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Biology

Avaliando interações proteicas em células vivas com emissão sensibilizada por FRET

Published: April 22, 2021 doi: 10.3791/62241
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1, 2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen, 2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Summary

A Transferência de Energia de Ressonância de Förster (FRET) entre duas moléculas de fluoróforo pode ser usada para estudar as interações proteicas na célula viva. Aqui, um protocolo é fornecido sobre como medir o FRET em células vivas, detectando a emissão sensibilizada do aceptor e a têmpera da molécula doadora usando microscopia confocal de varredura a laser.

Abstract

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) é a transferência de energia sem radiação de um doador excitado para uma molécula aceitadora e depende da distância e orientação das moléculas, bem como da extensão da sobreposição entre os espectros de emissão do doador e absorção do aceitador. FRET permite estudar a interação de proteínas na célula viva ao longo do tempo e em diferentes compartimentos subcelulares. Diferentes algoritmos baseados em intensidade para medir FRET usando microscopia têm sido descritos na literatura. Aqui, um protocolo e um algoritmo são fornecidos para quantificar a eficiência do FRET com base na medição da emissão sensibilizada do aceptor e da têmpera da molécula doadora. A quantificação do FRET ratiométrico na célula viva não requer apenas a determinação do crosstalk (transbordamento espectral ou sangria) das proteínas fluorescentes, mas também a eficiência de detecção da configuração microscópica. O protocolo fornecido aqui detalha como avaliar esses parâmetros críticos.

Introduction

A análise baseada em microscopia da Transferência de Energia por Ressonância de Förster (FRET) permite a avaliação das interações entre proteínas em células vivas. Ele fornece informações espaciais e temporais, incluindo informações sobre onde na célula e em qual compartimento subcelular a interação ocorre e se essa interação muda ao longo do tempo.

Theodor Förster lançou as bases teóricas do FRET em 19481. FRET é uma transferência de energia sem radiação de um doador excitado para uma molécula aceitadora e depende da distância das moléculas e da orientação relativa de seus dipolos de transição, bem como da sobreposição entre os espectros de emissão e absorção do doador e do aceitador. A taxa de transferência de energia é inversamente proporcional à sexta potência da distância doador-aceitador. Assim, o FRET pode ser usado para medir a proximidade molecular na faixa de 1-10 nm.

O FRET compete com outros processos de desexcitação da molécula doadora e resulta na chamada extinção do doador e na emissão sensibilizada do aceitador. A têmpera de doadores é uma redução do número de fótons de doadores emitidos, enquanto a emissão sensibilizada é um aumento nos fótons aceptores emitidos. Muitas análises microscópicas de FRET usam medidas de intensidade de fluorescência, incluindo fotobranqueamento do aceitador 2, fotobranqueamento do doador2 ou fotobranqueamento sensibilizado pelo FRET do aceitador3.

Aqui, um protocolo experimental passo-a-passo e um algoritmo matemático são apresentados para quantificar o FRET usando a têmpera do doador e a emissão sensibilizada pelo aceitador4,5, um método muitas vezes referido como FRET ratiométrico. Muitos protocolos sobre como aproximar a emissão sensibilizada têm sido publicados, poucos quantificaram a eficiência absoluta do FRET 6,7,8,9. A quantificação das eficiências de FRET na célula viva requer a determinação (i) do crosstalk (transbordamento espectral ou sangria) das proteínas fluorescentes e, também (ii) da eficiência de detecção da configuração microscópica. Embora o crosstalk possa ser avaliado por células de imagem que expressam apenas um dos fluoróforos, a avaliação da eficiência relativa de detecção da fluorescência do doador e do aceitador é mais complicada. Requer o conhecimento de, pelo menos, a razão entre o número de moléculas doadoras e aceitadoras que dão origem aos sinais medidos. O número de fluoróforos expressos em células vivas varia, no entanto, de célula para célula e é desconhecido. O chamado fator de α caracteriza as forças relativas do sinal de uma única molécula excitado doador e aceitador. O conhecimento do fator é um pré-requisito para medições quantitativas de FRET ratiométrico em amostras com proporções variáveis de moléculas aceitador-doador, conforme encontrado durante imagens de células vivas com proteínas fluorescentes. O uso de uma proteína de fusão doador-aceptor 1 para 1 como sonda de calibração permite a determinação do fator α e também serve como um controle positivo. Esta sonda geneticamente acoplada é expressa por células em quantidades totais desconhecidas, mas em uma quantidade relativa fixa e conhecida de um-para-um. O protocolo a seguir estabelece como construir a sonda 1 para 1 e como usá-la para quantificação da eficiência do FET. Uma planilha que inclui todas as fórmulas pode ser encontrada no suplemento e pode ser usada pelos leitores para inserir suas próprias medidas nas respectivas colunas, conforme descrito abaixo.

Embora o protocolo utilize o par doador/aceitador GFP-Cherry, a abordagem apresentada pode ser realizada com qualquer outro par FET. O Arquivo Suplementar 1 fornece detalhes sobre pares ciano-amarelo.

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Protocol

1. Construção do plasmídeo

  1. Para gerar a sonda de fusão eGFP-mCherry1, use um vetor de expressão de células de mamíferos N1 (ver Tabela de Materiais) com mCherry110 inserido usando os locais de restrição AgeI e BsrGI.
  2. Utilizar os seguintes oligonucleótidos para amplificar a eGFP11 sem um códon de paragem como fragmento de SalI-BamHI : N-terminal primer 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3' e C-terminal primer 5'-AAT ATA TGG ATC CCG CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC 3'.
  3. Insira este fragmento de SalI-BamHI no local de clonagem múltipla do vetor N1 para introduzir o ligador RNPPV (cinco aminoácidos) entre a proteína fluorescente verde e vermelha.
    NOTA: Este ligador produz uma eficiência média de FRET para o par doador-aceitador GFP-Cherry de cerca de 0,25 -0,3 (Figura 1A). A escolha de ligadores rígidos12 e helicoidais13 de comprimentos variados para escalar as eficiências de FRET medidas foi discutida em outro lugar, mas não é necessária para o nosso propósito da proteína de fusão. Daqui para frente, para simplificar, chamaremos as proteínas fluorescentes de "GFP" e "Cherry".

2. Cultura celular e transfecção

  1. Use qualquer linhagem celular, por exemplo, células NRK, para experimentos de FRET em meios, por exemplo, o meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM), sem vermelho fenol, para reduzir a fluorescência de fundo. Pela mesma razão, o uso de tripsina livre de vermelho fenol é aconselhável.
  2. Uma vez que as células são 80% confluentes, desprenda as células com 1 mL de tripsina-EDTA a 0,05%, conte o número de células em suspensão usando uma câmara de Neubauer e semeie cerca de 10.000 células por poço de um vidro de cobertura com câmara de 8 poços; alternativamente, a partir de uma cultura de células confluentes cultivadas em balão T25, utilizar 1 gota de suspensão celular de uma pipeta de 2 ml ou 3 gotas de uma suspensão celular de 5 ml de uma cultura confluente cultivada num balão de cultura de 12,5 células T.
  3. Cultivar células em câmaras de 8 poços (0,8 cm 2 / poço) com vidro de cobertura #1.0 para microscopia de células vivas de fluorescência em condições padrão de cultura celular (37°C e 5% de CO2).
  4. 24 h após o chapeamento transfectar as células usando um meio de transfecção apropriado comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais), com GFP, Cereja, GFP / mistura de cereja (mistura 1:1, ou seja, 0,8 μg e 0,8 μg de GFP e DNA plasmídico de cereja) e a quimera GFP-Cherry.
    1. Para transfecção, use 5 μL do reagente de transfecção em 45 μL de DMEM e 1,6 μg de DNA plasmídico. Mexa mexendo suavemente o tubo de microcentrífuga.
    2. Após 15 min de incubação da mistura à temperatura ambiente, adicionar 1-2 μL da mistura de reagente de transfecção a cada poço da lâmina de câmara de 8 poços. Devolva o vidro da tampa com câmara à incubadora.
  5. Deixe transcorrer 20 h após a transfecção antes da imagem de células vivas, para permitir a expressão adequada de proteínas fluorescentes, enovelamento e maturação, especialmente do fluoróforo vermelho.

3. Imagem FRET

  1. Imagem de células transfectadas numa câmara ambiente humidificada e aquecida a 37 °C. Para tamponar o meio celular em pH fisiológico, use o gás CO 2 ajustado para 5% de fluxo ou adicione 20 mM de HEPES para tornar o meio celular independente de CO2.
  2. Use um microscópio de varredura a laser confocal. Defina a excitação e a emissão da seguinte forma para otimizar o sinal e minimizar a conversa cruzada.
    1. Use a linha de 488 nm do laser de íons de argônio para excitar a GFP e o laser de estado sólido bombeado por diodo de 561 nm (ou laser de néon de hélio de 543 nm, dependendo das linhas de laser disponíveis) para excitar Cherry.
    2. Defina o seguinte no software de um microscópio confocal comercial. Defina o espelho dicroico como 488 / 561 clicando no botão usando o menu suspenso. Coletar fluorescência usando luz laser de 488 nm para excitação no canal 1 através de uma banda de emissão de 505 - 530 nm (ou 505 - 550 nm) e no canal 2 com um filtro de passagem longa >585 nm e use a luz laser de 561 nm para excitação no canal 3 com um filtro de passagem longa > 585 nm (tipo em comprimentos de onda). Filtros passa-fita, por exemplo, 590 - 650 nm ou similares também podem ser usados, que têm a vantagem de excluir o espalhamento Raman.
  3. Excite com os dois lasers sequencialmente e defina o modo de imagem para Switch após cada linha para que a excitação da imagem de 512 x 512 pixels se alterne após cada linha (e não após cada quadro, o que revogaria a capacidade de detectar FRET devido à difusão das proteínas rotuladas durante a gravação das imagens com excitações diferentes; clique no botão).
  4. Configure uma mini-série temporal de três imagens com cliques de botão para detectar se ocorre um fotobranqueamento significativo e, potencialmente, reduzir a potência do laser. O fotobranqueamento de menos de 1% é o ideal. A alta intensidade do laser também pode levar à saturação por absorção, reduzindo a eficiência aparente do FRET14. A potência do laser, até 10-20 μW medida na lente objetiva é segura de usar.
  5. Primeiro, células de imagem expressando a construção de fusão GFP-Cherry. Defina os parâmetros que definem a intensidade do laser integrada ao tempo por pixel em uma imagem confocal, ou seja, o tempo de permanência do pixel em microssegundos, a transmissão do filtro ajustável acousto-óptico (AOTF) em porcentagem e o zoom.
    1. Células de imagem usando uma objetiva de óleo de 63x e Zoom definido como 3x. Isso fornece ampliação e resolução suficientes para as células de imagem em sua totalidade. Aponte para um tamanho de pixel de 70-80 nm.
    2. Defina o tempo de permanência do pixel para 2-4 μs e a transmissão AOTF para o laser de 488 nm e 561 nm, de modo que as imagens tenham uma boa relação sinal-ruído sem branqueamento e sem pixels mostrando saturação de intensidade de fluorescência. É vantajoso ajustar a potência do laser de 488 e 561 de tal forma que os níveis de sinal no canal 1 e no canal 3 sejam semelhantes.
    3. Defina o ganho do Fotomultiplicador (modo de média) para 600-800.
  6. Imagem com estas configurações 15-20 células expressando a proteína de fusão GFP-Cherry. 15-20 células fornecem boas estatísticas, mantendo o tempo total de uma sessão de medição FRET limitado a algumas horas para ajudar a garantir a estabilidade da configuração microscópica.
  7. Imagem com as mesmas células de configurações expressando GFP, Cherry, GFP e Cherry e células não transfectadas. Procure células expressas no canal verde ou no canal vermelho, respectivamente.
  8. Em seguida, imagem de 15-20 células co-expressando proteínas de interesse acopladas à GFP e Cherry, respectivamente. Procurando células expressivas, evite a longa exposição das células, a fim de não branquear as proteínas fluorescentes. A cereja tem uma fotoestabilidade menor do que a GFP, e o branqueamento da cereja, o aceptor compromete a análise FRET.
    NOTA: Os espectros de absorção e emissão de GFP e Cherry são apresentados na figura suplementar 1. Após a medição por 5-6 h, é aconselhável repetir a imagem de algumas células que expressam a quimera GFP-Cherry no final da sessão de imagem para documentar que a configuração permaneceu estável e as eficiências de FRET detectadas da proteína de fusão GFP-Cherry não mudaram significativamente durante o curso de uma sessão de imagem.

4. Análise de imagem para detectar eficiências absolutas de FRET usando têmpera de doadores e emissão sensibilizada

NOTA: Aqui, um guia prático passo-a-passo sobre como determinar a eficiência do FRET com o uso da planilha anexa (Arquivo Suplementar 2) é fornecido. A teoria e a derivação das equações apresentadas podem ser encontradas em detalhes em publicações anteriores 4,15,16,17. Com as configurações descritas, as seguintes intensidades de fluorescência são coletadas.

  1. Meça o sinal do doador I 1 no canal 1, o canal doador, com excitação de 488 nm e uma banda de emissão de 505-530 nm.
    Equation 2
    onde ID é o sinal de doador não apagado no canal 1 que seria medido na ausência de um aceitador, é a eficiência média do FRET, e B 1 o sinal de fundo médio no canal 1.
  2. Meça o sinal aceitador I 3 no canal 3, o canal aceitador, com excitação e emissão de 561 nm a >585 nm.
    Equation 3
    onde IA é o sinal do aceitador e B 3 o fundo no canal 3.
  3. Meça o sinal FRET no canal 2, o canal de transferência, com excitação e emissão de 488 nm a >585 nm.
    Equation 4
    Onde, o sinal no canal 2 é uma soma de quatro componentes diferentes: (i) I D(1 - E)S 1 é o transbordamento espectral do sinal doador apagado para o canal de detecção >585 (com o fator de cross-talk S 1), (ii) IA S 2 é o sinal aceptor da excitação direta pela luz de 488 nm (com o fator de cross-talk S2), (iii) IDEα é a emissão sensibilizada do aceptor por FRET a partir da molécula doadora excitada (α será detalhada mais detalhadamente em 4.8. - 4.10.), e (iv) B2 é o sinal de fundo.
  4. Medir as intensidades médias de fundo nos canais 1, 2, 3 em células não transfectadas ou simuladas; qualquer um deles está bem com uma diferença insignificante. Para todas as medições celulares, use a ferramenta de mão livre para delinear regiões de interesse e evitar vesículas perinucleares com aumento da autofluorescência. É importante evitar a autofluorescência significativa dessas vesículas perinucleares.
    1. Insira as medidas nas colunas X, Y e Z da planilha fornecida. As intensidades médias de fundo nos 3 canais são inseridas em A2, B2 e C2 da planilha do Excel (Arquivo Suplementar 2).
  5. Meça as intensidades médias nos canais 1, 2, 3 de células que expressam GFP ou Cherry isoladamente e insira as medições nas colunas C, D, E e N, O, P. As respectivas intensidades de fundo são subtraídas (em F, G, H e Q, R, S).
  6. Para calcular E, a eficiência do FET, determine os fatores de cross-talk S 1 e S2. O fator de cross-talk espectral S1 é calculado a partir de células que expressam apenas GFP
    Equation 6
    na coluna I. Insira o valor médio de S1 na célula D2 da planilha do Excel.
  7. Calcular o fator de cross-talk espectral S2 a partir de células que expressam apenas Cherry
    Equation 7
    na coluna T. Insira a média de S2 na célula E2 da planilha do Excel.
  8. Certifique-se de que o fator de α relaciona o sinal de qualquer número dado de moléculas de GFP excitadas no canal 1 com o sinal de um número igual de moléculas de cereja excitadas no canal 2, e é definido por
    Equation 8   Equation 13
    onde Q A e QD são os rendimentos quânticos de fluorescência de Cherry e GFP; ηA e ηD as eficiências de detecção da fluorescência do aceitador e do doador nos canais 2 e 1, respectivamente.
    NOTA: O factor de α pode ser determinado a partir de duas amostras que expressam quantidades absolutas conhecidas de GFP e Cherry. No entanto, é impossível saber a quantidade exata de GFP e Cherry expressa em uma célula. Portanto, calculamos o fator usando células que expressam a proteína de fusão GFP-Cherry. Aqui, enquanto a quantidade absoluta ainda é desconhecida, a proporção de moléculas doadoras e aceitadoras é conhecida por ser uma.
  9. Meça as intensidades médias nos canais 1, 2, 3 das células que expressam a proteína de fusão GFP-Cherry e insira as medições nas colunas AE, AF, AG. As intensidades de fundo são subtraídas (em AH, AI, AJ).
  10. Calcular o factor de α (coluna AJ) a partir das intensidades de fluorescência nos canais 1, 2 e 3 da proteína de fusão GFP-Cherry da seguinte forma:
    Equation 10
  11. As intensidades corrigidas pelo fundo medidas no canal 1 (I 1 - B 1), 2 (I 2 - B 2) e 3 (I 3 - B3), respectivamente, são medidas usando a quimera GFP-Cherry. O fator de conversação cruzada espectral S1 foi determinado usando apenas células que expressam GFP (ver 4.7.). εD e ε A são os coeficientes de extinção da GFP, do doador, e da Cherry, a aceitadora, a 488 nm, e podem ser determinados a partir da literatura (ε GFP = 53.000 M-1 cm-1)18 e da curva de absorção da Cherry (εCherry ≈ 5560 M-1cm 1). A proporção Equation 11 foi inserida na célula G2 da planilha do Excel. Insira o valor médio do fator α em J2.
  12. Utilizar o factor de α determinado para o cálculo da eficiência do FRET, E, do seguinte modo (coluna AK):
    Equation 12
  13. Alternativamente, determine a eficiência do FET, E, para os controles negativos, ou seja, a co-expressão de GFP e Cherry e a expressão de GFP sozinha, adicionando as medidas dos canais 1, 2 e 3 na folha de excel na coluna AD, AE e AF sob as medições da proteína de fusão GFP-Cherry. Determine as eficiências de FRET entre as proteínas GFP e Cherry marcadas de interesse da mesma maneira.
  14. Determinar a intensidade do doador não extinguido, I D como (I 1 - B 1)/(1 - E), e a intensidade do aceitador como I A = I 3 - B3; esses valores são proporcionais aos níveis de expressão das proteínas marcadas.
  15. Determinar a razão de intensidade (Q) aceptor-doador corrigida da proteína de fusão GFP-Cherry da seguinte forma (coluna AL):
    Equation 13
  16. Para outras células co-transfectadas, calcule a relação molecular aceptor-doador N A/ND da seguinte forma:
    Equation 14
    NOTA: A lógica para determinar a relação N A/N D e plotar a eficiência média do FRET celular E versus N A/N D, é que uma molécula doadora pode transferir energia para múltiplos aceitadores, enquanto uma molécula aceitadora só pode receber energia de um doador em um determinado momento. Mesmo que apenas um aceitador possa interagir com um doador por causa da estequiometria da interação, espera-se que um aumento da concentração do aceptor aumente a fração de doadores em complexo com o aceitador por causa da lei da ação de massa. Assim, para uma faixa fixa (ou estreita de) expressão do doador, a eficiência do FRET deve aumentar com o aumento de N A / ND. Ao plotar a eficiência FRET E versus N A/N D para a co-expressão de GFP e Cherry, ou seja, a sonda negativa, no entanto, um aumento em N A/N D não deve resultar em um aumento na eficiência FRET (pelo menos em concentrações de aceitador suficientemente baixas onde FRET aleatório devido à proximidade de corantes aceptores para corantes doadores não ocorre).

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Representative Results

A Figura 1 mostra as imagens obtidas no canal doador, canal 1 (488, 505-530 nm), canal de transferência, canal 2 (488, >585 nm) e canal aceitador, canal 3 (561, >585 nm), respectivamente. Imagens representativas de células expressando apenas GFP, somente Cherry, co-expressando GFP e Cherry e expressando a proteína de fusão GFP-Cherry. As eficiências celulares médias de FRET calculadas em células NRK que expressam a proteína de fusão GFP-Cherry (controle positivo, Figura 2A) e aquelas que co-expressam GFP-Cherry (controle negativo, Figura 2B) são plotadas versus a razão de intensidade (Q) da relação aceitador-doador ou razão molecular N A/ND em cada célula. A Figura 2C ilustra um exemplo de como delinear uma região de interesse e evitar vesículas perinucleares com alta autofluorescência.

O algoritmo apresentado pode ser usado para quantificar a eficiência do FRET em qualquer região de interesse, incluindo a quantificação em cada pixel da imagem no canal de transferência. A Figura 2D mostra imagens FRET pixel-a-pixel normalizadas de células expressando a proteína de fusão GFP-Cherry, co-expressando GFP e Cherry como controle negativo e expressando subunidades receptoras do receptor Ashwell-Morell. A variante deste receptor no rato, a lectina hepática do rato (RHL1 e RHL2), é um sistema receptor de duas subunidades que é conhecido por hetero-oligomerizar. Todas as eficiências de FRET foram normalizadas para a da proteína de fusão GFP-Cherry. Marcamos RHL1 e 2 com GFP e Cherry no lado citoplasmático da membrana plasmática. A imagem mostra valores distintos de FRET na membrana plasmática em comparação com as vesículas intracelulares. A exclusão do domínio stalk do RHL1 (GFP-RHL1Δstalk), que se acredita mediar a interação apertada entre as duas subunidades, diminui as eficiências de FRET detectadas. Na Figura 2E, as eficiências celulares médias de FRET das células que expressam GFP-RHL1 e Cherry-RHL2, e GFP-RHL1Δstalk e Cherry-RHL2 são plotadas versus a relação molecular aceptor-doador (N A/ND). Para análises FRET adicionais deste sistema receptor, o leitor pode consultar uma publicação anterior5.

Figure 1
Figura 1: Imagens representativas de células expressando proteínas fluorescentes. Células que expressam apenas GFP (A), Cherry apenas (B), GFP e Cherry co-expressão (C) e GFP-Cherry fusion protein (D). Imagens no canal 1 (488, 505-530 nm), canal 2 (488, >585 nm) e canal 3 (561, >585 nm), respectivamente. As imagens foram obtidas com objetiva de óleo de 63x e zoom ajustado para 3x. Barra de escala: 10 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Quantificação das imagens FET. Eficiências médias de FRET celular para células que expressam a proteína de fusão GFP-Cherry plotada versus a relação de intensidade aceptor-doador (Q) (A) e versus a relação molecular aceptor-doador (N A/ND) para células que co-expressam GFP e Cherry (B). A linha espessa do círculo aberto representa uma única célula expressando a proteína de fusão GFP-Cherry. A linha fina do círculo aberto representa uma célula que co-expressa GFP e Cherry. Note-se que em relações N A/N D mais altas a fração do sinal útil, a emissão sensibilizada (I DEα) no canal de transferência torna-se cada vez menor em relação à excitação direta do aceptor (IAS2). Isso resulta em um erro maior na determinação de E. Imagens FRET pixel a pixel calculadas usando o algoritmo apresentado (C). Este painel ilustra uma célula co-expressando GFP e Cherry, o controle negativo, no canal doador, no canal de transferência e no canal aceptor. Também mostra um possível contorno de uma região de interesse evitando vesículas perinucleares com alta autofluorescência, o que pode afetar negativamente a precisão do cálculo do FET. (D) Todas as eficiências de FRET foram normalizadas para a da proteína de fusão GFP-Cherry. Da esquerda para a direita, proteína de fusão GFP-Cherry (controle positivo), co-expressão de GFP Cherry (controle negativo), GFP-RHL1 e Cherry-RHL2, e GFP-RHL1Δstalk e Cherry-RHL2. Barra de escala: 10 μm. Barra de escala codificada por cores: eficiência média normalizada do FRET (normalizada para o valor médio do controle positivo, a proteína de fusão GFP-Cherry). (E) Este painel mostra as eficiências médias do FRET celular para as células que expressam a GFP-RHL1 e Cherry-RHL2, bem como GFP-RHL1Δstalk e Cherry-RHL2 plotadas versus a relação molecular aceitador-doador (N A/ND). O círculo cinza fechado representa uma única célula que expressa GFP-RHL1 e Cherry-RHL2. O círculo preto fechado representa uma célula que expressa GFP-RHL1Δstalk e Cherry-RHL2. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Algoritmo para outros pares doador-aceitador. Algoritmo para outros pares doador-aceitador, como diferentes versões de proteínas fluorescentes ciano (ECFP, CyPet, mTFP1, Cerulean, mTurquoise2) e amarelas (EYFP, Citrino, Vênus, SYFP2, YPet). Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Planilha com o algoritmo FRET apresentado e uso da proteína de fusão GFP-Cherry para quantificar o FRET por emissão sensibilizada do aceitador e têmpera do doador. Células A2, B2, C2: Sinais de fundo médios (B 1, B 2, B 3) nos canais 1, 2 e 3, respectivamente. Células D2 e E2: Valores médios para os fatores de cross-talk S 1 e S2. Célula G2: Valor para a razão Equation 11do coeficiente de extinção . Célula I1 e I2: Coeficientes de extinção de GFP e Cherry à luz laser de 488 nm. Célula J2: Valor médio do fator. Coluna C (C5 e acima): intensidade de fluorescência medida de uma célula que expressa GFP no canal 1. Coluna D (D5 e acima): intensidade de fluorescência medida de uma célula que expressa GFP no canal 2. Coluna E (E5 e acima): intensidade de fluorescência medida de uma célula que expressa GFP no canal 3. Colunas F, G e H (F5, G5, H5 e acima, respectivamente): intensidades de fluorescência medidas subtraídas por intensidades médias de fundo em todos os 3 canais. Coluna I (I5 e acima): Fator de cross-talk calculado S1. Coluna M (M5 e acima): intensidade de fluorescência medida de uma célula que expressa Cherry no canal 1. Coluna N (N5 e acima): intensidade de fluorescência medida de uma célula que expressa Cherry no canal 2. Coluna O (O5 e acima): intensidade de fluorescência medida de uma célula que expressa Cherry no canal 3. Colunas P, Q e R (P5, Q5, R5 e acima, respectivamente): intensidades de fluorescência medidas subtraídas por intensidades médias de fundo em todos os 3 canais. Coluna S (S5 e acima): Fator de cross-talk calculado S2. Coluna W (W5 e acima): intensidade de fluorescência medida de uma célula não transfectada ou simulada no canal 1. Coluna X (X5 e acima): intensidade de fluorescência medida de uma célula não transfectada ou simulada no canal 2. Coluna Y (Y5 e acima): intensidade de fluorescência medida de uma célula não transfectada ou simulada no canal 3.Coluna AD (AD5 e acima): intensidade de fluorescência medida de uma célula que expressa a proteína de fusão GFP-Cherry (ou co-expressa GFP e Cherry, ou qualquer par de proteínas de interesse) no canal 1. Coluna AE (AE5 e acima): intensidade de fluorescência medida de uma célula que expressa a proteína de fusão GFP-Cherry (ou co-expressando GFP e Cherry, ou qualquer par de proteínas de interesse) no canal 2. AF da coluna (AF5 e acima): intensidade de fluorescência medida de uma célula que expressa a proteína de fusão GFP-Cherry (ou co-expressa GFP e Cherry, ou qualquer par de proteínas de interesse) no canal 3. Colunas AG, AH e AI (AG5, AH5, AI5 e acima, respectivamente): intensidades de fluorescência medidas subtraídas por intensidades médias de fundo em todos os 3 canais. Coluna AJ (AJ5 e acima): Fator de α calculado. Coluna AK (AK 5 e superior): Eficiência média calculada do FRET E. Coluna AL (AL5 e acima): razão de intensidade (Q) corrigida do aceptor/doador calculada. Exemplos de parâmetros calculados de um experimento FRET expressos em média e desvio padrão: S1 = 0,2232 ± 0,0060. S2 = 0,2039 ± 0,0074. α = 1.9463 ± 0.1409. E = 0,2713 ± 0,0220. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 1 suplementar: Espectros de absorção e emissão de GFP e Cherry. Espectros normalizados de absorção e emissão de fluorescência de eGFP e mCherry. As linhas de laser de excitação (488 e 543 nm) e as transmissões de filtro usadas para o canal doador (ch1: 505-530 nm) e os canais de transferência/aceitador (ch2 e 3: >585 nm) no microscópio confocal são marcados por sombreamento. Para excitação do aceitador, linhas de laser de 561 ou 590 nm também podem ser usadas. Base de dados de proteínas fluorescentes de origem (fpbase.org). Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

O protocolo apresentado detalha o uso da sonda de calibração de proteínas fluorescentes um-para-um acoplada geneticamente para quantificação do FRET utilizando a detecção de emissão sensibilizada do aceptor e têmpera da molécula doadora por microscopia confocal. Este método pode ser aplicado para avaliar as interações proteicas no contexto fisiológico da célula viva em diferentes compartimentos subcelulares. A resolução espacial pode ser melhorada ainda mais aplicando o algoritmo apresentado para calcular as eficiências FRET em cada pixel de uma imagem (TRE pixel a pixel). A determinação baseada na intensidade das eficiências absolutas de FRET requer a determinação do cross-talk, quantificado aqui com os fatores S , e a eficiência de detecção de moléculas doadoras e aceitadoras pela configuração microscópica dada, quantificada pelo fator α. Aqui, é fornecido um protocolo que permite a quantificação da eficiência da conversação cruzada e da detecção. O acoplamento direto da informação genética da proteína fluorescente garante a expressão equimolar em células vivas e, assim, possibilita a determinação do fator α. O conhecimento do fator de α, por sua vez, é um pré-requisito para a quantificação da eficiência do FRET em células vivas. As etapas críticas no protocolo fornecido são a clonagem adequada da quimera da proteína fluorescente diretamente acoplada, tempo suficiente após a transfecção para permitir a maturação da proteína fluorescente, o uso de proteínas fluorescentes em um microambiente celular semelhante, por exemplo, proteínas fluorescentes no citoplasma e no lado citoplasmático da membrana plasmática e uma configuração estável do microscópio.

A configuração experimental e o algoritmo apresentados aqui são projetados para o par GFP-Cherry FRET. Fornecemos no Arquivo Suplementar 1 o algoritmo para diferentes versões de proteínas fluorescentes ciano (ECFP, CyPet, mTFP1, Cerulean, mTurquoise2) e amarelas (EYFP, Citrino, Vênus, SYFP2, YPet). A vantagem desses pares de proteínas fluorescentes é uma maior sobreposição espectral entre o espectro de emissão do ciano e o espectro de absorção da proteína amarela (em comparação com a GFP-Cherry), resultando em valores de R0 um pouco mais altos e maiores eficiências de FET. No entanto, pela mesma razão, o número de fatores de crosstalk não desprezíveis e suas magnitudes também são maiores (ver Texto Suplementar).

Limitações do FRET raciométrico microscópico quantitativo em células vivas precisam ser consideradas e discutidas. O pré-requisito do uso do FRET para detectar interações moleculares é a aplicação de etiquetas fluorescentes. Nosso protocolo usa proteínas fluorescentes geneticamente codificadas. Uma vez que essas proteínas fluorescentes podem ser comparáveis em tamanho (27 kDa) à proteína marcada de interesse, elas podem alterar a localização e a função da proteína de interesse. Portanto, tanto a localização quanto a funcionalidade de qualquer proteína marcada de interesse devem ser testadas e comparadas com as da proteína endógena não marcada. Outro ponto crítico a ter em mente é o pool endógeno não rotulado da proteína de interesse. As interações do marcado com proteínas endógenas não marcadas diminuirão o sinal FET. Idealmente, todas as proteínas de interesse são rotuladas. Isso pode ser conseguido usando células que não possuem a proteína de interesse endogenamente (como no exemplo dado nas Figuras 2C e 2E ), usando células derivadas de camundongos knock-in, usando células modificadas por CRISPR, etc. Mesmo com o uso de FRET pixel a pixel, o sinal das moléculas doadoras e aceitadoras será calculado em média em um ponto limitado por difração, o limite de resolução de um microscópio confocal. Portanto, é impossível resolver diferentes populações de doadores dentro de um ponto limitado por difração. Pode haver doadores sem um aceitador, ou doadores com múltiplos aceitadores contribuindo para o sinal médio de FET. A dissecação de diferentes subpopulações moleculares por FRET requer imagens de fluorescência ao longo da vida22. Outro problema, especialmente em altos níveis de expressão, é o chamado FRET aleatório entre fluoróforos em estreita proximidade, sem interação subjacente das proteínas de interesse23. Este FRET aleatório pode ser significativo na membrana plasmática, dado o confinamento 2-D das proteínas da membrana em comparação com proteínas citoplasmáticas livremente difusivas. Portanto, experimentos de controle devem sempre ser feitos, como a exclusão de domínios que medeiam a interação presumida entre moléculas e o teste de redução no sinal FRET detectado.

A incerteza das estequiometrias exatas de proteínas que interagem em células vivas limita o uso de FRET como uma régua espectroscópica para avaliar distâncias moleculares entre proteínas em células vivas. Mesmo no caso de uma interação estrita um-para-um, (i) a flexibilidade do ligador que liga a proteína fluorescente à proteína de interesse, bem como (ii) a falta de conhecimento da orientação relativa dos momentos dipolares dos corantes (determinando o chamado fator κ2 ) pode confundir as medições exatas da distância. Estudos sobre construtos de fusão de aceptores com ligadores rígidos de diferentes comprimentos separando os dois fluoróforos e exibindo diferentes eficiências de FRET foram relatados em outros lugares12. Por outro lado, a avaliação de estequiometrias com medidas de FRET em células vivas é complexa, porém possível usando a quantificação FRET ratiométrica apresentada. O leitor inclinado pode ser encaminhado para trabalhos anteriores detalhando uma abordagem viável5.

Em resumo, a abordagem quantitativa FRET aqui apresentada permite a detecção de (i) interações proteicas no contexto fisiológico da célula viva, (ii) mudanças nas interações proteicas ao longo do tempo e (iii) diferenças nas interações em diferentes compartimentos subcelulares até o nível pixel-a-pixel de uma imagem confocal, e (iv) a dependência do sinal FRET detectado da relação aceptor-doador molecular expressa em uma célula viva.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer ao Serviço de Imagem de Neurociência da Escola de Medicina da Universidade de Stanford por fornecer equipamentos e espaço para este projeto. Esta pesquisa foi apoiada pelo financiamento intramural do Stanford Cancer Institute e da Gynecologic Oncology Division Stanford, bem como pelo GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 do Escritório Nacional de Pesquisa, Desenvolvimento e Inovação, Hungria.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x) Thermo Fisher Scientific 15400054
Clontech mCherry N1 vector Addgene 3553
DMEM without phenol red Thermo Fisher Scientific 11054020
Fugene 6 Promega E2691
HEPES Thermo Fisher Scientific 15630080
LabTek 8-well chambers #1.0 Thermo Fisher Scientific 12565470
L-Glutamine (200 mM) Thermo Fisher Scientific 25030081

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References

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Biologia Edição 170 imagens de células vivas FRET microscopia quantitativa de fluorescência fluoróforo interação proteica emissão sensibilizada

Erratum

Formal Correction: Erratum: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission
Posted by JoVE Editors on 03/14/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission. The Authors section was updated from:

György Vámosi1
Sarah Miller2
Molika Sinha2
Gabor Mocsár1
Malte Renz2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

to:

György Vámosi1
Sarah Miller2
Molika Sinha2
Maria Kristha Fernandez2
Gabor Mocsár1
Malte Renz2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

Avaliando interações proteicas em células vivas com emissão sensibilizada por FRET
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Vámosi, G., Miller, S., Sinha,… More

Vámosi, G., Miller, S., Sinha, M., Fernandez, M. K., Mocsár, G., Renz, M. Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission. J. Vis. Exp. (170), e62241, doi:10.3791/62241 (2021).

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