Summary
Deze studie presenteert de toepassing van levende pancreasweefselplakken op de studie van eilandjesfysiologie en eiland-immuuncelinteracties.
Abstract
Levende pancreasweefselplakken maken de studie van eilandjesfysiologie en -functie mogelijk in de context van een intacte micro-omgeving van eilandjes. Plakjes worden bereid uit levend menselijk en muis pancreasweefsel ingebed in agarose en gesneden met behulp van een vibratome. Deze methode zorgt ervoor dat het weefsel levensvatbaarheid en functie behoudt, naast het behoud van onderliggende pathologieën zoals type 1 (T1D) en type 2 diabetes (T2D). De slice-methode maakt nieuwe richtingen mogelijk in de studie van de pancreas door het onderhoud van de complexe structuren en verschillende intercellulaire interacties die de endocriene en exocriene weefsels van de pancreas omvatten. Dit protocol demonstreert hoe kleuring en time-lapse microscopie van levende endogene immuuncellen in pancreasplakken kunnen worden uitgevoerd, samen met beoordelingen van de eilandjesfysiologie. Verder kan deze benadering worden verfijnd om immuuncelpopulaties te onderscheiden die specifiek zijn voor eilandcelantigenen met behulp van belangrijke histocompatibiliteit complex-multimeerreagentia.
Introduction
Betrokkenheid van de alvleesklier is pathognomonisch voor ziekten zoals pancreatitis, T1D en T2D1,2,3. De studie van de functie in geïsoleerde eilandjes omvat meestal het verwijderen van de eilandjes uit hun omgeving4. De methode voor het snijden van levend pancreasweefsel is ontwikkeld om de studie van pancreasweefsel mogelijk te maken met behoud van intacte micro-omgevingen van eilandjes en het vermijden van het gebruik van stressvolle isolatieprocedures voor eilandjes5,6,7. Pancreasweefselplakken van menselijk donorweefsel zijn met succes gebruikt om T1D te bestuderen en hebben processen van bètacelverlies en disfunctie aangetoond naast immuuncelinfiltratie8,9,10,11,12,13. De methode voor het snijden van levend pancreasweefsel kan worden toegepast op zowel muis- als menselijk pancreasweefsel5,6,8. Menselijke pancreasweefselplakken uit orgaandonorweefsels worden verkregen door een samenwerking met het Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD). Muissegmenten kunnen worden gegenereerd uit verschillende muizenstammen.
Dit protocol zal zich richten op niet-obese diabetische recombinatie activerende gen-1-null (NOD. Rag1-/-) en T-celreceptor transgeen (AI4) (NOD. Vod1-/-. AI4 α/β) muisstammen. KNIKKEN. Rag1-/- muizen zijn niet in staat om T- en B-cellen te ontwikkelen als gevolg van een verstoring in het recombinatie-activerende gen 1 (Rag1)14. KNIKKEN. Vod1-/-. AI4 α/β muizen worden gebruikt als model voor versnelde diabetes type 1 omdat ze een enkele T-celkloon produceren die zich richt op een epitoop van insuline, wat resulteert in consistente eilandjesinfiltratie en snelle ziekteontwikkeling15. Het protocol dat hier wordt getoond, beschrijft procedures voor functionele en immunologische studies met behulp van levende menselijke en muis pancreasplakken door de toepassing van confocale microscopiebenaderingen. De hierin beschreven technieken omvatten levensvatbaarheidsbeoordelingen, eilandjesidentificatie en -locatie, cytosolische Ca2 + -opnames, evenals kleuring en identificatie van immuuncelpopulaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKINGEN: Alle experimentele protocollen met muizen werden goedgekeurd door de University of Florida Animal Care and Use Committee (201808642). Menselijke pancreassecties van weefseldonoren van beide geslachten werden verkregen via de Weefselbank Netwerk voor Pancreasorgaandonoren met Diabetes (nPOD), Universiteit van Florida. Menselijke pancreata werden geoogst van cadaverische orgaandonoren door gecertificeerde orgaanverwervingsorganisaties die samenwerken met nPOD in overeenstemming met de wet- en regelgeving inzake orgaandonatie en geclassificeerd als "Niet-menselijke proefpersonen" door de University of Florida Institutional Review Board (IRB) (IRB nr. 392-2008), waarbij wordt afgezien van de noodzaak van toestemming. nPOD-weefsels die specifiek voor dit project werden gebruikt, werden goedgekeurd als niet-menselijk door de IRB van de Universiteit van Florida (IRB20140093). De doelstellingen van secties 1-3 van dit protocol zijn om uit te leggen hoe een muis met succes kan worden ontleed, de pancreas kan worden voorbereid en verwerkt en levende pancreasweefselplakken kunnen worden gegenereerd. Oplossingen moeten van tevoren worden bereid en de recepten zijn te vinden in aanvullende tabel 1. Tijd is de meest kritische factor tijdens deze protocolstappen. Zodra de muis is opgeofferd, zal de levensvatbaarheid van het weefsel beginnen af te nemen. Alle drie de onderdelen van dit protocol moeten zo snel mogelijk worden voltooid totdat alle benodigde segmenten zijn gegenereerd.
1. Voorbereiding voor het genereren van alvleesklierplakken van muizen
- Klem het mes vast aan de vibratome bladehouder, maar bevestig het nog niet aan de vibratome.
- Smelt 100 ml van 1,25% w/v agarose met een laag smeltpunt in een magnetron. Bedien de magnetron met intervallen van 1 minuut en stop de magnetron gedurende 10 s als de agarose-oplossing begint te koken. Herhaal dit proces totdat de agarose is gesmolten en een homogene oplossing is geproduceerd. Plaats de fles in een waterbad van 37 °C.
OPMERKING: De lage agaroseconcentratie moet rekening houden met de lagere dichtheid van de alvleesklier van de muis. - Vul een Luer lock spuit van 10 ml met 3 ml warme agarose. Plaats een naald van 27 G 25 mm op de spuit. Bewaar de spuit met de afgedekte naald in een waterbad van 37 °C totdat de oplossing moet worden geïnjecteerd.
OPMERKING: Een naald van 27 G heeft de voorkeur omdat deze veilig in het gemeenschappelijke galkanaal van muizen past tussen 10-25 g lichaamsgewicht en de stroom van de zeer viskeuze agarose-oplossing mogelijk maakt. Hoewel grotere boornaalden kunnen worden geselecteerd voor gebruik, worden kleinere (grotere) naalden niet aanbevolen omdat deze gemakkelijker verstopt kunnen raken met de agarose-oplossing. - Voeg 20 ml gekoelde extracellulaire oplossing (ECS) toe aan een petrischaaltje van 10 cm.
OPMERKING: Het ECS hoeft op geen enkel moment te worden gebromd. - Vul twee onbehandelde petrischalen van 10 cm met 15 ml Krebs-Ringer bicarbonaatbuffer (KRBH) met 3 mM D-glucose en soja-trypsineremmer in een concentratie van 0,1 mg/ml per schotel.
OPMERKING: In dit protocol is het essentieel dat alle oplossingen die worden gebruikt voor het onderhouden van plakjes soja-trypsineremmer bevatten om weefselschade veroorzaakt door spijsverteringsproteasen van de pancreas te voorkomen.
2. Muizen alvleesklier excisie en weefselverwerking
OPMERKING: Het protocol voor het uitzrijgen van de alvleesklier, het verwerken van het weefsel en het genereren van plakjes is gewijzigd van Marciniak et al5. Om de levensvatbaarheid van het weefsel te garanderen, minimaliseert u de hoeveelheid tijd tussen het verwijderen van de alvleesklier en het genereren van plakjes. Alle benodigde apparatuur moet van tevoren worden voorbereid en zodanig worden georiënteerd dat een snelle voortgang door de onderstaande stappen mogelijk is. Galweg canulatie en injectie, evenals pancreasexcisie kunnen het beste worden uitgevoerd onder een stereoscoop.
- De muis wordt diep verdoofd met isofluraan en opgeofferd door cervicale dislocatie.
OPMERKING: Isofluraan is de geprefereerde verdovingsmethode. Er moet een concentratie van 5% isofluraan worden gebruikt. Bijvoorbeeld, 0,26 ml moet worden gebruikt met een kamer van 1 l16. Een afname van de levensvatbaarheid van pancreasweefsel werd waargenomen wanneer CO2 werd gebruikt. - Spuit de muis royaal met 70% v/v ethanol om weefselbesmetting met vacht tijdens de dissectie en excisie te verminderen. Plaats de muis in een dorsale neerwaartse, ventrale omhoog oriëntatie met de voorste kant naar links.
- Gebruik een schaar, open het peritoneum en verwijder de ribbenkast, zorg ervoor dat u het hart of aangrenzende bloedvaten niet doorboort. Gebruik een tang om de lever in de borstholte te draaien en om de darmen uit de lichaamsholte te verplaatsen om het gemeenschappelijke galkanaal bloot te leggen. Gebruik een Johns Hopkins bulldogklem om het ampulla van Vater af te sluiten.
- Haal een Luer-slotspuit van 10 ml, voorgeladen met 3 ml warme agarose-oplossing, uit het waterbad van 37 °C.
OPMERKING: Zodra de spuit met de agarose uit het waterbad is verwijderd, moet de pancreasinjectie snel worden uitgevoerd voordat de agarose afkoelt en in de spuit terechtkomt. - Houd de tang in de linkerhand en gebruik ze om de galwegen voor de injectie voorzichtig te ondersteunen en te stabiliseren.
- Houd de spuit in de rechterhand, steek de naald schuine kant omhoog in het galkanaal. Injecteer langzaam en gestaag de alvleesklier. Zodra de injectie begint, kan de stroom niet worden gestopt zonder dat de agarose verhardt in de spuit en in de alvleesklier.
OPMERKING: Het gebruikte volume is afhankelijk van het gewicht van de muis. Op basis van ervaring wordt aanbevolen om 1 ml agarose-oplossing te gebruiken per 10 g lichaamsgewicht van de muis met een maximaal volume van 2 ml. De alvleesklier moet er enigszins opgeblazen uitzien met een meer definitieve structuur, maar niet overbelast. Overinjectie resulteert in eilandjes die gescheiden raken van het exocriene weefsel en die een "uitgeblazen" uiterlijk in de plakjes hebben. - Verwijder de met agarose gevulde alvleesklier uit de muis. Knip met een tang en schaar de alvleesklier weg, begin bij de maag, ga naar de darmen en eindig bij de milt. Eenmaal weggesneden, verwijder voorzichtig de geïnjecteerde alvleesklier met een tang en plaats in een petrischaaltje van 10 cm gevuld met gekoeld ECS.
- Gebruik een schaar om het vetweefsel, bindweefsel, fibrotisch weefsel en delen van de alvleesklier te verwijderen die niet met agarose zijn geïnjecteerd.
OPMERKING: Delen van het weefsel die moeten worden verwijderd, hebben geen sterk gevestigde structuren en zullen er enigszins gelatineus uitzien. - Gebruik na het trimmen van het weefsel een schaar om het in kleinere secties met een diameter van ongeveer 5 mm te knippen, terwijl u het onder ECS laat. Snijd het weefsel voorzichtig af en zorg ervoor dat de agarose niet uit het weefsel wordt geduwd.
- Verwijder de stukjes weefsel uit het ECS en plaats ze op een tweelaagse ruitenwisser (zie de tabel met materialen). Rol ze voorzichtig op de ruitenwisser met een tang om overtollige vloeistof te verwijderen.
- Plaats met een tang de stukjes weefsel voorzichtig in een petrischaaltje van 35 mm met niet meer dan 4 stuks per bord. Plaats de platste kant van het weefselblok naar beneden gericht. Druk zachtjes op het weefsel met een tang.
OPMERKING: Zorg ervoor dat er ruimte is, ten minste een paar millimeter, tussen de stukjes weefsel en dat ze de rand van de plaat niet raken. - Giet de 37 °C agarose langzaam in de schaal en zorg ervoor dat u deze niet rechtstreeks op het weefsel giet. Giet voldoende zodat de weefselstukken volledig bedekt zijn. Zorg ervoor dat er een laag agarose boven de weefselstukken zit, omdat dit deel op de monsterhouder wordt gelijmd.
- Breng de schaal met de stukjes tissue voorzichtig over naar een koelkast om de agarose te laten uitharden. Zorg ervoor dat de weefselstukken niet verschuiven of gaan drijven. Als ze dat doen, stel ze dan snel aan met een tang.
OPMERKING: Het instellen van de agarose duurt slechts enkele minuten. - Zodra de agarose is uitgezet, gebruik je een scalpel om in rechte lijnen rond het weefsel te snijden om agaroseblokken te maken alsof je een raster tussen de stukjes weefsel maakt. Zorg ervoor dat u een paar millimeter agarose rond alle zijden van het weefsel achterlaat.
OPMERKING: Er mag geen weefsel uitsteken uit de agarose. Elk blok moet een kubus zijn van ongeveer 5 mm x 5 mm x 5 mm volume. - Gebruik het scalpel om de lege delen van agarose uit te klappen die rond de randen van de plaat zijn gesneden. Verwijder de blokjes met het tissue uit de schaal door ze voorzichtig op te tillen met een tang.
3. Muis pancreas plakjes generatie
- Schik met behulp van een tang de blokken op de monsterhouder; plaats ze zijwaarts, houd er rekening mee dat ze op de superlijm worden geklapt. Schik de blokken zo dat ze niet verder reiken dan de bladbreedte. Terwijl de trilling langzaam beweegt, schik je de blokken zo dat het mes zo ver mogelijk naar voren moet bewegen.
OPMERKING: Twee rijen van elk drie of vier blokken met een paar millimeter tussen de rijen werkt goed. De blokken binnen dezelfde rij kunnen elkaar raken, maar wanneer beide rijen elkaar raken, kan het moeilijk zijn om segmenten op te halen als ze van de blokken komen. - Breng een lijn superlijm aan op de monsterhouder en gebruik het uiteinde van de lijmdispenser om de lijm in een dunne laag uit te spreiden. Draai de tissueblokken op de lijm zodat de kant die het dichtst bij het weefsel ligt naar boven is gericht. Druk zachtjes op de blokken en laat de lijm drie minuten drogen.
- Bevestig de bladhouder en de plaat aan de vibratome, meestal met een schroef of magneet, afhankelijk van het vibratome-model. Pas de bladhoogte en de afgelegde afstand zo aan dat het blad over de lengte van de blokken beweegt en er nauwelijks boven komt.
OPMERKING: Een tang kan nuttig zijn bij het aanpassen van de bladhoogte. Ze kunnen bovenop het weefselblok worden geplaatst om het mes zo dicht mogelijk bij de bovenkant van het blok te plaatsen zonder het blok aan te raken. - Zorg ervoor dat de lijm is opgedroogd door de blokken voorzichtig met een tang te duwen en vul de vibratome-lade met gekoeld ECS totdat het mes bedekt is. Stel de trilling in om plakjes met een dikte van 120 μm te maken met een snelheid van 0,175 mm/s, een frequentie van 70 Hz en een amplitude van 1 mm.
OPMERKING: De trillingssnelheid kan worden aangepast afhankelijk van het gemak van het snijden van het weefsel. - Start de vibratome en let op wanneer plakjes van de weefselblokken beginnen te komen. Gebruik een Graefe-tang van 10 cm of een kleine no. 4-verfkwast om de plakjes voorzichtig te verwijderen zodra ze van het blok drijven en plaats ze in 10 cm platen met KRBH met 3 mM D-glucose en trypsineremmer. Pak de plakjes op door er een kwast of tang onder te leggen en de plakjes voorzichtig op te tillen. Incubeer niet meer dan 15 plakjes samen in één bord.
OPMERKING: Het is normaal dat de vibratome een paar passen over de blokken heeft waar geen plakjes worden gemaakt, maar deze moeten gedurende de tijd worden geminimaliseerd. Houd een schaar bij de hand voor het geval de plakjes niet volledig scheiden van de weefselblokken. Als dit gebeurt, wordt een hoek of rand van de plak aan het blok geplakt nadat het trilmes is gepasseerd. Trek de plak of het blok niet af wanneer u het vastzittende plak verwijdert. - Leg de borden met de plakjes op een wip op kamertemperatuur en bij 25 rpm. Laat de plakjes een uur op kamertemperatuur rusten. Als ze langer worden gelaten, plaatst u de plakjes in 15 ml plakkweekmedium (zie aanvullende tabel 1) in een incubator. Incubeer plakjes die zijn bereid voor onderzoek op dezelfde dag bij 37 °C en kweekplakken die 's nachts bij 24 °C worden gekweekt, waarbij ze ten minste 1 uur vóór de experimenten worden overgebracht naar 37 °C.
OPMERKING: Op de lange termijn hebben de plakjes een betere levensvatbaarheid wanneer ze worden gekweekt bij 24 °C, hoewel 37 °C dichter bij hun oorspronkelijke fysiologische omgeving ligt, waarschijnlijk als gevolg van de lagere activiteit van de uitgescheiden protease-enzymen bij lagere temperatuur. Muis en menselijke pancreasweefselschijfjes worden beide gekweekt op dezelfde temperatuur en met een maximum van 15 plakjes per gerecht. De mediarecepten verschillen echter voor menselijke en muisplakken. Beide formuleringen zijn opgenomen in aanvullende tabel 1. Bovendien is de procedure hetzelfde voor het genereren van muis- en menselijke plakjes, met uitzondering van de muisalvleesklier die injectie met agarose vereist voor stabilisatie. Menselijke plakjes worden verkregen via het nPOD Pancreas Slice Program. Zowel muis- als menselijke plakjes zijn 120 μm dik. Een verscheidenheid aan experimenten kan worden uitgevoerd op de plakjes; kies vlekkenpanelen die het beste werken voor geplande experimenten.
4. Plakvoorbereiding voor kleuringsprocedures
- Kweek de plakjes bij 37 °C gedurende ten minste 1 uur vóór de geplande experimenten. Warme KRBH met 3 mM D-glucose in een waterbad van 37 °C. Breng 2 ml KRBH met 3mM D-glucose over in een schaal van 35 mm en gebruik een penseel om het plakje voorzichtig in de schaal te plaatsen.
- Als de plak wordt overgebracht van medium, was het dan tweemaal met KRBH met 3 mM D-glucose. Zuig de KRBH voorzichtig op met 3 mM D-glucose met behulp van een transferpipet of Pasteur-pipet, zorg ervoor dat de plak niet wordt verstoord. Bewaar de plak in de plaat met KRBH die 3 mM D-glucose bevat terwijl de kleuringspanelen worden voorbereid.
5. Dithizone kleuring
OPMERKING: Hoewel dithizon kan worden gebruikt om de eilandjes rood te kleuren, zal het de plak doden omdat het cytotoxisch is gebleken voor eilandjes17.
- Meet 12,5 mg dithizon af, voeg het toe aan 1,25 ml dimethylsulfoxide en neem dit mengsel op in een spuit van 50 ml. Vul de spuit tot een volume van 25 ml met Hanks Balanced Salt Solution en bevestig een filter aan het uiteinde van de spuit. Vul 2 ml KRBH met 3 mM D-glucose toe en voeg 2 druppels van de gefilterde dithizonoplossing uit de spuit van 50 ml toe aan een schaal van 35 mm.
- Leg met een kwast voorzichtig een plakje in een petrischaaltje van 35 mm. Stel het plakje met de eilandjes aangegeven door rode dithizonkleuring met behulp van een stereomicroscoop.
6. Levensvatbaarheid kleuring
OPMERKING: In dit gedeelte van het protocol wordt beschreven hoe de levensvatbaarheid van de plakjes kan worden beoordeeld met behulp van calceïne-AM en blauw-fluorescerend SYTOX Blue (zie de tabel met materialen). Calcein-AM moet worden gebruikt in een concentratie van 4 μM en SYTOX Blue bij 1 μM.
- Aliquot 2 ml KRBH met 3 mM D-glucose en voeg 2 μL calceïne-AM-kleurstof en SYTOX Blue toe om aliquots te scheiden. Vortex de mengsels gedurende 5 s.
- Voeg 200 μL KRBH met 3 mM D-glucose en calceïne-AM kleurstof toe aan elke put van een 8-well chambered coverglass.
OPMERKING: Alternatieve platen en/of beeldvormingskamers anders dan een 8-well chambered coverglass kunnen worden gebruikt. - Plaats met een penseel voorzichtig een plakje in elke put van het bord en breng het bord met de plakjes gedurende 20 minuten over in een incubator van 37 °C. Was de plakjes tweemaal met KRBH met 3 mM D-glucose. Aspirateer de KRBH voorzichtig met behulp van een transfer- of Pasteur-pipet en zorg ervoor dat de plak niet wordt verstoord.
- Plaats de plak in een petrischaaltje met 35 mm met 35 mm met 2 ml KRBH met 3 mM D-glucose en 2 μl SYTOX Blue in een concentratie van 1 μL per 1 ml oplossing. Bedek de plak met een plakanker en zorg ervoor dat de zijkant met de harp naar beneden is gericht. Maak foto's van het segment.
OPMERKING: Als het plakanker blijft drijven, maak het dan aan beide zijden nat met KRBH met 3 mM D-glucose om het onder te dompelen in de oplossing. Het is van cruciaal belang om de plakjes altijd te behouden in oplossingen die proteaseremmer bevatten, zelfs tijdens het laden van kleurstoffen. De gebruikte levensvatbaarheidsvlekken kunnen worden aangepast voor het specifieke experiment of de microscoopstelling.
7. Slice Ca2+ indicatorkleuring
OPMERKING: In dit gedeelte van het protocol wordt beschreven hoe u plakjes voor Ca2+ -opnamen kunt kleuren met Oregon Green 488 BAPTA-1, AM en SYTOX Blue in muissegmenten (zie de tabel met materialen). De Oregon Green 488 BAPTA-1, AM moet worden gebruikt in een concentratie van 5,6 μM en de SYTOX Blue in 1 μM. In menselijke plakjes moet Fluo-4-AM worden gebruikt in een concentratie van 6,4 μM.
- Aliquot 2 ml KRBH met 3 mM D-glucose, voeg 7 μL van de Oregon Green 488 BAPTA-1, AM en vortex het mengsel gedurende 5 s toe.
OPMERKING: Gebruik voor plakjes menselijk weefsel Fluo-4-AM in plaats van de Oregon Green 488 BAPTA-1, AM. De Fluo-4-AM heeft de voorkeur omdat deze helderder is wanneer de intracellulaire Ca2+ concentratie toeneemt; het laadt echter niet goed in pancreasweefsel van muizen. Het protocol is hetzelfde als hierboven beschreven voor Fluo-4-AM met de uitzondering dat Fluo-4-AM slechts gedurende 30 minuten hoeft te worden geïncubeerd. - Voeg 200 μL KRBH met 3mM D-glucose en de kleurstof toe aan elke put van een 8-well chambered coverglass. Gebruik een verfkwast en plaats voorzichtig een plakje in elke put van het kamerdekglas. Breng het kamerglas met de plakjes gedurende 45 minuten over in een incubator van 37 °C.
- Was de plakjes tweemaal met KRBH met 3 mM D-glucose. Zuig de KRBH voorzichtig op met 3 mM D-glucose met behulp van een transfer- of Pasteur-pipet en zorg ervoor dat de plak niet wordt verstoord.
- Plaats een plak in een beeldplaat of kamer met KRBH die 3 mM D-glucose en SYTOX Blue bevat in een concentratie van 1 μL per 1 ml en dek af met een plakanker, zodat de harp naar beneden is gericht. Maak foto's van het segment.
OPMERKING: In dit protocol werd een schaal van 35 mm gebruikt gevuld met 2 ml KRBH met 3 mM D-glucose en 2 μl SYTOX Blue. Als het plakanker blijft drijven, maak het dan aan beide zijden nat met KRBH met 3 mM D-glucose om het in oplossing onder te dompelen.
8. Mouse slice Ca2+ opnames
OPMERKINGEN: In de volgende sectie wordt beschreven hoe u Ca2+ opnames uitvoert op pancreasweefselplakken van muizen met behulp van de Oregon Green 488 BAPTA-1, AM en SYTOX Blue. Beeldvorming werd uitgevoerd op een confocale laserscanmicroscoop (zie de Tabel met materialen voor details). De gebruikte lasers waren 405 nm voor de SYTOX Blue, 488 nm voor de Oregon Green 488 BAPTA-1, AM en 638 nm voor reflectie. Een HyD detector werd gebruikt voor de Oregon Green 488 BAPTA-1, AM. Fotomultiplicatorbuis (PMT) detectoren werden gebruikt voor reflectie en de SYTOX Blue. Het Ca2+ beeldvormingsprotocol is hetzelfde voor menselijke pancreasweefselplakken, behalve dat Fluo-4-AM als indicator werd gebruikt. Laservermogensniveaus, versterking en pinhole-grootte moeten worden aangepast op basis van het monster en het afgebeelde eilandje. Doorgaans zijn een pinhole van 1,5 luchtige units en een laservermogen van 1% goede uitgangspunten.
- Schakel ten minste 1 uur voor de opname de microscoop in en breng de incubator op het podium of in kooistijl in evenwicht tot 37 °C. Plaats de petrischaal met de dekselbodem met de plak van 35 mm op het podium na het verwijderen van het deksel. Stel scherp door de microscoop in te stellen op de 10x objectief- en brightfield-modus. Lokaliseer eilandjes met behulp van brightfield door te zoeken naar oranjebruine ovalen in de plak.
- Zodra een waarschijnlijk eilandje is gelokaliseerd, schakelt u de microscoop over naar de confocale beeldvormingsmodus. Om eilandjes op reflectie te bevestigen, schakelt u de 638 nm-laser in, stelt u het laservermogen in tussen 1% en 2% en schakelt u het 638 nm-inkepingsfilter uit dat normaal gesproken teruggekaatst licht zou verwijderen. Stel de detectielimieten op de PMT-detector in op een bandbreedte van ongeveer 20 nm gecentreerd rond 638 nm.
OPMERKING: Wees voorzichtig omdat het bedienen van de microscoop in reflectiemodus de detector kan beschadigen. Vanwege de hoge granulariteit van het endocriene weefsel kan gereflecteerd licht nu worden gebruikt om eilandjes te lokaliseren. De eilandjes verschijnen als groepen helder backscaterende korrelige cellen op dit reflectiekanaal. - Om de SYTOX Blue te bekijken, schakelt u de 405 nm laser en PMT-detector in en stelt u het laservermogen in tussen 1% en 2%. Centreer het interessante eilandje in het gezichtsveld met behulp van de X- en Y-knoppen van de podiumcontroller. Zodra een interessant eilandje is gelokaliseerd en bevestigd door backscatter, schakelt u over naar het 20x-objectief en zoomt u in, zodat het eilandje het grootste deel van het frame in beslag neemt.
- Neem een z-stack van het eilandje met een z-stapgrootte van 1,5 μm. Zoek het beste optische gedeelte van het eilandje waar de meeste cellen leven (negatief voor de SYTOX Blue) en goed geladen met de Oregon Green 488 BAPTA-1, AM of Fluo-4-AM.
OPMERKING: Het is niet ongebruikelijk om cellen te zien die overbelast zijn met een grote hoeveelheid kleurstof en die erg helder zijn. Dit kunnen stervende pancreascellen zijn waarin Ca2 + -opslag in het endoplasmatisch reticulum kan vrijkomen, wat resulteert in hoge niveaus van belasting; dit zijn geen ideale cellen om op te nemen. Zoek naar cellen die de kleurstof duidelijk hebben geladen, maar de detector niet oververzadigen, zodat een toename in helderheid zichtbaar is die optreedt wanneer cytosolische Ca2 + -niveaus fluctueren. Kleurstofbelasting van eilandjes in plakjes is variabel; de kleurstof laadt echter meestal goed door ~ 10-15 μm van het eilandje. Het laden van kleurstoffen kan echter moeilijk te visualiseren zijn als de cellen zich diep in het weefsel bevinden. - Om te voorkomen dat kleurstof tijdens de opname vervaagt, moet u ervoor zorgen dat het laservermogen op het 488 nm-kanaal niet hoger is dan 2%. Verhoog het gaatje tot 2 luchtige eenheden om meer signaal te verzamelen met een lager excitatievermogen.
- Stel de microscoop in om op te nemen in de XYZT-modus. Optimaliseer de instellingen om de framesnelheid te verlagen tot 2 s of minder per frame.
OPMERKING: Instellingen die kunnen worden aangepast om de framesnelheid te verlagen, zijn onder meer het inschakelen van bidirectioneel scannen, het verlagen of uitschakelen van het lijnmiddeling en het verhogen van de scansnelheid. - Zodra de instellingen zijn geoptimaliseerd, neemt u enkele minuten basale activiteit op.
OPMERKING: Een andere goede indicator van de levensvatbaarheid van het weefsel is als de cellen actief lijken en zichtbaar knipperen tijdens deze registratie van basale activiteit. - Voeg 100 μL 20x geconcentreerde glucose en KCl in KRBH toe aan de plaat met behulp van een micropipette van 200 μL op de gegeven tijdstippen om een eindconcentratie van 16,7 mM glucose of 30 mM KCl te bereiken.
OPMERKINGEN: Voeg de oplossingen voorzichtig toe en zorg ervoor dat u de plak niet verstoort tijdens de opname. Zorg ervoor dat je de plaat niet stoot met de micropipette. Het is typisch om het weefsel te zien samentrekken als reactie op deze stimulaties. De Ca2+ flux opnames werden verwerkt en gekwantificeerd in ImageJ18. Met behulp van ImageJ-software werd de kleuringsintensiteit van de Oregon Green 488 BAPTA-1, AM gemeten in de cellen door handmatig interessante gebieden (ROI's) te selecteren. De fluorescentie-intensiteit van deze ROIs werd berekend door de fluorescentiewaarden op latere tijdstippen te delen door de initiële fluorescentiewaarden van de cellen (F/F0). Een perfusiesysteem kan samen met een gespecialiseerde beeldvormingskamer worden gebruikt om de oplossingen voor segmenten dynamisch toe te dienen in plaats van ze handmatig toe te voegen. Aanbevelingen voor perfusiesystemen en beeldvormingskamers zijn te vinden in de tabel met materialen.
9. Kleuring van muis T-cellen in levende pancreasplakken
OPMERKING: In dit gedeelte van het protocol wordt beschreven hoe u immuuncellen in muisschijfjes kunt kleuren. De gebruikte muizenstam is de NOD. Vod1-/-. AI4 α/β omdat dit model consequent ziekte ontwikkelt met significante insulitis. De CD8+ T-cellen in deze muis richten zich allemaal op een epitoop van insuline, waardoor het gebruik van een phycoerythrin (PE)-gelabeld insuline-Db-tetrameer15 mogelijk is. Het CD8-antilichaam moet worden gebruikt in een concentratie van 1:20 en het insulinetetrameer in 1:50.
- Aliquot 100 μL KRBH met 3 mM D-glucose, voeg 2 μL PE insulinetetrameer en 5 μL allophycocyanine (APC) CD8 antilichaam toe en vortex het mengsel gedurende 5 s.
- Voeg 100 μL KRBH met 3 mM D-glucose en het tetrameer en antilichaam toe aan een put van een 8-well chambered coverglass. Gebruik een verfkwast en plaats voorzichtig een plakje in de put van het kamerdekglas. Breng het dekselglas met de kamer met de plak gedurende 30 minuten over in een incubator van 37 °C.
- Was de plak tweemaal met 2 ml KRBH met 3 mM D-glucose. Zuig de KRBH voorzichtig op met 3 mM D-glucose met behulp van een transfer- of Pasteur-pipet, zorg ervoor dat de plak niet wordt verstoord.
- Plaats de plak in een petrischaaltje met 35 mm met glazen bodem met KRBH met 3 mM D-glucose en de SYTOX Blue in een concentratie van 1 μL per 1 ml en dek af met een plakanker en plaats de zijkant met de harp naar beneden gericht. Maak foto's van het segment.
OPMERKING: Als het plakanker blijft drijven, maak het dan aan beide zijden nat met KRBH met 3 mM D-glucose om het onder te dompelen in de oplossing. Het verdunde antilichaam en tetrameer kunnen eenmalig worden hergebruikt. Na het kleuren van twee plakjes moet een vers antilichaammengsel worden gemaakt.
10. Registratie van immuuncellen van muizen
OPMERKING: In de volgende sectie wordt beschreven hoe u immuuncelopnamen uitvoert op pancreasweefselplakken van muizen met behulp van CD8-antilichaam, PE-insulinetetrameer en SYTOX Blue. De beeldvormingsopstelling is zoals beschreven in rubriek 8. Er werden opnames gemaakt met een resolutie van 800 × 800 pixels. De gebruikte lasers waren 405 nm voor de SYTOX Blue, 488 nm voor het insulinetetrameer en 638 nm voor CD8-antilichaam en reflectie. HyD-detectoren werden gebruikt voor CD8-antilichaam en PE-insulinetetrameer. PMT-detectoren werden gebruikt voor reflectie en de SYTOX Blue. Het immuuncelbeeldvormingsprotocol is hetzelfde voor menselijke pancreasweefselplakken, behalve voor het gebruik van verschillende antilichamen en antigeencomplexeerde HLA-multimeren voor menselijk weefsel. Voor zowel insulinetetrameerkleuring in muizenweefsel als HLA-multimeerkleuring in menselijk weefsel moet een co-kleuring van immuuncellen worden gebruikt om de aanwezigheid van de specifieke antigeen-reactieve T-cellen te verifiëren. Hier werd een anti-CD8 antilichaam gebruikt. Antilichamen, zoals anti-CD3 of anti-CD4, kunnen ook worden gebruikt, afhankelijk van de doelcelpopulatie.
- Schakel ten minste 1 uur voor de opname de microscoop in en breng de incubator op het podium tot 37 °C in evenwicht. Bevestig de petrischaal met 35 mm met glazen bodem met het plakje op het podium. Stel de microscoop scherp door het 10x-objectief in de brightfield-modus in te stellen. Lokaliseer de eilandjes met behulp van de brightfield-modus door te zoeken naar oranjebruin gekleurde ovalen in de plak.
- Schakel de microscoop over naar confocale beeldvorming door op de CS-knop op de touchscreencontroller van de microscoop te drukken. Als u eilandjes op reflectie wilt bekijken, schakelt u de 638-laser- en PMT-detector in, stelt u het laservermogen in tussen 1% en 2% en schakelt u de inkepingfilters uit.
OPMERKING: Vanwege de verhoogde granulariteit van het endocriene weefsel kan gereflecteerd licht nu worden gebruikt om eilandjes te lokaliseren. De eilandjes verschijnen als groepen heldere korrelige cellen op dit kanaal. - Als u het SYTOX Blue-, CD8-antilichaam en insulinetetrameer wilt bekijken, controleert u of het laservermogen tussen 1% en 2% ligt. Gebruik de volgende instellingen om elk van de drie te bekijken: schakel voor de SYTOX Blue de 405 nm-laser en PMT-detector in; voor het CD8-antilichaam, zet de HyD-detector aan; en om het insulinetetrameer te bekijken, schakelt u de 488 nm laser en HyD-detector in.
- Centreer het interessante eilandje in het gezichtsveld met behulp van de X- en Y-knoppen van de podiumcontroller. Zodra een interessant eilandje zich bevindt, schakelt u over naar het 20x-objectief en zoomt u in, zodat het eilandje het grootste deel van het frame in beslag neemt. Neem een z-stack van het eilandje met een z-stapgrootte van 1,5 μm. Zoek de beste optische secties (een reeks van tussen de 5 en 10 secties) van het eilandje waar de meeste cellen leven (negatief voor de SYTOX Blue) en alle omliggende immuuncellen in focus zijn.
OPMERKING: Probeer frames te vinden waar meerdere CD8-positieve en insulinetetrameerpositieve cellen het eilandje omringen of infiltreren. - Stel de microscoop in om op te nemen in de XYZT-modus. Optimaliseer de instellingen om elke 20 minuten een Z-stack van de geselecteerde stappen op te nemen over een periode van enkele uren.
OPMERKING: Indien mogelijk is het het beste om deze opnames te doen in een beeldvormingskamer waar temperatuur en CO2-niveaus kunnen worden geregeld, vooral wanneer u langer dan vier uur opneemt. In het geval van nachtelijke opname kan overtollig antilichaam aan de media worden toegevoegd om de T-celreceptorcyclus en kleurvervaging te compenseren. Bovendien kunnen verschillende fluoroforen worden gebruikt voor de T-celantistoffen. Op basis van ervaring werken antilichamen in het verre rode bereik het beste voor T-cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol levert levende pancreasweefselplakken op die geschikt zijn voor zowel functionaliteitsstudies als immuuncelopnamen. Het uiterlijk van de segmenten in zowel helder als ondergereflecteerd licht is weergegeven in figuur 1A,B. Zoals besproken, kunnen eilandjes worden gevonden in plakjes met gereflecteerd licht vanwege hun verhoogde granulariteit die optreedt vanwege hun insulinegehalte (figuur 1C) en worden ze duidelijk waargenomen in vergelijking met het achtergrondweefsel wanneer gereflecteerd licht wordt gebruikt. De levensvatbaarheid moet worden beoordeeld na het genereren van plakjes en eilandjes mogen niet worden geregistreerd als meer dan 20% van het eilandje niet levensvatbaar is. Een eilandje met een hoge levensvatbaarheid wordt weergegeven in figuur 1D, terwijl een voorbeeld van een slecht verwerkt plakje wordt weergegeven in aanvullende figuur 1. Eilandjes met een lage levensvatbaarheid hebben zware SYTOX Blue-kleuring en het weefsel zal bedekt zijn met de gekleurde kernen van dode cellen. Bovendien zullen calceïne-AM- en Ca2 + -indicatoren zoals de Oregon Green 488 BAPTA-1, AM die hier wordt gebruikt en Fluo-4-AM niet goed laden in dode cellen. Eilandjes moeten worden geselecteerd voor Ca2+-opnamen als ze levensvatbaar zijn en als de indicator overal op het eilandje wordt geladen. Ca2 + indicatorbelasting is indicatief voor de levensvatbaarheid van cellen, aangezien beide Ca2 + -indicatoren die in dit protocol worden besproken (de Oregon Green 488 BAPTA-1, AM en Fluo-4-AM) in cellen worden geladen via hetzelfde mechanisme als de levensvatbaarheidskleurstof, calceïne-AM.
Voor zowel de Ca2 + indicatorkleurstoffen als calceïne-AM, wanneer de vlekken in cellen worden geladen, wordt de acetoxymethylester in de cel gehydrolyseerd en wordt het molecuul membraan ondoordringbaar19. Een andere positieve indicator voor levensvatbaarheid is waarneembare basale activiteit in het hele eilandje met cellen die aan en uit knipperen. Basale activiteit moet ook in mindere mate waarneembaar zijn in het exocriene weefsel. Hoewel muizenweefsel de neiging heeft om minder zichtbare basale activiteit te hebben dan menselijk weefsel, is het nog steeds aanwezig. Een eilandje van een plakje gemaakt van een NOD. Rag1-/- muis alvleesklier is weergegeven in figuur 2A. Zoals hierboven vermeld, heeft de Oregon Green 488 BAPTA-1, AM die hier wordt gebruikt een lagere fluorescentie-intensiteitstoename bij binding Ca2 + (~ 14-voudig) dan Fluo-4 (~ 100-voudig). De Oregon Green 488 BAPTA-1, AM heeft echter het voordeel van een lagere calciumdissociatieconstante (Kd = 170 nM) dan Fluo-4 (Kd = 335 nM), waardoor de Oregon Green 488 BAPTA-1, AM gevoeliger is voor lagere concentraties cytosolic Ca2 +. De antwoorden zijn echter nog steeds kwantificeerbaar, zoals blijkt uit figuur 2B. Voorbeelden van een eilandje in een controleschijfje van menselijk pancreasweefsel in rust en van een eilandje met een sterke hoge glucoserespons worden getoond in figuur 2C en aanvullende video 1. Fluo-4-AM kleurstof is goed geladen en is zichtbaar in het hele eilandje bij lage glucoseconcentraties. Zoals hierboven besproken, is een typische gebeurtenis dat een percentage cellen grote hoeveelheden kleurstof laadt en er zeer helder uitziet. Bovendien zijn de beeldparameters voor deze opname zo ingesteld dat de meeste cellen in het eilandje er bij lage glucoseconcentraties niet te helder uitzien. Dit stelt de detector in staat om de toename van de helderheid op te pikken die optreedt tijdens veranderingen in intracellulaire Ca2 + -concentraties als reactie op hoge glucosespiegels. De kwantificering van de fluorescentie van individuele cellen tijdens deze respons is weergegeven in figuur 2D, met de verwachte piek na de hoge glucosestimulatie. ImageJ-software werd gebruikt om de kleurintensiteit van Fluo-4-AM en de Oregon Green 488 BAPTA-1, AM te berekenen door handmatig ROI's te selecteren. De vouwtoename in fluorescentie-intensiteit voor elke ROI werd berekend door de fluorescentiewaarden op latere tijdstippen te normaliseren met behulp van de initiële fluorescentiewaarden van de cellen (F/F0).
Dithizone kleurt de eilandjes rood en is zichtbaar onder een brightfield stereomicroscoop. Intacte eilandjes en eilandjes die uit elkaar beginnen te vallen als gevolg van het begin van T1D kunnen beide worden waargenomen met behulp van deze kleurstof (figuur 3A, B). Eilandjes kunnen worden gevonden met behulp van gereflecteerd licht (figuur 3C) en kunnen granulariteit beginnen te verliezen als gevolg van infiltratie van immuuncellen en celdood (figuur 3D). Meerdere CD3-positieve cellen zijn te zien infiltreren in het eilandje in Figuur 3D. Immuuncelpopulaties kunnen specifieker worden geïdentificeerd met behulp van CD8-antilichaam en insuline-tetrameerkleuring. Beeldvorming kan vervolgens worden toegepast om cellen te identificeren die co-kleuren voor beide markers (figuur 3E). De co-kleuring van de immuuncellen die het eilandje infiltreren in figuur 3D geeft aan dat de cellen effector T-cellen zijn die zich specifiek richten op het insuline-antigeen. De CD8 co-kleuring is essentieel om te onderscheiden dat de gebieden die positief kleuren voor tetrameer immuuncellen zijn. Het tetrameer mag niet alleen worden gebruikt zonder een co-kleuring van de immuuncel. Een kleurvergelijking van het CD8-antilichaam van de muis en de isotypecontrole Rat IgG2a, κ is te vinden in supplementele figuur 2. Een aanvullende vergelijking van een controletetrameer voor lymfocytisch choriomeningitisvirus (LCMV) tetrameer en het insulinetetrameer is te vinden in supplementele figuur 3. Sommige T-cellen blijven gedurende de hele opname stationair, veel bewegen iets binnen een klein gebied van het eilandje en andere zijn zeer mobiel en kunnen worden gezien als bewegend door het eilandje en exocrien weefsel. Het is niet ongebruikelijk om T-cellen te zien die meerdere mobiliteitstypen vertonen binnen dezelfde opname.
Figuur 1: Overzicht van plakjes en individuele eilandjes. (A) Darkfield stereomicroscopiebeeld van een levend menselijk pancreasweefselschijfje met eilandjes aangegeven door rode pijlen. (B) Gereflecteerd lichtbeeld van een levend menselijk pancreasweefsel met eilandjes aangegeven met witte pijlen. (C) Gereflecteerd lichtbeeld van een eilandje (omlijnd in magenta) in een levend menselijk pancreasweefsel. (D) Levensvatbaarheidskleuring van een eilandje met hoge levensvatbaarheid (beschreven in magenta) in een levend plakje menselijk pancreasweefsel. Levende cellen zijn aangegeven in groene en dode cellen in blauw. Schaalstaven (A, B) = 1 mm; schaalstaven (C, D) = 50 μm. Afkorting: AM = acetoxymethyl ester. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Registratie van veranderingen in intracellulaire Ca2+ concentraties en reacties op hoge glucoseconcentratie van een levende NOD. Rag1-/- muis pancreasweefsel plak en menselijk pancreasweefsel plak van een donor zonder diabetes. (A) Afbeeldingen van een eilandje binnen een levende NOD. Rag1-/- muis pancreasschijf geladen met een Oregon Green 488 BAPTA-1, AM (zie de tabel met materialen) die glucosestimulatie ondergaat. Van links naar rechts, een gereflecteerd lichtbeeld van het eilandje, het eilandje in lage glucose en het eilandje in hoge glucose. (B) Fluorescentiesporen van de Ca2+- respons van een eilandje binnen een levende NOD. Rag1-/- weefselschijf met de verwachte respons op hoge glucoseconcentratie [KRBH met 16,7 mM D-glucose (16,7 G)] en KCl [KRBH met 30 mM KCl en 3 mM D-glucose]. (C) Beelden van een eilandje in een levende menselijke pancreasschijf geladen met Fluo-4-AM die glucosestimulatie ondergaat. Van links naar rechts, een gereflecteerd lichtbeeld van het eilandje, het eilandje in lage glucose en het eilandje in hoge glucose. (D) Fluorescentiesporen van de Ca2+ respons van een eilandje in een levend menselijk pancreasweefsel plakje met de verwachte respons op KRBH met 16,7 mM D-glucose (16,7G). Schaalstaven (A) = 100 μm; schaalstaven (C) = 50 μm. Afkortingen: KRBH = Krebs-Ringer bicarbonaat buffer; KCl = kaliumchloride; KNIKKEN. Rag1-/- = niet-obese diabetische recombinatie activerend gen-1-null; KNIKKEN. Vod1-/-. AI4 α/β = T-celreceptor transgene (AI4) muizenstam. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Identificatie van eilandjes en immuuncelpopulaties in NOD. Rag1-/- en NOD. Vod1-/-. AI4 α/β muissegmenten. (A) Dithizonekleuring van eilandjes in een NOD. Rag1-/- muisschijf met de rood aangegeven eilandjes. (B) Dithizonekleuring van eilandjes in een NOD. Vod1-/-. AI4 α/β muisschijfje met de rood aangegeven eilandjes. Eilandjes verliezen hun vorm als gevolg van het begin van de ziekte. (C) Gereflecteerd lichtbeeld van een eilandje in een NOD. Rag1-/- muisschijfje. (D) Gereflecteerd lichtbeeld van een eilandje in een NOD. Vod1-/-. AI4 α/β muisschijfje met CD3-antilichaamkleuring (groen). (E) Levensvatbaarheidskleuring van dode cellen (blauw) en immuuncelkleuring (CD8 in groen en insulinetetrameer in rood) in een NOD. Vod1-/-. AI4 α/β muissegment. Schaalstaven (A) = 500 μm; schaalstaven (B) = 50 μm; scale bars (C) = 100 μm. Afkortingen: NOD. Rag1-/- = niet-obese diabetische recombinatie activerend gen-1-null; KNIKKEN. Vod1-/-. AI4 α/β = T-celreceptor transgene (AI4) muizenstam; CD = cluster van differentiatie; insuline-tet = insulinetetrameer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: NOD. Rag1-/- muis pancreasschijf na onjuiste bereiding zonder trypsineremmer en een nachtelijke incubatie bij 37 °C. (A) Darkfield stereomicroscopiebeeld van een levende NOD. Rag1-/- muis pancreasweefsel plak; schaalbalk = 1 mm. (B) Gereflecteerd lichtbeeld van een levende pancreasweefselschijf van muizen; schaalbalk = 50 μm. (C) Levensvatbaarheidskleuring van weefsel met lage levensvatbaarheid. Dode cellen worden in blauw aangegeven; scale bar = 50 μm. Afkorting: NOD. Rag1-/- = niet-obese diabetische recombinatie activerend gen-1-null. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Rat IgG2a, κ isotype controle antilichaam (links) en rat anti-muis CD8 antilichaam (rechts) kleuring vergelijking in NOD. Vod1-/-. AI4 α/β muissegmenten. (A) Gereflecteerde lichtbeelden van live NOD. Vod1-/-. AI4 α/β pancreasweefselplakken van muizen met een eilandje (links) en een bloedvat (rechts). (B) Antilichaamkleuring van levende NOD. Vod1-/-. AI4 α/β pancreasweefselplakken van muizen. (C) Overlay van de gereflecteerde licht- en antilichaamkanalen. Schaalbalken voor controleantilichaam (linkerpanelen) = 20 μm; schaalstaven voor CD8-antilichaam (rechterpanelen) = 50 μm. Afkortingen: NOD. Rag1-/- = niet-obese diabetische recombinatie activerend gen-1-null; KNIKKEN. Vod1-/-. AI4 α/β = T-celreceptortransgene (AI4) muizenstam; CD = cluster van differentiatie; IgG = immunoglobuline G. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3: Lymfocytische choriomeningitis virustetrameer (links) en insulinetetrameer (rechts) kleuringsvergelijking in NOD. Vod1-/-. AI4 α/β muissegmenten. (A) Gereflecteerde lichtbeelden van live NOD. Vod1-/-. AI4 α/β pancreasweefselplakken van muizen met een bloedvat in exocrien weefsel (links) en eilandjes (rechts). (B) Tetrameerkleuring van een levende NOD. Vod1-/-. AI4 α/β muisweefsel plakjes. (C) Overlay van de gereflecteerde licht- en tetrameerkanalen. Afkortingen: NOD. Rag1-/- = niet-obese diabetische recombinatie activerend gen-1-null; KNIKKEN. Vod1-/-. AI4 α/β = T-celreceptor transgene (AI4) muizenstam; LCMV = lymfocytische choriomeningitis virus; insuline-tet = insulinetetrameer. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende video 1: Opname van cytosolische Ca2 + gedetecteerd met Fluo-4 als reactie op hoge glucosestimulatie in een menselijke pancreasweefselschijf van een controledonor zonder diabetes. Cellen in het weefsel kunnen worden waargenomen om basale Fluo-4-activiteit te vertonen in een lage glucose-oplossing (3,0 mM), gevolgd door een toename van de Fluo-4 fluorescentie-intensiteit als reactie op een stimulatie met hoge glucose (16,7 mM). De video komt overeen met de stilstaande beelden en sporen in figuur 2C,D. Klik hier om deze video te downloaden.
Aanvullende tabel 1: Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het doel van dit protocol is om het genereren van pancreasplakken en de procedures die nodig zijn om de plakjes te gebruiken in functionele en immunologische studies te verklaren. Er zijn veel voordelen aan het gebruik van levende pancreasplakken. Er zijn echter verschillende kritieke stappen die essentieel zijn voor het weefsel om levensvatbaar en nuttig te blijven tijdens de beschreven experimentprotocollen. Het is noodzakelijk om snel te werken. De tijdsduur tussen het injecteren van de alvleesklier en het genereren van de plakjes op de vibratome moet worden geminimaliseerd om de levensvatbaarheid van het weefsel te behouden. De levensvatbaarheid wordt ook verbeterd door de alvleesklier in koud ECS te houden voordat deze wordt gesneden in tegenstelling tot ECS bij kamertemperatuur. Belangrijk is dat plakjes nooit in medium mogen zijn zonder proteaseremmer. Wanneer plakjes worden geïncubeerd zonder de proteaseremmer, zijn er grote afnames in levensvatbaarheid.
Wanneer de plakjes tijdens het laden van de kleurstof kort zonder inhibitor werden achtergelaten, konden Ca2+ fluxen als reactie op hoge glucose en KCl niet langer worden geregistreerd, ondanks dat basale activiteit nog steeds zichtbaar was in de plak. Alle oplossingen die worden gebruikt met levende plakjes, waaronder de KRBH met 3 mM D-glucose rustoplossing, de antilichaamincubatieoplossing en alle kweekmedia, moeten allemaal proteaseremmer bevatten in een concentratie van 0,1 mg per ml. De indicatorpanelen die worden gebruikt voor slice imaging kunnen worden aangepast afhankelijk van het doel van het experiment en de beschikbaarheid van microscooplasers. Er zijn tal van cel levensvatbaarheid kleurstoffen in verschillende kleuren die kunnen worden gebruikt in plaats van de SYTOX Blue die hier wordt gebruikt (zie de tabel met materialen). Voor Ca2+ experimenten werkt Fluo-4-AM goed in menselijk weefsel. Sommige onderzoekers hebben succes met het gebruik van de Oregon Green 488 BAPTA-1, AM die hier wordt gebruikt (zie de tabel met materialen) voor muisplakken, terwijl anderen goede resultaten behalen met Fluo-4-AM20,21,22.
Bovendien kunnen muizen die zijn ontworpen om de genetisch gecodeerde Ca2 + -indicator, GCaMP, in hun eilandjes tot expressie te brengen, worden gebruikt om de noodzaak te omzeilen om de plakjes te laden met een Ca2 + indicatorkleurstof. Hoewel de Oregon Green 488 BAPTA-1, AM die hier wordt gebruikt, niet zo helder is als Fluo-4-AM, zijn de Ca2 + -reacties nog steeds waarneembaar en kwantificeerbaar. Dit blijkt uit de toename van fluorescerende pieken in de NOD. Rag1-/- slice opnames na hoge glucose en KCl stimulatie. Andere stoffen, zoals sulfonylureumderivaten en arginine, kunnen aan het einde van het Ca2+-protocol als positieve controle worden gebruikt, maar ze zijn nog niet gebruikt met plakjes23,24,25. Hoewel er veel voordelen zijn aan de methode voor het snijden van levend pancreasweefsel, zijn er ook enkele beperkingen. Hoewel de plakjes meerdere dagen levensvatbaar kunnen blijven, zijn er sterke dalingen in levensvatbaarheid en functionaliteit als ze langer worden gekweekt, tenzij speciale kweekomstandigheden worden gebruikt11,26. Bovendien, omdat de plakjes levend exocrien weefsel van de pancreas bevatten, zullen acinaire cellen in de plakjes spijsverteringsenzymen blijven produceren en vrijgeven die moeten worden geremd met behulp van proteaseremmer. Daarom, wanneer u dit protocol gebruikt voor studies bij mensen of muizen, moet u altijd plakjes in oplossingen met proteaseremmer behouden.
De methode voor het snijden van levend pancreasweefsel voorkomt dat het pancreasweefsel onder chemische stress wordt geplaatst door het weefsel alleen bloot te stellen aan mechanische kracht tijdens het genereren van plakjes in tegenstelling tot chemicaliën die worden gebruikt tijdens isolatieprocedures van eilandjes5. Bovendien wordt intact pancreasweefsel behouden, waardoor een meer holistisch beeld ontstaat van de pathologieën en fysiologie die van nature in het orgaan voorkomen5. Met behulp van de levende pancreasweefsel slice-methode kan immuuncelactiviteit in situ en real-time worden waargenomen naast de weefselfunctie. Aanvullende in vitro beeldvormingstechnieken, zoals twee-fotonenmicroscopie, zijn al toegepast op weefselplakken afgeleid van thymus en kunnen worden toegepast op levende pancreasweefselplakken27. Identificatie van immuuncelpopulaties die aanwezig zijn in het weefsel, samen met hun activiteiten en effecten, zal het mogelijk maken om nieuwe kennis op te doen over de pathogenese van ziekten zoals T1D en T2D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door NIH-subsidies R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638 en P01 AI042288. Dit onderzoek is uitgevoerd met steun van het Netwerk voor Pancreas orgaandonoren met Diabetes (nPOD; RRID:SCR_014641), een gezamenlijk type 1 diabetes onderzoeksproject gesponsord door JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R), en The Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant #2018PG-T1D053). De inhoud en meningen die worden geuit, zijn de verantwoordelijkheid van de auteurs en weerspiegelen niet noodzakelijkerwijs de officiële mening van nPOD. Organ Procurement Organizations (OPO) die samenwerken met nPOD om onderzoeksbronnen te bieden, worden vermeld op http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. Dank aan Dr. Kevin Otto, Universiteit van Florida, voor het leveren van de vibratie die wordt gebruikt om muisplakken te genereren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #3 Style Scalpel Handle | Fisherbrand | 12-000-163 | |
| 1 M HEPES | Fisher Scientific | BP299-100 | HEPES Buffer, 1M Solution |
| 10 cm Untreated Culture Dish | Corning | 430591 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | BD | 301029 | BD Syringe with Luer-Lok Tips |
| 27 G Needle | BD | BD 305109 | BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles |
| 35 mm coverglass-bottom Petri dish | Ibidi | 81156 | µ-Dish 35 mm, high |
| 50 mL syringe | BD | 309653 | |
| 8-well chambered coverglass | Ibidi | 80826 | µ-Slide 8 Well |
| APC anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100712 | |
| BSA | Fisher Scientific | 199898 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5670 | CaCl2 |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | CaCl2 (dihydrate) |
| Compact Digital Rocker | Thermo Fisher Scientific | 88880020 | |
| Confocal laser-scanning microscope | Leica | SP8 | Pinhole = 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512 × 512 pixel resolution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C6H12O6 |
| ddiH2O | |||
| Dithizone | Sigma-Aldrich | D5130-10G | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | Dimethyl sulfoxide |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2805 | |
| Falcon 35 mm tissue culture dish | Corning | 353001 | Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes |
| FBS | Gibco | 10082147 | |
| Feather No. 10 Surgical Blade | Electron Microscopy Sciences | 7204410 | |
| fluo-4-AM | Invitrogen | F14201 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Gel Control Super Glue | Loctite | 45198 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | Hanks Balanced Salt Solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | C8H18N2O4S |
| Ice bucket | Fisherbrand | 03-395-150 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-05 | |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Roboz Surgical Store | RS-7440 | Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5" Length |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34705 | Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 2-Ply |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | This kit contains the calcein-AM live cell dye. |
| Low glucose DMEM | Corning | 10-014-CV | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | MgCl2 (hexahydrate) |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M2773 | MgSO4 (heptahydrate) |
| Magnetic Heated Platform | Warner Instruments | PM-1 | Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Microwave | GE | JES1460DSWW | |
| Nalgene Syringe Filter | Thermo Fisher Scientific | 726-2520 | |
| No.4 Paintbrush | Michaels | 10269140 | |
| Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | Imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Oregon Green 488 BAPTA-1-AM | Invitrogen | O6807 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Overnight imaging chamber | Okolab | H201-LG | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | To make agarose for slice generation |
| PE-labeled insulin tetramer | Emory Tetramer Research Core | sequence YAIENYLEL | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | KCl |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | KH2PO4 |
| Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 71998 | For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| SeaPlaque low melting-point agarose | Lonza | 50101 | To make agarose for slice generation |
| Slice anchor | Warner Instruments | 64-1421 | |
| Slice anchor (dynamic imaging) | Warner Instruments | 640253 | Slice anchor for dynamic imaging chamber |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | NaCl |
| Sodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | NaH2PO4 (monohydrate) |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20MW-AL | To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage |
| Stage-top incubator | Okolab | H201 | |
| Stereoscope | Leica | IC90 E MSV266 | |
| SYTOX Blue Dead Cell Stain | Invitrogen | S34857 | blue-fluorescent nucleic acid stain |
| Transfer Pipet | Falcon | 357575 | Falcon™ Plastic Disposable Transfer Pipets |
| Valve Control System | Warner Instruments | VCS-8 | System for dynamic stimulation recordings |
| Vibratome VT1000 S | Leica | VT1000 S | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 | Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02 |
References
- Uc, A., Fishman, D. S.
- Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes. Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).
- Taylor, R. Type 2 diabetes: etiology and reversibility. Diabetes Care. 36 (4), 1047-1055 (2013).
- Meier, R. P., et al. Islet of Langerhans isolation from pediatric and juvenile donor pancreases. Transplant International. 27 (9), 949-955 (2014).
- Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
- Panzer, J. K., Cohrs, C. M., Speier, S. Using pancreas tissue slices for the study of islet physiology. Methods in Molecular Biology. 2128, 301-312 (2020).
- Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells. Pflugers Archive. 446 (5), 553-558 (2003).
- Panzer, J. K., et al. Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis. JCI Insight. 5 (8), 134525 (2020).
- Dolai, S., et al. Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis. Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).
- Dolai, S., et al. Pancreas-specific SNAP23 depletion prevents pancreatitis by attenuating pathological basolateral exocytosis and formation of trypsin-activating autolysosomes. Autophagy. , 1-14 (2020).
- Qadir, M. M. F., et al. Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration. Nature Communications. 11 (1), 3265 (2020).
- Cohrs, C. M., et al. Dysfunction of persisting β cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis. Cell Reports. 31 (1), 107469 (2020).
- Liang, T., et al. Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology. Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nat Reviews. Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).
- Lamont, D., et al. Compensatory mechanisms allow undersized anchor-deficient class I MHC ligands to mediate pathogenic autoreactive T cell responses. Journal of Immunology. 193 (5), 2135-2146 (2014).
- Anesthesia and analgesia in laboratory animals. Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. , Academic Press. (2011).
- Clark, S. A., Borland, K. M., Sherman, S. D., Rusack, T. C., Chick, W. L. Staining and in vitro toxicity of dithizone with canine, porcine, and bovine islets. Cell Transplantation. 3 (4), 299-306 (1994).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Monette, R., Small, D. L., Mealing, G., Morley, P. A fluorescence confocal assay to assess neuronal viability in brain slices. Brain Research Protocols. 2 (2), 99-108 (1998).
- Gál, E., et al. A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice. Frontiers in Physiology. 10, 938 (2019).
- Stožer, A., Dolenšek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PloS One. 8 (1), 54638 (2013).
- Stožer, A., et al. Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices. PLoS Computational Biology. 9 (2), 1002923 (2013).
- Früh, E., Elgert, C., Eggert, F., Scherneck, S., Rustenbeck, I. Glucagonotropic and glucagonostatic effects of KATP channel closure and potassium depolarization. Endocrinology. 162 (1), 136 (2021).
- Satin, L. S. New mechanisms for sulfonylurea control of insulin secretion. Endocrine. 4 (3), 191-198 (1996).
- Ren, J., et al. Slow oscillations of KATP conductance in mouse pancreatic islets provide support for electrical bursting driven by metabolic oscillations. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (7), 805-817 (2013).
- Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ. PLoS One. 8 (11), 78706 (2013).
- Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A.
