Summary
Questo studio presenta l'applicazione di fette di tessuto pancreatico vivo allo studio della fisiologia delle isole e delle interazioni isolotto-cellula immunitaria.
Abstract
Le fette di tessuto pancreatico vivo consentono lo studio della fisiologia e della funzione delle isole nel contesto di un microambiente di isole intatte. Le fette sono preparate da tessuto pancreatico umano e di topo vivo incorporato nell'agarosio e tagliate usando un vibratoma. Questo metodo consente al tessuto di mantenere la vitalità e la funzione oltre a preservare patologie sottostanti come il diabete di tipo 1 (T1D) e di tipo 2 (T2D). Il metodo slice consente nuove direzioni nello studio del pancreas attraverso il mantenimento delle strutture complesse e delle varie interazioni intercellulari che comprendono i tessuti endocrini ed esocrini del pancreas. Questo protocollo dimostra come eseguire la colorazione e la microscopia time-lapse di cellule immunitarie endogene vive all'interno di fette pancreatiche insieme a valutazioni della fisiologia delle isole. Inoltre, questo approccio può essere perfezionato per discernere le popolazioni di cellule immunitarie specifiche per gli antigeni delle cellule insulari utilizzando i principali reagenti multimero complesso di istocompatibilità.
Introduction
Il coinvolgimento del pancreas è patognomonico a malattie come pancreatite, T1D e T2D1,2,3. Lo studio della funzione in isole isolate di solito comporta la rimozione delle isole dal loro ambiente circostante4. Il metodo della fetta di tessuto pancreatico vivo è stato sviluppato per consentire lo studio del tessuto pancreatico mantenendo intatti i microambienti delle isole ed evitando l'uso di stressanti procedure di isolamento delle isole5,6,7. Le fette di tessuto pancreatico da tessuto di donatore umano sono state utilizzate con successo per studiare il T1D e hanno dimostrato processi di perdita e disfunzione delle cellule beta oltre all'infiltrazione delle cellule immunitarie8,9,10,11,12,13. Il metodo della fetta di tessuto pancreatico vivo può essere applicato sia al tessuto pancreatico di topo che a quello umano5,6,8. Le fette di tessuto pancreatico umano da tessuti di donatori di organi sono ottenute attraverso una collaborazione con la Rete per i donatori di organi pancreatici con diabete (nPOD). Le fette di topo possono essere generate da una varietà di diversi ceppi di topo.
Questo protocollo si concentrerà sul gene-1-nullo attivante la ricombinazione diabetica non obesa (NOD). Rag1-/-) e il recettore delle cellule T transgenico (AI4) (NOD. Rag1-/-. Ceppi di topo AI4 α/β). ANNUIRE. I topi Rag1-/- non sono in grado di sviluppare cellule T e B a causa di un'interruzione del gene 1 (Rag1)14 che attiva la ricombinazione. ANNUIRE. Rag1-/-. I topi AI4 α/β sono utilizzati come modello per il diabete di tipo 1 accelerato perché producono un singolo clone di cellule T che prende di mira un epitopo di insulina, con conseguente infiltrazione costante delle isole e rapido sviluppo della malattia15. Il protocollo qui descritto descrive le procedure per studi funzionali e immunologici che utilizzano fette pancreatiche umane e di topo vive attraverso l'applicazione di approcci di microscopia confocale. Le tecniche qui descritte includono valutazioni di vitalità, identificazione e localizzazione delle isole, registrazioni citosoliche di Ca2+ , nonché colorazione e identificazione delle popolazioni di cellule immunitarie.
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Protocol
NOTE: Tutti i protocolli sperimentali che utilizzano topi sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università della Florida (201808642). Sezioni pancreatiche umane da donatori di tessuti di entrambi i sessi sono state ottenute tramite la banca dei tessuti Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD), Università della Florida. I pancreati umani sono stati prelevati da donatori di organi cadaverici da organizzazioni certificate di approvvigionamento di organi che collaborano con nPOD in conformità con le leggi e i regolamenti sulla donazione di organi e classificati come "soggetti non umani" dall'Università della Florida Institutional Review Board (IRB) (IRB n. 392-2008), rinunciando alla necessità di consenso. I tessuti nPOD specificamente utilizzati per questo progetto sono stati approvati come non umani dall'IRB dell'Università della Florida (IRB20140093). Gli obiettivi delle sezioni 1-3 di questo protocollo sono spiegare come sezionare con successo un topo, preparare ed elaborare il pancreas e generare fette di tessuto pancreatico vivo. Le soluzioni devono essere preparate in anticipo e le ricette possono essere trovate nella Tabella supplementare 1. Il tempo è il fattore più critico durante questi passaggi del protocollo. Una volta che il topo è stato sacrificato, la vitalità dei tessuti inizierà a diminuire. Tutte e tre le parti di questo protocollo devono essere completate il più rapidamente possibile fino a quando non vengono generate tutte le sezioni necessarie.
1. Preparazione per la generazione di fette di pancreas di topo
- Fissare la lama sul supporto della lama del vibratoma, ma non collegarla ancora al vibrame.
- Sciogliere 100 mL di agarosio a basso punto di fusione all'1,25% p/v in un forno a microonde. Azionare il microonde a intervalli di 1 minuto e arrestare il microonde per 10 secondi se la soluzione di agarosio inizia a bollire. Ripetere questo processo fino a quando l'agarosio non viene sciolto e viene prodotta una soluzione omogenea. Mettere la bottiglia a bagnomaria a 37 °C.
NOTA: La bassa concentrazione di agarosio è dovuta alla minore densità del pancreas del topo. - Riempire una siringa Luer lock da 10 mL con 3 mL di agarosio caldo. Montare un ago da 27 G da 25 mm sulla siringa. Conservare la siringa con l'ago fissato con cappuccio a bagnomaria a 37 °C fino all'iniezione della soluzione.
NOTA: Un ago da 27 G è preferito in quanto si adatta saldamente al dotto biliare comune dei topi tra 10-25 g di peso corporeo e consente il flusso della soluzione di agarosio altamente viscosa. Mentre gli aghi di foro più grande possono essere selezionati per l'uso, gli aghi più piccoli (calibro più grande) non sono raccomandati in quanto potrebbero essere più facilmente intasati con la soluzione di agarosio. - Aggiungere 20 ml di soluzione extracellulare refrigerata (ECS) a una capsula di Petri da 10 cm.
NOTA: l'ECS non ha bisogno di essere bollato in nessun punto. - Riempire due piastre di Petri non trattate da 10 cm con 15 mL di tampone bicarbonato Krebs-Ringer (KRBH) contenente 3 mM di D-glucosio e inibitore della tripsina di soia ad una concentrazione di 0,1 mg/mL per piatto.
NOTA: In tutto questo protocollo, è essenziale che tutte le soluzioni utilizzate per il mantenimento delle fette contengano inibitori della tripsina di soia per prevenire danni ai tessuti causati dalle proteasi digestive pancreatiche.
2. Escissione del pancreas del topo ed elaborazione dei tessuti
NOTA: Il protocollo per l'asportazione del pancreas, l'elaborazione del tessuto e la generazione di fette è modificato da Marciniak et al5. Per garantire la vitalità dei tessuti, ridurre al minimo la quantità di tempo tra la rimozione del pancreas e la generazione di fette. Tutte le attrezzature necessarie devono essere preparate in anticipo e orientate in modo da consentire una rapida progressione attraverso i passaggi seguenti. La canulazione e l'iniezione del dotto biliare e l'escissione del pancreas vengono eseguite al meglio sotto uno stereoscopio.
- Il topo è profondamente anestetizzato con isoflurano e sacrificato dalla lussazione cervicale.
NOTA: l'isoflurano è il metodo di anestesia preferito. Deve essere utilizzata una concentrazione di isoflurano al 5%. Ad esempio, 0,26 ml devono essere utilizzati con una camera da 1 L16. Una diminuzione della vitalità del tessuto pancreatico è stata osservata quando è stata utilizzata CO2 . - Spruzzare liberamente il mouse con etanolo al 70% v/v per ridurre la contaminazione dei tessuti con la pelliccia durante la dissezione e l'escissione. Posizionare il mouse in un orientamento dorsale verso il basso, ventrale verso l'alto con il lato anteriore a sinistra.
- Usando le forbici, aprire il peritoneo e rimuovere la gabbia toracica, facendo attenzione a non perforare il cuore o i vasi adiacenti. Utilizzare una pinza per capovolgere il fegato nella cavità toracica e per spostare l'intestino fuori dalla cavità corporea per esporre il dotto biliare comune. Usa un morsetto bulldog Johns Hopkins per occludere l'ampolla di Vater.
- Recuperare una siringa Luer lock da 10 mL precaricata con 3 mL di soluzione calda di agarosio dal bagno d'acqua a 37 °C.
NOTA: Una volta rimossa la siringa con l'agarosio dal bagno d'acqua, l'iniezione del pancreas deve essere eseguita rapidamente prima che l'agarosio si raffreddi e si depositi nella siringa. - Tenendo la pinza nella mano sinistra, usarle per sostenere e stabilizzare delicatamente il dotto biliare per l'iniezione.
- Tenere la siringa nella mano destra, inserire l'ago smussato verso l'alto nel dotto biliare. Iniettare lentamente e costantemente il pancreas. Una volta iniziata l'iniezione, il flusso non può essere interrotto senza l'indurimento dell'agarosio nella siringa e nel pancreas.
NOTA: il volume utilizzato dipenderà dal peso del mouse. Sulla base dell'esperienza, si raccomanda di utilizzare 1 mL di soluzione di agarosio per 10 g di peso corporeo del topo con un volume massimo di 2 ml. Il pancreas dovrebbe apparire leggermente gonfiato con una struttura più definitiva, ma non eccessivamente esteso. L'iniezione eccessiva provoca isole che si separano dal tessuto esocrino e che hanno un aspetto "soffiato" nelle fette. - Asportare il pancreas pieno di agarosio dal topo. Usando pinze e forbici, tagliare via il pancreas, iniziando dallo stomaco, spostandosi verso l'intestino e finendo con la milza. Una volta tagliato, rimuovere delicatamente il pancreas iniettato con una pinza e metterlo in una capsula di Petri di 10 cm piena di ECS refrigerato.
- Utilizzare le forbici per rimuovere l'adiposo, il tessuto connettivo, il tessuto fibrotico e le parti del pancreas che non vengono iniettate con agarosio.
NOTA: Le parti del tessuto che devono essere rimosse non avranno strutture fortemente consolidate e appariranno un po 'gelatinose. - Dopo aver tagliato il tessuto, utilizzare le forbici per tagliarlo in sezioni più piccole di circa 5 mm di diametro lasciandolo immerso sotto ECS. Tagliare il tessuto con cura, facendo attenzione a non spingere l'agarosio fuori dal tessuto.
- Rimuovere i pezzi di tessuto dall'ECS e posizionarli su un tergicristallo a due strati (vedere la tabella dei materiali). Arrotolarli delicatamente sul tergicristallo usando una pinza per rimuovere il liquido in eccesso.
- Usando una pinza, posizionare con cura i pezzi di tessuto in una capsula di Petri da 35 mm con non più di 4 pezzi per piastra. Posizionare il lato più piatto del blocco di tessuto rivolto verso il basso. Premere delicatamente sul tessuto usando una pinza.
NOTA: Assicurarsi che ci sia spazio, almeno qualche millimetro, tra i pezzi di tessuto e che non stiano toccando il bordo della piastra. - Versare lentamente l'agarosio a 37 °C nel piatto, facendo attenzione a non versarlo direttamente sul fazzoletto. Versare abbastanza in modo che i pezzi di tessuto siano completamente coperti. Assicurati che ci sia uno strato di agarosio sopra i pezzi di tessuto poiché questa parte sarà incollata al supporto del campione.
- Trasferire con cura il piatto con i pezzi di fazzoletto in frigorifero per consentire all'agarosio di fissarsi. Assicurarsi che i pezzi di tessuto non si spostino o inizino a fluttuare. Se lo fanno, riaggiustali rapidamente usando una pinza.
NOTA: l'impostazione dell'agarosio dovrebbe richiedere solo pochi minuti. - Una volta che l'agarosio si è impostato, usa un bisturi per tagliare il tessuto in linea retta per creare blocchi di agarosio come se facessero una griglia tra i pezzi di tessuto. Assicurati di lasciare alcuni millimetri di agarosio che circonda tutti i lati del tessuto.
NOTA: Non ci dovrebbe essere alcun tessuto sporgente dall'agarosio. Ogni blocco dovrebbe essere un cubo di circa 5 mm x 5 mm x 5 mm di volume. - Usa il bisturi per capovolgere le sezioni vuote di agarosio che sono state tagliate attorno ai bordi del piatto. Rimuovere i blocchi con il tessuto dal piatto sollevandoli con cura con una pinza.
3. Generazione di fette pancreatiche di topo
- Usando la pinza, disporre i blocchi sul supporto del campione; posizionali lateralmente, tenendo presente che verranno capovolti sulla super colla. Disporre i blocchi in modo che non si estendano oltre la larghezza della lama. Mentre il vibratoma si muove lentamente, disporre i blocchi in modo che la lama debba spostarsi in avanti il meno possibile.
NOTA: Due file di tre o quattro blocchi ciascuna con pochi millimetri tra le righe funzionano bene. I blocchi all'interno della stessa riga possono toccarsi, ma quando entrambe le righe si toccano, può essere difficile recuperare le fette mentre escono dai blocchi. - Applicare una linea di super colla sul portacampioni e utilizzare l'estremità del distributore di colla per stendere la colla in uno strato sottile. Capovolgere i blocchi di tessuto sulla colla in modo che il lato più vicino al tessuto sia rivolto verso l'alto. Spingere delicatamente verso il basso sui blocchi e lasciare asciugare la colla per tre minuti.
- Fissare il supporto della lama e la piastra al vibrato, in genere con una vite o un magnete, a seconda del modello di vibrame. Regolare l'altezza e la distanza percorsa della lama in modo che la lama si muova sulla lunghezza dei blocchi e appena sopra di essi.
NOTA: la pinza può essere utile durante la regolazione dell'altezza della lama. Possono essere posizionati sopra il blocco di tessuto per aiutare a posizionare la lama il più vicino possibile alla parte superiore del blocco senza toccare il blocco. - Assicurarsi che la colla si sia asciugata spingendo delicatamente i blocchi con una pinza e riempire il vassoio del vibratome con ECS refrigerato fino a quando la lama non è coperta. Impostare il vibratoma per creare fette di spessore 120 μm a una velocità di 0,175 mm/s, una frequenza di 70 Hz e un'ampiezza di 1 mm.
NOTA: La velocità del vibratoma può essere regolata in base alla facilità di taglio del tessuto. - Avviare il vibratoma e fare attenzione a quando le fette iniziano a staccarsi dai blocchi di tessuto. Utilizzare una pinza Graefe da 10 cm o un piccolo pennello n. 4 per rimuovere con cura le fette una volta che galleggiano fuori dal blocco e posizionarle in piastre da 10 cm con KRBH contenente 3 mM di D-glucosio e inibitore della tripsina. Raccogli le fette posizionando un pennello o una pinza sotto di esse e sollevando delicatamente le fette. Non incubare più di 15 fette insieme in un unico piatto.
NOTA: è normale che il vibratoma abbia alcuni passaggi sui blocchi in cui non vengono fatte fette, ma questi dovrebbero essere ridotti al minimo per il tempo. Avere le forbici pronte nel caso in cui le fette non si separino completamente dai blocchi di tessuto. Se ciò accade, un angolo o un bordo della fetta verrà attaccato al blocco dopo il passaggio della lama del vibratome. Non estrarre la fetta o il blocco quando si rimuove la fetta bloccata. - Posizionare le piastre con le fette su un bilanciere a temperatura ambiente e a 25 giri / min. Lasciare riposare le fette a temperatura ambiente per un'ora. Se devono essere lasciate più a lungo, posizionare le fette in 15 ml di terreno di coltura a fette (vedere tabella supplementare 1) in un'incubatrice. Incubare le fette preparate per gli studi in giornata a 37 °C e le fette di coltura che vengono coltivate durante la notte a 24 °C, trasferendole a 37 °C almeno 1 ora prima degli esperimenti.
NOTA: A lungo termine, le fette hanno una migliore vitalità se coltivate a 24 °C, anche se 37 °C sono più vicine al loro ambiente fisiologico nativo, probabilmente a causa della minore attività degli enzimi proteasi secreti a temperatura più bassa. Le fette di tessuto pancreatico umano e di topo vengono entrambe coltivate alla stessa temperatura e con un massimo di 15 fette per piatto. Tuttavia, le ricette dei media differiscono per le fette umane e di topo. Entrambe le formulazioni sono elencate nella Tabella supplementare 1. Inoltre, la procedura è la stessa per la generazione di fette di topo e umane ad eccezione del pancreas del topo che richiede l'iniezione di agarosio per la stabilizzazione. Le fette umane vengono acquisite attraverso il programma nPOD Pancreas Slice. Sia le fette di topo che quelle umane hanno uno spessore di 120 μm. Una varietà di esperimenti può essere eseguita sulle fette; scegli i pannelli di colorazione che funzionano meglio per gli esperimenti pianificati.
4. Preparazione delle fette per le procedure di colorazione
- Coltivare le fette a 37 °C per almeno 1 ora prima degli esperimenti pianificati. KRBH caldo contenente 3 mM di D-glucosio in un bagno d'acqua a 37 °C. Trasferire 2 mL di KRBH contenenti 3mM di D-glucosio in un piatto da 35 mm e utilizzare un pennello per posizionare delicatamente la fetta nel piatto.
- Se la fetta viene trasferita dal mezzo, lavarla due volte con KRBH contenente 3 mM di D-glucosio. Aspirare accuratamente il KRBH con 3 mM di D-glucosio utilizzando una pipetta di trasferimento o una pipetta Pasteur, facendo attenzione a non disturbare la fetta. Conservare la fetta nel piatto con KRBH contenente 3 mM di D-glucosio mentre i pannelli di colorazione sono preparati.
5. Colorazione del ditizone
NOTA: Sebbene il ditizone possa essere usato per macchiare le isole di rosso, ucciderà la fetta in quanto è stato trovato citotossico per le isole17.
- Misurare 12,5 mg di ditizone, aggiungerlo a 1,25 ml di dimetilsolfossido e prendere questa miscela in una siringa da 50 mL. Riempire la siringa a un volume di 25 ml utilizzando Hanks Balanced Salt Solution e fissare un filtro all'estremità della siringa. Aliquota 2 mL di KRBH con 3 mM di D-glucosio e aggiungere 2 gocce della soluzione di ditizone filtrata dalla siringa da 50 mL in un piatto da 35 mm.
- Usando un pennello, posizionare con cura una fetta in una capsula di Petri da 35 mm. Immagina la fetta con gli isolotti indicati dalla colorazione rossa del ditizone usando uno stereomicroscopio.
6. Colorazione di vitalità
NOTA: Questa sezione del protocollo descrive come valutare la vitalità delle fette utilizzando calcein-AM e SYTOX Blue blu-fluorescente (vedere la tabella dei materiali). Calcein-AM deve essere usato ad una concentrazione di 4 μM e SYTOX Blue a 1 μM.
- Aliquota 2 mL di KRBH contenente 3 mM di D-glucosio e aggiungere 2 μL di colorante calcein-AM e SYTOX Blue per separare le aliquote. Vortice le miscele per 5 s.
- Aggiungere 200 μL di KRBH contenente 3 mM di D-glucosio e colorante calcein-AM a ciascun pozzetto di un vetro di copertura a 8 pozzetti.
NOTA: è possibile utilizzare piastre alternative e/o camere di imaging diverse da un vetro di copertura a 8 pozzetti. - Usando un pennello, posizionare con cura una fetta in ogni pozzetto del piatto e trasferire il piatto con le fette in un incubatore a 37 °C per 20 minuti. Lavare le fette due volte con KRBH contenente 3 mM di D-glucosio. Aspirare accuratamente il KRBH utilizzando una pipetta transfer o Pasteur, avendo cura di non disturbare la fetta.
- Porre la fetta in una capsula di Petri con fondo in vetro da 35 mm contenente 2 mL di KRBH con 3 mM di D-glucosio e 2 μL di SYTOX Blue ad una concentrazione di 1 μL per 1 mL di soluzione. Coprire la fetta con un'ancora a fetta, assicurandosi che il lato con l'arpa sia rivolto verso il basso. Scatta immagini della fetta.
NOTA: se l'ancora della fetta continua a galleggiare, bagnarla su entrambi i lati con KRBH contenente 3 mM di D-glucosio per immergerla nella soluzione. È fondamentale mantenere sempre le fette in soluzioni contenenti inibitore della proteasi, anche durante il caricamento del colorante. Le macchie di viabilità utilizzate possono essere adattate per l'esperimento specifico o la configurazione del microscopio.
7. Colorazione dell'indicatore Ca2+ della fetta
NOTA: questa sezione del protocollo descrive come macchiare le fette per le registrazioni Ca2+ utilizzando Oregon Green 488 BAPTA-1, AM e SYTOX Blue nelle sezioni del mouse (vedere la Tabella dei materiali). L'Oregon Green 488 BAPTA-1, AM deve essere usato ad una concentrazione di 5,6 μM e il SYTOX Blue a 1 μM. Nelle fette umane, Fluo-4-AM deve essere usato ad una concentrazione di 6,4 μM.
- Aliquota 2 mL di KRBH contenente 3 mM di D-glucosio, aggiungere 7 μL di Oregon Green 488 BAPTA-1, AM e vortice la miscela per 5 s.
NOTA: per le fette di tessuto umano, utilizzare Fluo-4-AM invece di Oregon Green 488 BAPTA-1, AM. Il Fluo-4-AM è preferibile perché è più luminoso quando aumenta la concentrazione intracellulare di Ca2 +; tuttavia, non si carica bene nel tessuto pancreatico del topo. Il protocollo è lo stesso descritto sopra per Fluo-4-AM con l'eccezione che Fluo-4-AM deve essere incubato solo per 30 minuti. - Aggiungere 200 μL di KRBH contenente 3mM di D-glucosio e il colorante a ciascun pozzetto di un vetro di copertura a 8 pozzetti. Usando un pennello, posizionare con cura una fetta in ogni pozzetto del vetro di copertura camerato. Trasferire il vetro di copertura camerato con le fette in un incubatore a 37 °C per 45 minuti.
- Lavare le fette due volte con KRBH contenente 3 mM di D-glucosio. Aspirare accuratamente il KRBH con 3 mM di D-glucosio utilizzando una pipetta transfer o Pasteur, avendo cura di non disturbare la fetta.
- Posizionare una fetta in una piastra o camera di imaging con KRBH contenente 3 mM di D-glucosio e SYTOX Blue ad una concentrazione di 1 μL per 1 mL e coprire con un'ancora a fetta, assicurandosi che l'arpa sia rivolta verso il basso. Scatta immagini della fetta.
NOTA: In questo protocollo è stata utilizzata una parabola da 35 mm riempita con 2 mL di KRBH contenente 3 mM di D-glucosio e 2 μL di SYTOX Blue. Se l'ancora della fetta continua a galleggiare, bagnarla su entrambi i lati con KRBH contenente 3 mM di D-glucosio per immergerla in soluzione.
8. Registrazioni ca2+ della fetta di mouse
NOTE: La sezione seguente descrive come eseguire registrazioni Ca2+ su fette di tessuto pancreatico di topo utilizzando Oregon Green 488 BAPTA-1, AM e SYTOX Blue. L'imaging è stato eseguito su un microscopio a scansione laser confocale (vedere la Tabella dei materiali per i dettagli). I laser utilizzati erano 405 nm per il SYTOX Blue, 488 nm per l'Oregon Green 488 BAPTA-1, AM e 638 nm per la riflettanza. Un rilevatore HyD è stato utilizzato per l'Oregon Green 488 BAPTA-1, AM. I rivelatori a tubo fotomoltiplicatore (PMT) sono stati utilizzati per la riflettanza e il SYTOX Blue. Il protocollo di imaging Ca2+ è lo stesso per le fette di tessuto pancreatico umano, tranne per il fatto che Fluo-4-AM è stato utilizzato come indicatore. I livelli di potenza del laser, il guadagno e le dimensioni del foro stenopeico devono essere regolati in base al campione e alla particolare isolotto ripreso. In genere, un foro stenopeico di 1,5 unità ariose e una potenza laser dell'1% sono buoni punti di partenza.
- Almeno 1 ora prima della registrazione, accendere il microscopio ed equilibrare l'incubatore a 37 °C. Posizionare sul palco la capsula di Petri con fondo in vetro da 35 mm contenente la fetta dopo aver rimosso il coperchio. Mettere a fuoco impostando il microscopio sulla modalità obiettivo 10x e campo luminoso. Individua gli isolotti usando brightfield cercando ovali arancio-marrone all'interno della fetta.
- Una volta individuata una probabile isolotto, passare il microscopio alla modalità di imaging confocale. Per confermare gli isolotti in base alla riflettanza, accendere il laser a 638 nm, impostare la potenza del laser tra l'1% e il 2% e spegnere il filtro notch da 638 nm che normalmente rimuoverebbe la luce retrodiffusa. Impostare i limiti di rilevamento sul rilevatore PMT su una larghezza di banda di circa 20 nm centrata intorno a 638 nm.
NOTA: Prestare attenzione poiché l'utilizzo del microscopio in modalità di riflettanza potrebbe danneggiare il rilevatore. A causa dell'elevata granularità del tessuto endocrino, la luce riflessa può ora essere utilizzata per localizzare le isole. Le isole appariranno come gruppi di cellule granulari brillantemente retrodiffuse su questo canale di riflettanza. - Per visualizzare il SYTOX Blue, accendere il rilevatore laser e PMT da 405 nm e impostare la potenza del laser tra l'1% e il 2%. Centra l'isolotto di interesse nel campo visivo usando le manopole X e Y del controller dello stage. Una volta individuato un isolotto di interesse e confermato dal backscatter, passa all'obiettivo 20x e ingrandisci in modo che l'isolotto occupi la maggior parte dell'inquadratura.
- Prendi una pila z dell'isolotto con una dimensione z-step di 1,5 μm. Trova la migliore sezione ottica dell'isolotto in cui la maggior parte delle cellule sono vive (negativo per il SYTOX Blue) e ben caricato con l'Oregon Green 488 BAPTA-1, AM o Fluo-4-AM.
NOTA: Non è insolito vedere cellule che sono sovraccariche con una grande quantità di colorante e che sono molto luminose. Queste possono essere cellule pancreatiche morenti in cui può essere rilasciato lo stoccaggio di Ca2 + nel reticolo endoplasmatico, con conseguenti alti livelli di carico; queste non sono celle ideali da registrare. Cerca le cellule che hanno chiaramente caricato il colorante, ma non stanno sovrasaturando il rilevatore in modo che sia visibile un aumento della luminosità che si verifica quando i livelli citosolici di Ca2 + fluttuano. Il caricamento del colorante delle isole all'interno delle fette è variabile; tuttavia, il colorante in genere si carica bene attraverso ~ 10-15 μm dell'isolotto. Tuttavia, il carico del colorante può essere difficile da visualizzare se le cellule sono profonde nel tessuto. - Per evitare lo sbiadimento del colorante durante la registrazione, assicurarsi che la potenza del laser sul canale a 488 nm non superi il 2%. Aumentare il foro stenopeico a 2 unità ariose per raccogliere più segnale con una potenza di eccitazione inferiore.
- Impostare il microscopio per registrare in modalità XYZT. Ottimizza le impostazioni per ridurre la frequenza dei fotogrammi a 2 s o meno per fotogramma.
NOTA: le regolazioni delle impostazioni che possono essere effettuate per ridurre la frequenza dei fotogrammi includono l'attivazione della scansione bidirezionale, la diminuzione o la disattivazione della media di linea e l'aumento della velocità di scansione. - Una volta ottimizzate le impostazioni, registrare diversi minuti di attività basale.
NOTA: Un altro buon indicatore della vitalità dei tessuti è se le cellule appaiono attive e lampeggiano visibilmente durante questa registrazione dell'attività basale. - Aggiungere 100 μL di glucosio concentrato 20x e KCl in KRBH alla piastra utilizzando una micropipetta da 200 μL nei punti temporali indicati per ottenere una concentrazione finale di 16,7 mM di glucosio o 30 mM KCl.
NOTE: Aggiungere le soluzioni con attenzione, facendo attenzione a non disturbare la fetta durante la registrazione. Assicurati di non urtare la piastra con la micropipetta. È tipico vedere il tessuto contrarsi in risposta a queste stimolazioni. Le registrazioni del flusso di Ca2+ sono state elaborate e quantificate in ImageJ18. Utilizzando il software ImageJ, l'intensità di colorazione dell'Oregon Green 488 BAPTA-1, AM è stata misurata nelle celle selezionando manualmente le regioni di interesse (ROI). L'intensità di fluorescenza di questi ROI è stata calcolata dividendo i valori di fluorescenza nei punti temporali successivi per i valori di fluorescenza iniziali delle cellule (F / F0). Un sistema di perfusione può essere utilizzato insieme a una camera di imaging specializzata per amministrare le soluzioni alle fette in modo dinamico anziché aggiungerle manualmente. Le raccomandazioni sul sistema di perfusione e sulla camera di imaging sono disponibili nella Tabella dei materiali.
9. Colorazione delle cellule T di topo in fette pancreatiche vive
NOTA: questa sezione del protocollo descrive come macchiare le cellule immunitarie all'interno di fette di topo. Il ceppo di topo utilizzato è il NOD. Rag1-/-. AI4 α/β poiché questo modello sviluppa costantemente malattie con insolite significativa. Le cellule T CD8+ in questo topo prendono tutte di mira un epitopo di insulina, consentendo l'uso di un tetramero di insulina Db marcato con ficoeritrina (PE)15. L'anticorpo CD8 deve essere usato ad una concentrazione di 1:20 e il tetramero di insulina a 1:50.
- Aliquota 100 μL di KRBH contenente 3 mM di D-glucosio, aggiungere 2 μL di tetramero di insulina PE e 5 μL di anticorpo alloficocianina (APC) CD8 e vortice la miscela per 5 s.
- Aggiungere 100 μL di KRBH contenente 3 mM di D-glucosio e il tetramero e l'anticorpo a un pozzetto di un vetro di copertura a 8 pozzetti. Usando un pennello, posizionare con cura una fetta nel pozzetto del vetro di copertura camerato. Trasferire il vetro di copertura camerato con la fetta in un incubatore a 37 °C per 30 minuti.
- Lavare la fetta due volte con 2 mL di KRBH contenenti 3 mM di D-glucosio. Aspirare accuratamente il KRBH con 3 mM di D-glucosio utilizzando una pipetta transfer o Pasteur, facendo attenzione a non disturbare la fetta.
- Posizionare la fetta in una capsula di Petri con fondo in vetro da 35 mm contenente KRBH con 3 mM di D-glucosio e SYTOX Blue ad una concentrazione di 1 μL per 1 mL, e coprire con un'ancora a fetta, posizionando il lato con l'arpa rivolta verso il basso. Scatta immagini della fetta.
NOTA: se l'ancora della fetta continua a galleggiare, bagnarla su entrambi i lati con KRBH contenente 3 mM di D-glucosio per immergerla nella soluzione. L'anticorpo diluito e il tetramero possono essere riutilizzati una volta. Dopo aver macchiato due fette, deve essere fatta una miscela di anticorpi freschi.
10. Registrazione delle cellule immunitarie del topo
NOTA: la sezione seguente descrive come eseguire registrazioni di cellule immunitarie su fette di tessuto pancreatico di topo utilizzando anticorpo CD8, tetramero di insulina PE e SYTOX Blue. La configurazione dell'imaging è quella descritta nella sezione 8. Le registrazioni sono state effettuate a 800 × risoluzione di 800 pixel. I laser utilizzati erano 405 nm per il SYTOX Blue, 488 nm per il tetramero dell'insulina e 638 nm per l'anticorpo CD8 e la riflettanza. I rilevatori HyD sono stati utilizzati per l'anticorpo CD8 e il tetramero di insulina PE. I rilevatori PMT sono stati utilizzati per la riflettanza e il SYTOX Blue. Il protocollo di imaging delle cellule immunitarie è lo stesso per le fette di tessuto pancreatico umano, ad eccezione dell'uso di anticorpi diversi e multimeri HLA complessati con antigene per il tessuto umano. Sia per la colorazione del tetramero dell'insulina nel tessuto di topo che per la colorazione del multimero HLA nel tessuto umano, deve essere utilizzata una co-colorazione delle cellule immunitarie per verificare la presenza delle specifiche cellule T antigene-reattive. Qui è stato utilizzato un anticorpo anti-CD8. Gli anticorpi, come anti-CD3 o anti-CD4, possono anche essere utilizzati a seconda della popolazione cellulare target.
- Almeno 1 ora prima della registrazione, accendere il microscopio ed equilibrare l'incubatore sul palco a 37 °C. Fissare sul palco la capsula di Petri con fondo in vetro da 35 mm contenente la fetta. Focalizzare il microscopio impostando l'obiettivo 10x in modalità brightfield. Individua gli isolotti usando la modalità brightfield cercando ovali di colore arancio-marrone all'interno della fetta.
- Passare il microscopio all'imaging confocale premendo il pulsante CS sul controller touch screen del microscopio. Per visualizzare gli isolotti in base alla riflettanza, accendere il rilevatore laser e PMT 638, impostare la potenza del laser tra l'1% e il 2% e disattivare i filtri notch.
NOTA: A causa della maggiore granularità del tessuto endocrino, la luce riflessa può ora essere utilizzata per localizzare le isole. Le isole appariranno come gruppi di cellule granulari luminose su questo canale. - Per visualizzare il SYTOX Blue, l'anticorpo CD8 e il tetramero di insulina, verificare che la potenza del laser sia compresa tra l'1% e il 2%. Utilizzare le seguenti impostazioni per visualizzare ciascuna delle tre: per il SYTOX Blue, accendere il rilevatore laser e PMT da 405 nm; per l'anticorpo CD8, accendere il rilevatore HyD; e per visualizzare il tetramero dell'insulina, accendere il rilevatore laser e HyD da 488 nm.
- Centra l'isolotto di interesse nel campo visivo usando le manopole X e Y del controller dello stage. Una volta individuato un isolotto di interesse, passa all'obiettivo 20x e ingrandisci in modo che l'isolotto occupi la maggior parte del fotogramma. Prendi una pila z dell'isolotto con una dimensione z-step di 1,5 μm. Trova le migliori sezioni ottiche (una serie da 5 a 10 sezioni) dell'isolotto in cui la maggior parte delle cellule sono vive (negativo per il SYTOX Blue) e tutte le cellule immunitarie circostanti sono a fuoco.
NOTA: Cercare di trovare fotogrammi in cui ci sono più cellule CD8-positive e insulino-tetramero-positive che circondano o si infiltrano nell'isolotto. - Impostare il microscopio per registrare in modalità XYZT. Ottimizza le impostazioni per registrare uno Z-stack dei passaggi selezionati ogni 20 minuti per un periodo di diverse ore.
NOTA: Se possibile, è meglio eseguire queste registrazioni in una camera di imaging in cui è possibile controllare la temperatura e i livelli di CO2 , in particolare quando si registra per oltre quattro ore. Nel caso della registrazione notturna, l'eccesso di anticorpi può essere aggiunto al supporto per compensare il ciclo del recettore delle cellule T e lo sbiadimento del colorante. Inoltre, diversi fluorofori possono essere utilizzati per gli anticorpi delle cellule T. Sulla base dell'esperienza, gli anticorpi nella gamma rosso lontano funzionano meglio per le cellule T.
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Representative Results
Questo protocollo produrrà fette di tessuto pancreatico vivo adatte sia per studi di funzionalità che per registrazioni di cellule immunitarie. L'aspetto delle sezioni sia in campo luminoso che sotto la luce riflessa è mostrato nella Figura 1A,B. Come discusso, le isole possono essere trovate in fette usando la luce riflessa a causa della loro maggiore granularità che si verifica a causa del loro contenuto di insulina (Figura 1C) e sono chiaramente osservate rispetto al tessuto di fondo quando viene utilizzata la luce riflessa. La vitalità deve essere valutata dopo la generazione delle fette e le isole non devono essere registrate se più del 20% dell'isolotto non è vitale. Un isolotto con elevata vitalità è mostrato nella Figura 1D, mentre un esempio di una fetta mal lavorata è mostrato nella Figura supplementare 1. Le isole con bassa vitalità avranno una pesante colorazione SYTOX Blue e il tessuto sarà coperto dai nuclei colorati delle cellule morte. Inoltre, gli indicatori calcein-AM e Ca2+ come Oregon Green 488 BAPTA-1, AM utilizzati qui e Fluo-4-AM non si caricheranno bene nelle cellule morte. Gli isolotti devono essere selezionati per le registrazioni Ca2+ se sono vitali e se l'indicatore è caricato in tutto l'isolotto. Il carico dell'indicatore Ca2+ è indicativo della vitalità cellulare in quanto entrambi gli indicatori Ca2+ discussi in questo protocollo (Oregon Green 488 BAPTA-1, AM e Fluo-4-AM) sono caricati nelle cellule attraverso lo stesso meccanismo del colorante di vitalità, calcein-AM.
Sia per i coloranti indicatori Ca2+ che per la calceina-AM, quando le macchie vengono caricate nelle cellule, l'estere acetosimetilico viene idrolizzato all'interno della cellula e la molecola diventa impermeabile alla membrana19. Un altro indicatore positivo per la vitalità è l'attività basale osservabile in tutta l'isolotto con le cellule che lampeggiano e si spengono. L'attività basale dovrebbe anche essere osservabile nel tessuto esocrino in misura minore. Sebbene il tessuto di topo tenda ad avere un'attività basale meno visibile rispetto al tessuto umano, è ancora presente. Un isolotto da una fetta fatta da un NOD. Il pancreas rag1-/- del topo è mostrato nella Figura 2A. Come accennato in precedenza, l'Oregon Green 488 BAPTA-1, AM utilizzato qui ha un aumento dell'intensità di fluorescenza inferiore al legame di Ca2 + (~ 14 volte) rispetto a Fluo-4 (~ 100 volte). Tuttavia, l'Oregon Green 488 BAPTA-1, AM ha il vantaggio di una costante di dissociazione del calcio inferiore (Kd = 170 nM) rispetto al Fluo-4 (Kd = 335 nM), con il risultato che l'Oregon Green 488 BAPTA-1, AM è più sensibile a concentrazioni più basse di Ca2+ citosolico. Tuttavia, le risposte sono ancora quantificabili, come mostrato dalla Figura 2B. Esempi di un'isolotta all'interno di una fetta di tessuto pancreatico umano di controllo a riposo e di una che mostra una forte risposta glicemica elevata sono mostrati nella Figura 2C e nel Video supplementare 1. Il colorante Fluo-4-AM è caricato bene ed è visibile in tutta l'isolotto a basse concentrazioni di glucosio. Come discusso sopra, un evento tipico è che una percentuale di cellule carichi grandi quantità di colorante e appaia molto luminosa. Inoltre, i parametri dell'immagine sono stati impostati per questa registrazione in modo che la maggior parte delle cellule all'interno dell'isolotto non appaiano troppo luminose a basse concentrazioni di glucosio. Ciò consente al rilevatore di rilevare gli aumenti di luminosità che si verificano durante i cambiamenti nelle concentrazioni intracellulari di Ca2 + in risposta ad alti livelli di glucosio. La quantificazione della fluorescenza delle singole cellule durante questa risposta è mostrata nella Figura 2D, con il picco atteso dopo l'alta stimolazione del glucosio. Il software ImageJ è stato utilizzato per calcolare l'intensità di colorazione di Fluo-4-AM e Oregon Green 488 BAPTA-1, AM selezionando manualmente i ROI. L'aumento di piega dell'intensità di fluorescenza per ciascun ROI è stato calcolato normalizzando i valori di fluorescenza in momenti successivi utilizzando i valori di fluorescenza iniziali delle cellule (F / F0).
Il ditizone macchia gli isolotti di rosso ed è visibile sotto uno stereomicroscopio a campo luminoso. Isolotti e isolotti intatti che stanno iniziando a cadere a pezzi a causa dell'insorgenza di T1D possono essere entrambi osservati usando questo colorante (Figura 3A, B). Le isole possono essere trovate utilizzando la luce riflessa (Figura 3C) e possono iniziare a perdere granularità a causa dell'infiltrazione delle cellule immunitarie e della morte cellulare (Figura 3D). Più cellule CD3-positive possono essere viste infiltrarsi nell'isolotto nella Figura 3D. Le popolazioni di cellule immunitarie possono essere identificate in modo più specifico utilizzando l'anticorpo CD8 e la colorazione insulino-tetramera. L'imaging può quindi essere applicato per identificare le cellule che co-macchiano per entrambi i marcatori (Figura 3E). La co-colorazione delle cellule immunitarie che si infiltrano nell'isolotto nella Figura 3D indica che le cellule T effettrici sono cellule T effettrici che mirano specificamente all'antigene dell'insulina. La co-colorazione CD8 è essenziale per distinguere che le aree che si macchiano positive per il tetramero sono cellule immunitarie. Il tetramero non deve essere usato da solo senza una co-colorazione delle cellule immunitarie. Un confronto delle macchie dell'anticorpo CD8 del topo e del controllo dell'isotipo Rat IgG2a, κ può essere trovato nella Figura supplementare 2. Un ulteriore confronto tra un tetramero di controllo per il tetramero del virus della coriomeningite linfocitica (LCMV) e il tetramero dell'insulina può essere trovato nella Figura supplementare 3. Alcune cellule T rimangono ferme durante la registrazione, molte si muovono leggermente all'interno di una piccola area dell'isolotto e altre sono molto mobili e possono essere viste muoversi attraverso l'isolotto e il tessuto esocrino. Non è insolito vedere cellule T che mostrano più tipi di mobilità all'interno della stessa registrazione.
Figura 1: Panoramica delle fette e delle singole isole. (A) Immagine stereomicroscopica Darkfield di una fetta di tessuto pancreatico umano vivo con isole indicate da frecce rosse. (B) Immagine a luce riflessa di una fetta di tessuto pancreatico umano vivo con isole indicate da frecce bianche. (C) Immagine a luce riflessa di un'isolotto (delineata in magenta) all'interno di una fetta di tessuto pancreatico umano vivo. (D) Colorazione di vitalità di un'isolotto ad alta vitalità (delineata in magenta) all'interno di una fetta di tessuto pancreatico umano vivo. Le cellule vive sono indicate in verde e le cellule morte in blu. Barre di scala (A, B) = 1 mm; barre di scala (C, D) = 50 μm. Abbreviazione: AM = acetoxymethyl ester. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Registrazioni dei cambiamenti nelle concentrazioni intracellulari di Ca2+ e delle risposte all'alta concentrazione di glucosio di un NOD vivo. Rag1-/- fetta di tessuto pancreatico di topo e fetta di tessuto pancreatico umano da un donatore senza diabete. (A) Immagini di un isolotto all'interno di un NOD vivo. Rag1-/- fetta pancreatica di topo caricata con un Oregon Green 488 BAPTA-1, AM (vedi la Tabella dei materiali) sottoposta a stimolazione del glucosio. Da sinistra a destra, un'immagine a luce riflessa dell'isolotto, l'isolotto a basso contenuto di glucosio e l'isolotto in glucosio alto. (B) Tracce di fluorescenza della risposta Ca2+ di un isolotto all'interno di un NOD vivo. Rag1-/- fetta di tessuto con la risposta attesa ad alta concentrazione di glucosio [KRBH con 16,7 mM D-glucosio (16,7G)] e KCl [KRBH con 30 mM KCl e 3 mM D-glucosio]. (C) Immagini di un'isolotto all'interno di una fetta pancreatica umana viva caricata con Fluo-4-AM sottoposta a stimolazione del glucosio. Da sinistra a destra, un'immagine a luce riflessa dell'isolotto, l'isolotto a basso contenuto di glucosio e l'isolotto in glucosio alto. (D) Tracce di fluorescenza della risposta Ca2+ di un'isolotta all'interno di una fetta di tessuto pancreatico umano vivo con la risposta attesa a KRBH con 16,7 mM di D-glucosio (16,7G). Barre di scala (A) = 100 μm; barre di scala (C) = 50 μm. Abbreviazioni: KRBH = Krebs-Ringer buffer in bicarbonato; KCl = cloruro di potassio; ANNUIRE. Rag1-/- = gene-1-null attivante la ricombinazione diabetica non obesa; ANNUIRE. Rag1-/-. AI4 α/β = ceppo di topo transgenico del recettore delle cellule T (AI4). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Identificazione di isole e popolazioni di cellule immunitarie in NOD. Rag1-/- e NOD. Rag1-/-. AI4 α/β fette di mouse. (A) Colorazione del ditizone degli isolotti in un NOD. Rag1-/- fetta di topo con gli isolotti indicati in rosso. (B) Colorazione del ditizone degli isolotti in un NOD. Rag1-/-. AI4 α/β fetta di topo con gli isolotti indicati in rosso. Le isole stanno perdendo la loro forma a causa dell'insorgenza della malattia. (C) Immagine a luce riflessa di un isolotto in un NOD. Rag1-/- fetta di mouse. (D) Immagine a luce riflessa di un isolotto in un NOD. Rag1-/-. AI4 α/β fetta di topo con colorazione anticorpale CD3 (verde). (E) Colorazione di vitalità delle cellule morte (blu) e colorazione delle cellule immunitarie (CD8 in verde e tetramero di insulina in rosso) in un NOD. Rag1-/-. AI4 α/β fetta di mouse. Barre di scala (A) = 500 μm; barre di scala (B) = 50 μm; barre di scala (C) = 100 μm. Abbreviazioni: NOD. Rag1-/- = gene-1-null attivante la ricombinazione diabetica non obesa; ANNUIRE. Rag1-/-. AI4 α/β = ceppo di topo transgenico del recettore delle cellule T (AI4); CD = cluster di differenziazione; insulin-tet = tetramero di insulina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 1: NOD. Rag1-/- fetta pancreatica di topo a seguito di preparazione impropria senza inibitore della tripsina e un'incubazione notturna a 37 °C. (A) Immagine stereomicroscopica di Darkfield di un NOD vivo. Rag1-/- fetta di tessuto pancreatico di topo; barra della scala = 1 mm. (B) Immagine a luce riflessa di una fetta di tessuto pancreatico di topo vivo; barra di scala = 50 μm. (C) Colorazione di vitalità del tessuto a bassa vitalità. Le cellule morte sono indicate in blu; barra della scala = 50 μm. Abbreviazione: NOD. Rag1-/- = gene-1-null attivante la ricombinazione diabetica non obesa. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 2: Confronto delle colorazioni di IgG2a di ratto, anticorpo di controllo dell'isotipo κ (a sinistra) e anticorpo CD8 anti-topo di ratto (a destra) in NOD. Rag1-/-. AI4 α/β fette di mouse. (A) Immagini a luce riflessa di NOD dal vivo. Rag1-/-. AI4 α/β fette di tessuto pancreatico di topo che mostrano un'isolotto (a sinistra) e un vaso sanguigno (a destra). (B) Colorazione anticorpale di NOD vivo. Rag1-/-. AI4 α/β fette di tessuto pancreatico di topo. (C) Sovrapposizione della luce riflessa e dei canali anticorpali. Barre di scala per anticorpi di controllo (pannelli di sinistra) = 20 μm; barre di scala per anticorpi CD8 (pannelli di destra) = 50 μm. Abbreviazioni: NOD. Rag1-/- = gene-1-null attivante la ricombinazione diabetica non obesa; ANNUIRE. Rag1-/-. AI4 α/β = ceppo di topo transgenico del recettore delle cellule T (AI4); CD = cluster di differenziazione; IgG = immunoglobulina G. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 3: Confronto tra il tetramero del virus della coriomeningite linfocitica (a sinistra) e il tetramero dell'insulina (a destra) in NOD. Rag1-/-. AI4 α/β fette di mouse. (A) Immagini a luce riflessa di NOD dal vivo. Rag1-/-. AI4 α/β fette di tessuto pancreatico di topo che mostrano un vaso sanguigno nel tessuto esocrino (a sinistra) e nelle isole (a destra). (B) Colorazione tetramerica di un NOD vivo. Rag1-/-. AI4 α/β fette di tessuto di topo. (C) Sovrapposizione della luce riflessa e dei canali tetramerici. Abbreviazioni: NOD. Rag1-/- = gene-1-null attivante la ricombinazione diabetica non obesa; ANNUIRE. Rag1-/-. AI4 α/β = ceppo di topo transgenico del recettore delle cellule T (AI4); LCMV = virus della coriomeningite linfocitica; insulin-tet = tetramero di insulina. Fare clic qui per scaricare questo file.
Video supplementare 1: Registrazione di Ca2+ citosolico rilevato con Fluo-4 in risposta ad alta stimolazione del glucosio in una fetta di tessuto pancreatico umano da un donatore di controllo senza diabete. Si può osservare che le cellule all'interno del tessuto mostrano un'attività basale di Fluo-4 in una soluzione a basso contenuto di glucosio (3,0 mM), seguita da un aumento dell'intensità di fluorescenza del Fluo-4 in risposta a una stimolazione con glucosio alto (16,7 mM). Il video corrisponde alle immagini fisse e alle tracce mostrate nella Figura 2C,D. Clicca qui per scaricare questo video.
Tabella supplementare 1: Fare clic qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
L'obiettivo di questo protocollo è quello di spiegare la generazione di fette di pancreas e le procedure necessarie per impiegare le fette in studi funzionali e immunologici. Ci sono molti vantaggi nell'uso di fette pancreatiche vive. Tuttavia, ci sono diversi passaggi critici che sono essenziali affinché il tessuto rimanga vitale e utile durante i protocolli di esperimento descritti. È imperativo lavorare rapidamente. Il periodo di tempo tra l'iniezione del pancreas e la generazione delle fette sul vibratoma dovrebbe essere ridotto al minimo per mantenere la vitalità dei tessuti. La vitalità è anche migliorata mantenendo il pancreas in ECS freddo prima di affettare rispetto all'ECS a temperatura ambiente. È importante sottolineare che le fette non dovrebbero mai essere in mezzo senza inibitore della proteasi. Quando le fette vengono incubate senza l'inibitore della proteasi, ci sono grandi diminuzioni della vitalità.
Quando le fette sono state brevemente lasciate senza inibitore durante il caricamento del colorante, i flussi di Ca2 + in risposta all'alto livello di glucosio e KCl non potevano più essere registrati nonostante l'attività basale fosse ancora visibile nella fetta. Tutte le soluzioni utilizzate con fette vive, tra cui il KRBH con 3 mM di soluzione a riposo di D-glucosio, la soluzione di incubazione anticorpale e qualsiasi terreno di coltura, devono contenere tutti inibitore della proteasi ad una concentrazione di 0,1 mg per mL. I pannelli indicatori utilizzati per l'imaging a fette possono essere modificati a seconda dell'obiettivo dell'esperimento e della disponibilità di laser al microscopio. Esistono numerosi coloranti per la vitalità cellulare in diversi colori che possono essere utilizzati al posto del SYTOX Blue utilizzato qui (vedere la Tabella dei materiali). Per gli esperimenti Ca2+, Fluo-4-AM funziona bene nel tessuto umano. Alcuni ricercatori hanno successo nell'utilizzare l'Oregon Green 488 BAPTA-1, AM usato qui (vedi la Tabella dei materiali) per le fette di topo, mentre altri ottengono buoni risultati con Fluo-4-AM20,21,22.
Inoltre, i topi progettati per esprimere l'indicatore Ca2+ geneticamente codificato, GCaMP, nelle loro isole potrebbero essere utilizzati per aggirare la necessità di caricare le fette con un colorante indicatore Ca2 +. Sebbene l'Oregon Green 488 BAPTA-1, AM utilizzato qui non sia brillante come Fluo-4-AM, le risposte Ca2 + sono ancora osservabili e quantificabili. Ciò è evidenziato dall'aumento dei picchi fluorescenti mostrato nel NOD. Registrazioni rag1-/- slice a seguito di stimolazione ad alto contenuto di glucosio e KCl. Altre sostanze, come le sulfoniluree e l'arginina, possono essere utilizzate come controlli positivi alla fine del protocollo Ca2+, ma non sono ancora state utilizzate con fette23,24,25. Mentre ci sono molti vantaggi per il metodo di fetta di tessuto pancreatico vivo, ci sono anche alcune limitazioni. Sebbene le fette possano rimanere vitali per diversi giorni, ci sono forti cali di vitalità e funzionalità se vengono coltivate più a lungo, a meno che non vengano impiegate condizioni di coltura speciali11,26. Inoltre, poiché le fette contengono tessuto esocrino pancreatico vivo, le cellule acinari nelle fette continueranno a produrre e rilasciare enzimi digestivi che devono essere inibiti usando l'inibitore della proteasi. Pertanto, quando si utilizza questo protocollo per studi sull'uomo o sul topo, mantenere sempre fette in soluzioni con inibitore della proteasi.
Il metodo della fetta di tessuto pancreatico vivo evita di sottoporre il tessuto pancreatico a stress chimico esponendo il tessuto alla forza meccanica solo durante la generazione della fetta rispetto alle sostanze chimiche utilizzate durante le procedure di isolamento delle isole5. Inoltre, il tessuto pancreatico intatto viene mantenuto, consentendo una visione più olistica delle patologie e della fisiologia che si verificano naturalmente all'interno dell'organo5. Utilizzando il metodo della fetta di tessuto pancreatico vivo, l'attività delle cellule immunitarie può essere osservata in situ e in tempo reale insieme alla funzione tissutale. Ulteriori tecniche di imaging in vitro, come la microscopia a due fotoni, sono già state applicate a fette di tessuto derivate dal timo e potrebbero essere applicate a fette di tessuto pancreatico vivo27. L'identificazione delle popolazioni di cellule immunitarie presenti nel tessuto insieme alle loro attività e impatti consentirà di acquisire nuove conoscenze sulla patogenesi di malattie come T1D e T2D.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dalle sovvenzioni NIH R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638 e P01 AI042288. Questa ricerca è stata condotta con il supporto del Network for Pancreatic Organ donors with Diabetes (nPOD; RRID: SCR_014641), un progetto collaborativo di ricerca sul diabete di tipo 1 sponsorizzato da JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) e The Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant #2018PG-T1D053). Il contenuto e le opinioni espresse sono responsabilità degli autori e non riflettono necessariamente il punto di vista ufficiale di nPOD. Le organizzazioni di approvvigionamento di organi (OPO) che collaborano con nPOD per fornire risorse di ricerca sono elencate in http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. Grazie al Dr. Kevin Otto, Università della Florida, per aver fornito il vibratoma utilizzato per generare fette di mouse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #3 Style Scalpel Handle | Fisherbrand | 12-000-163 | |
| 1 M HEPES | Fisher Scientific | BP299-100 | HEPES Buffer, 1M Solution |
| 10 cm Untreated Culture Dish | Corning | 430591 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | BD | 301029 | BD Syringe with Luer-Lok Tips |
| 27 G Needle | BD | BD 305109 | BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles |
| 35 mm coverglass-bottom Petri dish | Ibidi | 81156 | µ-Dish 35 mm, high |
| 50 mL syringe | BD | 309653 | |
| 8-well chambered coverglass | Ibidi | 80826 | µ-Slide 8 Well |
| APC anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100712 | |
| BSA | Fisher Scientific | 199898 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5670 | CaCl2 |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | CaCl2 (dihydrate) |
| Compact Digital Rocker | Thermo Fisher Scientific | 88880020 | |
| Confocal laser-scanning microscope | Leica | SP8 | Pinhole = 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512 × 512 pixel resolution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C6H12O6 |
| ddiH2O | |||
| Dithizone | Sigma-Aldrich | D5130-10G | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | Dimethyl sulfoxide |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2805 | |
| Falcon 35 mm tissue culture dish | Corning | 353001 | Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes |
| FBS | Gibco | 10082147 | |
| Feather No. 10 Surgical Blade | Electron Microscopy Sciences | 7204410 | |
| fluo-4-AM | Invitrogen | F14201 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Gel Control Super Glue | Loctite | 45198 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | Hanks Balanced Salt Solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | C8H18N2O4S |
| Ice bucket | Fisherbrand | 03-395-150 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-05 | |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Roboz Surgical Store | RS-7440 | Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5" Length |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34705 | Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 2-Ply |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | This kit contains the calcein-AM live cell dye. |
| Low glucose DMEM | Corning | 10-014-CV | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | MgCl2 (hexahydrate) |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M2773 | MgSO4 (heptahydrate) |
| Magnetic Heated Platform | Warner Instruments | PM-1 | Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Microwave | GE | JES1460DSWW | |
| Nalgene Syringe Filter | Thermo Fisher Scientific | 726-2520 | |
| No.4 Paintbrush | Michaels | 10269140 | |
| Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | Imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Oregon Green 488 BAPTA-1-AM | Invitrogen | O6807 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Overnight imaging chamber | Okolab | H201-LG | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | To make agarose for slice generation |
| PE-labeled insulin tetramer | Emory Tetramer Research Core | sequence YAIENYLEL | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | KCl |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | KH2PO4 |
| Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 71998 | For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| SeaPlaque low melting-point agarose | Lonza | 50101 | To make agarose for slice generation |
| Slice anchor | Warner Instruments | 64-1421 | |
| Slice anchor (dynamic imaging) | Warner Instruments | 640253 | Slice anchor for dynamic imaging chamber |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | NaCl |
| Sodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | NaH2PO4 (monohydrate) |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20MW-AL | To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage |
| Stage-top incubator | Okolab | H201 | |
| Stereoscope | Leica | IC90 E MSV266 | |
| SYTOX Blue Dead Cell Stain | Invitrogen | S34857 | blue-fluorescent nucleic acid stain |
| Transfer Pipet | Falcon | 357575 | Falcon™ Plastic Disposable Transfer Pipets |
| Valve Control System | Warner Instruments | VCS-8 | System for dynamic stimulation recordings |
| Vibratome VT1000 S | Leica | VT1000 S | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 | Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02 |
References
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