Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bedömning av proteininteraktioner i levande celler med FRET-sensibiliserad emission

Published: April 22, 2021 doi: 10.3791/62241
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1, 2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen, 2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Summary

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) mellan två fluoroformolekyler kan användas för att studera proteininteraktioner i den levande cellen. Här tillhandahålls ett protokoll för hur man mäter FRET i levande celler genom att detektera sensibiliserad emission av acceptorn och släckning av donatormolekylen med hjälp av konfokal laserskanningsmikroskopi.

Abstract

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) är den strålningsfria överföringen av energi från en exciterad givare till en acceptormolekyl och beror på molekylernas avstånd och orientering samt graden av överlappning mellan givaremissionen och acceptorabsorptionsspektra. FRET tillåter att studera interaktionen mellan proteiner i den levande cellen över tid och i olika subcellulära fack. Olika intensitetsbaserade algoritmer för att mäta FRET med mikroskopi har beskrivits i litteraturen. Här tillhandahålls ett protokoll och en algoritm för att kvantifiera FRET-effektivitet baserat på mätning av både acceptorns sensibiliserade emission och kylning av donatormolekylen. Kvantifieringen av ratiometrisk FRET i den levande cellen kräver inte bara bestämning av överhörning (spektral spill-over eller genomblödning) av de fluorescerande proteinerna utan också detektionseffektiviteten hos den mikroskopiska inställningen. Protokollet som tillhandahålls här beskriver hur man bedömer dessa kritiska parametrar.

Introduction

Mikroskopibaserad analys av Förster Resonance Energy Transfer (FRET) möjliggör bedömning av interaktioner mellan proteiner i levande celler. Det ger rumslig och tidsmässig information, inklusive information om var i cellen och i vilket subcellulärt fack interaktionen äger rum och om denna interaktion förändras över tiden.

Theodor Förster lade den teoretiska grunden för FRET 19481. FRET är en strålningsfri överföring av energi från en exciterad givare till en acceptormolekyl och beror på molekylernas avstånd och den relativa orienteringen av deras övergångsdipoler samt överlappningen mellan givaremissionen och acceptorabsorptionsspektra. Energiöverföringshastigheten är omvänt proportionell mot den sjätte effekten av givar-acceptoravståndet. Således kan FRET användas för att mäta molekylär närhet i intervallet 1-10 nm.

FRET konkurrerar med andra de-excitationsprocesser av givarmolekylen och resulterar i den så kallade donatorsläckningen och sensibiliserade emissionen av acceptorn. Donatorsläckning är en minskning av antalet emitterade donatorfotoner, medan sensibiliserad emission är en ökning av emitterade acceptorfotoner. Många mikroskopiska FRET-analyser använder fluorescensintensitetsmätningar, inklusive acceptorfotoblekning 2, givarfotoblekning2 eller FRET-sensibiliserad fotoblekning av acceptorn3.

Här presenteras ett steg-för-steg-experimentellt protokoll och matematisk algoritm för att kvantifiera FRET med hjälp av donatorkylning och acceptorsensibiliserad emission4,5, en metod som ofta kallas ratiometrisk FRET. Många protokoll om hur man approximerar sensibiliserade utsläpp har publicerats, få har kvantifierat den absoluta FRET-effektiviteten 6,7,8,9. Kvantifieringen av FRET-effektiviteten i den levande cellen kräver bestämning av (i) överhörning (spektral spill-over eller genomblödning) av de fluorescerande proteinerna och även (ii) detektionseffektiviteten hos den mikroskopiska installationen. Medan överhörning kan bedömas genom att avbilda celler som endast uttrycker en av fluoroforerna, är bedömningen av den relativa detektionseffektiviteten hos givaren och acceptorfluorescensen mer komplicerad. Det kräver kunskap om åtminstone förhållandet mellan antalet donator- och acceptormolekyler som ger upphov till de uppmätta signalerna. Antalet fluoroforer som uttrycks i levande celler varierar dock från cell till cell och är okänt. Den så kallade α faktorn karakteriserar de relativa signalstyrkorna från en enda exciterad donator- och acceptormolekyl. Kunskap om faktorn är en förutsättning för kvantitativa ratiometriska FRET-mätningar i prover med variabla acceptor-till-donatormolekylförhållanden som påträffas vid avbildning av levande celler med fluorescerande proteiner. Användning av ett 1-till-1 donatoracceptorfusionsprotein som kalibreringssond möjliggör bestämning av den α faktorn och fungerar också som en positiv kontroll. Denna genetiskt kopplade sond uttrycks av celler i okända totala mängder men i en fast och känd relativ mängd en-till-en. Följande protokoll beskriver hur man konstruerar 1-till-1-sonden och hur man använder den för kvantifiering av FRET-effektivitet. Ett kalkylblad som innehåller alla formler finns i tillägget och kan användas av läsarna för att ange sina egna mått i respektive kolumn enligt beskrivningen nedan.

Medan protokollet använder GFP-Cherry-donator-/acceptorparet, kan det presenterade tillvägagångssättet utföras med vilket annat FRET-par som helst. Tilläggsfil 1 innehåller information om cyangula par.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Plasmidkonstruktion

  1. För att generera fusionssonden eGFP-mCherry1, använd en N1-celluttrycksvektor för däggdjur (se materialförteckning) med mCherry110 infogad med restriktionsställena AgeI och BsrGI.
  2. Använd följande oligonukleotider för att förstärka eGFP11 utan stoppkodon som SalI-BamHI-fragment : N-terminal primer 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3' och C-terminal primer 5'-AAT ATA TGG ATC CCG CTT GTA CAG CTC GTC GTC CAT GC 3'.
  3. Sätt in detta SalI-BamHI-fragment i N1-vektorns multipla kloningsställe för att införa RNPPV-länkare (fem aminosyror) mellan det gröna och röda fluorescerande proteinet.
    OBS: Denna länkare ger en genomsnittlig FRET-effektivitet för GFP-Cherry-donator-acceptorparet på cirka 0,25 -0,3 (figur 1A). Valet av styva12 och spiralformade13-länkar av varierande längd för att skala uppmätta FRET-effektivitet har diskuterats någon annanstans men krävs inte för vårt syfte med fusionsproteinet. Framöver kommer vi för enkelhetens skull att kalla de fluorescerande proteinerna "GFP" och "Cherry".

2. Cellodling och transfektion

  1. Använd vilken cellinje som helst, t.ex. NRK-celler, för FRET-experiment i media, t.ex. Dulbeccos modifierade Eagle's media (DMEM), utan fenolrött, för att minska bakgrundsfluorescensen. Av samma anledning rekommenderas användning av fenolrött fritt trypsin.
  2. När cellerna är 80% sammanflytande, lossa celler med 1 ml 0,05% trypsin-EDTA, räkna antalet celler i suspension med hjälp av en Neubauer-kammare och frö cirka 10 000 celler per brunn av ett 8-brunnskammarglas; Alternativt, från en sammanflytande cellkultur odlad i T25-kolv, använd 1 droppe cellsuspension från en 2 ml pipett eller 3 droppar från en 5 ml cellsuspension från en konfluent kultur odlad i en T12.5-cellig odlingskolv.
  3. Odla celler i 8-brunnskammare (0,8 cm 2 / brunn) med # 1,0 täckglas för fluorescens levande cellmikroskopi vid standardcellodlingsförhållanden (37 ° C och 5% CO2).
  4. 24 timmar efter plätering transfekt cellerna med hjälp av ett lämpligt kommersiellt tillgängligt transfektionsmedium (se materialtabell), med GFP, körsbär, GFP / körsbärsblandning (1: 1-blandning, dvs 0,8 μg och 0,8 μg GFP och körsbärsplasmid-DNA) och GFP-körsbärschimären.
    1. För transfektion, använd 5 μL transfektionsreagens i 45 μL DMEM och 1,6 μg plasmid-DNA. Rör om genom att försiktigt vrida mikrocentrifugröret.
    2. Efter 15 minuters inkubation av blandningen vid rumstemperatur tillsätts 1-2 μL av transfektionsreagensblandningen till varje brunn i 8-brunnskammarglaset. Sätt tillbaka det kammade täckglaset till inkubatorn.
  5. Låt 20 timmar efter transfektion förflyta före avbildning av levande celler, för att möjliggöra korrekt fluorescerande proteinuttryck, veckning och mognad, särskilt av den röda fluoroforen.

3. FRET-avbildning

  1. Avbildning av transfekterade celler i en fuktad och uppvärmd miljökammare vid 37 °C. För att buffra cellmediet vid fysiologiskt pH, använd CO 2-gas inställd på 5% flöde, eller tillsätt 20 mM HEPES för att göra cellmediet CO2-oberoende.
  2. Använd ett konfokalt laserskanningsmikroskop. Ställ in excitation och emission enligt följande för att optimera signalen och minimera överhörning.
    1. Använd argonjonlaserns 488-nm-linje för att excitera GFP och 561-nm-diodpumpad halvledarlaser (eller 543-nm heliumneonlaser, beroende på tillgängliga laserlinjer) för att excitera körsbär.
    2. Ställ in följande i programvaran för ett kommersiellt konfokalmikroskop. Ställ in Dichroic-spegeln på 488 / 561 med knappklick med rullgardinsmenyn. Samla fluorescens med 488 nm laserljus för excitation i kanal 1 genom ett emissionsband på 505 - 530 nm (eller 505 - 550 nm) och i kanal 2 med ett långpassfilter >585 nm och använd 561 nm laserljus för excitation i kanal 3 med ett långpassfilter > 585 nm (skriv in våglängder). Bandpassfilter t.ex. 590 - 650 nm eller liknande kan också användas som har fördelen att utesluta Raman-spridning.
  3. Excitera med de två lasrarna sekventiellt och ställ in bildläget på Byt efter varje rad så att excitationen av bilden på 512 x 512 pixlar växlar efter varje rad (och inte efter varje bildruta, vilket skulle upphäva möjligheten att detektera FRET på grund av diffusion av de märkta proteinerna medan bilderna spelas in med olika excitationer; knappklick).
  4. Ställ in en minitidsserie med tre bilder med knapptryck för att upptäcka om betydande fotoblekning inträffar och eventuellt minska lasereffekten. Fotoblekning på mindre än 1% är optimal. Hög laserintensitet kan också leda till absorptionsmättnad som minskar den uppenbara FRET-effektiviteten14. Lasereffekt, upp till 10-20 μW mätt vid objektivlinsen är säker att använda.
  5. Först bildceller som uttrycker GFP-Cherry-fusionskonstruktionen. Ställ in parametrarna som definierar den tidsintegrerade laserintensiteten per pixel i en konfokal bild, dvs. pixeluppehållstiden i mikrosekunder, AOTF-överföringen (acousto-optical tunable filter) i procent och zoomen.
    1. Bildceller med ett 63x oljemål och zoom inställd på 3x. Detta ger tillräcklig förstoring och upplösning till bildceller i sin helhet. Sikta på en pixelstorlek på 70-80 nm.
    2. Ställ in Pixel uppehållstid till 2-4 μs och AOTF-överföring för 488-nm och 561-nm laser så att bilderna har ett bra signal-brusförhållande utan blekning och inga pixlar som visar fluorescensintensitetsmättnad. Det är fördelaktigt att justera lasereffekten på 488 och 561 så att signalnivåerna i kanal 1 och kanal 3 är likartade.
    3. Ställ in fotomultiplikatorn (medelvärdesläge) på 600-800.
  6. Bild med dessa inställningar 15-20 celler som uttrycker GFP-Cherry fusionsproteinet. 15-20 celler ger bra statistik samtidigt som den totala tiden för en FRET-mätsession begränsas till några timmar för att säkerställa stabiliteten i den mikroskopiska uppsättningen.
  7. Bild med samma inställningsceller som uttrycker GFP, Cherry, GFP och Cherry och icke-transfekterade celler. Sök efter uttryckande celler i den gröna kanalen respektive den röda kanalen.
  8. Avbilda sedan 15-20 celler som samuttrycker proteiner av intresse kopplade till GFP respektive Cherry. Söka efter uttryckande celler, undvik lång exponering av cellerna för att inte bleka de fluorescerande proteinerna. Cherry har en lägre fotostabilitet än GFP, och blekning av Cherry, acceptorn äventyrar FRET-analysen.
    OBS: Absorptions- och emissionsspektra för GFP och körsbär visas i kompletterande figur 1. Efter mätning i 5-6 timmar är det lämpligt att upprepa avbildning av några celler som uttrycker GFP-Cherry-chimären i slutet av avbildningssessionen för att dokumentera att uppsättningen förblev stabil och detekterade FRET-effektivitet hos GFP-Cherry-fusionsproteinet inte förändrades signifikant under en bildsession.

4. Bildanalys för att detektera absolut FRET-effektivitet med hjälp av givarkylning och sensibiliserad emission

OBS: Här tillhandahålls en praktisk steg-för-steg-guide om hur man bestämmer FRET-effektiviteten med hjälp av det bifogade kalkylbladet (kompletterande fil 2). Teori och härledning av de presenterade ekvationerna finns i detalj i tidigare publikationer 4,15,16,17. Med de beskrivna inställningarna samlas följande fluorescensintensiteter in.

  1. Mät givarsignalen I 1 i kanal 1, givarkanalen, med 488 nm excitation och ett emissionsband på 505-530 nm.
    Equation 2
    där ID är den outsläckta givarsignalen i kanal 1 som skulle mätas i frånvaro av en acceptor, är den genomsnittliga FRET-effektiviteten och B 1 den genomsnittliga bakgrundssignalen i kanal 1.
  2. Mät acceptorsignalen I 3 i kanal 3, acceptorkanalen, med 561 nm excitation och emission vid >585 nm.
    Equation 3
    där IA är acceptorsignalen och B 3 bakgrunden i kanal 3.
  3. Mät FRET-signalen i kanal 2, överföringskanalen, med 488 nm excitation och emission vid >585 nm.
    Equation 4
    Där signalen i kanal 2 är summan av fyra olika komponenter: (i) I D(1 - E)S 1 är spektralspillet från den släckta givarsignalen till detekteringskanalen >585 (med överhörnningsfaktorn S 1), ii) IA S 2 är acceptorsignalen från den direkta excitationen med 488 nm ljus (med överhörnningsfaktorn S2), iii) IDEα är acceptorns sensibiliserade emission av FRET från den exciterade givarmolekylen (α beskrivs närmare i 4.8.8.4.10.), och iv) B2 är bakgrundssignalen.
  4. Mät genomsnittliga bakgrundsintensiteter i kanalerna 1, 2, 3 i icke-transfekterade eller mock-transfekterade celler; antingen är bra med försumbar skillnad. För alla cellmätningar, använd frihandsverktyget för att avgränsa intressanta regioner och undvika perinukleära vesiklar med ökad autofluorescens. Det är viktigt att undvika betydande autofluorescens från dessa perinukleära vesiklar.
    1. Ange måtten i kolumnerna X, Y och Z i det medföljande kalkylbladet. Genomsnittliga bakgrundsintensiteter i de 3 kanalerna anges i A2, B2 och C2 i Excel-kalkylbladet (kompletterande fil 2).
  5. Mät genomsnittliga intensiteter i kanalerna 1, 2, 3 av celler som uttrycker GFP eller Cherry ensam och ange mätningarna i kolumnerna C, D, E och N, O, P. Respektive bakgrundsintensitet subtraheras (i F, G, H och Q, R, S).
  6. För att beräkna E, FRET-effektiviteten, bestäm överhörningsfaktorerna S 1 och S2. Den spektrala överhörnningsfaktorn S1 beräknas från celler som endast uttrycker GFP
    Equation 6
    i kolumn I. Ange medelvärdet för S1 i cell D2 i Excel-kalkylbladet.
  7. Beräkna den spektrala överhörningsfaktorn S2 från celler som endast uttrycker körsbär
    Equation 7
    i kolumn T. Ange medelvärdet för S2 i cell E2 i Excel-kalkylbladet.
  8. Se till att den α faktorn relaterar signalen från ett givet antal exciterade GFP-molekyler i kanal 1 till signalen från ett lika stort antal exciterade körsbärsmolekyler i kanal 2 och definieras av
    Equation 8   Equation 13
    där Q A och QD är fluorescenskvantutbytet för körsbär och GFP; ηA och ηD detektionseffektiviteten hos acceptor- och givarfluorescens i kanalerna 2 respektive 1.
    OBS: Den α faktorn kunde bestämmas från två prover som uttrycker kända absoluta mängder GFP och Cherry. Det är dock omöjligt att veta den exakta mängden GFP och körsbär som uttrycks i en cell. Därför beräknade vi faktorn genom att använda celler som uttrycker GFP-Cherry-fusionsproteinet. Här, medan den absoluta mängden fortfarande är okänd, är förhållandet mellan givar- och acceptormolekyler känt för att vara ett.
  9. Mät genomsnittliga intensiteter i kanalerna 1, 2, 3 av celler som uttrycker GFP-körsbärsfusionsproteinet och ange mätningarna i kolumnerna AE, AF, AG. Bakgrundsintensiteter subtraheras (i AH, AI, AJ).
  10. Beräkna den α faktorn (AJ-kolonn) från fluorescensintensiteterna i kanal 1, 2 och 3 i GFP-körsbärsfusionsproteinet enligt följande:
    Equation 10
  11. Bakgrundskorrigerade intensiteter uppmätta i kanal 1 (I 1 - B 1), 2 (I 2 - B 2) respektive 3 (I 3 - B3) mäts med GFP-Cherry-chimären. Den spektrala överhörnningsfaktorn S1 bestämdes endast med celler som uttrycker GFP (se 4.7). εD och ε A är extinktionskoefficienterna för GFP, givaren, och Cherry, acceptorn, vid 488 nm, och kan bestämmas från litteraturen (ε GFP = 53 000 M-1 cm-1)18 och absorptionskurvan för Cherry (εCherry ≈ 5560 M-1cm 1). Förhållandet Equation 11 har angetts i cell G2 i Excel-kalkylbladet. Ange medelvärdet för den α faktorn i J2.
  12. Använd den fastställda α faktorn för beräkning av FRET-effektiviteten, E, enligt följande (kolumn AK):
    Equation 12
  13. Alternativt kan du bestämma FRET-effektiviteten, E, för de negativa kontrollerna, dvs. samuttrycket av GFP och Cherry och uttrycket av GFP ensam genom att lägga till mätningarna av kanalerna 1, 2 och 3 i excelarket i kolumn AD, AE och AF under GFP-Cherry fusionsproteinmätningarna. Bestäm FRET-effektiviteten mellan GFP- och Cherry-märkta proteiner av intresse på samma sätt.
  14. Bestäm den osläckta givarintensiteten, I D som (I 1 - B 1) / (1 - E) och acceptorintensiteten som I A = I 3 - B3; Dessa värden är proportionella mot uttrycksnivåerna för de märkta proteinerna.
  15. Bestäm det korrigerade intensitetsförhållandet mellan acceptor och givare (Q) för GFP-körsbärsfusionsproteinet enligt följande (kolumn AL):
    Equation 13
  16. För andra samtransfekterade celler, beräkna acceptor-tillgivarmolekylförhållandet N A/ND enligt följande:
    Equation 14
    OBS: Motiveringen för att bestämma N A / N D-förhållandet och plotta den genomsnittliga cellulära FRET-effektiviteten E kontra N A / N D, är att en donatormolekyl kan överföra energi till flera acceptorer medan en acceptormolekyl endast kan ta emot energi från en givare vid en given tidpunkt. Även om endast en acceptor kan interagera med en givare på grund av interaktionens stökiometri, förväntas en ökning av acceptorkoncentrationen öka andelen givare i komplex med acceptorn på grund av lagen om massverkan. För ett fast (eller smalt intervall) givaruttryck bör FRET-effektiviteten öka med ökande N A/ND. Vid plottning av FRET-effektiviteten E jämfört med N A/N D för samuttryck av GFP och körsbär, dvs. den negativa sonden, bör dock en ökning av N A/N D inte resultera i en ökning av FRET-effektiviteten (åtminstone vid tillräckligt låga acceptorkoncentrationer där slumpmässig FRET på grund av närheten mellan acceptorfärgämnen och donatorfärgämnen inte förekommer).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 visar bilderna som erhållits i givarkanalen, kanal 1 (488, 505-530 nm), överföringskanalen, kanal 2 (488, >585 nm) respektive acceptorkanalen, kanal 3 (561, >585 nm). Representativa bilder av celler som uttrycker endast GFP, endast körsbär, samuttryckande GFP och körsbär och uttrycker fusionsproteinet GFP-körsbär. Den genomsnittliga cellulära FRET-effektiviteten beräknad i NRK-celler som uttrycker GFP-Cherry-fusionsprotein (positiv kontroll, figur 2A) och de som uttrycker GFP-Cherry (negativ kontroll, figur 2B) plottas mot intensitetsförhållandet mellan acceptor och givare (Q) eller molekylförhållandet N A / ND i varje cell. Figur 2C illustrerar ett exempel på hur man skisserar ett område av intresse och undviker perinukleära vesiklar med hög autofluorescens.

Den presenterade algoritmen kan användas för att kvantifiera FRET-effektiviteten i alla intressanta regioner, inklusive kvantifieringen i varje pixel av bilden i överföringskanalen. Figur 2D visar normaliserade FRET-bilder pixel för pixel av celler som uttrycker GFP-Cherry-fusionsproteinet, som uttrycker GFP och Cherry som negativ kontroll och uttrycker receptorsubenheter av Ashwell-Morell-receptorn. Råttvarianten av denna receptor, råtthepatiskt lektin (RHL1 och RHL2), är ett två-subenhetsreceptorsystem som är känt för hetero-oligomerisera. Alla FRET-verkningsgrader normaliserades till GFP-körsbärsfusionsproteinet. Vi märkte RHL1 och 2 med GFP och körsbär på den cytoplasmatiska sidan av plasmamembranet. Bilden visar tydliga FRET-värden vid plasmamembranet jämfört med intracellulära vesiklar. Om man tar bort stjälkdomänen för RHL1 (GFP-RHL1Δstalk), som tros förmedla den täta interaktionen mellan de två underenheterna, minskar den detekterade FRET-effektiviteten. I figur 2E plottas genomsnittlig cellulär FRET-effektivitet för celler som uttrycker GFP-RHL1 och Cherry-RHL2 och GFP-RHL1Δstalk och Cherry-RHL2 jämfört med acceptor-till-donatormolekylförhållandet (N A/ND). För ytterligare FRET-analyser av detta receptorsystem hänvisas läsaren till en tidigare publikation5.

Figure 1
Figur 1: Representativa bilder av celler som uttrycker fluorescerande proteiner. Celler som uttrycker endast GFP (A), endast körsbär (B), GFP och körsbärsuttryck (C) och GFP-körsbärsfusionsprotein (D). Bilder i kanal 1 (488, 505-530 nm), kanal 2 (488, >585 nm) respektive kanal 3 (561, >585 nm). Bilder togs med 63x oljemål och zoom inställd på 3x. Skalstång: 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Kvantifiering av FRET-bilder. Genomsnittlig cellulär FRET-effektivitet för celler som uttrycker GFP-körsbärsfusionsproteinet plottat kontra acceptor-till-donatorintensitetsförhållandet (Q) (A) och kontra acceptor-till-donator-molekylförhållandet ( N A/ND) för celler som samuttrycker GFP och körsbär (B). Öppen cirkel tjock linje representerar en cell som uttrycker GFP-körsbärsfusionsprotein. Öppen cirkel tunn linje representerar en cell som uttrycker GFP och körsbär. Observera att vid högre N A / ND-förhållanden fraktionen av den användbara signalen blir den sensibiliserade emissionen (I DEα) i överföringskanalen mindre och mindre i förhållande till acceptorns direkta excitation (IAS2). Detta resulterar i ett större fel vid bestämningen av E. FRET-bilder pixel för pixel beräknade med den presenterade algoritmen (C). Denna panel illustrerar en cell som samuttrycker GFP och Cherry, den negativa kontrollen, i givarkanalen, överföringskanalen och acceptorkanalen. Den visar också en möjlig översikt över en region av intresse som undviker perinukleära vesiklar med hög autofluorescens, vilket kan påverka precisionen i FRET-beräkningen negativt. (D) All FRET-effektivitet normaliserades till GFP-körsbärsfusionsproteinet. Från vänster till höger, GFP-Cherry fusion protein (positiv kontroll), GFP Cherry co-expression (negativ kontroll), GFP-RHL1 och Cherry-RHL2 och GFP-RHL1Δstalk och Cherry-RHL2. Skalstång: 10 μm. Färgkodad skalstapel: normaliserad genomsnittlig FRET-effektivitet (normaliserad till medelvärdet för den positiva kontrollen, GFP-körsbärsfusionsproteinet). (E) Denna panel visar genomsnittlig cellulär FRET-effektivitet för celler som uttrycker GFP-RHL1 och Cherry-RHL2 samt GFP-RHL1Δstalk och Cherry-RHL2 plottade kontra acceptor-till-donatormolekylförhållandet (N A/ND). Stängd grå cirkel representerar en enda cell som uttrycker GFP-RHL1 och Cherry-RHL2. Stängd svart cirkel representerar en cell som uttrycker GFP-RHL1Δstalk och Cherry-RHL2. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande fil 1: Algoritm för andra donator-acceptorpar. Algoritm för andra donator-acceptorpar såsom olika versioner av cyan (ECFP, CyPet, mTFP1, Cerulean, mTurquoise2) och gula (EYFP, Citrine, Venus, SYFP2, YPet) fluorescerande proteiner. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 2: Kalkylblad med den presenterade FRET-algoritmen och användning av GFP-Cherry-fusionsproteinet för att kvantifiera FRET genom sensibiliserad emission av acceptorn och donatorsläckning. Cellerna A2, B2, C2: Genomsnittliga bakgrundssignaler (B 1, B 2, B 3) i kanalerna 1, 2 respektive 3. Cellerna D2 och E2: Medelvärden för överhörningsfaktorerna S 1 och S 2. Cell G2: Värde för extinktionskoefficientförhållande Equation 11. Cell I1 och I2: Extinktionskoefficienter för GFP och körsbär vid 488 nm laserljus. Cell J2: Medelvärde för faktor. Kolumn C (C5 och uppåt): uppmätt fluorescensintensitet hos en cell som uttrycker GFP i kanal 1. Kolumn D (D5 och uppåt): uppmätt fluorescensintensitet hos en cell som uttrycker GFP i kanal 2. Kolumn E (E5 och uppåt): uppmätt fluorescensintensitet hos en cell som uttrycker GFP i kanal 3. Kolumnerna F, G och H (F5, G5, H5 respektive uppåt): uppmätta fluorescensintensiteter subtraherade med genomsnittliga bakgrundsintensiteter i alla 3 kanalerna. Kolumn I (I5 och uppåt): Beräknad överhörnningsfaktor S1. Kolumn M (M5 och uppåt): uppmätt fluorescensintensitet hos en cell som uttrycker körsbär i kanal 1. Kolumn N (N5 och uppåt): uppmätt fluorescensintensitet hos en cell som uttrycker körsbär i kanal 2. Kolumn O (O5 och uppåt): uppmätt fluorescensintensitet hos en cell som uttrycker körsbär i kanal 3. Kolumnerna P, Q och R (P5, Q5, R5 respektive uppåt): uppmätta fluorescensintensiteter subtraherade med genomsnittliga bakgrundsintensiteter i alla 3 kanalerna. Kolumn S (S5 och uppåt): Beräknad överhörnningsfaktor S2. Kolumn W (W5 och uppåt): uppmätt fluorescensintensitet hos en icke- eller fingerad transfekterad cell i kanal 1. Kolumn X (X5 och uppåt): uppmätt fluorescensintensitet för en icke- eller skentransfekterad cell i kanal 2. Kolumn Y (Y5 och uppåt): uppmätt fluorescensintensitet hos en icke- eller skentransfekterad cell i kanal 3.Kolumn AD (AD 5 och uppåt): uppmätt fluorescensintensitet hos en cell som uttrycker fusionsproteinet GFP-körsbär (eller samuttryckande GFP och körsbär, eller något proteinpar av intresse) i kanal 1. Kolumn AE (AE5 och uppåt): uppmätt fluorescensintensitet hos en cell som uttrycker GFP-körsbärsfusionsproteinet (eller samuttryckande GFP och körsbär, eller något proteinpar av intresse) i kanal 2. Kolumn AF (AF5 och uppåt): uppmätt fluorescensintensitet hos en cell som uttrycker GFP-körsbärsfusionsproteinet (eller samuttryckande GFP och körsbär, eller något proteinpar av intresse) i kanal 3. Kolumnerna AG, AH och AI (AG5, AH5, AI5 respektive uppåt): uppmätta fluorescensintensiteter subtraherade av genomsnittliga bakgrundsintensiteter i alla 3 kanaler. Kolumn AJ (AJ5 och uppåt): Beräknat α faktor. Kolumn AK (AK 5 och uppåt): Beräknat medelvärde för FRET-effektivitet E. Kolumn AL (AL5 och uppåt): beräknat korrigerat förhållande mellan acceptor och donatorintensitet (Q). Exempel på beräknade parametrar från ett FRET-experiment uttryckt som medelvärde och standardavvikelse: S1 = 0,2232 ± 0,0060. S2 = 0,2039 ± 0,0074. α = 1.9463 ± 0.1409. E = 0,2713 ± 0,0220. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 1: GFP och körsbärsabsorptions- och emissionsspektra. Normaliserade absorptions- och fluorescensemissionsspektra för eGFP och mCherry. Excitationslaserlinjerna (488 och 543 nm) och filteröverföringarna som används för givarkanalen (ch1: 505-530 nm) och överförings- / acceptorkanalerna (ch2 & 3: >585 nm) i konfokalmikroskopet markeras med skuggning. För excitation av acceptorn kan 561 eller 590 nm laserlinjer också användas. Källa fluorescerande protein databas (fpbase.org). Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det presenterade protokollet beskriver användningen av den genetiskt kopplade en-till-en fluorescerande proteinkalibreringssonden för kvantifiering av FRET med hjälp av detektion av sensibiliserad emission av acceptorn och släckning av givarmolekylen genom konfokalmikroskopi. Denna metod kan tillämpas för att bedöma proteininteraktioner i den levande cellens fysiologiska sammanhang i olika subcellulära fack. Den rumsliga upplösningen kan förbättras ytterligare genom att använda den presenterade algoritmen för att beräkna FRET-effektiviteten i varje pixel i en bild (FRET pixel för pixel). Intensitetsbaserad bestämning av absolut FRET-effektivitet kräver bestämning av överhörning, kvantifierad här med S-faktorerna , och detektionseffektiviteten hos givar- och acceptormolekyler med den givna mikroskopiska uppsättningen, kvantifierad av den α faktorn. Här tillhandahålls ett protokoll som möjliggör kvantifiering av både överhörning och detektionseffektivitet. Direkt koppling av den genetiska informationen av fluorescerande protein garanterar ekvimolärt uttryck i levande celler och gör därmed bestämningen av den α faktorn möjlig. Kunskap om den α faktorn är i sin tur en förutsättning för kvantifiering av FRET-effektiviteten i levande celler. Kritiska steg i det tillhandahållna protokollet är korrekt kloning av det direktkopplade fluorescerande proteinchimären, tillräckligt med tid efter transfektion för att möjliggöra fluorescerande proteinmognad, användning av fluorescerande proteiner i en liknande cellulär mikromiljö, t.ex. fluorescerande proteiner i cytoplasma och på cytoplasmasidan av plasmamembranet och en stabil mikroskopuppsättning.

Experimentell uppställning och algoritm som presenteras här är utformade för GFP-Cherry FRET-paret. Vi tillhandahåller i tilläggsfilen 1 algoritmen för olika versioner av cyan (ECFP, CyPet, mTFP1, Cerulean, mTurquoise2) och gula fluorescerande proteiner (EYFP, Citrine, Venus, SYFP2, YPet). Fördelen med dessa fluorescerande proteinpar är en större spektral överlappning mellan cyanens emissionsspektrum och absorptionsspektrumet för det gula proteinet (jämfört med GFP-körsbär) vilket resulterar i något högre R0-värden och större FRET-effektivitet. Av samma skäl är dock antalet icke försumbara överhörningsfaktorer och deras storlek också större (se kompletterande text).

Begränsningar av kvantitativ mikroskopisk ratiometrisk FRET i levande celler måste beaktas och diskuteras. Förutsättningen för att använda FRET för att detektera molekylära interaktioner är tillämpningen av fluorescerande taggar. Vårt protokoll använder genetiskt kodade fluorescerande proteiner. Eftersom dessa fluorescerande proteiner kan vara jämförbara i storlek (27 kDa) med det märkta proteinet av intresse, kan de ändra lokalisering och funktion av proteinet av intresse. Därför bör både lokalisering och funktionalitet av alla märkta proteiner av intresse testas och jämföras med de för det endogena omärkta proteinet. En annan kritisk punkt att tänka på är den endogena omärkta poolen av proteinet av intresse. Interaktionerna mellan de märkta och omärkta endogena proteinerna kommer att minska FRET-signalen. Helst är alla proteiner av intresse märkta. Detta kan uppnås genom att använda celler som inte har proteinet av intresse endogent (som i exemplet i figur 2C och 2E ), använda celler härledda från knock-in-möss, använda CRISPR-modifierade celler etc. Även med användning av pixel-för-pixel FRET kommer signalen från givar- och acceptormolekyler att beräknas i genomsnitt över en diffraktionsbegränsad punkt, upplösningsgränsen för ett konfokalmikroskop. Därför är det omöjligt att lösa olika givarpopulationer inom en diffraktionsbegränsad plats. Det kan finnas givare utan acceptor, eller givare med flera acceptorer som bidrar till den genomsnittliga FRET-signalen. Dissekering av olika molekylära subpopulationer med FRET kräver fluorescens livstidsavbildning22. Ett annat problem, särskilt vid höga uttrycksnivåer, är den så kallade slumpmässiga FRET mellan fluoroforer i närheten utan underliggande interaktion mellan proteinerna av intresse23. Denna slumpmässiga FRET kan vara signifikant i plasmamembranet givet 2-D-inneslutningen av membranproteinerna jämfört med fritt diffusiva cytoplasmatiska proteiner. Därför bör kontrollexperiment alltid göras, såsom att radera domäner som förmedlar den förmodade interaktionen mellan molekyler och testa för reduktion av den detekterade FRET-signalen.

Osäkerheten hos exakta stökiometrier av interagerande proteiner i levande celler begränsar användningen av FRET som spektroskopisk linjal för att bedöma molekylära avstånd mellan proteiner i levande celler. Även vid en strikt en-till-en-interaktion kan (i) flexibiliteten hos länkaren som fäster det fluorescerande proteinet till proteinet av intresse samt (ii) bristen på kunskap om den relativa orienteringen av färgämnenas dipolmoment (bestämning av den så kalladeκ2-faktorn ) förvirra exakta avståndsmätningar. Studier av acceptorfusionskonstruktioner med styva länkar av olika längd som separerar de två fluoroforerna och uppvisar olika FRET-effektivitet har rapporterats på annan plats12. Omvänt är det komplext att bedöma stökiometrier med FRET-mätningar i levande celler, men möjligt med hjälp av den presenterade ratiometriska FRET-kvantifieringen. Den lutande läsaren kan hänvisas till tidigare arbete som beskriver ett genomförbart tillvägagångssätt5.

Sammanfattningsvis möjliggör den kvantitativa FRET-metoden som presenteras här detektion av (i) proteininteraktioner i den levande cellens fysiologiska sammanhang, (ii) förändringar i proteininteraktioner över tid och (iii) skillnader i interaktioner i olika subcellulära fack ner till pixel-för-pixel-nivån för en konfokal bild, och (iv) beroendet av den detekterade FRET-signalen av molekyläracceptor-till-donatorförhållandet uttryckt i en levande cell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi vill tacka Neuroscience Imaging Service vid Stanford University School of Medicine för att tillhandahålla utrustning och utrymme för detta projekt. Denna forskning stöddes av intramural finansiering av Stanford Cancer Institute och Gynecologic Oncology Division Stanford samt GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 från National Research, Development and Innovation Office, Ungern.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x) Thermo Fisher Scientific 15400054
Clontech mCherry N1 vector Addgene 3553
DMEM without phenol red Thermo Fisher Scientific 11054020
Fugene 6 Promega E2691
HEPES Thermo Fisher Scientific 15630080
LabTek 8-well chambers #1.0 Thermo Fisher Scientific 12565470
L-Glutamine (200 mM) Thermo Fisher Scientific 25030081

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Förster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Annal der Physik. 437, 55-75 (1948).
  2. Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
  3. Mekler, V. M. A photochemical technique to enhance sensitivity of detection of fluorescence resonance energy transfer. Photochemistry and Photobiology. 59, 615-620 (1994).
  4. Vamosi, G., et al. Conformation of the c-Fos/c-Jun complex in vivo: A combined FRET, FCCS, and MD-modeling study. Biophysical Journal. 94 (7), 2859-2868 (2008).
  5. Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (44), 2989-2997 (2012).
  6. van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission. Biophysical Journal. 86 (4), 2517-2529 (2004).
  7. Muller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. Quantification of Forster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells. Frontiers in Plant Sciences. 4, 413 (2013).
  8. Gates, E. M., LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. Improving quality, reproducibility, and usability of FRET-based tension sensors. Cytometry Part A. 95 (2), 201-213 (2019).
  9. Menaesse, A., et al. Simplified instrument calibration for wide-field fluorescence resonance energy transfer (FRET) measured by the sensitized emission method. Cytometry Part A. , 24194 (2020).
  10. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  11. Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene. 173, 1 Spec No 33-38 (1996).
  12. Nagy, P., et al. Novel calibration method for flow cytometric fluorescence resonance energy transfer measurements between visible fluorescent proteins. Cytometry Part A. 67 (2), 86-96 (2005).
  13. Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N., Nagamune, T. Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein. Protein Engineering. 14 (8), 529-532 (2001).
  14. Szendi-Szatmari, T., Szabo, A., Szollosi, J., Nagy, P. Reducing the detrimental effects of saturation phenomena in FRET microscopy. Analytical Chemistry. 91 (9), 6378-6382 (2019).
  15. Tron, L., et al. Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surfaces. Quantitative evaluation of the transfer efficiency on a cell-by-cell basis. Biophysical Journal. 45 (5), 939-946 (1984).
  16. Sebestyen, Z., et al. Long wavelength fluorophores and cell-by-cell correction for autofluorescence significantly improves the accuracy of flow cytometric energy transfer measurements on a dual-laser benchtop flow cytometer. Cytometry. 48 (3), 124-135 (2002).
  17. Szaloki, N., et al. High throughput FRET analysis of protein-protein interactions by slide-based imaging laser scanning cytometry. Cytometry Part A. 83 (9), 818-829 (2013).
  18. McRae, S. R., Brown, C. L., Bushell, G. R. Rapid purification of EGFP, EYFP, and ECFP with high yield and purity. Protein Expression and Purification. 41 (1), 121-127 (2005).
  19. Kremers, G. J., Goedhart, J., van Munster, E. B., Gadella, T. W. Cyan and yellow super fluorescent proteins with improved brightness, protein folding, and FRET Forster radius. Biochemistry. 45 (21), 6570-6580 (2006).
  20. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16 (9), (2016).
  21. Scott, B. L., Hoppe, A. D. Optimizing fluorescent protein trios for 3-Way FRET imaging of protein interactions in living cells. Science Reports. 5, 10270 (2015).
  22. Chen, Y. C., Spring, B. Q., Clegg, R. M. Fluorescence lifetime imaging comes of age how to do it and how to interpret it. Methods Molecular Biology. 875, 1-22 (2012).
  23. King, C., Sarabipour, S., Byrne, P., Leahy, D. J., Hristova, K. The FRET signatures of noninteracting proteins in membranes: Simulations and experiments. Biophysical Journal. 106 (6), 1309-1317 (2014).

Tags

Biologi utgåva 170 levande cellavbildning FRET kvantitativ fluorescensmikroskopi fluorofor proteininteraktion sensibiliserad emission

Erratum

Formal Correction: Erratum: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission
Posted by JoVE Editors on 03/14/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission. The Authors section was updated from:

György Vámosi1
Sarah Miller2
Molika Sinha2
Gabor Mocsár1
Malte Renz2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

to:

György Vámosi1
Sarah Miller2
Molika Sinha2
Maria Kristha Fernandez2
Gabor Mocsár1
Malte Renz2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

Bedömning av proteininteraktioner i levande celler med FRET-sensibiliserad emission
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vámosi, G., Miller, S., Sinha,… More

Vámosi, G., Miller, S., Sinha, M., Fernandez, M. K., Mocsár, G., Renz, M. Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission. J. Vis. Exp. (170), e62241, doi:10.3791/62241 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter