Summary
אנו מדווחים על בדיקה פשוטה, יעילה בזמן וספקטרוסקופיה מבוססת תפוקה גבוהה לכימות סיבי אקטין בדגימות ביולוגיות אקס ויוו מרקמות המוח של מכרסמים ונבדקים אנושיים.
Abstract
Actin, המרכיב העיקרי של cytoskeleton, ממלא תפקיד קריטי בשמירה על המבנה והתפקוד העצבי. תחת מצבים פיזיולוגיים, actin מתרחשת בשיווי משקל בשתי צורותיה: כדורית מונומרית (G-actin) וסיבים פולימריים (F- actin). במסופים הסינפטיים, actin cytoskeleton מהווה את הבסיס לפונקציות קריטיות לפני ואחרי סינפטית. יתר על כן, שינויים דינמיים במצב פילמור actin (אינטרקוונהפיכה בין צורות כדוריות חוטית של actin) קשורים קשר הדוק לשינויים הקשורים פלסטיות במבנה ובתפקוד סינפטי. אנו מדווחים כאן על מתודולוגיה מבוססת פלואורסצנטיות שונה כדי להעריך את מצב הפולמליזציה של actin בתנאי ex vivo. ה-assay משתמש בפאלואידין בעל תווית פלואורסצנטית, פלוטוקסין שנקשר במיוחד לסיבי אקטין (F-actin), ומספק מידה ישירה של אקטין סיבי פולימרי. כהוכחה לעיקרון, אנו מספקים ראיות להתאמת ההסתעפות של ההסתעפות הן ברקמת המוח האנושית מכרסמים והן בהומוגנטים שלאחר המוות. באמצעות latrunculin A (תרופה depolymerizes סיבי actin), אנו מאשרים את התועלת של ההסתערות בניטור שינויים ברמות F-actin. כמו כן, אנו מרחיבים את ההסמכה לשברים ביוכימיים של מסופי סינפטית מבודדים שבהם אנו מאשרים פולמריזציה actin מוגברת על ידי גירוי על ידי דפולריזציה עם K חוץ תאי גבוה+.
Introduction
אקטין חלבון Cytoskeletal מעורב בפונקציות תאיות מרובות, כולל תמיכה מבנית, תחבורה סלולרית, תנועתיות תאים וחלוקה. אקטין מתרחשת בשיווי משקל בשתי צורות: אקטין כדורי מונומרי (G-actin) ואקטין סיבי פולימרי (F-actin). שינויים מהירים במצב הפילמור של actin (בין צורות G ו- F) לגרום הרכבה חוט מהיר ופירוק ביסוד תפקידיה הרגולטוריים בפיזיולוגיה התאית. Actin מהווה את המרכיב העיקרי של המבנה cytoskeletal העצבי ומשפיע על מגוון רחב של פונקציות עצביות1,2. יש לציין כי האקטין ציטוסקלטון מהווה חלק בלתי נפרד מהפלטפורמה המבנית של המסופים הסינפטיים. ככזה, הוא דטרמיננטה מרכזית של מורפוגנזה סינפטית ופיזיולוגיה וממלא תפקיד בסיסי בשליטה על הגודל, המספר והמורפולוגיה של הסינפסות3,4,5. בפרט, דינאמי actin polymerization-depolymerization הוא דטרמיננטה מפתח של שיפוץ סינפטי הקשורים פלסטיות סינפטית שבבסיס תהליכי הזיכרון והלמידה. ואכן, הן presynaptic (כגון שחרור נוירוטרנסמיטר6,7,8,9,10) ו פונקציות postsynaptic (פלסטיות הקשורות שיפוץ דינמי11,12,13,14) להסתמך באופן ביקורתי על שינויים דינמיים במצב פולמור של cytoskeleton actin.
בתנאים פיזיולוגיים, רמות F-actin מוסדר באופן דינמי והדוק באמצעות מסלול רב-מודאלי מעורבים שינוי posttranslational4,15,16, כמו גם חלבונים מחייבים actin (ABPs)4,17. ABPs יכול להשפיע על דינמיקה actin ברמות מרובות (כגון ייזום או עיכוב פילמור, גרימת הסתעפות חוטים, ניתוק חוטים לחתיכות קטנות יותר, קידום depolymerization, והגנה מפני דפולימריזציה), והם בתורו תחת שליטה מודולטורית מחמירה רגיש לאותות חוץ תאיים שונים18,19,20. בדיקות רגולטוריות כאלה ברמות מרובות מכתיבות רגולציה קפדנית של דינמיקה actin ב cytoskeleton סינפטית, כוונון עדין מראש ופוסט-סינפטי היבטים של פיזיולוגיה עצבית הן במצב הבסיסי והן במצבים הנגרמים על ידי פעילות.
בהתחשב בתפקידים החשובים של actin בפיזיולוגיה העצבית, אין זה מפתיע כי מספר מחקרים סיפקו ראיות לשינויים בדינמיקה actin כמו אירועים פתוגניים קריטיים הקשורים למגוון רחב של הפרעות נוירולוגיות כולל ניוון עצבי, מחלות פסיכולוגיות, כמו גם מחלות נוירו-התפתחותיות3,21,22,23,24,25,26,27. למרות שפע של נתוני מחקר המצביעים על תפקידי מפתח של actin בפיזיולוגיה עצבית ופתופיזיולוגיה, עם זאת, פערים משמעותיים עדיין נשארים בהבנת הדינמיקה actin, במיוחד על cytoskeleton סינפטית. דרושים מחקרים נוספים כדי להבין טוב יותר את האקטין העצבי ואת השינויים שלו בתנאים פתולוגיים. תחום מרכזי אחד של מיקוד בהקשר זה הוא הערכת מצב פולמור actin. יש ערכות מסחריות מערביות מבוססות סופג (G-Actin / F-Actin בערכה ביוכימית vivo assay; Cytoskeleton SKU BK03728,29) ו מבחנים תוצרת בית להערכת רמות F-actin6. עם זאת, מכיוון שאלה דורשים בידוד ביוכימי של F-actin ו- G-actin ומכיוון שהכימות הבא שלהם מבוסס על פרוטוקולים immunoblotting, הם יכולים להיות זמן רב. אנו מדווחים בזאת על בדיקה מבוססת ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית שהותאמה ממחקר קודם30 עם שינויים שניתן להשתמש בהם כדי להעריך הן את רמות הבסיס של F-actin, כמו גם שינויים דינמיים בפירוק ההרכבה שלה. יש לציין כי שינינו ביעילות את הפרוטוקול המקורי הדורש דגימות המתאימות ל- 1 מ"ל cuvette לפורמט הלוח הנוכחי של 96 באר. הפרוטוקול שהשתנה ולכן הפחית באופן משמעותי את כמות הרקמה / מדגם הנדרש עבור ההסתעפות. כמו כן, אנו מספקים ראיות כי הפרוטוקול מתאים לא רק רקמת המוח הומוגנטים, אלא גם שברים תת תאיים כגון מסופים סינפטיים מבודדים (סינפטוזומים סינפטונוזומים). לבסוף, ניתן להשתמש במד"א עבור רקמות מוח של מכרסמים שזה עתה נותחו ודגימות מוח אנושיות מאוחסנות לטווח ארוך לאחר המוות. יש לציין, בעוד ההסתעפות מוצגת בהקשר עצבי, זה יכול להיות מורחב כראוי לסוגי תאים אחרים ותהליכים פיזיולוגיים הקשורים אליהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים הניסיוניים בוצעו בהתאם לתקנות ועדת האתיקה של אוניברסיטת אוטגו בטיפול ובשימוש בחיות מעבדה (פרוטוקול אתיקה מס'. AUP95/18 ו- AUP80/17) ובית המחוקקים של ניו זילנד. רקמות המוח האנושי התקבלו מהבנק לרקמות נוירולוגיות של בית החולים Clínic-IDIBAPS BioBank בברצלונה, ספרד. כל פרוטוקולי איסוף הרקמות אושרו על ידי ועדת האתיקה של בית החולים קלניק, ברצלונה, והסכמה מדעת התקבלה מהמשפחות.
1. הכנת מאגרים ריאגנטים
- הכן את המאגרים הבאים להומוגניזציה של רקמת המוח והכנת שבר מועשר של מסופים סינפטיים:
מאגר הומוגניזציה: 5 מ"מ HEPES, pH 7.4 בתוספת 0.32 M סוכרוז
מאגר ההשעיה: 5 מטר טריס, pH 7.4 בתוספת סוכרוז 0.32 M
חיץ כביסה: 5 מ"מ טריס, pH 8.1
1.2 מ' סוכרוז
1.0 מ' סוכרוז
0.85 מ' סוכרוז - הוסיפו תערובת ביתית או מסחרית של מעכבי פרוטאז ופוספטאז.
הערה: השתמשנו בגרסה נטולת EDTA של תערובת מעכבי פרוטאז מלאה (טבליה אחת לכל חיץ 10 מ"ל) וקוקטייל מעכבי פוספטאז הרביעי (1:100; נפח: נפח). - הכן את המאגרים והריאגנטים הבאים עבור הקיבעון, ההחלחלה והאיגוד של הפאלוקדין:
מאגר קרבס: 118.5 מ"מ NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0.1 מ"מ KH2PO4, 5 מ"מ NaHCO3, 10 מ"מ גלוקוז, 20 מ"מ HEPES, pH 7.4
1 M KCl
25% גלוטרדהיד (פתרון מניות)
מאגר קרבס המכיל 0.1% טריטון X-100 ו 1 מ"ג / מ"ל NaBH4
400x אלקסה פלואור 647 פאלודין ב DMSO
מאגר קרבס המכיל סוכרוז 0.32 M
50 מיקרומטר לטרונגולין A ב- DMSO (פתרון מלאי)
1 M KCl (פתרון מניות)
התראה: Phalloidin הוא רעיל (LD50 = 2 מ"ג / קילוגרם) ויש לטפל בו בזהירות. שאיפה של גלוטרלדהיד היא רעילה ויש לטפל בה במכסה המנוע של אדים. - אחסן את המאגרים ב 4 °C (60 °F) ו phalloidin ו latrunculin A ב -20 °C (70 °F) לאחסון לטווח ארוך.
הערה: אחסון מאגרים לטווח ארוך אינו מומלץ. ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
2. הומוגניזציה של רקמת המוח
- הומוגניזציה של רקמת מוח החולדה ההקפאה או שזה עתה נותחה בעשרה כרכים של חיץ הומוגניזציה בצינור זכוכית פוטר-Elvehjem ועלי על הקרח.
הערה: הומוגניזציה אופטימלית מושגת על ידי 15-20 משיכות של העלי ביד עבור רקמות המוח. הומוגניזציה מוצלחת יכולה להיות מאושרת על ידי זרימה חלקה של ההשעיה דרך צינור הזכוכית. ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. - לקבוע את ריכוז החלבון הומוגנט באמצעות מבחני ברדפורד31.
הערה: ניתן להשתמש גם במטענים חלופיים תוצרת בית או מסחרית להערכת חלבונים. - לדלל דגימות הומוגניות מאגר קרבס בריכוז של 2-3 חלבון מ"ג / מ"ל בנפח של 50 μL.
הערה: בחלק מהניסויים שלנו, אנו דגירה הומוגנטים עם 2 μM latrunculin A או DMSO (פקדים) ב 37 °C (69 °F) עבור 1 שעות. בשביל זה, homogenates הם resuspended ב 48 μL של מאגר קרבס, ו 2 μL של 50 μM latrunculin A או 2 μL של DMSO מתווסף. עוד יותר עבור immunoblotting, כמות קטנה של מדגם (10 מיקרוגרם) נאסף לאחר הדגירה. - תקן את הדגימות ההומוגניות (סעיף 5).
3. הכנת מסופי עצבים מבודדים
- הכנת סינפטוזומים
הערה: ניתן להשתמש גם בפרוטוקולים חלופיים32,33 עבור סינפטוזומים.- המוח צנטריפוגה הומוגנית ב 1,200 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- השלך את גלולה, שהוא השבר הגרעיני הגולמי.
- צנטריפוגה נוספת supernatant (S1) הושג בשלב 3.1.1 ב 12,000 x גרם במשך 15 דקות ב 4 °C (69 °F).
- הסר את supernatant (S2), שהוא שבר ציטוזולי מסיס.
- Resuspend גלולה (P2) שהושג בשלב 3.1.3, המהווה את השבר הסינפטוזולמי הגולמי במאגר resuspension.
הערה: נפח מאגר ההשעיה תלוי בכמות הרקמה ההתחלתית ובכמות גלולה המתקבלת. לדוגמה, כאשר מתחילים עם 150-300 מ ג של רקמות המוח, גלולה המתקבל ניתן להשהות ב 200 μL של מאגר ההשעיה. - טען את הסינפטוזומים הגולמיים שהושקעו מחדש על שיפוע סוכרוז לא רציף העשוי מנפחים שווים של 0.85-1.0-1.2 M סוכרוז.
הערה: בדרך כלל אנו משתמשים 1 מ"ל כל פתרון סוכרוז (עבור 150-300 רקמת מ"ג). זה יכול להיות שונה על פי כמויות רקמה גדולות יותר. מעברי צבע רציפים יכולים להתבצע באמצעות מזרק 25G לחוץ על הקיר הפנימי של צינור ultracentrifuge ושכבות עדינות של שכבות סוכרוז. - צנטריפוגה ב 85,000 x גרם עבור 2 שעות ב 4 מעלות צלזיוס.
הערה: בגלל המהירות הגבוהה של צנטריפוגה, ultracentrifuge מסוגל ליצור ואקום כדי להפחית את החימום נדרש. - לאסוף את השבר הסינפטוזומלי בממשק בין 1.0 ו 1.2 M סוכרוז באמצעות קצה צינור μL 200.
- לשטוף את השבר הסינפטומלי עם חיץ כביסה קר כקרח על ידי צנטריפוגה ב 18,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
הערה: לשטיפה, שבר סינפטוזומלי המתקבל בממשק של 1.0 ו 1.2 M סוכרוז נאסף בצינור טרי 1.5 מ"ל, ונפח שווה של חיץ כביסה מתווסף, הבטחת הסרת סוכרוז גבוה מהבינוני. - לשטוף את גלולה סינפטוזומלית שוב עם חיץ הומוגניזציה קר כקרח ב 12,000 גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- התחדשו בסינפטוזומים במאגר הומוגניזציה על קרח.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול לזמן קצר כאן. - לקבוע את ריכוז החלבון באמצעות מבחני ברדפורד.
- Resuspend הסינפטוזומים במאגר קרבס בריכוז של 2-3 חלבון מ"ג / מ"ל בנפח של 50 μL (47.5 μL אם סינפטוזומים הם להיות depolarized על ידי KCl; ראה סעיף 4).
הערה: עבור ההשעיה מחדש, השבר הסינפטוזולי מסתובב לראשונה ב- 12,000 x g למשך 5 דקות ב- 4 °C (60 °F) וה- supernatant (חיץ) מוסר. גלולה סינפטוזומלית הוא לאחר מכן resuspended במאגר קרבס על ידי צינור עדין באמצעות קצה צינור 200 μL. - המשך עם דה-פולריזציה (סעיף 4).
- הכנת סינפטונורוסומים
הערה: פרוטוקולים חלופיים34,35 עבור synaptoneurosomes ניתן להשתמש גם.- מעבירים את המוח הומוגנית דרך מסנן רשת רטוב מראש של גודל נקבובית 100 מיקרומטר במחזיק מסנן באמצעות מזרק 1 מ"ל.
הערה: הרטבה מראש של כל המסננים חשובה כדי למנוע אובדן מדגם ויש לעשות זאת באמצעות מאגר הומוגניזציה. לצורך כך, מאגר הומוגניזציה מועבר דרך המסננים במחזיק המסנן באמצעות מזרק של 1 מ"ל עד שהמאגר זורם החוצה. - לאסוף את הסינון (F1) בצינור מראש מצונן 1.5 מ"ל על קרח.
- חזור על התהליך (שלבים 3.2.1 ו- 3.2.2) עבור שבר F1 כדי להשיג את הסינון השני (F2).
- להעביר F2 filtrate דרך מסנן נטו של גודל נקבובית 5 מיקרומטר.
- לאסוף את הסינון (F3) בצינור מראש מצונן 1.5 מ"ל על קרח.
- צנטריפוגה סינון F3 ב 1,500 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- Resuspend גלולה (synaptoneurosomes) במאגר קרבס על קרח בריכוז של 2-3 חלבון מ"ג / מ"ל בנפח של 50 μL (47.5 μL אם סינפטוזומים הם להיות depolarized על ידי KCl; ראה סעיף 4).
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול לזמן קצר כאן. - להעריך את ריכוז החלבון באמצעות מבחני ברדפורד.
- המשך עם דה-פולריזציה (סעיף 4).
- מעבירים את המוח הומוגנית דרך מסנן רשת רטוב מראש של גודל נקבובית 100 מיקרומטר במחזיק מסנן באמצעות מזרק 1 מ"ל.
4. דה-פולריזציה בתיווך KCl של מסופים סינפטיים מבודדים
- סינפטוזומים/סינפטונוסומים שווים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות.
- לעורר סינפטוזומים / synaptoneurosomes על ידי הוספת KCl כדי להגדיל K חוץ תאי+ ל 50 מ"מ עבור 30 s ב 37 °C (69 °F) ולהוסיף נפח שווה של מאגר קרבס ערכת הבקרה unstimulated בהתאמה.
הערה: לדוגמה, להוסיף 2.5 μL של 1 M KCl כדי סינפטוזומים resuspended ב 47.5 μL של מאגר קרבס; ולהוסיף 2.5 μL של מאגר קרבס לסינפטוזום בקרת unstimulated בהתאמה. לניסויים שבהם מספר רב של דגימות מעורבות, להמשיך עם לא יותר מ 2 דגימות בכל פעם, כך זמן depolarization לא יעלה על 30 s. - לסיים את הגירוי על ידי הוספת גלוטרלדהיד (סעיף 5).
5. קיבוע וכתמי פאלודין של דגימות
- הוסף גלוטרלדהיד לדגימות הומוגניות/סינפטוסומליות/סינפטונוסומליות לריכוז סופי של 2.5% למשך 2-3 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: הוספנו 6 μL של 25% פתרון glutaraldehyde כך הריכוז הסופי של glutaraldehyde ב 50 דגימות μL (הומוגנטים / סינפטוזומים / synaptoneurosomes) היה ca. 2.5%. קיבוע הוא קריטי צריך להיות מהיר ולכן מיד לאחר הוספת glutaraldehyde, המדגם צריך להיות מערבולת נמרצת. - משקעים את הדגימות ב 20,000 x g במשך 5 דקות.
- הסר את העל-טבעי.
הערה: להשליך את supernatant במכסה המנוע אדים כמו glutaraldehyde רעיל. - לחלחל גלולה על ידי ההשעיה ב 100 μL של מאגר קרבס המכיל 0.1% טריטון X-100 ו 1 מ"ג / מ"ל NaHB4 עבור 2-3 דקות בטמפרטורת החדר.
- משקעים את הדגימות ב 20,000 x g במשך 5 דקות.
- הסר את מאגר החימול.
- לשטוף את גלולה עם 200 μL של מאגר קרבס על ידי צנטריפוגה ב 20,000 x g במשך 5 דקות.
- Resuspend ולהכתים את גלולה עם 1x Alexa Fluor 647 Phalloidin (המתאים 500 μU) ב 100 μL של מאגר קרבס במשך 10 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
הערה: זנים אחרים של אנלוגים פאלודין פלואורסצנטי זמינים מסחרית וניתן להחליף אותם במהלך ההסתעפות. ריכוז של פאלודין ואת נפח המדגם הכולל של הדגירה ייתכן שיהיה שונה בהתאם לכמות וסוג של רקמה / מדגם נבדק תנאים אופטימליים צריך להיות סטנדרטי בהתאם. - צנטריפוגה דגימות מוכתמות ב 20,000 x g במשך 5 דקות.
- הסר את הפאלוקדין הבלתי מאוגד (על-טבעי).
- לשטוף את המדגם עם 200 μL של מאגר קרבס על ידי צנטריפוגה ב 20,000 x g במשך 5 דקות.
- Resuspend ב 200 μL של מאגר קרבס המכיל 0.32 M סוכרוז.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול לזמן קצר כאן.
6. ניתוח פלואורומטרי ופיזור אור
- לוותר על אלקסה פלואור 647 דגימות מוכתמות פאלודין בצלחת שחורה 96-באר.
- למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות באורך גל עירור של 645 ננומטר ואורך גל פליטה של 670 ננומטר בקורא צלחת בטמפרטורת החדר.
- מעבירים את הדגימות מהצלחת השחורה של 96 באר לצלחת ה-96 באר השקופה באמצעות 200 טיפים לצינור μL.
- למדוד את פיזור האור ב 540 ננומטר כדי לתקן עבור כל ההפסדים שעלולים להתרחש במהלך השלבים הקודמים של קיבעון, חדירה וכתמים.
הערה: וריאציות בחומר ביולוגי שנשמר בדגימות המוכתמות עשויות להיות בולטות יותר עבור כמויות קטנות יותר של חומר התחלתי (ראה דיון). - כלול קבוצה של אלקסה פלואור 647 פאלודין במאגר קרבס בריכוזים שונים (0.05x, 0.1x, 0.25x, 0.35x, 0.75x, 0.5x ו 1x המתאימים 25, 50, 125, 175, 250, 375 ו 500 μU) עבור כל אצווה של ההסתערות כעקומה סטנדרטית.
הערה: זהו שלב אופציונלי ואינו משפיע על תוצאות הבדיקה במיוחד כאשר רמות F-actin באות לידי ביטוי באופן יחסי (סעיף 7). ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
7. ניתוח נתונים
- כמות F-actin בדגימות היא פרופורציונלית ישירות לעוצמת הפלואורסצנטיות של פאלודין מאוגד. אקספרס במונחים מוחלטים של יחידות של פאלודין מאוגד מחושב מן העקומה הליניארית של תקן פאלודין מתויג.
הערה: כדוגמה, ראו איורים 2A-B, 3A, 4A-B ואיור משלים 2. - רמות F-actin אקספרס כשבר של דגימות הבקרה.
הערה: כדוגמה, ראה איורים 5A-B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ליניאריות של ההסתעפות להערכת רמות F-actin
ראשית, נקבעה עקומה סטנדרטית לעלייה הליניארית בפלואורסצנטיות של אלקסה פלואור 647 פאלודין וחזרה על עצמה בכל קבוצת ניסויים(איור 1). כדי לחקור את הטווח הליניארי של ההסתעפות, עובדו כמויות שונות של הומוגנטים במוח ממכרסמים (איורים 2A ו-2B)ונבדקים אנושיים שלאחר המוות (איור 3A ו-3B). ההסתייגות נמצאה ליניארית בטווח של 50-200 מיקרוגרם חלבון כפי שהוערך על ידי כמויות של פאלודין שכותרתו נשמר. פיזור אור ב-540 ננומטר שימש לאישור כמויות הדגימות השונות (איור 2C ואיור 3C).
לטרונגולין, סוכן depolymerizing actin מפחית מחייב של פאלודין שכותרתו
Latrunculin A ידוע depolymerize סיבי actin ולהפחית את רמות F-actin36,37,38,39. הומוגנטים מרקמות המוח מכרסמים או אנושיים היו דגירה עם 2 μM latrunculin A במשך 1 שעה ב 37 °C (69 °F) כדי depolymerize סיבי actin. ערכות בקרה לא מטופלות בהתאמה היו דגירה עם DMSO לאותו משך של 1 שעה ב 37 °C (69 °F). ה-assay מדד בחוזקה את אובדן רמות ה-F-actin מ-95.7 ± 6.6 (ממוצע ± SEM) בדגימות בקרה ל-72.0 ± 3.2 (ממוצע ± SEM) מיקרו-μU של פאלודין מאוגד בדגימות latrunculin A שטופלו בהומוגנטים במוח מכרסמים (איור 4A). ירידה דומה (מ 83.7 ± 3.9 ל 66.9 ± 4.2 μU) בשימור של פאלודין שכותרתו נצפתה גם כאשר הומוגנים מרקמות המוח האנושיות היו נתונים לטיפול latrunculin A (איור 4B). ראוי לציין, רמות actin הכולל, כפי שהוערך על ידי immunoblotting, לא השתנה על טיפול עם latrunculin A הן חולדה (איור משלים 1A-B) ו אנושי (איור משלים 1C-D)המוח הומוגנטים.
דה-פולריזציה של מסופים סינפטיים מבודדיםמעוררת פילמור אקטין והיווצרות חוטים
Ex vivo depolarization של מסופים סינפטיים מבודדים הוכח לגרום לגירוי מהיר של פולימריזציה actin6,30,40, תופעה זו שימשה כאישור נוסף של ההסמכה שדווחה בזאת. שברים ביוכימיים מועשרים במסופים סינפטיים הוכנו בשני נימוסים שונים; שיטת אולטרה-צנטריפוגציה מבוססת הדרגתית להשגת "סינפטוזומים"41,42,43,44 ופרוטוקול מבוסס סינון רציף להשגת "סינפטונורוסומים"43,45,46. בגלל התשואה עבור האחרון הוא גבוה יותר, השתמשנו בו עבור רקמות המוח שלאחר המוות האנושי שבו כמויות הרקמה הם לעתים קרובות מגבילים. מצד שני, העדפנו להשתמש בסינפטוזומים עם רמה גבוהה יותר של העשרה של שברים סינפטיים41 לניסויים ברקמת המוח של החולדה שלנו.
דה-פולריזציה של סינפטוזומים או סינפטונורוזומים וגירוי של פולימריזציה של אקטין הושגו על ידי פרץ קצר (30 שניות) של עלייה ב- K+ ל - 50 מ"מ. החשיפה ל-KCl הביאה לעלייה של כמעט 40% בסינפטוזומים במוח המכרסמים בהשוואה לבקרות המדומה בהתאמה (איור 5A; ראו גם איור משלים 2A). קטן יותר (בסביבות 20%) אך עלייה עקבית נצפתה גם בסינפטונורוסומים אנושיים שטופלו ב- KCl (איור 5B; ראו גם איור משלים 2A). ניסויים אלה מאמתים את החוסן של ההסתייגות שלנו בקביעת שינויים ברמות F-actin בדגימות רקמת המוח, כולל מסופים סינפטיים מבודדים.
איור 1. עקומה סטנדרטית לפלואורסצנטיות של אלקסה פלואור 647 פאלודין. ליניאריות של פליטת פלואורסצנטיות של כמויות שונות (25-500 מיקרו-U) של פאלודין שכותרתו אושרה על ידי ספקטרוסקופיית פלואורסצנטיות בהתרגשות של 645 ננומטר ופליטה של 670 ננומטר (R2 = 0.9942). הנתונים מיוצגים כ- SEM ± ממוצע (n = 3). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. ליניאריות של פאלודין מחייב הומוגנטים של תא שלם מרקמת מוח עכברוש. (A)כריכת פאלודין לכמויות שונות של הומוגנטים (50-300 מיקרוגרם חלבון) הוערך. (B) האיגוד היה ליניארי בטווח של חלבון 50-200 מיקרוגרם (R2 = 0.9602). (C) פיזור ב 540 ננומטר שימש כדי לאשר כמויות שונות של הדגימות (R2 = 0.8319). הנתונים מיוצגים כ- SEM ± ממוצע (n = 4). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. פאלודין מחייב הומוגנטים של תאים שלמים מרקמת המוח האנושית שלאחר המוות. (A)שימור פאלודין במגוון כמויות של הומוגנטים (50-300 חלבון מיקרוגרם) הוערך. (B)כריכת פאלודין נמצאה ליניארית בטווח של חלבון 50-200 מיקרוגרם (R2 = 0.8832). (C)פיזור ב 540 ננומטר אישר את הכמויות המשתנות של הדגימות (R2 = 0.9730). הנתונים מיוצגים כ- SEM ± ממוצע (n = 4). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4. ההשפעות של latrunculin A על רמות F-actin. טיפול הומוגנטים במוח עם actin depolymerizing סוכן Latrunculin A (2 מיקרומטר, 1 שעות ב 37 מעלות צלזיוס) הביא לירידה משמעותית בכמויות של סיבי actin לעומת דגימות שליטה מדומה בהתאמה כפי שהוערך על ידי שמירה של פאלודין שכותרתו הן במכרסמים (p = 0.0034; זיווג דו-זנבי של סטודנט t-test)(A) ורקמות אנושיות שלאחר המוות (p = 0.0011; מזווג דו זנב סטודנט t-test)(B). הנתונים מיוצגים כ- SEM ± ממוצע (n = 6 זוגות). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5. ההשפעות של דה-פולריזציה בתיווך KCl על כמויות F-actin במסופים סינפטיים מבודדים. (A) דגירה של סינפטוזומים ממוחו של חולדה עם 50 mM KCl עבור 30 s ב 37 מעלות צלזיוס מגורה פולימריזציה actin אשר כתוצאה מכך הביא לעלייה מחייב phalloidin (p = 0.0014; מזווג דו זנב סטודנט של t-מבחן). (B)עלייה קטנה יותר נצפתה גם בשבר סינפטונורוסומלי מרקמות המוח האנושי שלאחר המוות (p = 0.014; מזווג דו-זנבי של סטודנט t-test). הנתונים מיוצגים כ- SEM ± ממוצע (n = 6 זוגות). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 1. ההשפעות של latrunculin A על רמות אקטין הכולל. הומוגנטים במוח היו דגירה עם latrunculin A (2 מיקרומטר, 1 שעות ב 37 מעלות צלזיוס) או נפח שווה של DMSO (1 שעה ב 37 מעלות צלזיוס). 10 מיקרוגרם חלבון לדגימה (latrunculin A מטופלים DMSO מדומה מטופלים פקדים) נאספו לפני הקיבעון. סה"כ רמות אקטין הוערכו על ידי immunoblotting. כתמים מייצגים מוצגים עבור חולדות (A) ו אנושי (C) הומוגנטים במוח. Latrunculin A לא שינה את רמות האקטין הכוללות הן בחולדה (B; p = 0.40; מזווגות דו-זנביות של סטודנט t-test)ואנושיות (D; p = 0.42; מזווגות דו-זנביות של סטודנט t-test)הומוגנטים במוח. הנתונים מיוצגים כ- SEM ± ממוצע (n = 3 זוגות). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 2. ההשפעות של דה-פולריזציה בתיווך KCl על רמות F-actin בסינפטוזומים של עכברושים וסינפטונורוזומים אנושיים. (A)דגירה של סינפטוזומים ממוחו של חולדה עם 50 mM KCl (30 s ב 37 °C )) עורר פולימרציה actin ועלייה וכתוצאה מכך מחייב פאלודין (p = 0.0019; מזווג דו זנב סטודנט t-test). (B) עלייה בשימור פאלודין נצפתה גם בשבר סינפטונוסומלי אנושי depolarized על ידי KCl בהשוואה לפקדים unstimulated בהתאמה (p = 0.015; מזווג דו זנב של סטודנט t-test). הנתונים מיוצגים כ- SEM ± ממוצע (n = 6 זוגות). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההסתייגות המתוארת כאן, המותאמת למעשה ממחקר קודם30 עם שינויים, מעסיקה פלוטוקסין, פאלודין מתויג עם תווית פלואורסצנטית. אנלוגים פאלודין פלואורסצנטי נחשבים תקן הזהב עבור כתמי סיבי actin ברקמות קבועות47,48,49. למעשה, הם הכלים העתיקים ביותר לזהות באופן ספציפי סיבי actin50 ועדיין להישאר המכשירים הנפוצים ביותר כדי לזהות סיבי actin במיוחד עבור ניתוחים מבוססי מיקרוסקופיה פלואורסצנטי הבאים. חשוב לציין, phalloidin הוכח כתם אפילו רופף, רשת לא סדירה של סיבי actinקצרים 51, המציין כי כריכת פאלודין אינו תלוי באורך חוטים. הפרוטוקול שלנו, לעומת זאת, מסתמך על ספקטרוסקופיית פלואורסצנטיות כדי לנתח את הדינמיקה של אקטין בדגימות ביולוגיות אקס ויוו, למשל רקמות מוח ממכרסמים ובני אדם.
היתרון העיקרי של הפרוטוקול הוא שהוא מקטין במידה ניכרת את הזמן שנדרש ביחס לפרוטוקולים הקיימים הדורשים תחילה בידוד ביוכימי מבוסס צנטריפוגה במהירות גבוהה של F-actin (הפרדה מ- G-actin בהתבסס על חדלות פירעון של חוטי אקטין בחומרי ניקוי מסוימים כגון טריטון X-100) וניתוח עוקב של רמות אימונואקטיביות באמצעות סופג מערבי6,28,29. יעילות הזמן של מבחני הזמן שלנו היא גם יתרון לגבי טכניקות אימונוציטוכימיה מבוססות פאלודין40,52, אם כי ייתצעו כמה יתרונות אחרים הקשורים האחרון. יתרון נוסף הוא שניתן ליישם אותו על רקמות המוח האנושיות שלאחר המוות, שרכשן קשור תמיד לעיכוב כלשהו לאחר המוות. יתר על כן, ביחס לפרוטוקול המקורי30 שממנו מתודולוגיה זו שונתה, הפחתנו במידה ניכרת את הדרישה לכמות הרקמה מ 1 מ"ל cuvette לבאר אחת של צלחת 96-באר. יתר על כן, בשל הכללת עקומת תקן פאלודין בכל קבוצה של ניסוי, הפרוטוקול שלנו יכול לכמת רמות מוחלטות של סיבי actin ביחידות של פאלודין מאוגד (איורים 2A-B, 3A, 4A-B; ראו גם איור משלים 2), כמו גם את הרמות ביחס לדגימות בקרה (איור 5A-B).
יש לציין כי היישום של פאלודין כדי להעריך את רמות F-actin עם זאת מוגבל לתאים קבועים ודגימות, הן עבור פרוטוקול assay שלנו, כמו גם פרוטוקולים מבוססי מיקרוסקופיה. הסיבה לכך היא כי phalloidin הוא למעשה heptapeptide אופניים רעילים שנקשר במיוחד בממשק בין יחידות משנה F-actin עם זיקה גבוהה ומייצב סיבי actin אלה, מה שהפך אותם מסוגלים depolymerize ולמעשה להגדיל את ההמרה נטו של G-actin לתוך F-actin40,53,54. לפיכך, phalloidin מייצב סיבי actin ב vivo ו במבחנה, והוא יכול לגרום לשינויים משמעותיים במצב שיווי המשקל של actin כשלעצמה47,55. כמו הערכה כזו של מצב פילמור actin בתיווך phalloidin פלואורסצנטי מבוסס על מבנים נימה שנעצרו. יתר על כן, בגלל חדירות נמוכה שלה באמצעות bilayer השומנים, מתודולוגיות מבוססות פאלודין להסתמך על חדירות של התאים או דגימות ביולוגיות. חוסר היכולת של קורס זמן לחיות תאים בדיקה היא ולכן מגבלה מרכזית של הפרוטוקול כמו עם שיטות מבוססות אימונוציטוכימיה באמצעות פאלודין.
חוסר היכולת של שיטות מבוססות פאלודין כדי להעריך שינויים דינמיים חוטי actin בתאים חיים unfixed מעלה את השאלה אם יש הליכים חלופיים לעשות זאת. אכן, נעשו התקדמות בהקשר זה עם ביטוי אקסוגני של אנלוגים פלואורסצנטיים-actin לפני הניתוח באמצעות פרוטוקולים כגון מיקרוגרפיה וידאו36,56, פלואורסצנטי מתאושש לאחר photobleaching (FRAP)38 או העברת אנרגיה תהודה פלואורסצנטית (FRET)39. ביטוי הטרולוגי של פפטידים וחלבונים מתויגים פלואורסצנטיים שקושרים חוטי אקטין משמשים גם כדי ללמוד דינמיקה actin בתאים חיים; עם זאת ישנם חסרונות ומגבלות הקשורים אליהם, כמו גם עם הביטוי ההטרולוגי של actin מתויג פלואורסצנטי47,49,57. לדוגמה, G-actin הכולל 50-70% מכלל actin ברוב התאים הוא מסיס ומפוזר בחופשיות cytosol, וכתוצאה מכך רקע גבוה יותר גורם לאתגרים בהבחנה אותות מסיבים actin במיוחד57.
גורם קריטי בהסתעפות הוא שכפי שמוצג באיור 2 ובאיור 3; זה לא ליניארי לאורך כל טווח כמויות החלבון שנבדקו. לפיכך, כמות אופטימלית של חלבון מתאים לבדיקה צריך להיקבע הראשון או כמות אנלוגי פאלודין צריך להיות מותאם כך שהוא כבר לא מגביל (בכמויות גבוהות יותר של חלבונים). היבט קריטי נוסף של הפרוטוקול הוא כי צעדים מבוססי צנטריפוגה מרובים להסרת קיבוע, סוכן חדירות ופאלואידין מאוגד יכול להוביל לאובדן משתנה של חלבונים (ו F-actin מאוגד phalloidin) מן הדגימות, במיוחד כאשר כמויות נמוכות יותר של דגימות משמשים. לכן חשוב לנרמל את כמות המדגם נשמר על ידי ניטור פיזור אור ב 540 ננומטר. לבסוף, מכיוון ש-actin נמצאת במצב דינמי של אינטרקונומיות בין צורות ה-F וה-G שלה, התיקון צריך להיות מהיר. היבט קריטי הקשורים מינורי של הבדיקה היא שאנחנו לא יכולים להעריך את יעילותה בהערכת פולימריזציה אקטין תרופתי. בניגוד depolymerization actin תרופתי על ידי latrunculin A, jasplakinolide (סוכן פולימרציה actin אמין בשימוש נרחב) יש אתרי קשירה חופפים עם phalloidin ומעכב תחרותי שלה מחייב סיבי actin58,59. עם זאת, תעסוקה של מסופי סינפטית מגורה KCl כמודל ex vivo עבור פולמור actin מוגברת עולה כי ההסתערות שלנו יכולה גם לזהות עליות ברמות F-actin.
לסיכום, אנו מתארים בדיקה חזקה של זמן יעיל ובעל תפוקה גבוהה לניתוח סיבי אקטין (F-actin) והתחלפותיה במצבים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים המתאימים לפורמט צלחת של 96 בארות. בשילוב עם שיטות קיימות אחרות להערכת F-actin בדגימות קבועות ולא מתוקנות, הפרוטוקול יוכיח להיות כלי חיוני במחקרים הקשורים actin בתחום מדעי המוח, כמו גם בתחומים אחרים של מחקר מדעי הביולוגי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הנוירולוגית של ניו זילנד (1835-PG), המועצה לחקר הבריאות של ניו זילנד (#16-597) והמחלקה לאנטומיה, אוניברסיטת אוטגו, ניו זילנד. אנו חייבים לבנק הרקמות הנוירולוגיות של HCB-IDIBAPS BioBank (ספרד) עבור רקמות המוח האנושי. אנו מודים לג'יאקסיאן ג'אנג על עזרתה בהקלטה ועריכה של הסרטון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3.5 mL, open-top thickwall polycarbonate tube | Beckman Coulter | 349622 | For gradient centrifugation (synaptosome prep) |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22287 | F-actin specific ligand |
| Antibody against b-actin | Santa Cruz Biotechnology | Sc-47778 | For evaluation of total actin levels by immunoblotting |
| Antibody against GAPDH | Abcam | Ab181602 | For evaluation of GAPDH levels by immunoblotting |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | Bradford based protein estimation |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | Krebs buffer component |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | For inhibition of endogenous protease activity during sample preparation |
| Corning 96-well Clear Flat Bottom Polystyrene | Corning | 3596 | For light-scattering measurements |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Krebs buffer component |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | Solvent for phalloidin and latrunculin A |
| Fluorescent flatbed scanner (Odyssey Infrared Scanner) | Li-Cor Biosciences | For detection of immunoreactive signals on immunoblots | |
| Glutaraldehyde solution (25% in water) Grade II | Sigma-Aldrich | G6257 | Fixative |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Buffer ingredient for sample preparation and Krebs buffer component |
| Latrunculin A | Sigma-Aldrich | L5163 | Depolymerizer of actin filaments |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma-Aldrich | M2670 | Krebs buffer component |
| Microplates | |||
| Mitex membrane filter 5 mm | Millipore | LSWP01300 | Preparation of synaptoneurosomes |
| Nunc F96 MicroWell Black Plate | Thermo Fisher Scientific | 237105 | For fluorometric measurements |
| Nylon net filter 100 mm | Millipore | NY1H02500 | Preparation of synaptoneurosomes |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail IV | Abcam | ab201115 | For inhibition of endogenous phosphatase activity during sample preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Krebs buffer component and for depolarization of synaptic terminals |
| Potassium phosphate monobasic ((KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Krebs buffer component |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 71320 | Component of Permeabilization buffer |
| Sodium chloride (NaCl) | LabServ (Thermo Fisher Scientific) | BSPSL944 | Krebs buffer component |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | LabServ (Thermo Fisher Scientific) | BSPSL900 | Krebs buffer component |
| SpectraMax i3x | Molecular Devices | For fluorometric measurements | |
| Sucrose | Fisher Chemical | S/8600/60 | Buffer ingredient for sample preparation |
| Swimnex Filter Holder | Millipore | Sx0001300 | Preparation of synaptoneurosomes |
| Tissue grinder 5 mL Potter-Elvehjem | Duran Wheaton Kimble | 358034 | For tissue homogenization |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Component of Permeabilization buffer |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T6066 | Buffer ingredient for sample preparation |
References
- Penzes, P., Rafalovich, I. Regulation of the actin cytoskeleton in dendritic spines. Advances in Experimental Medicine and Biology. 970, 81-95 (2012).
- Venkatesh, K., Mathew, A., Koushika, S. P. Role of actin in organelle trafficking in neurons. Cytoskeleton. 77 (3-4), 97-109 (2020).
- Shirao, T., González-Billault, C. Actin filaments and microtubules in dendritic spines. Journal of Neurochemistry. 126 (2), 155-164 (2013).
- Bertling, E., Hotulainen, P. New waves in dendritic spine actin cytoskeleton: From branches and bundles to rings, from actin binding proteins to post-translational modifications. Molecular and Cellular Neuroscience. 84, 77-84 (2017).
- Bellot, A., et al. The structure and function of actin cytoskeleton in mature glutamatergic dendritic spines. Brain Research. 1573, 1-16 (2014).
- Wolf, M., et al. ADF/Cofilin controls synaptic actin dynamics and regulates synaptic vesicle mobilization and exocytosis. Cerebral Cortex. 25 (9), 2863-2875 (2015).
- Morales, M., Colicos, M. A., Goda, Y. Actin-dependent regulation of neurotransmitter release at central synapses. Neuron. 27 (3), 539-550 (2000).
- Doussau, F., Augustine, G. J. The actin cytoskeleton and neurotransmitter release: An overview. Biochimie. 82 (4), 353-363 (2000).
- Sakaba, T., Neher, E. Involvement of actin polymerization in vesicle recruitment at the calyx of held synapse. Journal of Neuroscience. , (2003).
- Lee, J. S., Ho, W. K., Lee, S. H. Actin-dependent rapid recruitment of reluctant synaptic vesicles into a fast-releasing vesicle pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
- Rust, M. B., et al. Learning, AMPA receptor mobility and synaptic plasticity depend on n-cofilin-mediated actin dynamics. EMBO Journal. 29, 1889-1902 (2010).
- Bosch, M., et al. Structural and molecular remodeling of dendritic spine substructures during long-term potentiation. Neuron. 82, 444-459 (2014).
- Hanley, J. G. Actin-dependent mechanisms in AMPA receptor trafficking. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 381 (2014).
- Kasai, H., Fukuda, M., Watanabe, S., Hayashi-Takagi, A., Noguchi, J. Structural dynamics of dendritic spines in memory and cognition. Trends in Neurosciences. 33, 121-129 (2010).
- Terman, J. R., Kashina, A. Post-translational modification and regulation of actin. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 30-38 (2013).
- Wilson, C., Terman, J. R., González-Billault, C., Ahmed, G. Actin filaments-A target for redox regulation. Cytoskeleton. 73, 577-595 (2016).
- Borovac, J., Bosch, M., Okamoto, K. Regulation of actin dynamics during structural plasticity of dendritic spines: Signaling messengers and actin-binding proteins. Molecular and Cellular Neuroscience. 91, 122-130 (2018).
- Saneyoshi, T., Hayashi, Y. The Ca2+ and Rho GTPase signaling pathways underlying activity-dependent actin remodeling at dendritic spines. Cytoskeleton. 69 (8), 545-554 (2012).
- Mizuno, K. Signaling mechanisms and functional roles of cofilin phosphorylation and dephosphorylation. Cellular Signalling. 25 (2), 457-469 (2013).
- Dos Remedios, C. G., et al. Actin binding proteins: Regulation of cytoskeletal microfilaments. Physiological Reviews. 83 (2), 433-473 (2003).
- Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).
- Penzes, P., VanLeeuwen, J. E. Impaired regulation of synaptic actin cytoskeleton in Alzheimer's disease. Brain Research Reviews. 67 (1-2), 184-192 (2011).
- Pelucchi, S., Stringhi, R., Marcello, E. Dendritic spines in Alzheimer's disease: How the actin cytoskeleton contributes to synaptic failure. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 908 (2020).
- Kounakis, K., Tavernarakis, N. The Cytoskeleton as a Modulator of Aging and Neurodegeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1178, 227-245 (2019).
- Nishiyama, J. Plasticity of dendritic spines: Molecular function and dysfunction in neurodevelopmental disorders. Psychiatry and Clinical Neurosciences. 73 (9), 541-550 (2019).
- Michaelsen-Preusse, K., Feuge, J., Korte, M. Imbalance of synaptic actin dynamics as a key to fragile X syndrome. Journal of Physiology. 596 (14), 2773-2782 (2018).
- Hensel, N., Claus, P. The Actin Cytoskeleton in SMA and ALS: How Does It Contribute to Motoneuron Degeneration. Neuroscientist. 24 (1), 54-72 (2018).
- Kommaddi, R. P., et al. Aβ mediates F-actin disassembly in dendritic spines leading to cognitive deficits in alzheimer's disease. Journal of Neuroscience. 38 (5), 1085-1099 (2018).
- Kommaddi, R. P., et al. Glutaredoxin1 Diminishes Amyloid Beta-Mediated Oxidation of F-Actin and Reverses Cognitive Deficits in an Alzheimer's Disease Mouse Model. Antioxidants and Redox Signaling. 31 (18), 1321-1338 (2019).
- Bernstein, B. W., Bamburg, J. R. Cycling of actin assembly in synaptosomes and neurotransmitter release. Neuron. 3 (2), 257-265 (1989).
- Sapan, C. V., Lundblad, R. L., Price, N. C. Colorimetric protein assay techniques. Biotechnology and applied biochemistry. 29 (2), Pt 2 99-108 (1999).
- Kolodziej, A., et al. High resolution quantitative synaptic proteome profiling of mouse brain regions after auditory discrimination learning. Journal of Visualized Experiments. (118), e54992 (2016).
- Byun, Y. G., Chung, W. S. A novel in vitro live-imaging assay of astrocyte-mediated phagocytosis using pH indicator-conjugated synaptosomes. Journal of Visualized Experiments. (132), e56647 (2018).
- Chmielewska, J. J., Kuzniewska, B., Milek, J., Urbanska, K., Dziembowska, M. Neuroligin 1, 2, and 3 Regulation at the Synapse: FMRP-Dependent Translation and Activity-Induced Proteolytic Cleavage. Molecular Neurobiology. 56 (4), 2741-2759 (2019).
- Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mRNAs. Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).
- Fischer, M., Kaech, S., Knutti, D., Matus, A. Rapid actin-based plasticity in dendritic spines. Neuron. 20 (5), 847-854 (1998).
- Caesar, M., Felk, S., Aasly, J. O., Gillardon, F. Changes in actin dynamics and F-actin structure both in synaptoneurosomes of LRRK2(R1441G) mutant mice and in primary human fibroblasts of LRRK2(G2019S) mutation carriers. Neuroscience. 284, 311-324 (2015).
- Star, E. N., Kwiatkowski, D. J., Murthy, V. N. Rapid turnover of actin in dendritic spines and its regulation by activity. Nature Neuroscience. 5, 239-246 (2002).
- Okamoto, K. I., Nagai, T., Miyawaki, A., Hayashi, Y. Rapid and persistent modulation of actin dynamics regulates postsynaptic reorganization underlying bidirectional plasticity. Nature Neuroscience. 7, 1104-1112 (2004).
- Bernstein, B. W., Dewit, M., Bamburg, J. R. Actin disassembles reversibly during electrically induced recycling of synaptic vesicles in cultured neurons. Molecular Brain Research. 53 (1-2), 236-250 (1998).
- Ahmad, F., Liu, P. Synaptosome as a tool in Alzheimer's disease research. Brain Research. 1746, 147009 (2020).
- Ahmad, F., et al. Isoform-specific hyperactivation of calpain-2 occurs presymptomatically at the synapse in Alzheimer's disease mice and correlates with memory deficits in human subjects. Scientific Reports. 8 (1), 13119 (2018).
- Ahmad, F., et al. Reactive Oxygen Species-Mediated Loss of Synaptic Akt1 Signaling Leads to Deficient Activity-Dependent Protein Translation Early in Alzheimer's Disease. Antioxidants and Redox Signaling. 27 (16), 1269-1280 (2017).
- Ahmad, F., et al. Developmental lead (Pb)-induced deficits in redox and bioenergetic status of cerebellar synapses are ameliorated by ascorbate supplementation. Toxicology. 440, 152492 (2020).
- Ahmad, F., Salahuddin, M., Alsamman, K., Herzallah, H. K., Al-Otaibi, S. T. Neonatal maternal deprivation impairs localized de novo activity-induced protein translation at the synapse in the rat hippocampus. Bioscience Reports. 38 (3), 0118 (2018).
- Ahmad, F., Salahuddin, M., Alsamman, K., Almulla, A. A., Salama, K. F. Developmental lead (Pb)-induced deficits in hippocampal protein translation at the synapses are ameliorated by ascorbate supplementation. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 14, 3289-3298 (2018).
- Melak, M., Plessner, M., Grosse, R. Actin visualization at a glance. Journal of Cell Science. 130 (3), 525-530 (2017).
- Adams, A. E. M., Pringle, J. R. Staining of actin with fluorochrome-conjugated phalloidin. Methods in Enzymology. 194, 729-731 (1991).
- Belin, B. J., Goins, L. M., Mullins, R. D. Comparative analysis of tools for live cell imaging of actin network architecture. BioArchitecture. 4 (6), 189-202 (2014).
- Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4498-4502 (1979).
- Taffarel, M., de Souza, M. F., Machado, R. D., de Souza, W. Localization of actin in the electrocyte of Electrophorus electricus L. Cell and Tissue Research. 242, 453-455 (1985).
- Glebov, O. O. Distinct molecular mechanisms control levels of synaptic F-actin. Cell Biology International. 44 (1), 336-342 (2020).
- Dancker, P., Löw, I., Hasselbach, W., Wieland, T. Interaction of actin with phalloidin:. Polymerization and stabilization of F-actin. BBA - Protein Structure. , (1975).
- Lengsfeld, A. M., Löw, I., Wieland, T., Dancker, P., Hasselbach, W. Interaction of phalloidin with actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (7), 2803-2807 (1974).
- Coluccio, L. M., Tilney, L. G. Phalloidin enhances actin assembly by preventing monomer dissociation. Journal of Cell Biology. 99, 529-535 (1984).
- Colicos, M. A., Collins, B. E., Sailor, M. J., Goda, Y. Remodeling of synaptic actin induced by photoconductive stimulation. Cell. 107 (5), 605-616 (2001).
- Lemieux, M. G., et al. Visualization of the actin cytoskeleton: Different F-actin-binding probes tell different stories. Cytoskeleton. 71, 157-169 (2014).
- Bubb, M. R., Senderowicz, A. M. J., Sausville, E. A., Duncan, K. L. K., Korn, E. D. Jasplakinolide, a cytotoxic natural product, induces actin polymerization and competitively inhibits the binding of phalloidin to F-actin. Journal of Biological Chemistry. , (1994).
- Holzinger, A. Jasplakinolide: an actin-specific reagent that promotes actin polymerization. Methods in molecular biology. 269, Clifton, N.J. 14869-14871 (2009).
