हम कृन्तकों और मानव विषयों के मस्तिष्क के ऊतकों से पूर्व वीवो जैविक नमूनों में ऐक्टिन फिलामेंट्स की मात्रा के लिए एक सरल, समय कुशल और उच्च-थ्रूपुट फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रोस्कोपी-आधारित परख की रिपोर्ट करते हैं।
साइटोस्केलेटन का प्रमुख घटक ऐक्टिन, न्यूरोनल संरचना और कार्य के रखरखाव में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। शारीरिक राज्यों के तहत, ऐक्टिन अपने दो रूपों में संतुलन में होता है: मोनोमेरिक गोलाकार (जी-ऐक्टिन) और बहुलक फिलामेंटस (एफ-ऐक्टिन)। सिनैप्टिक टर्मिनलों पर, ऐक्टिन साइटोस्केलेटन महत्वपूर्ण पूर्व और पोस्ट-सिनैप्टिक कार्यों का आधार बनाता है। इसके अलावा, ऐक्टिन बहुलकता स्थिति (गोलाकार और ऐक्टिन के फिलामेंटस रूपों के बीच अंतर-प्रकटीकरण) में गतिशील परिवर्तन सिनैप्टिक संरचना और कार्य में प्लास्टिसिटी से संबंधित परिवर्तनों से निकटता से जुड़े हुए हैं। हम यहां पूर्व वीवो स्थितियों में ऐक्टिन की बहुलकता स्थिति का आकलन करने के लिए एक संशोधित फ्लोरेसेंस आधारित कार्यप्रणाली की रिपोर्ट करते हैं । परख फ्लोरोसेंटी लेबल वाले फालोइडिन को रोजगार देती है, जो एक फालोटोक्सिन है जो विशेष रूप से ऐक्टिन फिलामेंट्स (एफ-ऐक्टिन) को बांधता है, जो पॉलीमराइज्ड फिलामेंटस ऐक्टिन का सीधा पैमाना प्रदान करता है। सिद्धांत के सबूत के रूप में, हम कृंतक और पोस्टमार्टम मानव मस्तिष्क ऊतक समरूप दोनों में परख की उपयुक्तता के लिए सबूत प्रदान करते हैं। लैट्रनक्यूलिन ए (एक दवा जो ऐक्टिन फिलामेंट्स को विकृत करती है) का उपयोग करके, हम एफ-ऐक्टिन स्तरों में परिवर्तन की निगरानी में परख की उपयोगिता की पुष्टि करते हैं। इसके अलावा, हम अलग-अलग सिनैप्टिक टर्मिनलों के जैव रासायनिक अंशों तक परख का विस्तार करते हैं जिसमें हम उच्च एक्सट्रासेलुलर के+के साथ डीपोलराइजेशन द्वारा उत्तेजना पर बढ़ी हुई ऐक्टिन बहुलीकरण की पुष्टि करते हैं।
साइटोस्केलेटल प्रोटीन ऐक्टिन कई सेलुलर कार्यों में शामिल है, जिसमें संरचनात्मक समर्थन, सेलुलर परिवहन, सेल मोटिविटी और डिवीजन शामिल हैं। ऐक्टिन दो रूपों में संतुलन में होता है: मोनोमेरिक गोलाकार ऐक्टिन (जी-ऐक्टिन) और पॉलीमराइज्ड फिलामेंटस ऐक्टिन (एफ-ऐक्टिन)। ऐक्टिन (इसके जी-और एफ-फॉर्म के बीच इंटरकन्वेशन) की बहुलकता स्थिति में तेजी से परिवर्तन के परिणामस्वरूप तेजी से फिलामेंट असेंबली होती है और अनियंत्रितता होती है और सेलुलर फिजियोलॉजी में इसकी नियामक भूमिकाओं को कम करता है। ऐक्टिन न्यूरोनल साइटोस्केलेल संरचना का प्रमुख घटक है और न्यूरोनल कार्यों की एक विस्तृत श्रृंखला को प्रभावित करता है1,2 ध्यान दें, ऐक्टिन साइटोस्केलेटन सिनैप्टिक टर्मिनलों के संरचनात्मक मंच का एक अभिन्न हिस्सा है। इस प्रकार, यह सिनैप्टिक मॉर्फोजेनेसिस और शरीर विज्ञान का एक प्रमुख निर्धारक है और सिनैप्स3,4,5के आकार, संख्या और आकृति विज्ञान के नियंत्रण में एक मौलिक भूमिका निभाता है। विशेष रूप से, गतिशील ऐक्टिन बहुलक-depolymerization स्मृति और सीखने की प्रक्रियाओं अंतर्निहित सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी के साथ जुड़े सिनैप्टिक रीमॉडलिंग का एक प्रमुख निर्धारक है। दरअसल, दोनों प्रेसिनैप्टिक (जैसे न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज6,7,8,9,10)और पोस्टसिनैप्टिक कार्य (प्लास्टिसिटी से संबंधित डायनेमिक रिमॉडलिंग11,12,13,14)ऐक्टिन साइटोस्केलेटन की बहुलकीकरण स्थिति में गतिशील परिवर्तनों पर गंभीर रूप से भरोसा करते हैं।
शारीरिक परिस्थितियों में, एफ-ऐक्टिन का स्तर एक बहुमॉडल मार्ग के माध्यम से गतिशील और कसकर विनियमित होता है जिसमें पोस्टट्रांसलेशनल संशोधन4,15,16 के साथ-साथ ऐक्टिन-बाइंडिंग प्रोटीन (एबीपी)4, 17शामिल हैं। एबीपीएस कई स्तरों पर ऐक्टिन गतिशीलता को प्रभावित कर सकता है (जैसे पॉलीमराइजेशन की शुरुआत या बाधा, फिलामेंट ब्रांचिंग को प्रेरित करना, छोटे टुकड़ों में फिलामेंट्स को तोड़ना, डीपॉलिमराइजेशन को बढ़ावा देना, और डिपॉलिमराइजेशन से रक्षा करना), और विभिन्न अतिरिक्त और इंट्रासेल्युलर संकेतों के प्रति संवेदनशील एक कड़े मॉड्यूलरी नियंत्रण के तहत बदले में हैं18,19,20। कई स्तरों पर इस तरह की नियामक जांच सिनैप्टिक साइटोस्केलेटन में ऐक्टिन गतिशीलता का एक सख्त नियमन तय करती है, बेसल और गतिविधि-प्रेरित दोनों राज्यों में न्यूरोनल फिजियोलॉजी के ठीक ट्यूनिंग प्री-और पोस्टसिनैप्टिक पहलुओं को ठीक करती है।
न्यूरोनल फिजियोलॉजी में ऐक्टिन की महत्वपूर्ण भूमिकाओं को देखते हुए, यह आश्चर्य की बात नहीं है कि कई अध्ययनों ने न्यूरोडिजेनरेशन, मनोवैज्ञानिक रोगों के साथ-साथ न्यूरोडेवलपमेंटल बीमारियों3, 22, 23,24,25,26,27सहित न्यूरोलॉजिकल विकारों की एक विस्तृत श्रृंखला से जुड़ी महत्वपूर्ण रोगजनक घटनाओं के रूप में ऐक्टिन गतिशीलता में परिवर्तन के लिए सबूत प्रदान किए हैं। न्यूरोनल फिजियोलॉजी और रोगविज्ञान में ऐक्टिन की प्रमुख भूमिकाओं की ओर इशारा करते हुए अनुसंधान डेटा के धन के बावजूद, हालांकि, विशेष रूप से सिनैप्टिक साइटोस्केलेटन में ऐक्टिन गतिशीलता की समझ में महत्वपूर्ण अंतराल अभी भी बने हुए हैं। न्यूरोनल ऐक्टिन की बेहतर समझ और पैथोलॉजिकल परिस्थितियों में इसके बदलाव की बेहतर समझ के लिए अधिक शोध अध्ययनों की जरूरत है । इस संदर्भ में फोकस का एक प्रमुख क्षेत्र ऐक्टिन बहुलकीकरण स्थिति का आकलन है । वेरो परख बायोकेमिकल किट में वेस्टर्न ब्लॉटिंग-बेस्ड कमर्शियल किट (जी-ऐक्टिन/एफ-ऐक्टिन; साइटोस्केलेटन SKU BK03728,29)और एफ-ऐक्टिन स्तर6के आकलन के लिए घर में बने परख । हालांकि, क्योंकि इन एफ-ऐक्टिन और जी-ऐक्टिन के जैव रासायनिक अलगाव की आवश्यकता है और क्योंकि उनके बाद की मात्रा इम्यूनोब्लोटिंग प्रोटोकॉल पर आधारित है, वे समय लेने वाली हो सकती है । हम इसके साथ-साथ संशोधनों के साथ पिछले अध्ययन30 से अनुकूलित फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रोस्कोपी-आधारित परख की रिपोर्ट करते हैं जिसका उपयोग एफ-ऐक्टिन के बेसल स्तरों के साथ-साथ इसकी असेंबली-डिस्एम्बेब्लि में गतिशील परिवर्तनों का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। विशेष रूप से, हमने मूल प्रोटोकॉल को कुशलतापूर्वक संशोधित किया है जिसके लिए वर्तमान 96-वेल प्लेट प्रारूप में 1 एमएल क्यूवेट के लिए उपयुक्त नमूनों की आवश्यकता होती है। इसलिए संशोधित प्रोटोकॉल ने परख के लिए आवश्यक ऊतक/नमूना राशि को काफी कम कर दिया है । इसके अलावा, हम सबूत प्रदान करते हैं कि प्रोटोकॉल न केवल मस्तिष्क ऊतक समरूप के लिए उपयुक्त है, बल्कि अलग-थलग सिनैप्टिक टर्मिनल (सिनेप्टोसोम और सिनैप्टोन यूरोसोम्स) जैसे उपकोशिकीय अंश भी हैं। अंत में, परख हौसले से विच्छेदित कृंतक मस्तिष्क ऊतकों और दीर्घकालिक संग्रहीत मानव मस्तिष्क के नमूनों के लिए नियोजित किया जा सकता है । ध्यान दें, जबकि परख एक न्यूरोनल संदर्भ में प्रस्तुत किया जाता है, यह उपयुक्त अन्य सेल प्रकार और उनके साथ जुड़े शारीरिक प्रक्रियाओं के लिए बढ़ाया जा सकता है।
यहां वर्णित परख, अनिवार्य रूप से संशोधनों के साथ पिछले अध्ययन30 से अनुकूलित, फ्लोरोसेंट लेबल के साथ टैग किए गए एक फालोटोक्सिन, फालोइडिन को नियोजित करती है। फ्लोरोसेंट फ्लोइडिन एनालॉग को स्थिर …
The authors have nothing to disclose.
इस काम को न्यूजीलैंड के न्यूरोलॉजिकल फाउंडेशन (1835-पीजी), न्यूजीलैंड हेल्थ रिसर्च काउंसिल (#16-597) और एनाटॉमी विभाग, ओटागो, न्यूजीलैंड द्वारा समर्थित किया गया था। हम मानव मस्तिष्क के ऊतकों के लिए एचसीबी-IDIBAPS बायोबैंक (स्पेन) के न्यूरोलॉजिकल ऊतक बैंक के ऋणी हैं। हम वीडियो की रिकॉर्डिंग और संपादन में उनकी मदद के लिए जियाजियान झांग को धन्यवाद देते हैं ।
3.5 mL, open-top thickwall polycarbonate tube | Beckman Coulter | 349622 | For gradient centrifugation (synaptosome prep) |
Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22287 | F-actin specific ligand |
Antibody against b-actin | Santa Cruz Biotechnology | Sc-47778 | For evaluation of total actin levels by immunoblotting |
Antibody against GAPDH | Abcam | Ab181602 | For evaluation of GAPDH levels by immunoblotting |
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | Bradford based protein estimation |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | Krebs buffer component |
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | For inhibition of endogenous protease activity during sample preparation |
Corning 96-well Clear Flat Bottom Polystyrene | Corning | 3596 | For light-scattering measurements |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Krebs buffer component |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | Solvent for phalloidin and latrunculin A |
Fluorescent flatbed scanner (Odyssey Infrared Scanner) | Li-Cor Biosciences | For detection of immunoreactive signals on immunoblots | |
Glutaraldehyde solution (25% in water) Grade II | Sigma-Aldrich | G6257 | Fixative |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Buffer ingredient for sample preparation and Krebs buffer component |
Latrunculin A | Sigma-Aldrich | L5163 | Depolymerizer of actin filaments |
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma-Aldrich | M2670 | Krebs buffer component |
Microplates | |||
Mitex membrane filter 5 mm | Millipore | LSWP01300 | Preparation of synaptoneurosomes |
Nunc F96 MicroWell Black Plate | Thermo Fisher Scientific | 237105 | For fluorometric measurements |
Nylon net filter 100 mm | Millipore | NY1H02500 | Preparation of synaptoneurosomes |
Phosphatase Inhibitor Cocktail IV | Abcam | ab201115 | For inhibition of endogenous phosphatase activity during sample preparation |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Krebs buffer component and for depolarization of synaptic terminals |
Potassium phosphate monobasic ((KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Krebs buffer component |
Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 71320 | Component of Permeabilization buffer |
Sodium chloride (NaCl) | LabServ (Thermo Fisher Scientific) | BSPSL944 | Krebs buffer component |
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | LabServ (Thermo Fisher Scientific) | BSPSL900 | Krebs buffer component |
SpectraMax i3x | Molecular Devices | For fluorometric measurements | |
Sucrose | Fisher Chemical | S/8600/60 | Buffer ingredient for sample preparation |
Swimnex Filter Holder | Millipore | Sx0001300 | Preparation of synaptoneurosomes |
Tissue grinder 5 mL Potter-Elvehjem | Duran Wheaton Kimble | 358034 | For tissue homogenization |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Component of Permeabilization buffer |
Trizma base | Sigma-Aldrich | T6066 | Buffer ingredient for sample preparation |