Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Vurdering av proteininteraksjoner i levende celler med FRET-sensibilisert utslipp

Published: April 22, 2021 doi: 10.3791/62241
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1, 2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen, 2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Summary

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) mellom to fluoroformolekyler kan brukes til å studere proteininteraksjoner i den levende cellen. Her er det gitt en protokoll for hvordan man måler FRET i levende celler ved å oppdage sensibilisert utslipp av akseptoren og slukke donormolekylet ved hjelp av konfokal laserskanningsmikroskopi.

Abstract

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) er den strålingsfrie overføringen av energi fra en eksitert donor til et akseptormolekyl og avhenger av molekylets avstand og orientering, samt omfanget av overlapping mellom donorutslipp og akseptorabsorpsjonsspektra. FRET tillater å studere samspillet mellom proteiner i levende celle over tid og i forskjellige subcellulære rom. Ulike intensitetsbaserte algoritmer for å måle FRET ved mikroskopi er beskrevet i litteraturen. Her er en protokoll og en algoritme gitt for å kvantifisere FRET-effektivitet basert på måling av både sensibilisert utslipp av akseptoren og slukking av donormolekylet. Kvantifiseringen av ratiometrisk FRET i den levende cellen krever ikke bare bestemmelse av crosstalk (spektral spill-over, eller bleed-through) av fluorescerende proteiner, men også deteksjonseffektiviteten til det mikroskopiske oppsettet. Protokollen som er gitt her, beskriver hvordan man vurderer disse kritiske parametrene.

Introduction

Mikroskopibasert analyse av Förster Resonance Energy Transfer (FRET) gjør det mulig å vurdere interaksjoner mellom proteiner i levende celler. Det gir romlig og tidsmessig informasjon, inkludert informasjon om hvor i cellen og i hvilket subcellulært rom interaksjonen finner sted, og om denne interaksjonen endres over tid.

Theodor Förster la det teoretiske grunnlaget for FRET i 19481. FRET er en strålingsfri overføring av energi fra en eksitert donor til et akseptormolekyl og avhenger av avstanden til molekylene og den relative orienteringen av deres overgangsdipoler, samt overlappingen mellom donorutslipp og akseptorabsorpsjonsspektra. Hastigheten av energioverføring er omvendt proporsjonal med den sjette kraften i donor-akseptoravstanden. Dermed kan FRET brukes til å måle molekylær nærhet i området 1-10 nm.

FRET konkurrerer med andre de-eksitasjonsprosesser av donormolekylet og resulterer i såkalt donor-quenching og sensibilisert utslipp av akseptoren. Donor-quenching er en reduksjon av antall utstrålede donorfotoner, mens sensibilisert utslipp er en økning i utsendte akseptorfotoner. Mange mikroskopiske FRET-analyser bruker fluorescensintensitetsmålinger, inkludert akseptorfotobleking 2, donorfotobleking2 eller FRET-sensibilisert fotobleking av akseptoren3.

Her presenteres en trinnvis eksperimentell protokoll og matematisk algoritme for å kvantifisere FRET ved hjelp av donorslukking og akseptorsensibilisert utslipp4,5, en metode som ofte refereres til som ratiometrisk FRET. Mange protokoller om hvordan man tilnærmer seg sensibilisert utslipp har blitt publisert, få har kvantifisert den absolutte FRET-effektiviteten 6,7,8,9. Kvantifiseringen av FRET-effektivitet i den levende cellen krever bestemmelse av (i) crosstalk (spektral spill-over, eller bleed-through) av fluorescerende proteiner og også (ii) deteksjonseffektiviteten til det mikroskopiske oppsettet. Mens crosstalk kan vurderes ved å avbilde celler som uttrykker bare en av fluoroforene, er vurderingen av den relative deteksjonseffektiviteten til donoren og akseptorfluorescensen mer komplisert. Det krever kunnskap om minst forholdet mellom antall donor- og akseptormolekyler som gir opphav til de målte signalene. Antallet fluoroforer uttrykt i levende celler varierer imidlertid fra celle til celle og er ukjent. Den såkalte α-faktoren karakteriserer de relative signalstyrkene fra et enkelt eksitert donor- og akseptormolekyl. Kunnskap om faktoren er en forutsetning for kvantitative ratiometriske FRET-målinger i prøver med variable akseptor-til-donor-molekylforhold som påtruffet under levende celleavbildning med fluorescerende proteiner. Ved å bruke et 1-til-1 donor-akseptorfusjonsprotein som en kalibreringssonde kan bestemmelsen av den α faktoren og fungerer også som en positiv kontroll. Denne genetisk koblede sonden uttrykkes av celler i ukjente totale mengder, men i en fast og kjent relativ mengde en-til-en. Følgende protokoll beskriver hvordan man konstruerer 1-til-1-sonden og hvordan man bruker den til kvantifisering av FRET-effektivitet. Et regneark som inneholder alle formler finnes i tillegget og kan brukes av leserne til å legge inn sine egne målinger i de respektive kolonnene som beskrevet nedenfor.

Mens protokollen bruker GFP-Cherry donor / akseptorpar, kan den presenterte tilnærmingen utføres med et hvilket som helst annet FRET-par. Tilleggsfil 1 gir detaljer om cyangule par.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Plasmid konstruksjon

  1. For å generere eGFP-mCherry1-fusjonssonden, bruk en N1 pattedyrcelleekspresjonsvektor (se materialfortegnelse) med mCherry110 satt inn ved hjelp av restriksjonsstedene AgeI og BsrGI.
  2. Bruk følgende oligonukleotider til å forsterke eGFP11 uten stoppkodon som SalI-BamHI fragment: N-terminal primer 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3' og C-terminal primer 5'-AAT ATA TGG ATC CCG CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC 3'.
  3. Sett inn dette SalI-BamHI-fragmentet i det flere kloningsstedet til N1-vektoren for å introdusere RNPPV-linker (fem aminosyrer) linker mellom det grønne og røde fluorescerende proteinet.
    MERK: Denne linkeren gir en gjennomsnittlig FRET-effektivitet for GFP-Cherry donor-akseptorparet på ca. 0,25 -0,3 (figur 1A). Valget av stive12 - og spiralformede13-linkere av varierende lengde for å skalere målt FRET-effektivitet har vært diskutert andre steder, men er ikke nødvendig for vårt formål med fusjonsproteinet. For enkelhets skyld vil vi kalle fluorescerende proteiner 'GFP' og 'Kirsebær'.

2. Cellekultur og transfeksjon

  1. Bruk en hvilken som helst cellelinje, for eksempel NRK-celler, til FRET-eksperimenter i medier, for eksempel Dulbeccos modifiserte Eagle's media (DMEM), uten fenolrødt, for å redusere bakgrunnsfluorescens. Av samme grunn anbefales bruk av fenolrødt gratis trypsin.
  2. Når cellene er 80% sammenflytende, løsner celler med 1 ml 0,05% trypsin-EDTA, teller antall celler i suspensjon ved hjelp av et Neubauer-kammer og frø ca. 10.000 celler per brønn av et 8-brønnkammeret dekkglass; alternativt, fra en konfluent cellekultur dyrket i T25-kolben, bruk 1 dråpe cellesuspensjon fra en 2 ml pipette eller 3 dråper fra en 5 ml cellesuspensjon fra en konfluent kultur dyrket i en T12,5-cellekulturkolbe.
  3. Dyrk celler i 8-brønnkamre (0,8 cm 2 / brønn) med # 1,0 dekkglass for fluorescens levende cellemikroskopi ved standard cellekulturforhold (37 ° C og 5% CO2).
  4. 24 timer etter plating transfekt cellene ved hjelp av et passende kommersielt tilgjengelig transfeksjonsmedium (se materialfortegnelse), med GFP, kirsebær, GFP / kirsebærblanding (1: 1-blanding, dvs. 0,8 μg og 0,8 μg GFP og kirsebærplasmid-DNA), og GFP-kirsebærkimæren.
    1. For transfeksjon, bruk 5 μL av transfeksjonsreagenset i 45 μL DMEM og 1, 6 μg plasmid-DNA. Rør ved å forsiktig bla på mikrosentrifugerøret.
    2. Etter 15 min inkubasjon av blandingen ved romtemperatur, tilsett 1-2 μL av transfeksjonsreagensblandingen til hver brønn i 8-brønnkammerets lysbilde. Sett det kamrede dekselglasset tilbake til inkubatoren.
  5. La 20 timer etter transfeksjon gå før levende celleavbildning, for å muliggjøre riktig fluorescerende proteinuttrykk, folding og modning, spesielt av den røde fluoroforen.

3. FRET bildebehandling

  1. Bilde transfekterte celler i et fuktet og oppvarmet miljøkammer ved 37 °C. For å bufre cellemediet ved fysiologisk pH, bruk CO 2 gass satt til 5% strømning, eller legg til 20 mM HEPES for å gjøre cellemediet CO2-uavhengig.
  2. Bruk et konfokal laserskanningsmikroskop. Still inn eksitasjon og utslipp som følger for å optimalisere signalet og minimere krysstale.
    1. Bruk 488-nm-linjen til argonionlaseren for å opphisse GFP og 561-nm diodepumpet solid state-laser (eller 543 nm Helium Neon-laser, avhengig av tilgjengelige laserlinjer) for å opphisse Cherry.
    2. Sett følgende i programvaren til et kommersielt konfokalmikroskop. Sett Dichroic-speilet til 488 / 561 ved å klikke ved hjelp av rullegardinmenyen. Samle fluorescens ved hjelp av 488 nm laserlys for eksitasjon i kanal 1 gjennom et utslippsbånd på 505 - 530 nm (eller 505 - 550 nm) og i kanal 2 med et langpassfilter >585 nm og bruk 561 nm laserlys for eksitasjon i kanal 3 med et langpassfilter > 585 nm (type i bølgelengder). Båndpassfiltre f.eks. 590 - 650 nm eller lignende kan også brukes som har fordelen av å utelukke Raman-spredning.
  3. Exciter med de to laserne sekvensielt og sett bildemodusen til Switch etter hver linje slik at eksiteringen av bildet på 512 x 512 piksler veksler etter hver linje (og ikke etter hver ramme som ville oppheve evnen til å oppdage FRET på grunn av diffusjon av de merkede proteinene mens du tar opp bildene med forskjellige eksitasjoner; knappeklikk).
  4. Sett opp en mini-tidsserie med tre bilder med knappeklikk for å oppdage om betydelig fotobleking oppstår, og potensielt redusere lasereffekten. Fotobleking på mindre enn 1% er optimalt. Høy laserintensitet kan også føre til absorpsjonsmetning som reduserer den tilsynelatende FRET-effektiviteten14. Lasereffekt, opptil 10-20 μW målt ved objektivlinsen er trygt å bruke.
  5. Først bildeceller som uttrykker GFP-Cherry-fusjonskonstruksjonen. Angi parametrene som definerer den tidsintegrerte laserintensiteten per piksel i et konfokalt bilde, dvs. pikseloppholdstiden i mikrosekunder, den akustooptiske justerbare filteroverføringen (AOTF) i prosent og zoomen.
    1. Bildeceller som bruker et 63x oljeobjekt og Zoom satt til 3x. Dette gir tilstrekkelig forstørrelse og oppløsning til bildeceller i sin helhet. Sikt etter en pikselstørrelse på 70-80 nm.
    2. Sett Pixel oppholdstid til 2-4 μs og AOTF-overføring for 488 nm og 561 nm laser slik at bildene har et godt signal-støyforhold uten bleking og ingen piksler som viser fluorescensintensitetsmetning. Det er fordelaktig å justere lasereffekten på 488 og 561 slik at signalnivåene i kanal 1 og kanal 3 er like.
    3. Sett fotomultiplikatorforsterkningen (gjennomsnittsmodus) til 600-800.
  6. Bilde med disse innstillingene 15-20 celler som uttrykker GFP-kirsebærfusjonsproteinet. 15-20 celler gir god statistikk samtidig som den totale tiden for en FRET-måleøkt begrenses til noen få timer for å sikre stabiliteten til det mikroskopiske oppsettet.
  7. Bilde med de samme innstillingscellene som uttrykker GFP, kirsebær, GFP og kirsebær og ikke-transfekterte celler. Søk etter uttrykkende celler i henholdsvis den grønne eller røde kanalen.
  8. Deretter bilde 15-20 celler co-uttrykke proteiner av interesse koblet til GFP og Cherry, henholdsvis. Søker etter uttrykkende celler, unngå lang eksponering av cellene for ikke å bleke fluorescerende proteiner. Kirsebær har lavere fotostabilitet enn GFP, og bleking av kirsebær, akseptoren kompromitterer FRET-analyse.
    MERK: Absorpsjons- og utslippsspektra av GFP og kirsebær er vist i tilleggsfigur 1. Etter måling i 5-6 timer anbefales det å gjenta avbildningen av noen få celler som uttrykker GFP-Cherry-kimæren på slutten av bildeøkten for å dokumentere at oppsettet forble stabilt og påviste FRET-effektivitet av GFP-Kirsebær-fusjonsproteinet ikke endret seg signifikant i løpet av en avbildningsøkt.

4. Bildeanalyse for å oppdage absolutt FRET-effektivitet ved bruk av donorslukking og sensitivisert utslipp

MERK: Her er det gitt en praktisk trinnvis veiledning om hvordan du bestemmer FRET-effektiviteten ved bruk av det vedlagte regnearket (tilleggsfil 2). Teori og utledning av de presenterte ligningene finnes i detalj i tidligere publikasjoner 4,15,16,17. Med de beskrevne innstillingene samles følgende fluorescensintensiteter.

  1. Mål donorsignalet I 1 i kanal 1, donorkanalen, med 488 nm eksitasjon og et utslippsbånd på 505-530 nm.
    Equation 2
    hvor ID er det uslokkede donorsignalet i kanal 1 som vil bli målt i fravær av en akseptor, er gjennomsnittlig FRET-effektivitet, og B 1 det gjennomsnittlige bakgrunnssignalet i kanal 1.
  2. Mål akseptorsignalet I 3 i kanal 3, akseptorkanalen, med 561 nm eksitasjon og utslipp ved >585 nm.
    Equation 3
    hvor I A er akseptorsignalet og B 3 bakgrunnen i kanal 3.
  3. Mål FRET-signalet i kanal 2, overføringskanalen, med 488 nm eksitasjon og utslipp ved >585 nm.
    Equation 4
    Der signalet i kanal 2 er summen av fire forskjellige komponenter: (i) I D(1 - E)S 1 er spektralutslippet fra det slukkede donorsignalet til >585-deteksjonskanalen (med krysstalefaktoren S 1), (ii) I A S 2 er akseptorsignalet fra direkte eksitasjon med 488 nm lys (med krysstalefaktor S2), (iii) IDEα er den sensibiliserte utstrålingen av akseptoren av FRET fra det eksiterte donormolekylet (α vil bli detaljert nærmere i 4.8. - 4.10.), og (iv) B2 er bakgrunnssignalet.
  4. Mål gjennomsnittlige bakgrunnsintensiteter i kanal 1, 2, 3 i ikke-transfekterte eller mock-transfektede celler; Enten er greit med ubetydelig forskjell. For alle cellemålinger, bruk frihåndsverktøyet for å avgrense interesseområder og unngå perinukleære vesikler med økt autofluorescens. Det er viktig å unngå signifikant autofluorescens fra disse perinukleære vesiklene.
    1. Skriv inn målingene i kolonnene X, Y og Z i det angitte regnearket. Gjennomsnittlig bakgrunnsintensitet i de 3 kanalene legges inn i A2, B2 og C2 i Excel-regnearket (tilleggsfil 2).
  5. Mål gjennomsnittlig intensitet i kanal 1, 2, 3 av celler som uttrykker GFP eller Kirsebær alene, og skriv inn målingene i kolonner C, D, E og N, O, P. Respektive bakgrunnsintensiteter trekkes fra (i F, G, H og Q, R, S).
  6. For å beregne E, FRET-effektiviteten, bestemme krysstalefaktorene S 1 og S 2. Den spektrale krysstalefaktoren S1 beregnes fra celler som bare uttrykker GFP
    Equation 6
    i kolonne I. Skriv inn middelverdien for S1 i celle D2 i Excel-regnearket.
  7. Beregn spektral krysstalefaktor S2 fra celler som bare uttrykker kirsebær
    Equation 7
    i kolonne T. Skriv inn gjennomsnittet for S2 i celle E2 i Excel-regnearket.
  8. Sikre at den α faktoren relaterer signalet fra et gitt antall eksiterte GFP-molekyler i kanal 1 til signalet fra et likt antall eksiterte kirsebærmolekyler i kanal 2, og er definert ved
    Equation 8   Equation 13
    hvor Q A og QD er fluorescenskvanteutbyttet av kirsebær og GFP; ηA og η D deteksjonseffektiviteten av akseptor- og donorfluorescens i henholdsvis kanal 2 og 1.
    MERK: Den α faktoren kan bestemmes fra to prøver som uttrykker kjente absolutte mengder GFP og kirsebær. Det er imidlertid umulig å vite den nøyaktige mengden GFP og kirsebær uttrykt i en celle. Derfor beregnet vi faktoren ved å bruke celler som uttrykker GFP-kirsebærfusjonsproteinet. Her, mens den absolutte mengden fortsatt er ukjent, er forholdet mellom donor- og akseptormolekyler kjent for å være en.
  9. Mål gjennomsnittlige intensiteter i kanal 1, 2, 3 av celler som uttrykker GFP-kirsebærfusjonsproteinet, og skriv målingene inn i kolonnene AE, AF, AG. Bakgrunnsintensiteter trekkes fra (i AH, AI, AJ).
  10. Beregn den α faktoren (AJ-kolonnen) fra fluorescensintensitetene i kanal 1, 2 og 3 av GFP-kirsebærfusjonsproteinet som følger:
    Equation 10
  11. Bakgrunnskorrigerte intensiteter målt i henholdsvis kanal 1 (I 1 - B 1), 2 (I 2 - B 2) og 3 (I 3 - B3) måles med GFP-kirsebærkimæren. Den spektrale krysspratfaktoren S1 ble bestemt ved hjelp av celler som kun uttrykker GFP (se 4.7.). εD og ε A er ekstinksjonskoeffisientene til GFP, donoren og kirsebær, akseptoren, ved 488 nm, og kan bestemmes fra litteraturen (ε GFP = 53 000 M-1 cm-1)18 og absorpsjonskurven til kirsebær (εkirsebær ≈ 5560 M-1cm 1). Forholdet Equation 11 er angitt i celle G2 i Excel-regnearket. Skriv inn middelverdien for α-faktoren i J2.
  12. Bruk den bestemte α-faktoren for beregning av FRET-effektiviteten, E, som følger (kolonne AK):
    Equation 12
  13. Alternativt kan du bestemme FRET-effektivitet, E, for de negative kontrollene, dvs. samuttrykket av GFP og Cherry og uttrykket av GFP alene ved å legge til målingene av kanal 1, 2 og 3 i excel-arket i kolonne AD, AE og AF under GFP-Cherry-fusjonsproteinmålingene. Bestem FRET-effektivitet mellom GFP- og Kirsebærmerkede proteiner av interesse på samme måte.
  14. Bestem den uslokkede donorintensiteten, I D som (I 1 - B 1) / (1 - E), og akseptorintensiteten som I A = I 3 - B3; Disse verdiene er proporsjonale med ekspresjonsnivåene av de merkede proteinene.
  15. Bestem det korrigerte akseptor-til-donor-intensitetsforholdet (Q) for GFP-kirsebærfusjonsproteinet som følger (kolonne AL):
    Equation 13
  16. For andre ko-transfekterte celler, beregne akseptor-til-donor molekylært forhold N A / ND som følger:
    Equation 14
    MERK: Begrunnelsen for å bestemme N A / N D-forholdet og plotte den gjennomsnittlige cellulære FRET-effektiviteten E versus N A / ND, er at ett donormolekyl kan overføre energi til flere akseptorer mens et akseptormolekyl bare kan motta energi fra en donor på et gitt tidspunkt. Selv om bare en akseptor kan samhandle med en donor på grunn av samspillets støkiometri, forventes en økning av akseptorkonsentrasjon å øke andelen donorer i kompleks med akseptoren på grunn av massehandlingsloven. For et fast (eller smalt utvalg av) donoruttrykk, bør FRET-effektiviteten stige med økende N A/ND. Ved plotting av FRET-effektiviteten E versus N A/N D for samuttrykket av GFP og kirsebær, dvs. den negative sonden, bør imidlertid en økning i N A/N D ikke resultere i en økning i FRET-effektiviteten (i det minste ved tilstrekkelig lave akseptorkonsentrasjoner der tilfeldig FRET på grunn av nærheten av akseptorfargestoffer til donorfargestoffer ikke forekommer).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser bildene tatt i henholdsvis donorkanalen, kanal 1 (488, 505-530 nm), overføringskanalen, kanal 2 (488, >585 nm) og akseptorkanalen, kanal 3 (561, >585 nm). Representative bilder av celler som kun uttrykker GFP, kun kirsebær, som uttrykker GFP og kirsebær, og uttrykker GFP-kirsebærfusjonsproteinet. De gjennomsnittlige cellulære FRET-effektivitetene beregnet i NRK-celler som uttrykker GFP-kirsebærfusjonsprotein (positiv kontroll, figur 2A) og de som samtidig uttrykker GFP-kirsebær (negativ kontroll, figur 2B) er plottet mot akseptor-til-donor-ratiointensitetsforholdet (Q) eller molekylforholdet N A/ND i hver celle. Figur 2C illustrerer et eksempel på hvordan man kan skissere et område av interesse og unngå perinukleære vesikler med høy autofluorescens.

Den presenterte algoritmen kan brukes til å kvantifisere FRET-effektivitet i en hvilken som helst region av interesse, inkludert kvantifisering i hver piksel i bildet i overføringskanalen. Figur 2D viser normaliserte piksel-for-piksel FRET-bilder av celler som uttrykker GFP-Cherry-fusjonsproteinet, som samtidig uttrykker GFP og Cherry som negativ kontroll, og uttrykker reseptorunderenheter av Ashwell-Morell-reseptoren. Rottevarianten av denne reseptoren, hepatisk lektin fra rotter (RHL1 og RHL2), er et to-subenhetsreseptorsystem som er kjent for å hetero-oligomerisere. Alle FRET-effektiviteter ble normalisert til GFP-kirsebærfusjonsproteinet. Vi merket RHL1 og 2 med GFP og Cherry på den cytoplasmatiske siden av plasmamembranen. Bildet viser distinkte FRET-verdier i plasmamembranen sammenlignet med intracellulære vesikler. Sletting av stengeldomenet til RHL1 (GFP-RHL1Δstalk), som antas å formidle den tette interaksjonen mellom de to underenhetene, reduserer den oppdagede FRET-effektiviteten. I figur 2E er gjennomsnittlig cellulær FRET-effektivitet av celler som uttrykker GFP-RHL1 og Cherry-RHL2, og GFP-RHL1Δstalk og Cherry-RHL2 plottet mot akseptor-til-donor molekylærforholdet (N A / ND). For ytterligere FRET-analyser av dette reseptorsystemet kan leseren referere til en tidligere publikasjon5.

Figure 1
Figur 1: Representative bilder av celler som uttrykker fluorescerende proteiner. Celler som bare uttrykker GFP (A), kun kirsebær (B), GFP og kirsebær-samuttrykk (C) og GFP-kirsebærfusjonsprotein (D). Bilder av henholdsvis kanal 1 (488, 505–530 nm), kanal 2 (488 >585 nm) og kanal 3 (561 >585 nm). Bilder ble oppnådd med 63x oljemål og zoom satt til 3x. Skala bar: 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Kvantifisering av FRET-bilder. Gjennomsnittlig cellulær FRET-effektivitet for celler som uttrykker GFP-kirsebærfusjonsproteinet plottet versus akseptor-til-donor-intensitetsforholdet (Q) (A) og versus akseptor-til-donor-molekylærforholdet ( N A / ND) for celler som uttrykker GFP og kirsebær (B). Åpen sirkel tykk linje representerer enkeltcelle som uttrykker GFP-kirsebærfusjonsprotein. Åpen sirkel tynn linje representerer en celle som uttrykker GFP og kirsebær. Merk at ved høyere N A / ND-forhold blir brøkdelen av det nyttige signalet, den sensibiliserte emisjonen (I DEα) i overføringskanalen mindre og mindre i forhold til den direkte eksitasjonen av akseptoren (IA, S,2). Dette resulterer i en større feil i fastsettelsen av E. Piksel-for-piksel FRET-bilder beregnet ved hjelp av den presenterte algoritmen (C). Dette panelet illustrerer en celle som uttrykker GFP og Cherry, den negative kontrollen, i donorkanalen, overføringskanalen og akseptorkanalen. Det viser også en mulig oversikt over et område av interesse for å unngå perinukleære vesikler med høy autofluorescens som kan påvirke presisjonen av FRET-beregningen negativt. (D) Alle FRET-effekter ble normalisert til effekten av GFP-kirsebærfusjonsproteinet. Fra venstre til høyre, GFP-kirsebærfusjonsprotein (positiv kontroll), GFP kirsebær samuttrykk (negativ kontroll), GFP-RHL1 og Cherry-RHL2, og GFP-RHL1Δstalk og Cherry-RHL2. Skala bar: 10 μm. Fargekodet skalalinje: normalisert gjennomsnittlig FRET-effektivitet (normalisert til middelverdien av den positive kontrollen, GFP-Cherry-fusjonsproteinet). (E) Dette panelet viser gjennomsnittlig cellulær FRET-effektivitet for celler som uttrykker GFP-RHL1 og Cherry-RHL2 samt GFP-RHL1Δstalk og Cherry-RHL2 plottet versus akseptor-til-donor molekylært forhold (N A / ND). Lukket grå sirkel representerer en enkelt celle som uttrykker GFP-RHL1 og Cherry-RHL2. Lukket svart sirkel representerer en celle som uttrykker GFP-RHL1Δstalk og Cherry-RHL2. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfil 1: Algoritme for andre donor-akseptorpar. Algoritme for andre donor-akseptorpar som forskjellige versjoner av cyan (ECFP, CyPet, mTFP1, Cerulean, mTurquoise2) og gule (EYFP, Citrine, Venus, SYFP2, YPet) fluorescerende proteiner. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 2: Regneark med presentert FRET-algoritme og bruk av GFP-kirsebærfusjonsproteinet for å kvantifisere FRET ved sensibilisert utslipp av akseptoren og donorslukking. Celle A2, B2, C2: Gjennomsnittlige bakgrunnssignaler (B 1, B 2, B 3) i henholdsvis kanal 1, 2 og 3. Celle D2 og E2: Gjennomsnittsverdier for krysstalefaktorene S 1 og S2. Celle G2: Verdi for ekstinksjonskoeffisientforhold Equation 11. Cell I1 og I2: Utryddelseskoeffisienter av GFP og kirsebær ved 488 nm laserlys. Celle J2: Middelverdi for faktor. Kolonne C (C5 og opp): målt fluorescensintensitet av en celle som uttrykker GFP i kanal 1. Kolonne D (D5 og oppover): målt fluorescensintensitet av en celle som uttrykker GFP i kanal 2. Kolonne E (E5 og opp): målt fluorescensintensitet av en celle som uttrykker GFP i kanal 3. Kolonne F, G og H (henholdsvis F5, G5, H5 og oppover): målt fluorescensintensitet trukket fra gjennomsnittlig bakgrunnsintensitet i alle 3 kanaler. Kolonne I (I5 og oppover): Beregnet krysspratfaktor S1. Kolonne M (M5 og oppover): målt fluorescensintensitet av en celle som uttrykker kirsebær i kanal 1. Kolonne N (N5 og oppover): målt fluorescensintensitet av en celle som uttrykker kirsebær i kanal 2. Kolonne O (O5 og oppover): målt fluorescensintensitet av en celle som uttrykker kirsebær i kanal 3. Kolonne P, Q og R (henholdsvis P5, Q5, R5 og oppover): målte fluorescensintensiteter trukket fra gjennomsnittlig bakgrunnsintensitet i alle 3 kanaler. Kolonne S (S5 og oppover): Beregnet krysspratfaktor S2. Kolonne W (W5 og oppover): målt fluorescensintensitet av en ikke- eller mock-transfektet celle i kanal 1. Kolonne X (X5 og oppover): målt fluorescensintensitet av en ikke- eller mock-transfektet celle i kanal 2. Kolonne Y (Y5 og oppover): målt fluorescensintensitet av en ikke- eller mock-transfektet celle i kanal 3.Kolonne AD (AD5 og oppover): målt fluorescensintensitet av en celle som uttrykker GFP-kirsebærfusjonsproteinet (eller co-uttrykkende GFP og kirsebær, eller et hvilket som helst proteinpar av interesse) i kanal 1. Kolonne AE (AE5 og oppover): målt fluorescensintensitet av en celle som uttrykker GFP-kirsebærfusjonsproteinet (eller samuttrykkende GFP og kirsebær, eller et hvilket som helst proteinpar av interesse) i kanal 2. Kolonne AF (AF5 og oppover): målt fluorescensintensitet av en celle som uttrykker GFP-kirsebærfusjonsproteinet (eller samuttrykkende GFP og kirsebær, eller et hvilket som helst proteinpar av interesse) i kanal 3. Kolonne AG, AH og AI (henholdsvis AG5, AH5, AI5 og oppover): målt fluorescensintensitet trukket fra gjennomsnittlig bakgrunnsintensitet i alle 3 kanaler. Kolonne AJ (AJ5 og oppover): Beregnet α faktor. Kolonne AK (AK 5 og oppover): Beregnet gjennomsnittlig FRET-effektivitet E. Kolonne AL (AL5 og oppover): beregnet korrigert akseptor-til-donor-intensitetsforhold (Q). Eksempler på beregnede parametere fra et FRET-eksperiment uttrykt som gjennomsnitt og standardavvik: S1 = 0,2232 ± 0,0060. S2 = 0,2039 ± 0,0074. α = 1.9463 ± 0.1409. E = 0,2713 ± 0,0220. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 1: GFP og kirsebærabsorpsjon og utslippsspektra. Normalisert absorpsjon og fluorescensutslippsspektra av eGFP og mCherry. Eksitasjonslaserlinjene (488 og 543 nm) og filteroverføringene som brukes til donorkanalen (ch1: 505-530 nm) og overførings-/akseptorkanalene (ch2 &3: >585 nm) i konfokalmikroskopet er merket med skyggelegging. For eksitering av akseptoren kan 561 eller 590 nm laserlinjer også brukes. Kilde fluorescerende protein database (fpbase.org). Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den presenterte protokollen beskriver bruken av den genetisk koblede en-til-en fluorescerende proteinkalibreringssonden for kvantifisering av FRET ved påvisning av sensibilisert utslipp av akseptoren og slukking av donormolekylet ved konfokalmikroskopi. Denne metoden kan brukes til å vurdere proteininteraksjoner i den levende cellens fysiologiske sammenheng i forskjellige subcellulære rom. Romlig oppløsning kan forbedres ytterligere ved å bruke den presenterte algoritmen til å beregne FRET-effektivitet i hver piksel i et bilde (piksel-for-piksel FRET). Intensitetsbasert bestemmelse av absolutte FRET-effektiviteter krever bestemmelse av krysstale, kvantifisert her med S-faktorene , og deteksjonseffektiviteten til donor- og akseptormolekyler ved det gitte mikroskopiske oppsettet, kvantifisert av α-faktoren. Her er det gitt en protokoll som tillater kvantifisering av både kryssprat og deteksjonseffektivitet. Direkte kobling av den genetiske informasjonen til fluorescerende protein garanterer ekvimolært uttrykk i levende celler og gjør dermed bestemmelsen av den α faktoren mulig. Kunnskap om den α faktoren er igjen en forutsetning for kvantifisering av FRET-effektiviteten i levende celler. Kritiske trinn i den medfølgende protokollen er riktig kloning av den direkte koblede fluorescerende proteinkimæren, tilstrekkelig tid etter transfeksjon for å tillate fluorescerende proteinmodning, bruk av fluorescerende proteiner i et lignende cellulært mikromiljø, for eksempel fluorescerende proteiner i cytoplasma og på cytoplasmatisk side av plasmamembran, og et stabilt mikroskopoppsett.

Eksperimentelt oppsett og algoritme presentert her er designet for GFP-Cherry FRET-paret. I tilleggsfilen 1 gir vi algoritmen for forskjellige versjoner av cyan (ECFP, CyPet, mTFP1, Cerulean, mTurquoise2) og gule fluorescerende proteiner (EYFP, Citrin, Venus, SYFP2, YPet). Fordelen med disse fluorescerende proteinparene er en større spektral overlapping mellom emisjonsspekteret til cyanen og absorpsjonsspekteret til det gule proteinet (sammenlignet med GFP-Cherry), noe som resulterer i noe høyere R0-verdier og større FRET-effektivitet. Men av samme grunn er antallet ikke-ubetydelige krysstalefaktorer og deres størrelser også større (se tilleggstekst).

Begrensninger av kvantitativ mikroskopisk ratiometrisk FRET i levende celler må vurderes og diskuteres. Forutsetningen for å bruke FRET for å oppdage molekylære interaksjoner er anvendelsen av fluorescerende koder. Vår protokoll bruker genetisk kodede fluorescerende proteiner. Siden disse fluorescerende proteinene kan være sammenlignbare i størrelse (27 kDa) med det merkede proteinet av interesse, kan de endre lokalisering og funksjon av proteinet av interesse. Derfor bør både lokalisering og funksjonalitet av ethvert merket protein av interesse testes og sammenlignes med det endogene umerkede proteinet. Et annet kritisk punkt å huske på er det endogene umerkede bassenget av proteinet av interesse. Interaksjonene av merket med umerkede endogene proteiner vil redusere FRET-signalet. Ideelt sett er alle proteiner av interesse merket. Dette kan oppnås ved å bruke celler som ikke har proteinet av interesse endogent (som i eksemplet gitt i figur 2C og 2E), ved hjelp av celler avledet fra innslagsmus, ved hjelp av CRISPR-modifiserte celler, etc. Selv ved bruk av piksel-for-piksel FRET, vil signalet fra donor- og akseptormolekyler bli gjennomsnittet over et diffraksjonsbegrenset punkt, oppløsningsgrensen til et konfokalmikroskop. Derfor er det umulig å løse ulike donorpopulasjoner innenfor et diffraksjonsbegrenset sted. Det kan være givere uten akseptor, eller givere med flere akseptorer som bidrar til det gjennomsnittlige FRET-signalet. Dissekering av forskjellige molekylære subpopulasjoner ved FRET krever fluorescens levetidsavbildning22. Et annet problem, spesielt ved høye ekspresjonsnivåer, er den såkalte tilfeldige FRET mellom fluoroforer i umiddelbar nærhet uten underliggende interaksjon av proteinene av interesse23. Denne tilfeldige FRET kan være signifikant i plasmamembranen gitt 2-D-inneslutningen av membranproteinene sammenlignet med fritt diffusive cytoplasmatiske proteiner. Derfor bør kontrolleksperimenter alltid gjøres, for eksempel å slette domener som formidler den antatte interaksjonen mellom molekyler og teste for reduksjon i det oppdagede FRET-signalet.

Usikkerheten til eksakte støkiometrier av vekselvirkende proteiner i levende celler begrenser bruken av FRET som spektroskopisk linjal for å vurdere molekylære avstander mellom proteiner i levende celler. Selv i tilfelle av en streng en-til-en-interaksjon, (i) fleksibiliteten til linkeren som fester det fluorescerende proteinet til proteinet av interesse, samt (ii) mangelen på kunnskap om den relative orienteringen av fargestoffenes dipolmomenter (bestemmelse av den såkalte κ 2-faktoren) kan forvirre nøyaktige avstandsmålinger. Studier på akseptorfusjonskonstruksjoner med stive linkere av forskjellige lengder som separerer de to fluoroforene og viser forskjellige FRET-effektiviteter, er rapportert andre steder12. Omvendt er det komplisert å vurdere støkiometrier med FRET-målinger i levende celler, men mulig ved å bruke den presenterte ratiometriske FRET-kvantifiseringen. Den tilbøyelige leser kan henvises til tidligere arbeider som beskriver en gjennomførbar tilnærming5.

Oppsummert tillater den kvantitative FRET-tilnærmingen deteksjon av (i) proteininteraksjoner i den levende cellens fysiologiske kontekst, (ii) endringer i proteininteraksjoner over tid og (iii) forskjeller i interaksjoner i forskjellige subcellulære rom ned til piksel-for-piksel-nivået til et konfokalt bilde, og (iv) avhengigheten av det oppdagede FRET-signalet på det molekylære akseptor-til-donor-forholdet uttrykt i en levende celle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke Neuroscience Imaging Service ved Stanford University School of Medicine for å gi utstyr og plass til dette prosjektet. Denne forskningen ble støttet av intramural finansiering av Stanford Cancer Institute og Gynecologic Oncology Division Stanford, samt GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 fra National Research, Development and Innovation Office, Ungarn.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x) Thermo Fisher Scientific 15400054
Clontech mCherry N1 vector Addgene 3553
DMEM without phenol red Thermo Fisher Scientific 11054020
Fugene 6 Promega E2691
HEPES Thermo Fisher Scientific 15630080
LabTek 8-well chambers #1.0 Thermo Fisher Scientific 12565470
L-Glutamine (200 mM) Thermo Fisher Scientific 25030081

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Förster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Annal der Physik. 437, 55-75 (1948).
  2. Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
  3. Mekler, V. M. A photochemical technique to enhance sensitivity of detection of fluorescence resonance energy transfer. Photochemistry and Photobiology. 59, 615-620 (1994).
  4. Vamosi, G., et al. Conformation of the c-Fos/c-Jun complex in vivo: A combined FRET, FCCS, and MD-modeling study. Biophysical Journal. 94 (7), 2859-2868 (2008).
  5. Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (44), 2989-2997 (2012).
  6. van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission. Biophysical Journal. 86 (4), 2517-2529 (2004).
  7. Muller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. Quantification of Forster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells. Frontiers in Plant Sciences. 4, 413 (2013).
  8. Gates, E. M., LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. Improving quality, reproducibility, and usability of FRET-based tension sensors. Cytometry Part A. 95 (2), 201-213 (2019).
  9. Menaesse, A., et al. Simplified instrument calibration for wide-field fluorescence resonance energy transfer (FRET) measured by the sensitized emission method. Cytometry Part A. , 24194 (2020).
  10. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  11. Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene. 173, 1 Spec No 33-38 (1996).
  12. Nagy, P., et al. Novel calibration method for flow cytometric fluorescence resonance energy transfer measurements between visible fluorescent proteins. Cytometry Part A. 67 (2), 86-96 (2005).
  13. Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N., Nagamune, T. Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein. Protein Engineering. 14 (8), 529-532 (2001).
  14. Szendi-Szatmari, T., Szabo, A., Szollosi, J., Nagy, P. Reducing the detrimental effects of saturation phenomena in FRET microscopy. Analytical Chemistry. 91 (9), 6378-6382 (2019).
  15. Tron, L., et al. Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surfaces. Quantitative evaluation of the transfer efficiency on a cell-by-cell basis. Biophysical Journal. 45 (5), 939-946 (1984).
  16. Sebestyen, Z., et al. Long wavelength fluorophores and cell-by-cell correction for autofluorescence significantly improves the accuracy of flow cytometric energy transfer measurements on a dual-laser benchtop flow cytometer. Cytometry. 48 (3), 124-135 (2002).
  17. Szaloki, N., et al. High throughput FRET analysis of protein-protein interactions by slide-based imaging laser scanning cytometry. Cytometry Part A. 83 (9), 818-829 (2013).
  18. McRae, S. R., Brown, C. L., Bushell, G. R. Rapid purification of EGFP, EYFP, and ECFP with high yield and purity. Protein Expression and Purification. 41 (1), 121-127 (2005).
  19. Kremers, G. J., Goedhart, J., van Munster, E. B., Gadella, T. W. Cyan and yellow super fluorescent proteins with improved brightness, protein folding, and FRET Forster radius. Biochemistry. 45 (21), 6570-6580 (2006).
  20. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16 (9), (2016).
  21. Scott, B. L., Hoppe, A. D. Optimizing fluorescent protein trios for 3-Way FRET imaging of protein interactions in living cells. Science Reports. 5, 10270 (2015).
  22. Chen, Y. C., Spring, B. Q., Clegg, R. M. Fluorescence lifetime imaging comes of age how to do it and how to interpret it. Methods Molecular Biology. 875, 1-22 (2012).
  23. King, C., Sarabipour, S., Byrne, P., Leahy, D. J., Hristova, K. The FRET signatures of noninteracting proteins in membranes: Simulations and experiments. Biophysical Journal. 106 (6), 1309-1317 (2014).

Tags

Biologi utgave 170 levende celleavbildning FRET kvantitativ fluorescensmikroskopi fluorofor proteininteraksjon sensibilisert emisjon

Erratum

Formal Correction: Erratum: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission
Posted by JoVE Editors on 03/14/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission. The Authors section was updated from:

György Vámosi1
Sarah Miller2
Molika Sinha2
Gabor Mocsár1
Malte Renz2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

to:

György Vámosi1
Sarah Miller2
Molika Sinha2
Maria Kristha Fernandez2
Gabor Mocsár1
Malte Renz2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

Vurdering av proteininteraksjoner i levende celler med FRET-sensibilisert utslipp
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vámosi, G., Miller, S., Sinha,… More

Vámosi, G., Miller, S., Sinha, M., Fernandez, M. K., Mocsár, G., Renz, M. Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission. J. Vis. Exp. (170), e62241, doi:10.3791/62241 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter