين (يمين) مقارنة التلطيخ في NOD. Rag1-/-. AI4 α/β شرائح الماوس. (أ) تعكس صور ضوئية من NOD الحية. Rag1-/-. AI4 α/β شرائح أنسجة البنكرياس الماوس تظهر الأوعية الدموية في أنسجة الغدد الصماء (يسار) والجزر الصغيرة (يمين). (ب) تترامر تلطيخ NOD الحية. Rag1-/-. AI4 α/β شرائح أنسجة الماوس. (ج) تراكب قنوات الضوء المنعكس وقنوات التترامر. الاختصارات: NOD. Rag1-/- = غير بدين السكري-إعادة التركيب تنشيط الجينات-1-null; موافقه. Rag1-/-. AI4 α/β = T مستقبلات الخلايا المعدلة وراثيا (AI4) سلالة الماوس; LCMV = فيروس التهاب المشيمة المشيمية الليمفاوي; الأنسولين تيت = رباعي الأنسولين. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
فيديو تكميلي 1: تسجيل Ca2+ السيلوتوليك تم اكتشافه باستخدام Fluo-4 استجابة لتحفيز الجلوكوز العالي في شريحة أنسجة البنكرياس البشرية من متبرع تحكم بدون مرض السكري. يمكن ملاحظة الخلايا داخل الأنسجة لإظهار نشاط فلوو-4 القاعدي في محلول منخفض الجلوكوز (3.0 mM)، تليها زيادة في كثافة فلوو-4 الفلورية استجابة لتحفيز مع ارتفاع الجلوكوز (16.7 mM). يتوافق الفيديو مع الصور الثابتة ولآثارها المعروضة في الشكل 2C, D. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
الجدول التكميلي 1: الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الهدف من هذا البروتوكول هو شرح توليد شرائح البنكرياس والإجراءات اللازمة لتوظيف شرائح في الدراسات الوظيفية والمناعية. هناك العديد من الفوائد لاستخدام شرائح البنكرياس الحية. ومع ذلك ، هناك العديد من الخطوات الحاسمة التي تعتبر ضرورية للأنسجة لتبقى قابلة للحياة ومفيدة خلال بروتوكولات التجربة الموصوفة. ومن الضروري العمل بسرعة. وينبغي تقليل طول الفترة الزمنية بين حقن البنكرياس وتوليد شرائح على الهزاز للحفاظ على صلاحية الأنسجة. كما يتم تحسين الجدوى عن طريق الحفاظ على البنكرياس في ECS الباردة قبل تشريح بدلا من ECS درجة حرارة الغرفة. الأهم من ذلك، شرائح لا ينبغي أبدا أن تكون في المتوسط دون مثبط البروتيز. عندما يتم احتضان شرائح دون مثبط البروتيز، وهناك انخفاض كبير في الجدوى.
عندما تركت شرائح لفترة وجيزة دون مثبطات أثناء تحميل الصبغة، Ca2 + التدفقات استجابة لارتفاع الجلوكوز وKCl لم يعد من الممكن تسجيلها على الرغم من النشاط القاعدي لا تزال مرئية في الشريحة. جميع الحلول المستخدمة مع شرائح حية بما في ذلك KRBH مع 3 MM D-الجلوكوز يستريح الحل, حل حضانة الأجسام المضادة, وأي وسائل الإعلام الثقافة, يجب أن تحتوي على جميع مثبطات البروتيز بتركيز 0.1 ملغ لكل مل. يمكن تعديل لوحات المؤشرات المستخدمة لتصوير الشرائح اعتمادا على هدف التجربة وتوافر الليزر المجهري. هناك العديد من الأصباغ صلاحية الخلية في ألوان مختلفة التي يمكن استخدامها بدلا من الأزرق SYTOX المستخدمة هنا (انظر جدول المواد). بالنسبة لتجارب Ca2+ ، يعمل Fluo-4-AM بشكل جيد في الأنسجة البشرية. بعض الباحثين لديهم النجاح باستخدام الأخضر ولاية أوريغون 488 BAPTA-1، AM المستخدمة هنا (انظر جدول المواد) لشرائح الماوس، في حين أن البعض الآخر الحصول على نتائج جيدة مع فلو-4-AM20،21،22.
بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الفئران المهندسة للتعبير عن مؤشر Ca2 + المشفر وراثيا ، GCaMP ، في الجزر الخاصة بهم للتحايل على الحاجة إلى تحميل الشرائح بصبغة مؤشر Ca2 + . على الرغم من أن ولاية أوريغون الأخضر 488 BAPTA-1، AM المستخدمة هنا ليست مشرقة مثل فلوو-4-AM، والاستجابات Ca2+ لا تزال ملحوظة وقابلة للقياس الكمي. ويتضح ذلك من الزيادة في قمم الفلورسنت المبينة في الإيماءة. تسجيلات Rag1-/- شريحة بعد ارتفاع الجلوكوز وتحفيز KCl. ويمكن استخدام مواد أخرى، مثل السلفونيلوريا وأرجينين، كضوابط إيجابية في نهاية بروتوكول Ca2+ ، ولكنها لم تستخدم بعد مع شرائح23,24,25. في حين أن هناك العديد من الفوائد لطريقة شريحة أنسجة البنكرياس الحية, وهناك أيضا بعض القيود. على الرغم من أن الشرائح يمكن أن تبقى قابلة للحياة لعدة أيام، هناك انخفاض حاد في الجدوى والأداء الوظيفي إذا تم استزراعها لفترة أطول، ما لم يتم توظيف ظروف ثقافية خاصة11,26. بالإضافة إلى ذلك، كما شرائح تحتوي على أنسجة الغدد الصماء البنكرياس الحية، وسوف تستمر خلايا الأسينار في شرائح لإنتاج والإفراج عن الإنزيمات الهضمية التي تحتاج إلى أن تمنع باستخدام مثبط البروتيز. لذلك، عند استخدام هذا البروتوكول لدراسات الإنسان أو الماوس، والحفاظ دائما شرائح في حلول مع مثبط بروتياز.
طريقة شريحة أنسجة البنكرياس الحية يتجنب وضع أنسجة البنكرياس تحت الضغط الكيميائي فقط عن طريق تعريض الأنسجة للقوة الميكانيكية خلال توليد شريحة بدلا من المواد الكيميائية المستخدمة خلال إجراءات عزل الجزيرة5. وعلاوة على ذلك، يتم الحفاظ على أنسجة البنكرياس سليمة، مما يسمح لرؤية أكثر شمولية من الأمراض وعلم وظائف الأعضاء التي تحدث بشكل طبيعي داخل organ5. باستخدام طريقة شريحة أنسجة البنكرياس الحية ، يمكن ملاحظة نشاط الخلايا المناعية في الموقع وفي الوقت الحقيقي إلى جانب وظيفة الأنسجة. وقد تم بالفعل تطبيق تقنيات التصوير المختبري الإضافية، مثل المجهر ثنائي الفوتون، على شرائح الأنسجة المشتقة من الغدة الصعترية ويمكن تطبيقها على شرائح أنسجة البنكرياس الحية27. تحديد مجموعات الخلايا المناعية الموجودة في الأنسجة جنبا إلى جنب مع أنشطتها وآثارها سوف تسمح للحصول على معرفة جديدة على مسببات الأمراض من أمراض مثل T1D و T2D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح متنافسة.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منح R01 DK123292، T32 DK108736، UC4 DK104194، UG3 DK122638، وP01 AI042288. وقد أجريت هذه البحوث بدعم من شبكة المتبرعين أعضاء البنكرياس مع مرض السكري (nPOD; RRID:SCR_014641)، وهو مشروع بحثي تعاوني من النوع 1 لمرض السكري برعاية JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R)، وليونا م. وهاري ب. هيلمسلي الخيرية الاستئمانية (غرانت #2018PG-T1D053). المحتوى والآراء التي أعرب عنها هي مسؤولية المؤلفين ولا تعكس بالضرورة وجهة النظر الرسمية للnPOD. يتم سرد منظمات شراء الأعضاء (OPO) بالشراكة مع nPOD لتوفير موارد البحث في http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. شكرا للدكتور كيفن أوتو، جامعة فلوريدا، لتوفير هزاز المستخدمة لتوليد شرائح الماوس.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #3 Style Scalpel Handle | Fisherbrand | 12-000-163 | |
| 1 M HEPES | Fisher Scientific | BP299-100 | HEPES Buffer, 1M Solution |
| 10 cm Untreated Culture Dish | Corning | 430591 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | BD | 301029 | BD Syringe with Luer-Lok Tips |
| 27 G Needle | BD | BD 305109 | BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles |
| 35 mm coverglass-bottom Petri dish | Ibidi | 81156 | µ-Dish 35 mm, high |
| 50 mL syringe | BD | 309653 | |
| 8-well chambered coverglass | Ibidi | 80826 | µ-Slide 8 Well |
| APC anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100712 | |
| BSA | Fisher Scientific | 199898 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5670 | CaCl2 |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | CaCl2 (dihydrate) |
| Compact Digital Rocker | Thermo Fisher Scientific | 88880020 | |
| Confocal laser-scanning microscope | Leica | SP8 | Pinhole = 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512 × 512 pixel resolution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C6H12O6 |
| ddiH2O | |||
| Dithizone | Sigma-Aldrich | D5130-10G | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | Dimethyl sulfoxide |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2805 | |
| Falcon 35 mm tissue culture dish | Corning | 353001 | Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes |
| FBS | Gibco | 10082147 | |
| Feather No. 10 Surgical Blade | Electron Microscopy Sciences | 7204410 | |
| fluo-4-AM | Invitrogen | F14201 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Gel Control Super Glue | Loctite | 45198 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | Hanks Balanced Salt Solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | C8H18N2O4S |
| Ice bucket | Fisherbrand | 03-395-150 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-05 | |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Roboz Surgical Store | RS-7440 | Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5" Length |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34705 | Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 2-Ply |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | This kit contains the calcein-AM live cell dye. |
| Low glucose DMEM | Corning | 10-014-CV | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | MgCl2 (hexahydrate) |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M2773 | MgSO4 (heptahydrate) |
| Magnetic Heated Platform | Warner Instruments | PM-1 | Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Microwave | GE | JES1460DSWW | |
| Nalgene Syringe Filter | Thermo Fisher Scientific | 726-2520 | |
| No.4 Paintbrush | Michaels | 10269140 | |
| Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | Imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Oregon Green 488 BAPTA-1-AM | Invitrogen | O6807 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Overnight imaging chamber | Okolab | H201-LG | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | To make agarose for slice generation |
| PE-labeled insulin tetramer | Emory Tetramer Research Core | sequence YAIENYLEL | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | KCl |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | KH2PO4 |
| Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 71998 | For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| SeaPlaque low melting-point agarose | Lonza | 50101 | To make agarose for slice generation |
| Slice anchor | Warner Instruments | 64-1421 | |
| Slice anchor (dynamic imaging) | Warner Instruments | 640253 | Slice anchor for dynamic imaging chamber |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | NaCl |
| Sodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | NaH2PO4 (monohydrate) |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20MW-AL | To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage |
| Stage-top incubator | Okolab | H201 | |
| Stereoscope | Leica | IC90 E MSV266 | |
| SYTOX Blue Dead Cell Stain | Invitrogen | S34857 | blue-fluorescent nucleic acid stain |
| Transfer Pipet | Falcon | 357575 | Falcon™ Plastic Disposable Transfer Pipets |
| Valve Control System | Warner Instruments | VCS-8 | System for dynamic stimulation recordings |
| Vibratome VT1000 S | Leica | VT1000 S | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 | Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02 |
References
- Uc, A., Fishman, D. S. Pancreatic disorders. Pediatric Clinics of North America. 64 (3), 685-706 (2017).
- Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes. Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).
- Taylor, R. Type 2 diabetes: etiology and reversibility. Diabetes Care. 36 (4), 1047-1055 (2013).
- Meier, R. P., et al. Islet of Langerhans isolation from pediatric and juvenile donor pancreases. Transplant International. 27 (9), 949-955 (2014).
- Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
- Panzer, J. K., Cohrs, C. M., Speier, S. Using pancreas tissue slices for the study of islet physiology. Methods in Molecular Biology. 2128, 301-312 (2020).
- Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells. Pflugers Archive. 446 (5), 553-558 (2003).
- Panzer, J. K., et al. Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis. JCI Insight. 5 (8), 134525 (2020).
- Dolai, S., et al. Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis. Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).
- Dolai, S., et al. Pancreas-specific SNAP23 depletion prevents pancreatitis by attenuating pathological basolateral exocytosis and formation of trypsin-activating autolysosomes. Autophagy. , 1-14 (2020).
- Qadir, M. M. F., et al. Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration. Nature Communications. 11 (1), 3265 (2020).
- Cohrs, C. M., et al. Dysfunction of persisting β cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis. Cell Reports. 31 (1), 107469 (2020).
- Liang, T., et al. Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology. Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nat Reviews. Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).
- Lamont, D., et al. Compensatory mechanisms allow undersized anchor-deficient class I MHC ligands to mediate pathogenic autoreactive T cell responses. Journal of Immunology. 193 (5), 2135-2146 (2014).
- Anesthesia and analgesia in laboratory animals. Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. , Academic Press. (2011).
- Clark, S. A., Borland, K. M., Sherman, S. D., Rusack, T. C., Chick, W. L. Staining and in vitro toxicity of dithizone with canine, porcine, and bovine islets. Cell Transplantation. 3 (4), 299-306 (1994).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Monette, R., Small, D. L., Mealing, G., Morley, P. A fluorescence confocal assay to assess neuronal viability in brain slices. Brain Research Protocols. 2 (2), 99-108 (1998).
- Gál, E., et al. A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice. Frontiers in Physiology. 10, 938 (2019).
- Stožer, A., Dolenšek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PloS One. 8 (1), 54638 (2013).
- Stožer, A., et al. Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices. PLoS Computational Biology. 9 (2), 1002923 (2013).
- Früh, E., Elgert, C., Eggert, F., Scherneck, S., Rustenbeck, I. Glucagonotropic and glucagonostatic effects of KATP channel closure and potassium depolarization. Endocrinology. 162 (1), 136 (2021).
- Satin, L. S. New mechanisms for sulfonylurea control of insulin secretion. Endocrine. 4 (3), 191-198 (1996).
- Ren, J., et al. Slow oscillations of KATP conductance in mouse pancreatic islets provide support for electrical bursting driven by metabolic oscillations. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (7), 805-817 (2013).
- Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ. PLoS One. 8 (11), 78706 (2013).
- Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. Two-photon imaging of the immune system. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 12, Unit 12.26 (2012).
