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Biology

फ्रेट-संवेदनशील उत्सर्जन के साथ लाइव-कोशिकाओं में प्रोटीन इंटरैक्शन का आकलन करना

Published: April 22, 2021 doi: 10.3791/62241
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1, 2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen, 2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Summary

दो फ्लोरोफोर अणुओं के बीच फॉस्टर रेजोनेंस एनर्जी ट्रांसफर (फ्रेट) का उपयोग जीवित कोशिका में प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। यहां, एक प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है कि कॉनफोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके स्वीकर्ता के संवेदनशील उत्सर्जन का पता लगाकर और दाता अणु के शमन द्वारा जीवित कोशिकाओं में फ्रेट को कैसे मापा जाए।

Abstract

फॉस्टर रेजोनेंस एनर्जी ट्रांसफर (फ्रेट) एक उत्तेजित दाता से एक स्वीकर्ता अणु में ऊर्जा का विकिरण रहित हस्तांतरण है और अणुओं की दूरी और अभिविन्यास के साथ-साथ दाता उत्सर्जन और स्वीकर्ता अवशोषण स्पेक्ट्रा के बीच ओवरलैप की सीमा पर निर्भर करता है। फ्रेट समय के साथ और विभिन्न उपकोशिकीय डिब्बों में जीवित कोशिका में प्रोटीन की बातचीत का अध्ययन करने की अनुमति देता है। माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके फ्रेट को मापने के लिए विभिन्न तीव्रता-आधारित एल्गोरिदम साहित्य में वर्णित किए गए हैं। यहां, स्वीकर्ता के संवेदनशील उत्सर्जन और दाता अणु के शमन दोनों को मापने के आधार पर फ्रेट दक्षता को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल और एक एल्गोरिदम प्रदान किया जाता है। जीवित कोशिका में अनुपातमित फ्रेट की मात्रा का निर्धारण न केवल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के क्रॉसस्टॉक (वर्णक्रमीय स्पिल-ओवर, या ब्लीड-थ्रू) के निर्धारण की आवश्यकता होती है, बल्कि सूक्ष्म सेटअप की पहचान दक्षता भी होती है। यहां दिए गए प्रोटोकॉल में इन महत्वपूर्ण मापदंडों का आकलन करने का विवरण दिया गया है।

Introduction

फ्रॉस्टर रेजोनेंस एनर्जी ट्रांसफर (फ्रेट) का माइक्रोस्कोपी-आधारित विश्लेषण जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन के बीच बातचीत के मूल्यांकन की अनुमति देता है। यह स्थानिक और लौकिक जानकारी प्रदान करता है, जिसमें यह जानकारी शामिल है कि सेल में कहां और किस उपकोशिकीय डिब्बे में बातचीत होती है और यदि यह बातचीत समय के साथ बदलती है।

थियोडोर फ्रॉस्टर ने 1948में फ्रेट की सैद्धांतिक नींव रखी। फ्रेट एक उत्तेजित दाता से एक स्वीकर्ता अणु में ऊर्जा का विकिरण रहित हस्तांतरण है और अणुओं की दूरी और उनके संक्रमण द्विध्रुवीय के सापेक्ष अभिविन्यास के साथ-साथ दाता उत्सर्जन और स्वीकर्ता अवशोषण स्पेक्ट्रा के बीच ओवरलैप पर निर्भर करता है। ऊर्जा हस्तांतरण की दर दाता-स्वीकर्ता दूरी की छठी शक्ति के व्युत्क्रमानुपाती है। इस प्रकार, फ्रेट का उपयोग 1-10 एनएम की सीमा में आणविक निकटता को मापने के लिए किया जा सकता है।

फ्रेट दाता अणु की अन्य डी-उत्तेजना प्रक्रियाओं के साथ प्रतिस्पर्धा करता है और इसके परिणामस्वरूप स्वीकर्ता के तथाकथित दाता-शमन और संवेदनशील उत्सर्जन होता है। दाता-शमन उत्सर्जित दाता फोटॉनों की संख्या में कमी है, जबकि संवेदी उत्सर्जन उत्सर्जित स्वीकर्ता फोटॉनों में वृद्धि है। कई सूक्ष्म फ्रेट विश्लेषण प्रतिदीप्ति तीव्रता माप का उपयोग करते हैं, जिसमें स्वीकर्ता फोटोब्लीचिंग2, दाता फोटोब्लीचिंग2, या स्वीकर्ता3 के फ्रेट-संवेदी फोटोब्लीचिंग शामिल हैं।

यहां, दाता शमन और स्वीकर्ता संवेदी उत्सर्जन 4,5 का उपयोग करके फ्रेट को मापने के लिए एक चरण-दर-चरण प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल और गणितीय एल्गोरिथ्म प्रस्तुत किया जाता है, एक विधि जिसे अक्सर अनुपातमित फ्रेट कहा जाता है। अनुमानित संवेदी उत्सर्जन के तरीके पर कई प्रोटोकॉल प्रकाशित किए गए हैं, कुछ ने पूर्ण फ्रेट दक्षता 6,7,8,9 की मात्रा निर्धारित की है। जीवित कोशिका में फ्रेट क्षमता की मात्रा का निर्धारण करने के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन के क्रॉसस्टॉक (वर्णक्रमीय स्पिल-ओवर, या ब्लीड-थ्रू) और (ii) माइक्रोस्कोपिक सेटअप की पहचान दक्षता का निर्धारण करने की आवश्यकता होती है। जबकि क्रॉसस्टॉक का मूल्यांकन इमेजिंग कोशिकाओं द्वारा किया जा सकता है जो केवल एक फ्लोरोफोरे को व्यक्त करते हैं, दाता और स्वीकर्ता प्रतिदीप्ति की सापेक्ष पहचान दक्षता का आकलन अधिक जटिल है। इसके लिए कम से कम दाता और स्वीकर्ता अणुओं की संख्या के अनुपात के ज्ञान की आवश्यकता होती है जो मापा संकेतों को जन्म देते हैं। जीवित कोशिकाओं में व्यक्त फ्लोरोफोर की संख्या भिन्न होती है, हालांकि, सेल से सेल में और अज्ञात है। तथाकथित α कारक एकल उत्तेजित दाता और स्वीकर्ता अणु से सापेक्ष संकेत शक्तियों की विशेषता है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लाइव-सेल इमेजिंग के दौरान सामने आने वाले चर स्वीकर्ता-से-दाता अणु अनुपात वाले नमूनों में मात्रात्मक अनुपातमेट्रिक फ्रेट माप के लिए कारक का ज्ञान एक शर्त है। अंशांकन जांच के रूप में 1-टू-1 दाता-स्वीकर्ता संलयन प्रोटीन का उपयोग करने से α कारक का निर्धारण होता है और यह सकारात्मक नियंत्रण के रूप में भी कार्य करता है। यह आनुवंशिक रूप से युग्मित जांच कोशिकाओं द्वारा अज्ञात कुल मात्रा में व्यक्त की जाती है लेकिन एक-से-एक की एक निश्चित और ज्ञात सापेक्ष मात्रा में। निम्नलिखित प्रोटोकॉल बताता है कि 1-टू-1 जांच का निर्माण कैसे किया जाए और फ्रेट दक्षता की मात्रा का परिमाणीकरण करने के लिए इसका उपयोग कैसे किया जाए। एक स्प्रेडशीट जिसमें सभी सूत्र शामिल हैं, पूरक में पाया जा सकता है और पाठकों द्वारा नीचे उल्लिखित संबंधित कॉलम में अपने स्वयं के माप दर्ज करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

जबकि प्रोटोकॉल जीएफपी-चेरी दाता / स्वीकर्ता जोड़ी का उपयोग करता है, प्रस्तुत दृष्टिकोण किसी भी अन्य फ्रेट जोड़ी के साथ किया जा सकता है। पूरक फ़ाइल 1 सियान-पीले जोड़े पर विवरण प्रदान करता है।

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Protocol

1. प्लास्मिड निर्माण

  1. ईजीएफपी-एमचेरी 1 संलयन जांच उत्पन्न करने के लिए, प्रतिबंध साइटों एजआई और बीएसआरजीआई का उपयोग करके डाली गई एमचेरी10 के साथ एन 1 स्तनधारी सेल अभिव्यक्ति वेक्टर (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें।
  2. ईजीएफपी11 को स्टॉप कोडन के बिना एसएएलआई-बाम्ही टुकड़े के रूप में बढ़ाने के लिए निम्नलिखित ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का उपयोग करें: एन-टर्मिनल प्राइमर 5'-एएटी टीएए कैग टीसीजी एसीजी एजीजी एजीसी एएजीजी जीएजी जीजी जी 3' और सी-टर्मिनल प्राइमर 5'-एएटी एटीए टीजीजी एटीसी सीसीजी सीटीटी जीटीए सीएजी सीटीसी जीटीसी जीटीसी जीसी 3'।
  3. हरे और लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के बीच आरएनपीपीवी लिंकर (पांच एमिनो-एसिड) लिंकर पेश करने के लिए एन 1 वेक्टर की कई क्लोनिंग साइट में इस साली-बीएएमएचआई टुकड़े को डालें।
    नोट: यह लिंकर लगभग 0.25 -0.3 (चित्रा 1 ए) की जीएफपी-चेरी दाता-स्वीकर्ता जोड़ी के लिए एक औसत फ्रेट दक्षता उत्पन्न करता है। मापा फ्रेट क्षमता को मापने के लिए अलग-अलग लंबाई के कठोर12 और पेचदार13 लिंकर की पसंद पर कहीं और चर्चा की गई है, लेकिन संलयन प्रोटीन के हमारे उद्देश्य के लिए आवश्यक नहीं है। सादगी के लिए आगे बढ़ते हुए हम फ्लोरोसेंट प्रोटीन को 'जीएफपी' और 'चेरी' कहेंगे।

2. सेल संस्कृति और अभिकर्मक

  1. पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को कम करने के लिए, मीडिया में फ्रेट प्रयोगों के लिए किसी भी सेल लाइन, जैसे, एनआरके कोशिकाओं का उपयोग करें, उदाहरण के लिए, फिनोल लाल के बिना , डलबेको के संशोधित ईगल मीडिया (डीएमईएम)। इसी कारण से, फिनोल लाल मुक्त ट्रिप्सिन के उपयोग की सलाह दी जाती है।
  2. एक बार जब कोशिकाएं 80% कंफ्लुएंट हो जाती हैं, तो 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को अलग करें, न्यूबाउर कक्ष का उपयोग करके निलंबन में कोशिकाओं की संख्या की गणना करें और 8-अच्छी तरह से कक्षित कवर ग्लास के प्रति कुएं लगभग 10,000 कोशिकाओं को बीज दें; वैकल्पिक रूप से, टी 25 फ्लास्क में उगाए गए कॉन्फ्लुएंट सेल कल्चर से, 2 एमएल पिपेट से सेल सस्पेंशन की 1 बूंद या टी 12.5-सेल कल्चर फ्लास्क में उगाए गए कॉन्फ्लुएंट कल्चर से 5-एमएल सेल सस्पेंशन से 3 बूंदों का उपयोग करें।
  3. मानक सेल कल्चर स्थितियों (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2) पर फ्लोरेसेंस लाइव-सेल माइक्रोस्कोपी के लिए # 1.0 कवर ग्लास के साथ 8-वेल कक्षों (0.8 सेमी2 / वेल) में कोशिकाओं को बढ़ाएं।
  4. प्लेटिंग के 24 घंटे बाद जीएफपी, चेरी, जीएफपी / चेरी मिश्रण (1: 1 मिश्रण, यानी, 0.8 μg और 0.8 μg GFP और चेरी प्लास्मिड डीएनए), और GFP-चेरी चिमेरा के साथ एक उपयुक्त व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मक मीडिया ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके कोशिकाओं को स्थानांतरित करें।
    1. अभिकर्मक के लिए, डीएमईएम के 45 μL और प्लास्मिड डीएनए के 1.6 μg में अभिकर्मक अभिकर्मक के 5 μL का उपयोग करें। माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब को धीरे से फ्लिक करके हिलाएं।
    2. कमरे के तापमान पर मिश्रण के 15 मिनट इनक्यूबेशन के बाद, 8-वेल चैंबर स्लाइड के प्रत्येक कुएं में अभिकर्मक अभिकर्मक मिश्रण का 1-2 μL जोड़ें। कक्षित कवर ग्लास को इनक्यूबेटर में वापस करें।
  5. लाइव-सेल इमेजिंग से पहले अभिकर्मक के 20 घंटे बाद, उचित फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति, तह और परिपक्वता की अनुमति देने के लिए, विशेष रूप से लाल फ्लोरोफोरे।

3. फ्रेट इमेजिंग

  1. छवि 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफाइड और गर्म पर्यावरण कक्ष में स्थानांतरित कोशिकाएं। शारीरिक पीएच पर सेल मीडिया को बफर करने के लिए,सीओ 2 गैस सेट को 5% प्रवाह में उपयोग करें, या सेल मीडिया सीओ 2-स्वतंत्र प्रस्तुत करने के लिए20 एमएम एचईपीईएस जोड़ें।
  2. कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। सिग्नल को अनुकूलित करने और क्रॉस-टॉक को कम करने के लिए उत्तेजना और उत्सर्जन को निम्नानुसार सेट करें।
    1. चेरी को उत्तेजित करने के लिए जीएफपी को उत्तेजित करने के लिए आर्गन आयन लेजर की 488-एनएम लाइन और 561-एनएम डायोड पंप सॉलिड स्टेट लेजर (या 543-एनएम हीलियम नियॉन लेजर, उपलब्ध लेजर लाइनों के आधार पर) का उपयोग करें।
    2. एक वाणिज्यिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के सॉफ्टवेयर में निम्नलिखित सेट करें। पुल-डाउन मेनू का उपयोग करके बटन क्लिक द्वारा डाइक्रोइक दर्पण को 488/561 पर सेट करें। चैनल 1 में उत्तेजना के लिए 488-एनएम लेजर प्रकाश का उपयोग करके 505 - 530 एनएम (या 505 - 550 एनएम) के उत्सर्जन बैंड के माध्यम से और चैनल 2 में लंबे पास फिल्टर >585 एनएम) के साथ प्रतिदीप्ति एकत्र करें और चैनल 3 में उत्तेजना के लिए 561-एनएम लेजर प्रकाश का उपयोग करें, जिसमें 585 एनएम (तरंग दैर्ध्य में प्रकार) > लंबे पास फिल्टर का उपयोग किया जाए। बैंड पास फिल्टर जैसे, 590 - 650 एनएम या इसी तरह का भी उपयोग किया जा सकता है जिसमें रमन-प्रकीर्णन को छोड़कर लाभ होता है।
  3. दो लेजर के साथ क्रमिक रूप से उत्तेजित करें और इमेजिंग मोड को प्रत्येक पंक्ति के बाद स्विच करने के लिए सेट करें ताकि 512 x 512 पिक्सेल छवि की उत्तेजना प्रत्येक पंक्ति के बाद वैकल्पिक हो (और प्रत्येक फ्रेम के बाद नहीं जो विभिन्न उत्तेजनाओं के साथ छवियों को रिकॉर्ड करते समय लेबल प्रोटीन के प्रसार के कारण फ्रेट का पता लगाने की क्षमता को निरस्त कर देगी; बटन क्लिक)।
  4. महत्वपूर्ण फोटोब्लीचिंग होती है या नहीं, यह पता लगाने के लिए बटन क्लिक द्वारा तीन छवियों की एक मिनी-टाइम श्रृंखला सेट करें, और संभावित रूप से लेजर शक्ति को कम करें। 1% से कम की फोटोब्लीचिंग इष्टतम है। उच्च लेजर तीव्रता भी अवशोषण संतृप्ति को कम कर सकती है जो स्पष्ट फ्रेट दक्षता14 को कम कर सकती है। उद्देश्य लेंस पर मापा गया लेजर पावर, 10-20 μW तक उपयोग करने के लिए सुरक्षित हैं।
  5. सबसे पहले, जीएफपी-चेरी संलयन निर्माण को व्यक्त करने वाली छवि कोशिकाएं। उन मापदंडों को सेट करें जो एक कॉन्फोकल छवि में प्रति पिक्सेल समय-एकीकृत लेजर तीव्रता को परिभाषित करते हैं, यानी, माइक्रोसेकंड में पिक्सेल निवास समय, प्रतिशत में एकोस्टो-ऑप्टिकल टैपेबल फ़िल्टर (एओटीएफ) ट्रांसमिशन, और ज़ूम।
    1. 63x तेल उद्देश्य का उपयोग करके छवि कोशिकाएं और 3x पर ज़ूम सेट। यह अपनी संपूर्णता में छवि कोशिकाओं के लिए पर्याप्त आवर्धन और संकल्प प्रदान करता है। 70-80 एनएम के पिक्सेल आकार का लक्ष्य रखें।
    2. 488-एनएम और 561-एनएम लेजर के लिए पिक्सेल का समय 2-4 μ और AOTF ट्रांसमिशन के लिए सेट करें ताकि छवियों में ब्लीचिंग के बिना एक अच्छा सिग्नल-टू-शोर अनुपात हो और प्रतिदीप्ति तीव्रता संतृप्ति दिखाने वाला कोई पिक्सेल न हो। 488 और 561 की लेजर शक्ति को समायोजित करना फायदेमंद है जैसे कि चैनल 1 और चैनल 3 में सिग्नल स्तर समान हैं।
    3. फोटोमल्टीप्लायर (औसत मोड) लाभ को 600-800 पर सेट करें।
  6. इन सेटिंग्स के साथ 15-20 कोशिकाएं जीएफपी-चेरी संलयन प्रोटीन को व्यक्त करती हैं। सूक्ष्म सेट-अप की स्थिरता सुनिश्चित करने में मदद करने के लिए फ्रेट माप सत्र के कुल समय को कुछ घंटों तक सीमित रखते हुए 15-20 कोशिकाएं अच्छे आंकड़े प्रदान करती हैं।
  7. जीएफपी, चेरी, जीएफपी और चेरी और गैर-संक्रमित कोशिकाओं को व्यक्त करने वाली समान सेटिंग्स कोशिकाओं के साथ छवि। क्रमशः हरे चैनल या लाल चैनल में व्यक्त कोशिकाओं की खोज करें।
  8. फिर, छवि 15-20 कोशिकाएं क्रमशः जीएफपी और चेरी के साथ युग्मित रुचि के प्रोटीन को सह-व्यक्त करती हैं। व्यक्त कोशिकाओं की खोज, फ्लोरोसेंट प्रोटीन को ब्लीच नहीं करने के लिए कोशिकाओं के लंबे समय तक संपर्क से बचें। चेरी में जीएफपी की तुलना में कम फोटोस्टेबिलिटी है, और ब्लीचिंग चेरी, स्वीकर्ता फ्रेट विश्लेषण से समझौता करता है।
    नोट: जीएफपी और चेरी के अवशोषण और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा को पूरक चित्र 1 में दिखाया गया है। 5-6 घंटे तक मापने के बाद, इमेजिंग सत्र के अंत में जीएफपी-चेरी चिमेरा को व्यक्त करने वाली कुछ कोशिकाओं को दोहराने की सलाह दी जाती है ताकि यह दस्तावेज किया जा सके कि सेट-अप स्थिर रहा और इमेजिंग सत्र के दौरान जीएफपी-चेरी संलयन प्रोटीन की फ्रेट क्षमता का पता चला।

4. दाता शमन और संवेदनशील उत्सर्जन का उपयोग करके पूर्ण फ्रेट क्षमता का पता लगाने के लिए छवि विश्लेषण

नोट: यहां, संलग्न स्प्रेडशीट (पूरक फ़ाइल 2) के उपयोग के साथ फ्रेट दक्षता निर्धारित करने के तरीके के बारे में एक व्यावहारिक चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका प्रदान की गई है। प्रस्तुत समीकरणों के सिद्धांत और व्युत्पत्ति को पिछलेप्रकाशनों 4,15,16,17 में विस्तार से पाया जा सकता है। वर्णित सेटिंग्स के साथ, निम्नलिखित प्रतिदीप्ति तीव्रता एकत्र की जाती है।

  1. 488-एनएम उत्तेजना और 505-530 एनएम के उत्सर्जन बैंड के साथ चैनल 1, दाता चैनल में दाता सिग्नल आई 1 को मापें।
    Equation 2
    जहां आईडी चैनल 1 में अनचा हुआ दाता संकेत है जिसे स्वीकर्ता की अनुपस्थिति में मापा जाएगा, औसत फ्रेट दक्षता है, और बी1 चैनल 1 में औसत पृष्ठभूमि संकेत है।
  2. चैनल 3, स्वीकर्ता चैनल में स्वीकर्ता सिग्नल I 3 को मापें, जिसमें 561-एनएम उत्तेजना और उत्सर्जन >585 एनएम पर हो।
    Equation 3
    जहां आईए स्वीकर्ता संकेत है और बी3 चैनल 3 में पृष्ठभूमि है।
  3. चैनल 2, ट्रांसफर चैनल में फ्रेट सिग्नल को मापें, जिसमें 488-एनएम उत्तेजना और >585 एनएम पर उत्सर्जन होता है।
    Equation 4
    जहां, चैनल 2 में सिग्नल चार अलग-अलग घटकों का योग है: (i) ID (1 - E) S1 >585 डिटेक्शन चैनल (क्रॉस-टॉक फैक्टर S1 के साथ) में बुझे हुए दाता संकेत से वर्णक्रमीय फैलाव है, (ii) IAS2 488-nm प्रकाश (क्रॉस-टॉक फैक्टर S2 के साथ) द्वारा प्रत्यक्ष उत्तेजना से स्वीकर्ता संकेत है। (iii) आईडीईओ उत्तेजित दाता अणु से फ्रेट द्वारा स्वीकर्ता का संवेदी उत्सर्जन है (α 4.8. - 4.10 में आगे विस्तृत किया जाएगा), और (iv) बी2 पृष्ठभूमि संकेत है।
  4. चैनल 1, 2, 3 में गैर-संक्रमित या नकली-संक्रमित कोशिकाओं में औसत पृष्ठभूमि तीव्रता को मापें; या तो नगण्य अंतर के साथ ठीक है। सभी सेल मापों के लिए, हितों के क्षेत्रों को चित्रित करने और बढ़े हुए ऑटोफ्लोरेसेंस के साथ पेरिन्यूक्लियर पुटिकाओं से बचने के लिए फ्री-हैंड टूल का उपयोग करें। इन पेरिन्यूक्लियर पुटिकाओं से महत्वपूर्ण ऑटोफ्लोरेसेंस से बचना महत्वपूर्ण है।
    1. प्रदान की गई स्प्रेडशीट के कॉलम एक्स, वाई और जेड में माप दर्ज करें। 3 चैनलों में औसत पृष्ठभूमि तीव्रता एक्सेल स्प्रेडशीट (पूरक फ़ाइल 2) के ए 2, बी 2 और सी 2 में दर्ज की जाती है।
  5. अकेले जीएफपी या चेरी को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के चैनल 1, 2, 3 में औसत तीव्रता को मापें, और कॉलम सी, डी, ई, और एन, ओ, पी में माप दर्ज करें। संबंधित पृष्ठभूमि तीव्रता को घटाया जाता है (एफ, जी, एच, और क्यू, आर, एस में)।
  6. ई की गणना करने के लिए, फ्रेट दक्षता, क्रॉस-टॉक कारक एस1 और एस2 निर्धारित करें। वर्णक्रमीय क्रॉस-टॉक कारक एस1 की गणना केवल जीएफपी व्यक्त करने वाली कोशिकाओं से की जाती है
    Equation 6
    कॉलम I में. एक्सेल स्प्रेडशीट पर सेल डी 2 में एस1 के लिए औसत मान दर्ज करें।
  7. केवल चेरी को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं से वर्णक्रमीय क्रॉस-टॉक कारक एस2 की गणना करें
    Equation 7
    एक्सेल स्प्रेडशीट पर सेल ई 2 में एस 2 के लिए माध्य दर्ज करें।
  8. सुनिश्चित करें कि α कारक चैनल 1 में उत्तेजित जीएफपी अणुओं की किसी भी संख्या से चैनल 2 में समान संख्या में उत्तेजित चेरी अणुओं के संकेत से संबंधित है, और इसे किसके द्वारा परिभाषित किया गया है?
    Equation 8   Equation 13
    जहां क्यूए और क्यूडी चेरी और जीएफपी की प्रतिदीप्ति क्वांटम पैदावार हैं; η ए और ηडी क्रमशः चैनल 2 और 1 में स्वीकर्ता और दाता प्रतिदीप्ति की पहचान क्षमता।
    नोट: α कारक को जीएफपी और चेरी की ज्ञात पूर्ण मात्रा व्यक्त करने वाले दो नमूनों से निर्धारित किया जा सकता है। हालांकि, एक सेल में व्यक्त जीएफपी और चेरी की सटीक मात्रा जानना असंभव है। इसलिए, हमने जीएफपी-चेरी संलयन प्रोटीन को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं का उपयोग करके कारक की गणना की। यहां, जबकि पूर्ण राशि अभी भी अज्ञात है, दाता और स्वीकर्ता अणुओं का अनुपात एक माना जाता है।
  9. जीएफपी-चेरी संलयन प्रोटीन को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के चैनल 1, 2, 3 में औसत तीव्रता को मापें, और कॉलम एई, एएफ, एजी में माप दर्ज करें। पृष्ठभूमि तीव्रता को घटाया जाता है (एएच, एआई, एजे में)।
  10. जीएफपी-चेरी संलयन प्रोटीन के चैनल 1, 2 और 3 में प्रतिदीप्ति तीव्रता से α कारक (एजे कॉलम) की गणना निम्नानुसार करें:
    Equation 10
  11. चैनल 1 (I 1 - B 1), 2 (I 2 - B2) और 3 (I 3 - B3) में मापा गया पृष्ठभूमि-सही तीव्रता क्रमशः GFP-Chery chimera का उपयोग करके मापा जाता है। वर्णक्रमीय क्रॉस टॉक फैक्टर एस1 को केवल जीएफपी व्यक्त करने वाली कोशिकाओं का उपयोग करके निर्धारित किया गया था (देखें 4.7.)। εडी और εए जीएफपी, दाता और चेरी, स्वीकर्ता के विलुप्त होने के गुणांक हैं, 488 एनएम पर, और साहित्य से निर्धारित किया जा सकता है (εजीएफपी = 53,000 एम -1सेमी -1)18 और चेरी के अवशोषण वक्र (εचेरी ≈ 5560 एम -1सेमी1)। एक्सेल स्प्रेडशीट के सेल जी 2 में अनुपात Equation 11 दर्ज किया गया है। J2 में α कारक के लिए माध्य मान दर्ज करें।
  12. फ्रेट दक्षता, ई की गणना के लिए निर्धारित α कारक का उपयोग निम्नानुसार करें (कॉलम एके):
    Equation 12
  13. वैकल्पिक रूप से, नकारात्मक नियंत्रणों के लिए फ्रेट दक्षता, ई निर्धारित करें, यानी, जीएफपी और चेरी की सह-अभिव्यक्ति और जीएफपी-चेरी संलयन प्रोटीन माप के तहत कॉलम एडी, एई और एएफ में एक्सेल शीट में चैनल 1, 2 और 3 के माप को जोड़कर अकेले जीएफपी की अभिव्यक्ति। जीएफपी और चेरी लेबल प्रोटीन के बीच फ्रेट क्षमता का निर्धारण उसी तरह से करें।
  14. बिना नमी वाले दाता तीव्रता, ID को (I1 - B 1)/(1 - E) के रूप में निर्धारित करें, और IA = I3 - B 3 के रूप में स्वीकर्ता तीव्रता निर्धारित करें; ये मान टैग किए गए प्रोटीन के अभिव्यक्ति स्तरों के समानुपाती हैं।
  15. जीएफपी-चेरी संलयन प्रोटीन के सही स्वीकर्ता-से-दाता तीव्रता अनुपात (क्यू) को निम्नानुसार निर्धारित करें (कॉलम एएल):
    Equation 13
  16. अन्य सह-संक्रमित कोशिकाओं के लिए, स्वीकर्ता-से-दाता आणविक अनुपात एनए / एनडी की गणना निम्नानुसार करें:
    Equation 14
    नोट: एनए / एनडी अनुपात को निर्धारित करने और औसत सेलुलर फ्रेट दक्षता ई बनाम एनए / एनडी को प्लॉट करने का तर्क यह है कि एक दाता अणु कई स्वीकर्ताओं को ऊर्जा हस्तांतरित कर सकता है जबकि एक स्वीकर्ता अणु केवल एक निश्चित समय में एक दाता से ऊर्जा प्राप्त कर सकता है। यहां तक कि अगर बातचीत के स्टोइकोमेट्री के कारण केवल एक स्वीकर्ता दाता के साथ बातचीत कर सकता है, तो स्वीकर्ता एकाग्रता में वृद्धि से सामूहिक कार्रवाई के कानून के कारण स्वीकर्ता के साथ जटिल दाताओं के अंश में वृद्धि होने की उम्मीद है। इस प्रकार, दाता अभिव्यक्ति की एक निश्चित (या संकीर्ण सीमा) के लिए, फ्रेट दक्षता को एनए / एनडी में वृद्धि के साथ बढ़ना चाहिए। जीएफपी और चेरी की सह-अभिव्यक्ति के लिए फ्रेट दक्षता ई बनाम एनए / एनडी की योजना बनाते समय, यानी नकारात्मक जांच, हालांकि, एनए / एनडी में वृद्धि के परिणामस्वरूप फ्रेट दक्षता में वृद्धि नहीं होनी चाहिए (कम से कम पर्याप्त रूप से कम स्वीकर्ता सांद्रता में जहां दाता रंगों के स्वीकर्ता रंगों के आसपास के क्षेत्र के कारण यादृच्छिक फ्रेट नहीं होता है)।

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Representative Results

चित्र 1 दाता चैनल, चैनल 1 (488, 505-530 एनएम), स्थानांतरण चैनल, चैनल 2 (488, >585 एनएम), और स्वीकर्ता चैनल, चैनल 3 (561, >585 एनएम) में प्राप्त छवियों को क्रमशः दिखाता है। केवल जीएफपी को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवियां, केवल चेरी, जीएफपी और चेरी को सह-व्यक्त करना, और जीएफपी-चेरी संलयन प्रोटीन को व्यक्त करना। जीएफपी-चेरी संलयन प्रोटीन (सकारात्मक नियंत्रण, चित्रा 2 ए) को व्यक्त करने वाली एनआरके कोशिकाओं में गणना की गई औसत सेलुलर फ्रेट क्षमता और जीएफपी-चेरी (नकारात्मक नियंत्रण, चित्रा 2 बी) को सह-व्यक्त करने वाले प्रत्येक सेल में स्वीकर्ता-से-दाता अनुपात तीव्रता अनुपात (क्यू) या आणविक अनुपात एनए / एनडी के खिलाफ प्लॉट किया जाता है। चित्रा 2 सी रुचि के क्षेत्र को रेखांकित करने और उच्च ऑटोफ्लोरेसेंस के साथ पेरिन्यूक्लियर पुटिकाओं से बचने के तरीके पर एक उदाहरण दिखाता है।

प्रस्तुत एल्गोरिथ्म का उपयोग ट्रांसफर चैनल में छवि के प्रत्येक पिक्सेल में परिमाणीकरण सहित रुचि के किसी भी क्षेत्र में फ्रेट दक्षता को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। चित्रा 2 डी जीएफपी-चेरी संलयन प्रोटीन को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की सामान्यीकृत पिक्सेल-दर-पिक्सेल फ्रेट छवियों को दर्शाता है, जीएफपी और चेरी को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सह-व्यक्त करता है, और एशवेल-मोरेल रिसेप्टर के रिसेप्टर सबयूनिट्स को व्यक्त करता है। इस रिसेप्टर का चूहा संस्करण, चूहा हेपेटिक लेक्टिन (आरएचएल 1 और आरएचएल 2), एक दो-सबयूनिट रिसेप्टर सिस्टम है जिसे हेटेरो-ऑलिगोमेराइज के लिए जाना जाता है। सभी फ्रेट क्षमताओं को जीएफपी-चेरी संलयन प्रोटीन के लिए सामान्यीकृत किया गया था। हमने प्लाज्मा झिल्ली के साइटोप्लाज्मिक पक्ष पर जीएफपी और चेरी के साथ आरएचएल 1 और 2 को लेबल किया। छवि इंट्रासेल्युलर पुटिकाओं की तुलना में प्लाज्मा झिल्ली पर अलग-अलग फ्रेट मान दिखाती है। RHL1 (GFP-RHL1Stalk) के डंठल डोमेन को हटाने से, जिसे दो सबयूनिट्स के बीच तंग बातचीत को मध्यस्थ करने के लिए माना जाता है, पता लगाए गए फ्रेट क्षमता को कम करता है। चित्रा 2 ई में, जीएफपी-आरएचएल 1 और चेरी-आरएचएल 2, और जीएफपी-आरएचएल 1एस्टॉक और चेरी-आरएचएल 2 को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की औसत सेलुलर फ्रेट क्षमता को स्वीकर्ता-से-दाता आणविक अनुपात (एनए / एनडी) के खिलाफ प्लॉट किया गया है। इस रिसेप्टर सिस्टम के आगे के फ्रेट विश्लेषण के लिए पाठक पिछले प्रकाशन 5 का उल्लेख कर सकताहै।

Figure 1
चित्रा 1: फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवियां। केवल जीएफपी (ए), चेरी केवल (बी), जीएफपी और चेरी सह-अभिव्यक्ति (सी), और जीएफपी-चेरी संलयन प्रोटीन (डी) को व्यक्त करने वाली कोशिकाएं। चैनल 1 (488, 505-530 एनएम), चैनल 2 (488, >585 एनएम), और चैनल 3 (561, >585 एनएम) में छवियां क्रमशः। छवियों को 63x तेल उद्देश्य के साथ प्राप्त किया गया था और ज़ूम को 3x पर सेट किया गया था। स्केल बार: 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: फ्रेट छवियों का परिमाणीकरण। जीएफपी-चेरी संलयन प्रोटीन को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के लिए औसत सेलुलर फ्रेट क्षमता स्वीकर्ता-से-दाता तीव्रता अनुपात (क्यू) (ए) और जीएफपी और चेरी (बी) को सह-व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के लिए स्वीकर्ता-से-दाता आणविक अनुपात (एनए / एनडी) बनाम। खुली सर्कल मोटी रेखा जीएफपी-चेरी संलयन प्रोटीन को व्यक्त करने वाली एकल कोशिका का प्रतिनिधित्व करती है। खुली सर्कल पतली रेखा जीएफपी और चेरी को सह-व्यक्त करने वाली सेल का प्रतिनिधित्व करती है। ध्यान दें कि उच्च एनए / एनडी अनुपात पर उपयोगी संकेत का अंश, स्थानांतरण चैनल में संवेदी उत्सर्जन (आईडीई) स्वीकर्ता (आईएएस2) के प्रत्यक्ष उत्तेजना के सापेक्ष छोटा और छोटा हो जाता है। इसके परिणामस्वरूप ई के निर्धारण में एक बड़ी त्रुटि होती है। पिक्सेल-दर-पिक्सेल फ्रेट छवियों की गणना प्रस्तुत एल्गोरिथ्म (सी) का उपयोग करके की जाती है। यह पैनल दाता चैनल, स्थानांतरण चैनल और स्वीकर्ता चैनल में जीएफपी और चेरी, नकारात्मक नियंत्रण को सह-व्यक्त करने वाले सेल को दर्शाता है। यह उच्च ऑटोफ्लोरेसेंस के साथ पेरिन्यूक्लियर पुटिकाओं से बचने वाले रुचि के क्षेत्र की एक संभावित रूपरेखा भी दिखाता है जो फ्रेट गणना की सटीकता को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकता है। (डी) सभी फ्रेट क्षमताओं को जीएफपी-चेरी संलयन प्रोटीन के लिए सामान्यीकृत किया गया था। बाएं से दाएं, जीएफपी-चेरी संलयन प्रोटीन (सकारात्मक नियंत्रण), जीएफपी चेरी सह-अभिव्यक्ति (नकारात्मक नियंत्रण), जीएफपी-आरएचएल 1 और चेरी-आरएचएल 2, और जीएफपी-आरएचएल 1स्टॉक और चेरी-आरएचएल 2। स्केल बार: 10 μm. रंग-कोडित स्केल बार: सामान्यीकृत औसत फ्रेट दक्षता (सकारात्मक नियंत्रण, जीएफपी-चेरी संलयन प्रोटीन के औसत मूल्य के लिए सामान्यीकृत)। (ई) यह पैनल जीएफपी-आरएचएल 1 और चेरी-आरएचएल 2 के साथ-साथ जीएफपी-आरएचएल 1एस्टॉक और चेरी-आरएचएल 2 प्लॉटेड बनाम स्वीकर्ता-से-दाता आणविक अनुपात (एनए / एनडी) को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के लिए औसत सेलुलर फ्रेट क्षमता दिखाता है। बंद ग्रे सर्कल जीएफपी-आरएचएल 1 और चेरी-आरएचएल 2 को व्यक्त करने वाले एकल सेल का प्रतिनिधित्व करता है। बंद काला सर्कल जीएफपी-आरएचएल 1एस्टॉक और चेरी-आरएचएल 2 को व्यक्त करने वाली कोशिका का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1: अन्य दाता-स्वीकर्ता जोड़े के लिए एल्गोरिथ्म। अन्य दाता-स्वीकर्ता जोड़े के लिए एल्गोरिथ्म जैसे कि सियान के विभिन्न संस्करण (ईसीएफपी, साइपेट, एमटीएफपी 1, सेरुलेन, एमतुर्फ़ोइस 2) और पीला (ईवाईएफपी, सिट्रिन, वीनस, एसवाईएफपी 2, वाईपेट) फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: प्रस्तुत फ्रेट एल्गोरिदम के साथ स्प्रेडशीट और स्वीकर्ता के संवेदी उत्सर्जन और दाता-शमन द्वारा फ्रेट को मापने के लिए जीएफपी-चेरी संलयन प्रोटीन का उपयोग। सेल ए 2, बी 2, सी 2: चैनल 1,2 और 3 में क्रमशः औसत पृष्ठभूमि संकेत (बी 1, बी 2, बी 3)। सेल डी 2 और ई 2: क्रॉस-टॉक कारकों एस1, और एस2 के लिए औसत मान। सेल जी 2: विलुप्त होने गुणांक अनुपात Equation 11के लिए मूल्य। सेल आई 1, और आई 2: 488-एनएम लेजर प्रकाश पर जीएफपी और चेरी के विलुप्त होने के गुणांक। सेल जे 2: कारक के लिए औसत मूल्य। कॉलम सी (सी 5 और ऊपर): चैनल 1 में जीएफपी व्यक्त करने वाले सेल की प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापा। कॉलम डी (डी 5 और ऊपर): चैनल 2 में जीएफपी व्यक्त करने वाले सेल की प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापा। कॉलम ई (ई 5 और ऊपर): चैनल 3 में जीएफपी व्यक्त करने वाले सेल की प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापा। कॉलम एफ, जी, और एच (एफ 5, जी 5, एच 5 और ऊपर, क्रमशः): सभी 3 चैनलों में औसत पृष्ठभूमि तीव्रता द्वारा घटाए गए प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापा गया। कॉलम I (I5 और ऊपर): क्रॉस-टॉक फैक्टर S1 की गणना की। कॉलम एम (एम 5 और ऊपर): चैनल 1 में चेरी को व्यक्त करने वाले सेल की प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापा। कॉलम एन (एन 5 और ऊपर): चैनल 2 में चेरी को व्यक्त करने वाले सेल की प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापा। कॉलम ओ (ओ 5 और ऊपर): चैनल 3 में चेरी को व्यक्त करने वाले सेल की प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापा। कॉलम पी, क्यू, और आर (क्रमशः पी 5, क्यू 5, आर 5 और ऊपर): सभी 3 चैनलों में औसत पृष्ठभूमि तीव्रता द्वारा घटाए गए प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापा गया। कॉलम एस (एस 5 और ऊपर): क्रॉस-टॉक फैक्टर एस2 की गणना की। कॉलम डब्ल्यू (डब्ल्यू 5 और ऊपर): चैनल 1 में एक गैर-या मॉक-ट्रांसक्रिप्टेड सेल की प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापा। कॉलम एक्स (एक्स 5 और ऊपर): चैनल 2 में एक गैर-या मॉक-ट्रांसक्रिप्टेड सेल की प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापा। कॉलम वाई (वाई 5 और ऊपर): चैनल 3 में एक गैर-या मॉक-ट्रांसक्रिप्टेड सेल की प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापा गया। कॉलम एडी (एडी 5 और ऊपर): चैनल 1 में जीएफपी-चेरी फ्यूजन प्रोटीन (या जीएफपी और चेरी, या रुचि की किसी भी प्रोटीन जोड़ी) को व्यक्त करने वाले सेल की प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापा। कॉलम एई (एई 5 और ऊपर): चैनल 2 में जीएफपी-चेरी संलयन प्रोटीन (या जीएफपी और चेरी, या रुचि की किसी भी प्रोटीन जोड़ी को सह-व्यक्त) व्यक्त करने वाले सेल की प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापा। कॉलम एएफ (एएफ 5 और ऊपर): चैनल 3 में जीएफपी-चेरी संलयन प्रोटीन (या जीएफपी और चेरी, या रुचि की किसी भी प्रोटीन जोड़ी को सह-व्यक्त) व्यक्त करने वाले सेल की प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापा। कॉलम एजी, एएच, और एआई (एजी 5, एएच 5, एआई 5 और ऊपर, क्रमशः): सभी 3 चैनलों में औसत पृष्ठभूमि तीव्रता द्वारा घटाए गए प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापा गया। कॉलम एजे (एजे 5 और ऊपर): कारक α गणना की। कॉलम एके (एके 5 और ऊपर): गणना का मतलब फ्रेट दक्षता ई है। कॉलम एएल (एएल 5 और ऊपर): गणना की गई सही स्वीकर्ता-से-दाता तीव्रता अनुपात (क्यू)। फ्रेट प्रयोग से गणना किए गए मापदंडों के उदाहरण ों को माध्य और मानक विचलन के रूप में व्यक्त किया गया है: एस1 = 0.2232 ± 0.0060। S2 = 0.2039 ± 0.0074 α = 1.9463 ± 0.1409. E = 0.2713 ± 0.0220 कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 1: जीएफपी और चेरी अवशोषण और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा। ईजीएफपी और एमचेरी के सामान्यीकृत अवशोषण और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रा। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप में दाता चैनल (सीएच 1: 505-530 एनएम) और ट्रांसफर / स्वीकर्ता चैनल (सीएच 2 और 3: >585 एनएम) के लिए उपयोग की जाने वाली उत्तेजना लेजर लाइनें (488 और 543 एनएम) और फिल्टर ट्रांसमिशन को छायांकन द्वारा चिह्नित किया जाता है। स्वीकर्ता की उत्तेजना के लिए, 561 या 590-एनएम लेजर लाइनों का भी उपयोग किया जा सकता है। स्रोत फ्लोरोसेंट प्रोटीन डेटा बेस (fpbase.org)। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

प्रस्तुत प्रोटोकॉल में आनुवंशिक रूप से युग्मित वन-टू-वन फ्लोरोसेंट प्रोटीन कैलिब्रेशन जांच के उपयोग का विवरण दिया गया है ताकि स्वीकर्ता के संवेदनशील उत्सर्जन का पता लगाने और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा दाता अणु के शमन का उपयोग करके फ्रेट की मात्रा निर्धारित की जा सके। इस विधि को विभिन्न उपकोशिकीय डिब्बों में जीवित कोशिका के शारीरिक संदर्भ में प्रोटीन इंटरैक्शन का आकलन करने के लिए लागू किया जा सकता है। एक छवि (पिक्सेल-बाय-पिक्सेल फ्रेट) के प्रत्येक पिक्सेल में फ्रेट क्षमता की गणना करने के लिए प्रस्तुत एल्गोरिदम को लागू करके स्थानिक रिज़ॉल्यूशन को और बेहतर बनाया जा सकता है। पूर्ण फ्रेट क्षमता के तीव्रता-आधारित निर्धारण के लिए क्रॉस-टॉक के निर्धारण की आवश्यकता होती है, जो एस कारकों के साथ यहां निर्धारित की जाती है, और दिए गए सूक्ष्म सेट-अप द्वारा दाता और स्वीकर्ता अणुओं की पहचान दक्षता, α कारक द्वारा निर्धारित की जाती है। यहां, एक प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है जो क्रॉस-टॉक और डिटेक्शन दक्षता दोनों की मात्रा का ठहराव करने की अनुमति देता है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन की आनुवंशिक जानकारी का प्रत्यक्ष युग्मन जीवित कोशिकाओं में इक्विमोलर अभिव्यक्ति की गारंटी देता है और इस तरह α कारक का निर्धारण संभव बनाता है। बदले में α कारक का ज्ञान जीवित कोशिकाओं में फ्रेट दक्षता की मात्रा का ठहराव करने के लिए एक शर्त है। प्रदान किए गए प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम सीधे युग्मित फ्लोरोसेंट प्रोटीन चिमेरा की उचित क्लोनिंग, फ्लोरोसेंट प्रोटीन परिपक्वता की अनुमति देने के लिए अभिकर्मक के बाद पर्याप्त समय, एक समान सेलुलर माइक्रोएन्वायरमेंट में फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग, उदाहरण के लिए, साइटोप्लाज्म में फ्लोरोसेंट प्रोटीन और प्लाज्मा झिल्ली के साइटोप्लाज्मिक पक्ष पर, और एक स्थिर माइक्रोस्कोप सेट-अप है।

यहां प्रस्तुत प्रयोगात्मक सेट-अप और एल्गोरिदम जीएफपी-चेरी फ्रेट जोड़ी के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। हम पूरक फ़ाइल 1 में सियान (ईसीएफपी, साइपेट, एमटीएफपी 1, सेरुलेन, एमतुर्फ़ोइस 2) और पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईवाईएफपी, सिट्रीन, वीनस, एसवाईएफपी 2, वाईपेट) के विभिन्न संस्करणों के लिए एल्गोरिदम प्रदान करते हैं। इन फ्लोरोसेंट प्रोटीन जोड़े का लाभ सियान के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम और पीले प्रोटीन के अवशोषण स्पेक्ट्रम (जीएफपी-चेरी की तुलना में) के बीच एक अधिक वर्णक्रमीय ओवरलैप है, जिसके परिणामस्वरूप कुछ हद तक उच्च आर0 मान और बड़ी फ्रेट क्षमता होती है। हालांकि, इसी कारण से, गैर-नगण्य क्रॉसस्टॉक कारकों की संख्या और उनके परिमाण भी बड़े हैं (पूरक पाठ देखें)।

जीवित कोशिकाओं में मात्रात्मक सूक्ष्म अनुपातमेट्रिक फ्रेट की सीमाओं पर विचार करने और चर्चा करने की आवश्यकता है। आणविक इंटरैक्शन का पता लगाने के लिए फ्रेट का उपयोग करने की शर्त फ्लोरोसेंट टैग का अनुप्रयोग है। हमारा प्रोटोकॉल आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग करता है। चूंकि ये फ्लोरोसेंट प्रोटीन आकार (27 केडीए) में रुचि के टैग किए गए प्रोटीन के बराबर हो सकते हैं, इसलिए वे रुचि के प्रोटीन के स्थानीयकरण और कार्य को बदल सकते हैं। इसलिए, रुचि के किसी भी टैग किए गए प्रोटीन के स्थानीयकरण और कार्यक्षमता दोनों का परीक्षण किया जाना चाहिए और अंतर्जात अनलेबल प्रोटीन के साथ तुलना की जानी चाहिए। ध्यान में रखने के लिए एक और महत्वपूर्ण बिंदु रुचि के प्रोटीन का अंतर्जात अनलेबल पूल है। अनलेबल अंतर्जात प्रोटीन के साथ लेबल की बातचीत फ्रेट सिग्नल को कम कर देगी। आदर्श रूप से, रुचि के सभी प्रोटीन लेबल किए जाते हैं। यह उन कोशिकाओं का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है जिनके पास अंतर्जात रूप से रुचि का प्रोटीन नहीं है (जैसे कि चित्रा 2 सी और 2 ई में दिए गए उदाहरण में), नॉक-इन चूहों से प्राप्त कोशिकाओं का उपयोग करके, सीआरआईएसपीआर संशोधित कोशिकाओं का उपयोग करके, आदि। पिक्सेल-दर-पिक्सेल फ्रेट के उपयोग के साथ भी, दाता और स्वीकर्ता अणुओं के संकेत को विवर्तन-सीमित स्थान पर औसत किया जाएगा, जो एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप की रिज़ॉल्यूशन सीमा है। इसलिए, विवर्तन-सीमित स्थान के भीतर विभिन्न दाता आबादी को हल करना असंभव है। स्वीकर्ता के बिना दाता हो सकते हैं, या औसत फ्रेट सिग्नल में योगदान देने वाले कई स्वीकर्ताओं वाले दाता हो सकते हैं। फ्रेट द्वारा विभिन्न आणविक उप-आबादी को विच्छेदित करने के लिए प्रतिदीप्ति जीवनकाल इमेजिंग22 की आवश्यकता होती है। एक और समस्या, विशेष रूप से उच्च अभिव्यक्ति स्तरों पर, रुचि के प्रोटीन की अंतर्निहित बातचीत के बिना निकट निकटता में फ्लोरोफोरे के बीच तथाकथित यादृच्छिक फ्रेटहै। यह यादृच्छिक फ्रेट प्लाज्मा झिल्ली में महत्वपूर्ण हो सकता है क्योंकि झिल्ली प्रोटीन के 2-डी कारावास की तुलना में स्वतंत्र रूप से साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन की तुलना में होता है। इसलिए, नियंत्रण प्रयोगों को हमेशा किया जाना चाहिए जैसे कि उन डोमेन को हटाना जो अणुओं के बीच अनुमानित बातचीत को मध्यस्थ करते हैं और पता लगाए गए फ्रेट सिग्नल में कमी के लिए परीक्षण करते हैं।

जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन के अंतःक्रियात्मक प्रोटीन के सटीक स्टोइकोमेट्री की अनिश्चितता जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन के बीच आणविक दूरी का आकलन करने के लिए स्पेक्ट्रोस्कोपिक शासक के रूप में फ्रेट के उपयोग को सीमित करती है। यहां तक कि एक सख्त वन-टू-वन इंटरैक्शन के मामले में, (i) फ्लोरोसेंट प्रोटीन को रुचि के प्रोटीन से जोड़ने वाले लिंकर के लचीलेपन के साथ-साथ (ii) रंगों के द्विध्रुवीय क्षणों के सापेक्ष अभिविन्यास के ज्ञान की कमी (तथाकथित 2 कारक का निर्धारण) सटीक दूरी मापको भ्रमित कर सकता है। दो फ्लोरोफोरे को अलग करने और अलग-अलग फ्रेट क्षमता प्रदर्शित करने वाले अलग-अलग लंबाई के कठोर लिंकर के साथ स्वीकर्ता संलयन संरचनाओं परअध्ययन कहीं और रिपोर्ट किए गए हैं। इसके विपरीत, जीवित कोशिकाओं में फ्रेट माप के साथ स्टोइकोमेट्री का आकलन करना जटिल है, हालांकि प्रस्तुत अनुपातमेट्रिक फ्रेट परिमाणीकरण का उपयोग करके संभव है। इच्छुक पाठक को पिछले काम के लिए संदर्भित किया जा सकता है जिसमें एक व्यवहार्य दृष्टिकोणका विवरण दिया गया है।

सारांश में, यहां प्रस्तुत मात्रात्मक फ्रेट दृष्टिकोण (i) जीवित कोशिका के शारीरिक संदर्भ में प्रोटीन इंटरैक्शन का पता लगाने की अनुमति देता है, (ii) समय के साथ प्रोटीन इंटरैक्शन में परिवर्तन और (iii) एक कॉन्फोकल छवि के पिक्सेल-दर-पिक्सेल स्तर तक विभिन्न उपकोशिकीय डिब्बों में बातचीत में अंतर, और (iv) एक जीवित सेल में व्यक्त आणविक स्वीकर्ता-से-दाता अनुपात पर पता लगाए गए फ्रेट सिग्नल की निर्भरता।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम इस परियोजना के लिए उपकरण और स्थान प्रदान करने के लिए स्टैनफोर्ड यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन में न्यूरोसाइंस इमेजिंग सर्विस को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस शोध को स्टैनफोर्ड कैंसर इंस्टीट्यूट और गाइनीकोलॉजिकल ऑन्कोलॉजी डिवीजन स्टैनफोर्ड के साथ-साथ जीआईएनओपी -2.3.2-15-2016-00026, जीआईएनओपी -2.3.3-15-2016-00030, एनएन 129371, एएनएन 135107 के राष्ट्रीय अनुसंधान, विकास और नवाचार कार्यालय, हंगरी से इंट्राम्यूरल फंडिंग द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x) Thermo Fisher Scientific 15400054
Clontech mCherry N1 vector Addgene 3553
DMEM without phenol red Thermo Fisher Scientific 11054020
Fugene 6 Promega E2691
HEPES Thermo Fisher Scientific 15630080
LabTek 8-well chambers #1.0 Thermo Fisher Scientific 12565470
L-Glutamine (200 mM) Thermo Fisher Scientific 25030081

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References

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जीव विज्ञान अंक 170 लाइव-सेल इमेजिंग फ्रेट मात्रात्मक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी फ्लोरोफोरे प्रोटीन इंटरैक्शन संवेदनशील उत्सर्जन

Erratum

Formal Correction: Erratum: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission
Posted by JoVE Editors on 03/14/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission. The Authors section was updated from:

György Vámosi1
Sarah Miller2
Molika Sinha2
Gabor Mocsár1
Malte Renz2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

to:

György Vámosi1
Sarah Miller2
Molika Sinha2
Maria Kristha Fernandez2
Gabor Mocsár1
Malte Renz2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

फ्रेट-संवेदनशील उत्सर्जन के साथ लाइव-कोशिकाओं में प्रोटीन इंटरैक्शन का आकलन करना
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Vámosi, G., Miller, S., Sinha,… More

Vámosi, G., Miller, S., Sinha, M., Fernandez, M. K., Mocsár, G., Renz, M. Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission. J. Vis. Exp. (170), e62241, doi:10.3791/62241 (2021).

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